genetica3.pdf

POLIMORFISMI DI LUNGHEZZA DI SEQUENZE SEMPLICI (SSLP)
Minisatelliti
• Noti anche come VNTR, cioè Ripetizioni in Tandem a Numero Variabile.
• Sono sequenze in cui l’unità ripetitiva è di circa 25 nucleotidi.
• La variabilità consiste nel numero di volte in cui sono ripetute.
• Non sono distribuite uniformemente su tutto il genoma ma più frequenti nelle regioni telomeriche. Alleli > 300 bp.
Microsatelliti
• Noti anche come STR, cioè Ripetizioni in Tandem Semplici.
• Sono sequenze in cui l’unità ripetitiva è più corta (2-4 nucleotidi).
• Sono distribuite più uniformemente in tutto il genoma, quindi più utili ai fini della applicazione in genetica.
• Gli alleli sono più corti rispetto a quelli dei minisatelliti (< 300 bp).
• Sono 6,5 x 10 5 in un genoma umano.
Analisi di microsatelliti mediante PCR
Il gene mutato è associato all’allele 4, il gene normale all’allele 7
In questo albero genealogico vengono seguiti un gene malattia dominante ed
un polimorfismo di microsatelliti.
• Rosso gli alleli polimorfici
• Nero soggetti affetti
• Bianco soggetti sani
Considerando che il soggetto II-1 è malato e ha genotipo 1/2, e che il gene in
esame è strettamente associato al locus polimorfico, si possono fare 2 ipotesi:
1. il gene malato è associato all’allele 1, il gene sano all’allele 2
2. il gene malato è associato all’allele 2, il gene sano all’allele 1
In seguito a ricombinazione, il gene mutato risulta essere
associato all’allele 7 invece che all’allele 4
I nonni sono entrambi deceduti, quindi non abbiamo informazioni sufficienti a capire quale delle due disposizioni è quella
giusta. Se analizziamo la progenie, notiamo che tutti i figli malati (tranne uno) portano l’allele 1, mentre i figli sani (tranne uno) portano
l’allele 2. In questi figli, gli alleli 3 e 4 derivano dal padre che è sano, quindi non sono rilevanti ai fini dell’analisi.
Figli
1. 1 – malato
2. 2 – sano
3. 1 – malato
4. 1 – malato
5. 2 – sano
6. 2 - malato
Ipotesi 1
• allele 1 gene malato
• allele 2 gene sano
Parentale
Parentale
Parentale
Parentale
Parentale
Ricombinante
Ipotesi 2
• allele 1 gene sano
• allele 2 gene malato
Ricombinante
Ricombinante
Ricombinante
Ricombinante
Ricombinante
Parentale
ipotesi 1
ipotesi 2
Nell’ipotesi 1, il risultato effettivamente osservato verrebbe ottenuto con un unico evento di ricombinazione. La frequenza di
ricombinazione è 1/6, cioè il 16,7%.
Nell’ipotesi 2, per ottenere il risultato osservato occorrerebbero 5 eventi di ricombinazione. Pur essendo più probabile l’ipotesi
1, non si può del tutto escludere l’ipotesi 2. Queste incertezze si possono esprimere utilizzando il LOD Score. Se la nonna fosse
disponibile, e se si stabilisse che il suo genotipo è 1-5, si potrebbe dire con certezza che in questa famiglia l’allele malattia è associato
all’allele 1.
21

SQUILIBRIO DA LINKAGE
La mutazione compare per la prima volta in un soggetto A3, B3/A4, B4 sul cromosoma che
porta gli alleli A3 e B3. Per effetto delle vicinanza del locus C rispetto al locus B, la mutazione
tenderà ad essere trasmessa ai discendenti insieme all’allele B3 (pochi eventi di ricombinazione tra
B e C). Invece, potranno verificarsi più crossing-over tra C e A, quindi nelle generazioni il gene
mutato si dissocia dall’allele A3 che era presente nel cromosoma originario.
Se il gene mutato è vantaggioso, si osserverà un aumento della frequenza dell’aplotipo
B3/C rispetto agli altri aplotipo possibili. Se la mutazione è svantaggiosa si osserverà il contrario.
