POTENSI BAKTERI Micrococcus sp. L II 61 SEBAGAI AGEN ...

POTENSI BAKTERI Micrococcus sp. L II 61 SEBAGAI AGEN PELARUT LUMPUR
MINYAK
Ni’matuzahroh (*), Intan Ayu Pratiwi, Tini Surtiningsih, Fatimah, Sri Sumarsih (**)
(*) Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FSAINTEK, Universitas Airlangga
(**) Laboratorium Biokimia, Departemen Kimia, FSAINTEK, Universitas Airlangga
Kampus C Unair , Jln. Mulyorejo, Surabaya - Indonesia,
* ) E-mail: nimatuzahroh@yahoo.com
ABSTRACT
This research aimed to uncovering potential of Micrococcus sp. L II 61 bacteria that
was isolated from Pegirian Surabaya as oil cleaner agent. This is an experimental research to
detect the presence of biosurfactant and lipase enzyme in liquid culture of Micrococcus sp. L
II 61 with aliphatic hydrocarbon (cooking oil) as a substrate growth. Biosurfactant production
was evaluated by measuring the surface tension supernatant using tensiometer du Nouy and
measuring emulsification activity value using diesel oil as hydrocarbon test. Lipase enzyme
was detected by measuring lipolitic activity value of crude enzyme (culture supernatant) by
using p-nitrofenil palmitic (p-npp) as a substrate test. Data were analysed descriptively. The
results showed that Micrococcus sp. L II 61 produced biosurfacatant with surface tension
decreasing of culture supernatant up to 30,27 ± 1,17 mN/m compared than aquadest and value
of hydrocarbon emulsification activity (AE 1 hour) 20,24 ± 0,68%. Crude lipase enzyme of 16
hours incubation Micrococcus sp. L II 61 culture having a lipolytic activity 33,53 ± 0,14
U/mL at pH 7 and 37°C. Micrococcus sp. L II 61 is a highly potential to be developed as oil
sludge cleaner agent.
Keywords: Micrococcus sp. L II 61, biosurfactant, lipase enzyme
PENGANTAR
Lumpur minyak merupakan endapan berupa lumpur atau pasta berwarna hitam yang
tercampur dengan tanah, kerikil, air dan bahan lainnya. Akumulasi lumpur minyak dalam
tangki-tangki minyak akan menyebabkan penurunan kemampuan penyimpanan minyak serta
dapat mempercepat proses pengeroposan tangki sehingga perlu adanya upaya pembersihan
atau pengangkatan lumpur minyak yang tidak terangkat oleh pompa konvensional (Banat and
Rancich, 2009). Menumpuknya limbah lumpur minyak di tanah juga berdampak pada
penurunan kualitas lingkungan khususnya kesuburan tanah di tempat pembuangan limbah,
kualitas air tanah serta menganggu kesehatan lingkungan (Ni’matuzahroh dkk. 2009).
Upaya penanggulangan lumpur minyak yang dianggap efektif selama ini adalah
dengan menggunakan surfaktan. Namun, pemakaian surfaktan kimia dapat menyebabkan
masalah bagi lingkungan karena sifatnya yang resisten, sulit dipecah secara biologis, dan
sangat toksik saat terakumulasi dalam suatu ekosistem alam (Fiechter, 1992). Sehingga,

penggunaan mikroba dalam aplikasi bioteknologi untuk menggantikan surfaktan kimia
namun memiliki fungsi yang sama mulai dimanfaatkan. Keberadaan mikroba ini dikaitkan
dengan keberadaan enzim lipase yang dapat menghidrolisis minyak yang tidak larut dalam air
menjadi produk yang larut dalam air serta keberadaan biosurfaktan yang dapat menurunkan
tegangan permukaan dan tegangan interfasial pada ruang antara air dan minyak serta material
non polar dengan cara berakumulasi pada interfasial dari cairan yang tidak dapat saling larut.
Berdasarkan penelitian eksplorasi bakteri proteolitik dan lipolitik dari limbah rumah
potong hewan oleh Fatimah dan Nurhariyati (2011) dihasilkan bakteri-bakteri penghasil
enzim protease dan lipase. Salah satu isolat yang didapatkan adalah Micrococcus sp. L II 61.
