OCDE 476 - Institut Pasteur de Lille

476 OCDE/OECDDétermination de la survie, de la viabilité et de la fréquence des mutants25. A la fin de la période d’exposition, les cellules sont lavées et mises en culture afin dedéterminer leur survie et de permettre l’expression du phénotype mutant. La détermination de lacytotoxicité est commencée immédiatement après la période de traitement en mesurant l’efficacitérelative de clonage (survie) ou la croissance relative totale des cultures.26. A chaque locus correspond un temps bien défini qui est nécessaire à l’expression optimaledu phénotype des mutants nouvellement induits. Ainsi, HPRT et XPRT ont besoin d’au moins 6 à 8jours et TK d’au moins 2 jours. Pour déterminer le nombre de mutants et l’efficacité de clonage, lescellules sont mises en cultures respectivement en présence et en l’absence d’agents sélectifs. Oncommence à mesurer la viabilité, qui permet de calculer la fréquence des mutants, à la fin de lapériode d’expression en déposant les cultures dans un milieu non sélectif.27. Si la réponse de la substance d’essai est positive dans l’essai sur L5178Y TK +/- , les coloniesdoivent être comptées dans au moins une des cultures de traitement (celle de la concentration la plusfortement positive) et dans les témoins négatifs et positifs. Si la réponse de la substance d’essai estnégative dans l’essai sur L5178Y TK +/- , les colonies doivent être comptées dans les témoins négatifset positifs. Dans l’essai sur TK6TK +/-on peut également compter les colonies.RESULTATS ET RAPPORTTraitement des résultats28. Les données doivent comprendre les déterminations de cytotoxicité et de viabilité, lerecensement des colonies et les fréquences de mutants pour les cultures de traitement et celles destémoins. Dans le cas d’une réponse positive dans l’essai sur L5178Y TK +/- , les colonies sontrecensées en distinguant les petites des grandes colonies dans au moins une culture de traitement(celle de la concentration la plus fortement positive) et dans les cultures des témoins négatifs etpositifs. La nature moléculaire et cytogénétique des deux sortes de colonies de mutants (petites etgrandes) a été étudiée en détail (23)(24). Dans l’essai TK +/- , les colonies sont recensées sur la base descritères de croissance normale (grandes colonies) et de croissance faible (petites colonies) (25). Lescellules mutantes qui ont subi les dégâts génétiques les plus importants on un temps de duplicationplus long et elles forment des petites colonies. Ces dégâts vont de la perte du gène entier à desaberrations chromosomiques se manifestant dans le caryotype. L’induction de petites colonies demutants a été mise en rapport avec des substances qui engendrent des aberrations chromosomiquesimportantes (26). Les cellules mutantes moins affectées croissent à des vitesses semblables à cellesdes cellules parentales et forment de grandes colonies.29. Le taux de survie (efficacité de clonage relative) ou la croissance totale relative doivent êtredonnés. La fréquence de mutants doit être exprimée comme le nombre de cellules mutantes divisé parle nombre des cellules survivantes.30 Les données individuelles concernant chaque culture doivent être indiquées. En outre,toutes les données doivent être résumées sous forme de tableaux.31. Il n'est pas obligatoire de vérifier une réponse positive claire. Par contre, les résultatsambigus demandent à être confirmés par une seconde expérience indépendante. Pour cette expériencede confirmation, il est préférable de modifier les conditions expérimentales. Les résultats négatifsdemandent à être confirmés au cas par cas. Si cela n’est pas jugé nécessaire, une justification6/12