POLIMORFISMI DI SINGOLI NUCLEOTIDI (SNP)
• Posizioni del genoma in corrispondenza delle quali alcuni soggetti hanno un nucleotide (ad es. G) ed altri uno diverso (ad es. C).
• Presenti in gran numero nel genoma (circa 1,4 x 10 6 ).
• Solo alcuni generano RFLP perché la sequenza nella quale si trovano non è riconosciuta da enzimi di restrizione.
• Possono essere evidenziati con metodi diversi dall’elettroforesi su gel.
Rivelazione di SNP mediante ibridazione in soluzione
22
Sonda specifica per un SNP, complementarietà
non totale con la sequenza normale.
Fluorocromo inibito, nessuna fluorescenza visibile.
Rivelazione di SNP su filtro mediante oligonucleotidi allele-specifici (ASO)
Perfetta complementarietà dovuta ad un SNP:
quando c’è ibridazione la sonda si apre.
Fluorocromo attivo, forte fluorescenza visibile e
misurabile per via strumentale.
SNP-1 SNP-2
La sonda specifica per SNP-2 non ibridizza con SNP-1 La sonda specifica per SNP-2 ibridizza con SNP-2
Ovviamente, la sonda specifica per SNP-1 darà un risultato complementare.
GENETICA DI POPOLAZIONI – LEGGE DI HARDY-WEINBERG
Condizioni di validità Premesse
1. Popolazione di dimensioni infinite
2. Panmissia, cioè incroci casuali
3. Assenza di mutazioni (o equilibrio)
4. Assenza di migrazione tra popolazioni
5. Assenza di selezione (tutti i genotipi hanno lo stesso successo riproduttivo)
1. Locus singolo con due alleli: A e a
2. Frequenza dell’allele A = p
3. Frequenza dell’allele a = q
4. p + q = 1
5. 1 – q = p
In una popolazione panmittica, le frequenze degli alleli e dei genotipi restano costanti di generazione in generazione e sono
facilmente deducibili. E’ più facile che la popolazione sia panmittica per un carattere non visibile come il gruppo sanguigno.

EQUAZIONE DI HARDY-WEINBERG
Dal momento che ciascun soggetto ha due alleli per un gene, la distribuzione dei genotipi alla generazione successiva è:
(p + q) 2
cioè
p 2 (AA) + 2pq (Aa) + q 2 (aa) = 1
Ogni soggetto della popolazione deriva dall’unione di due gameti nei quali i due alleli A ed a possono
presentarsi con probabilità p e q rispettivamente. Quindi, l’intera popolazione (quadrato di lato 1) è costituita
dalla somma delle frequenze dei tre genotipi possibili.
In caso di dominanza completa, i genotipi AA ed Aa avranno uguale fenotipo, quindi non saranno identificabili. In questo
caso, il calcolo delle frequenze può essere eseguito basandosi sui soggetti il cui genotipo è certo, vale a dire gli omozigoti per l’allele
recessivo aa.
Esempio
Su 100 soggetti è stata determinata l’appartenenza al gruppo sanguigno RH.
Risultati: RH + = 84
RH - = 16
Calcolo delle frequenze. 16 soggetti su 100 sono aa quindi q 2 = 16/100
quindi q = 16 / 100 = 4/10 cioè 0,4
di conseguenza p = 1 – q = 1 – 0,4 = 0,6
In caso di codominanza, i genotipi omozigoti ed eterozigoti avranno fenotipo diverso, quindi sono facilmente identificabili. In
questo caso, il calcolo delle frequenze alleliche può essere eseguito partendo dalle frequenze genotipiche e contando tutti gli alleli
presenti nella popolazione. Ciò fornisce un risultato più attendibile.