Isolat Micrococcus sp. L II 61 memiliki indeks lipolitik tertinggi sehingga potensial
dilakukan uji potensinya dalam melarutkan lumpur minyak.
Berdasarkan latar belakang di atas, perlu dilakukan pengukuran tentang aktivitas
lipolitik crude enzyme lipase dan keberadaan biosurfaktan dalam supernatan kultur
Micrococcus sp. L II 61 dan potensinya dalam melarutkan lumpur minyak secara laboratoris,
yaitu dengan menggunakan metode filtrasi untuk mengetahui pengaruh perlakuan terhadap
kelarutan lumpur minyak. Hasil persentase kelarutan lumpur minyak oleh crude enzyme
lipase Micrococcus sp. L II 61 tersebut dapat dijadikan acuan sebagai upaya pembersihan dan
pengangkatan lumpur minyak dari dasar tangki-tangki penyimpanan minyak yang berbasis
ramah lingkungan.
BAHAN DAN CARA KERJA
Bahan penelitian yang digunakan meliputi isolat Micrococcus sp. L II 61, lumpur
minyak, Bushnell-Haas mineral salts medium, p-NPP, Na 2 CO 3, Nutrient Broth (NB), minyak
goreng, solar, dan akuades.
Pertumbuhan Micrococcus sp. L II 61
Botol kultur ukuran 100 mL diisi dengan 50 mL Bushnell-Haas mineral salts medium
dan diinokulasikan 5% (v/v) kultur Micrococcus sp. L II 61. Aktivitas enzim ditentukan
menggunakan metode spektrofotometrik dengan substrat p-nitrofenil palmitat (p-NPP)
selama 48 jam dengan rentang waktu pengamatan 4 jam. Eppendorf diisi 700 µL larutan p-
NPP 0,503 mM dalam buffer fosfat pH 7 ditambahkan 300 µL supernatan. Kemudian
diinkubasi dalam waterbath pada suhu 37ºC selama 30 menit. Eppendorf diangkat dari
waterbath lalu ditambahkan 100 µL larutan Na 2 CO 3 0,2 M, p-nitrofenol yang terbentuk
ditandai dengan warna kuning, kemudian diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada λ 410

nm. OD yang diperoleh selanjutnya akan digunakan untuk menetapkan nilai aktivitas enzim
lipase. Pada penentuan aktivitas enzim lipase ini dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali.
Nilai aktivitas tertinggi dijadikan acuan proses produksi crude enzyme lipase.
Botol kultur ukuran 100 mL diisi dengan 50 mL media Nutrient Broth ditambah 2%
(v/v) minyak disterilkan dengan autoclave kemudian diinokulasikan 5% (v/v) kultur
Micrococcus sp. L II 61 dengan nilai absorbansi 0,5 pada λ 650 nm ke dalam masing-masing
botol. Kultur bakteri kemudian diinkubasi dalam shaker dengan kecepatan 120 rpm dengan
titik optimal waktu inkubasi. Kemudian supernatan disentrifugasi pada kecepatan 9.000 rpm
dalam suhu 4°C selama 15 menit. Supernatan digunakan untuk uji aktivitas enzim dan
keberadaan biosurfaktan.
Uji aktivitas enzim dan biosurfaktan
Supernatan hasil sentrifugasi tersebut digunakan sebagai crude enzyme (ekstrak kasar
enzim). Crude enzyme lipase tersebut diuji aktivitas lipolitik secara kuantitatif (pengukuran
aktivitas enzim (U/mL) menggunakan substrat p-NPP) dengan titik optimal waktu inkubasi.
Supernatan hasil sentrifugasi tersebut digunakan sebagai crude (ekstrak kasar)
biosurfaktan. Biosurfaktan tersebut diuji dengan pengukuran nilai tegangan permukaan
(mN/m) serta aktivitas emulsifikasi (%) pada solar setelah 1 dan 24 jam (Pruthi and
Cameotra, 1997).
