OCDE 476 - Institut Pasteur de Lille

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476 OCDE/OECDDétermination de la survie, de la viabilité et de la fréquence des mutants25. A la fin de la période d’exposition, les cellules sont lavées et mises en culture afin dedéterminer leur survie et de permettre l’expression du phénotype mutant. La détermination de lacytotoxicité est commencée immédiatement après la période de traitement en mesurant l’efficacitérelative de clonage (survie) ou la croissance relative totale des cultures.26. A chaque locus correspond un temps bien défini qui est nécessaire à l’expression optimaledu phénotype des mutants nouvellement induits. Ainsi, HPRT et XPRT ont besoin d’au moins 6 à 8jours et TK d’au moins 2 jours. Pour déterminer le nombre de mutants et l’efficacité de clonage, lescellules sont mises en cultures respectivement en présence et en l’absence d’agents sélectifs. Oncommence à mesurer la viabilité, qui permet de calculer la fréquence des mutants, à la fin de lapériode d’expression en déposant les cultures dans un milieu non sélectif.27. Si la réponse de la substance d’essai est positive dans l’essai sur L5178Y TK +/- , les coloniesdoivent être comptées dans au moins une des cultures de traitement (celle de la concentration la plusfortement positive) et dans les témoins négatifs et positifs. Si la réponse de la substance d’essai estnégative dans l’essai sur L5178Y TK +/- , les colonies doivent être comptées dans les témoins négatifset positifs. Dans l’essai sur TK6TK +/-on peut également compter les colonies.RESULTATS ET RAPPORTTraitement des résultats28. Les données doivent comprendre les déterminations de cytotoxicité et de viabilité, lerecensement des colonies et les fréquences de mutants pour les cultures de traitement et celles destémoins. Dans le cas d’une réponse positive dans l’essai sur L5178Y TK +/- , les colonies sontrecensées en distinguant les petites des grandes colonies dans au moins une culture de traitement(celle de la concentration la plus fortement positive) et dans les cultures des témoins négatifs etpositifs. La nature moléculaire et cytogénétique des deux sortes de colonies de mutants (petites etgrandes) a été étudiée en détail (23)(24). Dans l’essai TK +/- , les colonies sont recensées sur la base descritères de croissance normale (grandes colonies) et de croissance faible (petites colonies) (25). Lescellules mutantes qui ont subi les dégâts génétiques les plus importants on un temps de duplicationplus long et elles forment des petites colonies. Ces dégâts vont de la perte du gène entier à desaberrations chromosomiques se manifestant dans le caryotype. L’induction de petites colonies demutants a été mise en rapport avec des substances qui engendrent des aberrations chromosomiquesimportantes (26). Les cellules mutantes moins affectées croissent à des vitesses semblables à cellesdes cellules parentales et forment de grandes colonies.29. Le taux de survie (efficacité de clonage relative) ou la croissance totale relative doivent êtredonnés. La fréquence de mutants doit être exprimée comme le nombre de cellules mutantes divisé parle nombre des cellules survivantes.30 Les données individuelles concernant chaque culture doivent être indiquées. En outre,toutes les données doivent être résumées sous forme de tableaux.31. Il n'est pas obligatoire de vérifier une réponse positive claire. Par contre, les résultatsambigus demandent à être confirmés par une seconde expérience indépendante. Pour cette expériencede confirmation, il est préférable de modifier les conditions expérimentales. Les résultats négatifsdemandent à être confirmés au cas par cas. Si cela n’est pas jugé nécessaire, une justification6/12
OCDE/OECD 476pertinente doit être fournie. Dans les expériences complémentaires, faites à la suite de résultatséquivoques ou négatifs, il faut envisager de modifier des paramètres de l'étude, afin d'élargir lagamme des conditions évaluées. Les paramètres susceptibles d'être modifiés comprennentl'espacement des niveaux de doses et les conditions de l'activation métabolique.Evaluation et interprétation des résultats32. Plusieurs critères permettent de déterminer si un résultat est positif, notamment unaccroissement de la fréquence de mutants, lié à la dose ou reproductible. En premier lieu il s’agit deprendre en considération la pertinence biologique des résultats. L'évaluation des résultats peuts'appuyer sur des méthodes statistiques mais la signification statistique ne doit pas être le seul facteurde décision.33. Si les résultats obtenus avec une substance d’essai ne répondent pas aux critères donnésci-dessus il faut conclure que la substance en question n’est pas mutagène dans cet essai.34. Quoique la plupart des essais donneront des résultats clairement positifs ou négatifs, ilarrive occasionnellement que l'ensemble des résultats d'un essai n'autorise pas un jugementcatégorique sur l'activité de la substance étudiée. Ces résultats équivoques ou discutables peuventsurvenir indépendamment du nombre de fois que l'essai a été répété.35. Des résultats positifs dans un essai in vitro de mutation génique sur des cellules demammifères indiquent que la substance d’essai induit des mutations géniques dans les cellules demammifères des cultures utilisées. Une relation dose-réponse positive, si elle est reproductible, estdes plus significatives. Des résultats négatifs signifient que, dans les conditions de l'essai, lasubstance d'essai n'induit pas de mutations géniques dans les cellules de mammifère des culturesutilisées.Rapport d’essai36. Le rapport d'essai doit reprendre les informations suivantes :Substance d'essai :- données d'identification et n° CAS, s'il est connu ;- état physique et pureté ;- propriétés physico-chimiques importantes pour l’exécution de l’essai ;- stabilité de la substance si elle est connue.Solvant/véhicule :- justification du choix du solvant ou véhicule ;- solubilité et stabilité de la substance dans le milieu, si elles sont connues.Cellules :- type et source des cellules utilisées ;- nombre des cultures cellulaires ;- nombre de repiquages, le cas échéant ;- méthodes d'entretien des cultures, s’il y a lieu ;- l'absence de mycoplasmes.7/12
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