Esempio
Su 100 soggetti è stata determinata l’appartenenza al gruppo sanguigno MN (M ed N sono codominanti)
• Soggetti di gruppo M (quindi MM) = 32
• Soggetti di gruppo MN (quindi MN) = 48
• Soggetti di gruppo N (quindi NN) = 20
Gli alleli M presenti nella popolazione sono (32 x 2 + 48) / 200 = 0,56 = p
Gli alleli N presenti nella popolazione sono (20 x 2 + 48) / 200 = 0,44 = q
Esempio di locus con più alleli: il gruppo sanguigno AB0
• sia p = la frequenza dell’allele I A
• sia q = la frequenza dell’allele I B
• sia r = la frequenza dell’allele i
e la somma delle frequenze alleliche sia p + q + r = 1
p + q = 1
La distribuzione delle frequenze genotipiche è data dalla seguente tabella:
gruppo genotipo
frequenza
genotipo
frequenza
gruppo
0 ii r 2 r 2
A
I A I A
I A i
p 2
2pr
p 2 + 2pr
B
I B I B
I B i
q 2
2qr
q 2 + 2qr
AB I A I B 2pq 2pq
La frequenza dei soggetti di gruppo 0 è r 2 . Quindi, r equivale alla radice quadrata della frequenza dei soggetti di gruppo 0.
La frequenza dei soggetti di gruppo A è p 2 + 2pr.
La somma delle frequenze dei soggetti di gruppo A e di quelli di gruppo 0 è p 2 + 2pr + r 2 , cioè (p + r) 2 .
Quindi p + r = A + 0 e di conseguenza p = A + 0 - r
23

La frequenza dei soggetti di gruppo B è q 2 + 2qr.
La somma delle frequenze dei soggetti di gruppo B e di quelli di gruppo 0 è q 2 + 2qr + r 2 , cioè (q + r) 2 .
Quindi q + r = B + 0 e di conseguenza q = B + 0 - r
Esempio: in una popolazione, la frequenza dei fenotipi osservati è la seguente:
• gruppo A: 80
• gruppo B: 26
• gruppo 0: 90
• gruppo AB: 6
• TOTALE: 202
Calcolo della frequenza r dell’allele i: soggetti ii = 90/202
quindi r = 90 / 202 r = 0,66
Calcolo della frequenza p dell’allele I A : soggetti A + 0 = 170/202
quindi p + r = 170 / 202 = 0,917 p = 0,91 – 066 = 0,25
Calcolo della frequenza q dell’allele I B : soggetti B + 0 = 116/202
quindi q + r = 116 / 202 = 0,76 q = 0,76 – 0,66 = 0,1
Nel caso di caratteri legati ad X, un calcolo semplificato delle frequenze alleliche può essere effettuato partendo da un
campione di maschi.
Ad esempio, su un campione di 100 soggetti di sesso maschile, 9 sono risultati daltonici. Poiché il gene per il daltonismo
risiede sul cromosoma X e i maschi sono emizigoti per questo cromosoma, la frequenza dell’allele per daltonismo viene ricavata
direttamente dal numero di maschi daltonici:
• 9/100 è la frequenza di maschi daltonici
• la frequenza q dell’allele d è 9/100 = 0,09
• la frequenza p dell’allele D è 1 – 0,09 = 0,91
Nella popolazione dalla quale deriva il campione di maschi, le frequenze genotipiche delle donne sono date da:
• p 2 = 0,91 2 = 0,83 frequenza delle donne DD
• 2pq = 2 x 0,91 x 0,09 = 0,164 frequenza delle donne Dd (portatrici sane)
• q 2 = 0,09 2 = 0,008 frequenza delle donne dd (daltoniche)
Determinare se una popolazione è in equilibrio (secondo la legge di Hardy-Weinberg) per gli alleli di un determinato gene
L M e L N sono due alleli codominanti che determinano il gruppo sanguigno MN.
In un campione di 5961 americani di origine caucasica, si trovano le seguenti proporzioni:
La differenza tra Noss e Natt non è significativa (p=0,19), quindi la popolazione è in equilibrio.
Coefficiente di selezione (s): probabilità di un genotipo di non riuscire a riprodursi, dovuta alla selezione naturale:
• s = 0 tipo più adatto
• s = 1 carattere letale
Fitness: valore adattativo di un genotipo. Viene misurato dal suo contributo proporzionale di progenie alla generazione successiva ed
è uguale a 1 – s.
In una malattia autosomica recessiva, ad ogni generazione si perdono sq 2 geni patologici. Se la frequenza non diminuisce è
perché la perdita viene compensata da nuove mutazioni alla velocità di µ(1 – sq 2 ), dove µ è il tasso di mutazione per gene per
generazione. All’equilibrio, sq 2 = µ(1 – sq 2 ). Siccome q è piccolo, in pratica µ = sq 2 . Per la maggior parte dei geni, µ = 10 -5 – 10 -7 .