Pembuatan larutan surfaktan sintetis Tween-20 konsentrasi sama dengan CMC
Surfaktan Tween-20 ditimbang sebanyak 0,11 g/L dan dilarutkan dalam buffer fosfat
pH 7. Larutan dikarakterisasi dengan mengukur nilai tegangan permukaan (mN/m) dan
aktivitas emulsifikasinya (%) pada minyak uji solar. Larutan surfaktan sintetis ini merupakan
kontrol yang digunakan sebagai surfaktan tandingan dari biosurfaktan Micrococcus sp. L II
61 dalam uji kelarutan lumpur minyak.
Uji kelarutan lumpur minyak
Penelitian ini termasuk ke dalam penelitian eksperimental yang terdiri dari 1 kontrol
dan 5 perlakuan dengan rincian sebagai berikut :
Kontrol (T), yaitu 0,20 mL lumpur minyak + 7,80 mL surfaktan sintetis Tween-20 pada
konsentrasi sama dengan CMC.
Perlakuan 1 (A), yaitu 0,20 mL lumpur minyak + 7,80 mL akuades.

Perlakuan 2 (Ea), yaitu 0,20 mL lumpur minyak + 1 mL supernatan Micrococcus sp. L II
61 + 6,80 mL akuades.
Perlakuan 3 (Eb), yaitu 0,20 mL lumpur minyak + 2 mL supernatan Micrococcus sp. L II
61 + 5,80 mL akuades.
Perlakuan 4 (Ec), yaitu 0,20 mL lumpur minyak + 3 mL supernatan Micrococcus sp. L II
61 + 4,80 mL akuades.
Perlakuan 5 (E8), yaitu 0,20 mL lumpur minyak + 7,8 mL supernatan Micrococcus sp. L
II 61.
Seluruh kelompok kontrol dan perlakuan yang masing-masing terdiri atas 3 ulangan
divortex pada suhu ruang (27-30 o C) selama 15 menit. Lumpur minyak yang terlarut (dalam
fase cair), disentrifugasi pada kecepatan 9.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C.
Filtrasi fase cair dari masing-masing perlakuan
Sebanyak 1 mL sampel fase cair dari hasil sentrifugasi dituang ke dalam aluminium
foil dengan kertas saring di dalamnya kemudian dioven pada suhu 51—55°C selama enam
jam. Kelarutan diukur dari lumpur minyak yang terpisah dan terperangkap dikertas saring
tersebut. Kertas saring yang telah kering kembali ditimbang dan dicatat beratnya sebagai Wt.
Semua prosedur yang dilakukan dilakukan secara bebas lemak. Setiap perlakuan yang
dilakukan dalam uji kelarutan lumpur minyak, selalu disertai dengan blanko. Blanko
merupakan berat larutan supernatan tanpa penambahan lumpur minyak. Berat blanko dari
masing-masing perlakuan dicatat sebagai Wb.
Penghitungan nilai persentase kelarutan lumpur minyak
Nilai persentase kelarutan lumpur minyak pada masing- masing perlakuan dapat
dihitung dengan menggunakan rumus berikut:
Dimana:
Wot = berat lumpur minyak terlarut (g)
Wb = berat blanko perlakuan (g)
Wop= berat lumpur minyak perlakuan (g)

Sedangkan berat lumpur minyak terlarut dihitung menggunakan rumus berikut:
Dimana:
Wot=berat lumpur minyak terlarut (g/volume total)
Wt = berat kertas saring + lumpur minyak terlarut (g/mL)
Wo = berat kertas saring (g)
HASIL
berikut:
Aktivitas enzim tersaji dalam gambar 1. dan hasil persentase kelarutan pada gambar 2
Gambar 1. Grafik aktivitas enzim lipase Micrococcus sp. L II 61
Gambar 2. Grafik persentase kelarutan lumpur minyak
PEMBAHASAN
Aktivitas lipolitik crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II 61
Aktivitas lipolitik crude enzyme lipase yang diukur secara kuantitatif dengan
menggunakan p-nitrofenil palmitat (p-NPP) sebagai substrat uji. Crude enzyme lipase

Micrococcus sp. L II 61 memiliki nilai aktivitas lipolitik sebesar 33,53 ± 0,14 U/mL pada pH
7, suhu 37°C dengan waktu inkubasi 16 jam.