Esempio
La fibrosi cistica è una malattia rara, determinata dagli alleli F ed f, che colpisce in Italia 1/3250 neonati. Qual è la frequenza
dei portatori sani (Ff)?
• q 2 = 1/3250 = 0,00031
• q = 0,0175
• p = 0,9825
FFf = 2pq = 0,0344 cioè 1/29
24

• La probabilità che due Ff si incrocino è 0,0344 x 0,0344 = 0,0012.
• Tra i loro figli 1/4 sarà ff 0,0012/4 = 0,0003, cioè 1/3333, molto simile al 1/3250 osservato.
La fibrosi cistica in Inghilterra colpisce 1/2000 neonati.
• q 2 = 1/2000 = 0,0005
• q = 0,022
• p = 0,978
Portatori sani FFf = 2pq = 0,043 cioè 1/23
• La probabilità che due Ff si incrocino è 0,043 x 0,043 = 0,0018.
• Tra i loro figli 1/4 sarà ff 0,0018/4 = 0,0005, cioè 1/2000 come osservato.
Per la fibrosi cistica:
• s = 1
• q 2 = 0,0005
• quindi µ = 0,0005 = 5 x 10 -4 MOLTO IMPROBABILE. Il tasso di mutazione è troppo alto e ci sono prove che nuove mutazioni
compaiono molto più raramente.
Vantaggio dell’eterozigote
La frequenza relativamente elevata di alleli che determinano una ridotta fitness negli omozigoti è stata spiegando assumendo
che gli eterozigoti (Aa) abbiano una fitness più elevata rispetto ad entrambi gli omozigoti (AA ed aa). Nel caso della fibrosi cistica
(CF), si pensa che gli eterozigoti siano più resistenti agli effetti disidratanti di malattie che causano diarrea. Gli eterozigoti per HbS
(l’allele dell’anemia falciforme) hanno un’aumentata resistenza alla malaria.
Genotipo Frequenza prima della selezione Fitness o 1 – selezione Frequenza dopo la selezione
AA p 2 1-t p 2 (1-t)
Aa 2pq 1 2pq
aa q 2 1-s q 2 (1-s)
• t è il coefficiente di selezione contro il genotipo AA
• s è il coefficiente di selezione contro il genotipo aa
Dopo la selezione, le frequenze genotipiche sono cambiate. La nuova frequenza allelica viene calcolata come segue:
qdopo selezione = qds = [pq + q 2 (1 - s)]/(1 - p 2 t - q 2 s)
La variazione della frequenza allelica è la differenza tra q e qds, ovvero:
variazione di q = [pq + q 2 (1 - s)]/(1 - p 2 t - q 2 s –q) = pq(pt – qs)/(1 - p 2 t – q 2 s)
In una situazione all’equilibrio per vantaggio dell’eterozigote, la variazione della frequenza allelica da una generazione all’altra
dovrebbe essere nulla. Ciò significa che deve verificarsi una delle seguenti condizioni:
p = 0, o q = 0
o pt – qs = 0
se pt – qs = 0, allora pt = qs
poiché p = 1 – q, allora qeq = t/(s + t) e peq = s/(s + t)
Pertanto, all’equilibrio per vantaggio dell’eterozigote, le frequenze all’eliche sono determinate dai coefficienti di selezione.
Vantaggio dell’eterozigote
Nel caso della fibrosi cistica, siano s1 e s2 i coefficienti di selezione contro i genotipi FF ed ff.
All’equilibrio, p x s1 = q x s2, cioè s1 = q/p x s2
dato che p = 0,978; q = 0,022 e s2 = 1
s1 = 0,022
Fenotipi
FF 1 – s1 0,978
Ff 1 - 0 1,0
ff 1 – s2 0
La frequenza degli alleli f verrebbe mantenuta se gli eterozigoti Ff avessero, in media, 2,3% di figli in più rispetto agli omozigoti FF.
25

In condizioni di panmissia e in assenza di selezione, le frequenze alleliche e le frequenze genotipiche non cambiano di
generazione in generazione.