Hasil pengukuran tegangan permukaan dan aktivitas emulsifikasi dari biosurfaktan
Micrococcus sp. L II 61
Nilai aktivitas emulsifikasi supernatan Micrococcus sp. L II 61 pada minyak uji solar
setelah 1 jam dan 24 jam masing-masing adalah 20,24 ± 0,68% dan 17,31 % ± 1,19%.
Sedangkan nilai tegangan permukaan dari supernatan Micrococcus sp. L II 61 adalah 41,73 ±
1,17 mN/m dan terjadi penurunan tegangan permukaan dalam supernatan kultur Micrococcus
sp. L II 61 terhadap media produksi NB dan akuades sebesar 21,47 ± 1,02 dan 30,27 ± 1,17
mN/m. Penurunan nilai tegangan permukaan (>10 dyne/cm) menunjukkan bahwa bakteri
tersebut berpotensi menghasilkan biosurfaktan (Francy et al., 1991).
Karakteristik larutan surfaktan sintetis Tween-20 pada konsentrasi sama dengan CMC
Tegangan permukaan dari larutan surfaktan sintetis Tween-20 pada konsentrasi sama
dengan CMC adalah 56,76 ± 0,28 mN/m dengan nilai penurunan tegangan permukaan
terhadap akuades sebesar 15,24 ± 0,28 mN/m dan terhadap pelarut (buffer fosfat pH 7)
sebesar 14,18 ± 0,28 mN/m. Dan nilai aktivitas emulsifikasi dari surfaktan sintetis Tween-20
pada konsentrasi sama dengan CMC setelah 1 jam dan 24 jam pada minyak uji solar masingmasing
adalah 35,5 ± 1,03% serta 32,25 ± 2,19%.
Hasil uji kelarutan lumpur minyak pada masing-masing perlakuan
Hasil uji statistik menggunakan one-Way ANOVA (α 0,05) menunjukkan bahwa ada
pengaruh variasi perlakuan supernatan Micrococcus sp. L II 61 terhadap kelarutan lumpur
minyak (%). Dan setelah dilakukan uji lanjutan menggunakan uji Duncan, dapat diketahui
bahwa terdapat pasangan kelompok perlakuan supernatan Micrococcus sp. L II 61 memiliki
kelarutan lumpur minyak (%) berbeda signifikan.
Kontrol perlakuan (T) yang menggunakan surfaktan sintetis Tween-20 pada
konsentrasi sama dengan CMC memiliki persentase kelarutan lumpur minyak sebesar 32,19
± 1,46%. Hasil kelarutan lumpur minyak oleh Tween-20 tersebut tidak berbeda signifikan
dengan 25% (v/v) supernatan Micrococcus sp. L II 61. Hal ini mengindikasikan bahwa
supernatan Micrococcus sp. L II 61 berpotensi untuk menggantikan penggunaan surfaktan
sintetis.

Tabel 1. Rata-rata persentase kelarutan lumpur minyak dengan penambahan supernatan
Micrococcus sp. L II 61
Kelarutan Oil sludge
Kode
(%) dengan notasi
Perlakuan
(α 0,05)
A 0,47 ± 0,01 a
Ea 0,47 ± 1,30 b
Eb 31,94 ± 1,48 c
T 32,19 ± 1,46 c
Ec 37,58 ± 0,65 d
E8 86, 38 ± 2,39 e
Keterangan : Nilai rata–rata persentase kelarutan oil sludge yang diikuti oleh notasi huruf berbeda
menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan (α 0,05). Notasi huruf berdasarkan hasil uji Duncan.