N° soggetti 350
Genotipo AA 180
Genotipo Aa 100
Genotipo aa 70
Fitness AA 1,0000
Fitness Aa 1,0000
Fitness aa 1,0000
Frequenza iniziale A 0,6571
Frequenza iniziale a 0,3429
In condizioni di selezione, gli alleli dannosi possono scomparire e quelli favorevoli fissarsi nella popolazione.
N° soggetti 280
Genotipo AA 100
Genotipo Aa 150
Genotipo aa 30
Fitness AA 1,0000
Fitness Aa 1,0000
Fitness aa 0,0000
Frequenza iniziale A 0,625000
Frequenza iniziale a 0,375000
Esempio di equilibrio bilanciato in una popolazione nella quale c’è vantaggio dell’eterozigote:
N° soggetti 282
Genotipo AA 100
Genotipo Aa 180
Genotipo aa 2
Fitness AA 0,9000
Fitness Aa 1,0000
Fitness aa 0,0000
Frequenza iniziale A 0,8156
Frequenza iniziale a 0,1844
26
EMOGLOBINE
Il 70% delle proteine nella cellula è costituito da emoglobine:
• prelevano ossigeno a livello degli alveoli polmonari e lo portano ai tessuti periferici;
• sono presenti nelle cellule in forma solubile.
Pseudogene: gene non più attivo.
Cromosoma 16 Cromosoma 11
Tra transizione da emoglobina fetale a emoglobina adulta avviene bruscamente al momento della nascita.
Esistono molte varianti dell’Hb che in diversa maniera riducono l’efficienza dell’emoglobina. Queste varianti vengono
mantenute perché rendono il globulo rosso più resistente ad alcuni parassiti come il plasmodio della malaria.

Numero di varianti di Hb
Tipo Numero
Varianti della catena alfa 199
Varianti della catena beta
Varianti della catena gamma:
335
• G-gamma = 38
• A-gamma = 20
68
• Ignote = 3
• Speciali = 7
Varianti della catena delta 28
Varianti con 2 sostituzioni amminoacidiche:
• alfa = 1
• beta = 17
Varianti a catene ibride 10
Varianti a catene più lunghe:
• al C-terminale = 9
• al N-terminale = 4
Varianti con delezioni (15); con inserzioni (4); con delezioni ed inserzioni (3) 22
TOTALE 693
Allineamento dei prodotti dei geni alfa
Allineamento dei prodotti dei geni beta delle globine
Al momento dello switch da emoglobina fetale a emoglobina
adulta, c’è una degradazione delle catene gamma che determina l’ittero.
Catena alfa dell’emoglobina
• Localizzazione: 16p13.3
• Dimensioni: 141 amminoacidi; 15126 Da
• Subunità: eterotetramero di:
• 2 catene alfa e 2 catene beta nell’emoglobina A
adulta (HbA)
• 2 catene alfa e 2 catene delta nell’emoglobina A2
adulta (HbA2)
• 2 catene alfa e 2 catene epsilon nell’emoglobina
embrionale Gower-2
• 2 catene alfa e 2 catene gamma nell’emoglobina
fetale (HbF)
• Dà il colore rosso al sangue.
• Appartiene alla famiglia delle globine.
Catena beta dell’emoglobina
• Localizzazione: 11p15.5
• Dimensioni: 146 amminoacidi; 15867 Da
• Funzione: coinvolta nel trasporto dell’ossigeno dai polmoni ai vari
tessuti periferici
• Subunità: eterotetramero di 2 catene alfa e 2 catene beta
nell’emoglobina A adulta (HbA)
• Ptm: il glucosio reagisce non enzimaticamente con l’N terminale
della catena beta per formare un legame chetoaminico stabile.
Questo accade lentamente e in continuazione durante la vita di
120 giorni del globulo rosso. Il tasso di glicosidazione aumenta nei
pazienti con diabete mellito.
• Ptm: S-nitrosilata; un gruppo di ossido nitrico è prima legato al
Fe(II) (o ione ferro) e poi trasferito al Cys-93 per permettere la
cattura dell’O2.
• Appartiene alla famiglia delle globine.