Pada kelompok perlakuan E8 dengan penambahan 90% (v/v) biosurfaktan dan crude
enzyme lipase Micrococcus sp. L II 61 memiliki hasil persentase kelarutan lumpur minyak
yang paling tinggi, yaitu 86,38 ± 2,39%. Berlawanan dengan hasil dari kedua perlakuan di
atas, perlakuan A (akuades) tidak mampu melarutkan lumpur minyak dan perlakuan Ea yang
hanya ditambahkan dengan 12,5% (v/v) crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II 61
memiliki hasil persentase kelarutan lumpur minyak lebih tinggi di atas akuades, yaitu 27,28 ±
1,30%.
Peningkatan hasil kelarutan lumpur minyak oleh crude enzyme lipase Micrococcus sp.
L II 61 dapat disebabkan karena supernatan Micrococcus sp. L II 61 mampu menghasilkan
biosurfaktan dan crude enzyme lipase sekaligus yang berfungsi mengkatalis hidrolisis ikatan
ester dalam substrat lipid yang tidak larut air sehingga mampu menjadikan partikel lebih kecil
sehingga meningkatkan kelarutan lumpur minyak sehingga mampu dibawa dan
dipertahankan oleh biosurfaktan pada fase larut air. Micrococcus sp. L II 61 potensial
digunakan sebagai agen pelarut minyak karena kemampuannya dalam menghasilkan
biosurfaktan dan enzim lipase.
Proses hidrolisis hidrokarbon terjadi pada ikatan ester trigliserida yang diputus oleh
enzim lipase sehingga menjadi asam lemak dan gliserol. Enzim lipase spesifik memutus
ikatan triacylglycerol acylhydrolase pada nomor 3.1.1.3. Pada kondisi tertentu, lipase mampu
mengkatalisis proses hidrolase dari ikatan ester inter fase antara fase substrat tidak larut dan
fase air (Ghosh et al., 1996).
Micrococcus sp. lain mampu memproduksi fosfolipid dan asam lemak netral. selain
itu, supernatan Micrococcus sp. terbukti memiliki crude enzyme (ekstrak kasar enzim) lipase
dengan pusat serin-imidazol aktif dan oleh karena itu, mirip dengan enzim esterolytic pada
studi (Lawrence et al., 1967), mekanisme penggunaan sisi aktif serin.

Menurut Leahy and Colwell (1990) bakteri yang memiliki kemampuan adaptasi
Micrococcus sp. terhadap hidrokarbon minyak bumi menunjukkan laju biodegradasi yang
lebih tinggi sehingga potensial digunakan sebagai kandidat bakteri pendegradasi hidrokarbon.
Micrococcus luteus telah ditemukan memiliki pertumbuhan biomassa yang tinggi dan
pengurangan substrat antara kelompok bakteri yang diisolasi dari limbah minyak bumi yang
terkontaminasi (Hamza et. al., 2009). Micrococcus varians dapat menjadi sumber potensial
untuk proses remediasi situs minyak yang terkontaminasi (Khan and Sigh, 2011).
Micrococcus memiliki kemampuan untuk memanfaatkan berbagai substrat yang tidak
biasa seperti piridin, herbisida, biphenyls diklorinasi dan minyak. Micrococcus memiliki
kemampuan dalam detoksifikasi atau biodegradasi dari banyak polutan hidrokarbon lain di
lingkungan. Hal ini dibuktikan oleh tingkat efisiensi biodegradasi yang tertinggi dalam empat
minggu pertama oleh Micrococcus sp. dianalisis menggunakan karakteristik supernatan cair
dan aktivitas emulsifikasi melaporkan peran Micrococcus varians dalam proses bioremediasi
hidrokarbon (Khan and Sigh, 2011).
Micrococcus luteus dan Pseudomonas putida telah ditemukan dapat memulai tahap
awal proses degradasi LAS (Eniola and Olayemi, 2007). Kemampuan untuk mentolerir
konsentrasi LAS yang tinggi membuat bakteri Micrococcus luteus dan Pseudomonas putida
penting dalam penghapusan LAS. Kemampuan Micrococcus luteus dan Pseudomonas putida
untuk menahan konsentrasi surfaktan yang tinggi disebabkan oleh reorientasi bakteri tersebut
dalam beradaptasi terhadap paparan surfaktan dalam limbah.
Micrococcus sp. L II 61 potensial digunakan sebagai agen biodegradasi dan
bioremidiasi karena fungsinya yang mampu menghasilkan enzim lipase dan biosurfaktan
sekaligus. Kajian spesifikasi biodegradasi dan bioremidiasi hidrokarbon oleh Micrococcus sp.
L II 61 yang akan dilakukan selanjutnya.
Berdasarkan hasil dan pembahasan penelitian di atas disimpulkan bahwa variasi
perlakuan penambahan supernatan Micrococcus sp. L II 61 berpengaruh signifikan terhadap
peningkatan persentase kelarutan lumpur minyak. Perlakuan 90% (v/v) supernatan
Micrococcus sp. L II 61 memberikan nilai persentase kelarutan lumpur minyak tertinggi,
yaitu 86,38 ± 2,39%.
Perlakuan penambahan supernatan Micrococcus sp. L II 61 terbukti paling potensial
dalam melarutkan lumpur minyak sehingga dapat disarankan untuk digunakan dalam
melarutkan lumpur minyak. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang optimalisasi
produksi enzim lipase Micrococcus sp. L II 61 dalam melarutkan lumpur minyak.

KEPUSTAKAAN
Banat, I. M. and Rancich, I. 2009. No Man Entry Tank Cleaning and VOC Control Using
Biotechnological Interventions. Environmental Technologies for Refineries
programme. University of Ulster. Europe.
Eniola, K. I. T. and Olayemi, A. B. 2007. Linear Alkylbenzene Sulfonate Tolerance in
Bacteria Isolated from Sediment of Tropical Water Bodies Polluted with
Detergents. Environmental and Public Health Research (EPHR) Laboratory,
Department of Microbiology, University of Ilorin, P.M.B. 1515, Ilorin, Kwara State,
Nigeria, 1-8.
Fatimah, dan Nurhariyati, T. 2011. Eksplorasi Bakteri Proteolitik dan Lipolitik dari
Limbah Rumah Potong Hewan. Laporan Penelitian Hibah Riset Universitas
Airlangga. Universitas Airlangga.
Fiechter, A. 1992. Biosurfactants: Moving Towards Industrial Application. Trends in
Biotechnology. 10: 208–217.
Francy, D. S., Thomas, J. M., Raymond, R. I., dan Word, C. H. 1991. Emulsification of
Hydrocarbon by Subsurface Bacteria. J. Ind. Microbiol. Vol. 8. pp. 237-
246.Ghosh, P. K., Saxena, R. K., Gupta R., Yadav, R. P., and Davidson S. 1996.
Microbial Lipases: Production and Applications. Science Progress 79 (2), 119-157.
Hamza, U. D., Mohammed, I. A., Ibrahim, S. 2009. Kinetics of Biological Reduction of
Chemical Oxygen Demand from Petroleum Refinery Wastewater. Department of
Chemical Engineering, Ahmadu Bello University, Zaria, Nigeria. Hal. 1-7.
Khan J. A., and Sigh S. 2011. Evaluation of Oil Degradation Potential of Micrococcus
varians. International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology,
Vol 2, 1-6.
Lawrence, R. C., Fryer T. F. and Reiter B. 1967. The Production and Characterization of
Lipases from a Micrococcus and a Pseudomonad. University of reading; the
national institute for research in dairying, Shinjield, reading, Berkshire.
Leahy, J. G. and Colwell, R. R. 1990. Microbial Degradation of Hydrocarbons in The
Enviroment. Microbiology and Moleculer Biology Reviews Rev. 1990, 54(3):305.
Ni’matuzahroh, Supriyanto, A., Affandi, M. dan Fatimah. 2009. Bioremediasi Tanah
Tercemar Minyak menggunakan Konsorsium Mikroba. Laporan Hibah
Penelitian Strategis Nasional Tahun Anggaran 2009. Universitas Airlangga.
Surabaya.
Pruthi, V. and S. S. Cameotra, 1997. Rapid Identification of Biosurfactant Producing
Bacterial Strain Using a Cell Surface Hidrophobicity Techniques. Biotechnol
Technique. 11: 671-674.