18
13
27

PRINCIPALI VARIANTI STRUTTURALI DELL’EMOGLOBINA
Emoglobine con nuove proprietà fisiche
HbS
HbC
Emoglobine instabili
Hb Hammersmith
Singola sostituzione nucleotidica (β 42 Phe Ser)
28
Varianti che causano anemie emolitiche
Polimerizzazione dell’HbS deossigenata, cellule falciformi, occlusione
vascolare ed emolisi: le cellule falciformi sono più suscettibili di rottura.
Tendenza alla cristallizzazione della HbC ossigenata, cellule meno deformabili,
blanda emolisi. Nei soggetti HbS:HbC fenotipo a cellule falciformi lieve.
Hb instabile, precipitabile, emolisi e bassa affinità per O2.
Hb Hyde Park
Emoglobine con alterato trasporto di O2
La sostituzione rende il ferro ossidato dell’eme resistente alla metemoglobina
Singola sostituzione nucleotidica (β 92 His Tyr) riduttasi. Questa HbM non trasporta O2. Cianosi nei portatori.
Hb Kempsey
Singola sostituzione nucleotidica (β 99 Asp Asn)
La sostituzione mantiene la Hb nella struttura ad alta affinità per O2. Poco
ossigeno ai tessuti, policitemia (se c’è un ridotto apporto di ossigeno, il midollo
produce più globuli rossi
Hb Kansas
La sostituzione mantiene Hb nella struttura a bassa affinità per O2.
Singola sostituzione nucleotidica (β 102 Asn Thr) Cianosi asintomatica nei portatori.
HbE
Varianti con fenotipo talassemico
La mutazione porta alla sintesi di una Hb anormale e ad una sintesi
Singola sostituzione nucleotidica (β 26 Glu Lys)
ridotta per difetto di splicing dell’RNA. Talassemia lieve.
Hb Lepore
Sintesi ridotta, talassemia grave negli omozigoti o in soggetti che
Crossing over ineguale tra i geni δ e b, proteina di fusione δβ,
di lunghezza pari a quella di una catena non-α
presentano anche alleli β-talassemici.
TALASSEMIE
Sono dovute ad un’alterazione quantitativa delle α o delle β globine:
• α-talassemie: difetto di produzione di α-globina
• β-talassemie: difetto di produzione di β-globina
Normale Talassemia α Talassemia β

Crossing-over ineguale e generazione di clusters alfa con uno e con tre geni:
Talassemia minor: asintomatico.
Eterozigote ββ 0
Eterozigote ββ +
↑
↓
29

Talassemia intermedia: sintomatico, ma non richiede trasfusione.
Due mutazioni lievi
Una mutazione molto lieve + α-talassemia o persistenza di HbF
Talassemia maior: sintomatologia grave, richiede
trasfusioni.
Omozigote β 0 β 0
Eterozigote β 0 β +
La mutazione dell’emoglobina E
30
Mutazioni nel promotore del gene β-globinico che danno origine a talassemia-β + :
Questa mutazione dà origine sia ad un’anomalia quantitativa, dovuta all’attivazione di un sito donatore di splicing criptico, sia
ad una qualitativa, poiché il messaggero maturo corretto contiene una lisina al posto di un acido glutammico, al codone 26. La A al
codone 26 è, almeno in apparenza, sufficiente ad attivare questo sito donatore di splicing alternativo, che viene quindi utilizzato il 40%
delle volte.
Meccanismi molecolari responsabili di HPFH
• In A sono mostrate 3 delezioni HPFH che rimuovono
grandi segmenti di DNA all’estremità 3’ del cluster βglobinico,
comprendente i geni dell’adulto. Tuttavia,
non tutte le delezioni di questo tipo sono responsabili di
HPFH, come mostrato dalle 3 mutazioni δβ-talassemia
rappresentate.
• In B sono indicate le localizzazioni di mutazioni
(numerate rispetto al sito di capping) nel promotore dei
geni G γ e A γ delle globine fetali, riscontrate in individui
con HPFH (indicati con la freccia sopra la linea).
Queste posizioni presumibilmente indicano la posizione
di importanti sequenze di controllo, ma nella maggior
parte dei casi non coinvolgono i comuni elementi del
promotore (CACCC, CCAAT o TATA). La barra al di
sotto della sequenza indica la posizione di una piccola
delezione in un paziente, che rimuove il secondo
CCAAT box.
MECCANISMO CONSEGUENZA