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Component Resolved Diagnosis (CRD): l’utilizzo dei componenti molecolari nella diagnostica allergologica in vitro
La diagnostica molecolare in allergologia: la richiesta del clinico e la
risposta del laboratorio; un approccio operativo utilizzando i test
riflessi
Giulio Vignati, Anna Fasolato, Antonietta Maronati
Centro Malattie Endocrine e Metaboliche, Ospedale “G. Fornaroli”, Magenta
RIASSUNTO Il significativo incremento di incidenza della patologia allergica in atto sta determinato un notevole
aumento delle richieste per le strutture specialistiche allergologiche con dilatazioni nei tempi di
accesso alle stesse che, in particolari periodi dell’anno, non sono compatibili con un corretta gestione clinica dei
pazienti. La necessità dei medici di medicina generale e/o dei pediatri di libera scelta di ridurre i tempi decisionali per
un corretto percorso diagnostico verso cui indirizzare i propri pazienti ed il significativo miglioramento delle potenzialità
operative del laboratorio nella diagnostica delle allergopatie ha determinato un maggior ricorso alle indagini in vitro
eseguibili in fase di approccio iniziale in presenza di manifestazioni cliniche da possibile causa allergica. Per affrontare
in maniera idonea tali situazioni è in atto da diversi anni nella nostra struttura ed in maniera più che soddisfacente per
tutte le componenti (paziente, medico richiedente, laboratorio, allergologo) un percorso che prevede l’esecuzione
iniziale di test di screening (Phadiatop o Phadiatop infant in funzione dell’età del paziente) seguita, in caso di positività
degli stessi, dall’esecuzione di un pannello concordato con gli specialisti. Con tale approccio si differenziano, con
tempistica molto rapida, circa il 50% dei pazienti come portatori di possibili sensibilizzazioni e quindi meritevoli di
approfondimento allergologico presso le strutture specialistiche cui invece non vengono indirizzati, a meno di
perdurante sospetto clinico, i pazienti negativi ai test di screening. La tradizionale diagnostica allergologica basata
sulla evidenziazione (in vivo) e quantificazione (in vitro) delle sIgE con l’utilizzo degli estratti allergenici è stata
recentemente affiancata dalla disponibilità di ricercare (soprattutto per la diagnostica in vitro) le diverse componenti
molecolari con l’utilizzo di allergeni specifici ottenuti con tecnica ricombinante (Component Resolved Diagnostics,
CRD). Tale possibilità sta introducendo (e sicuramente ne introdurrà in un prossimo futuro con l’utilizzo della
tecnologia su microarray come per il sistema Immuno-Sorbent Allergen Chip, ISAC) un indubbio cambiamento
nell’utilizzo da parte del clinico dei dati resi disponibili dal laboratorio: non solo una indicazione di possibile
sensibilizzazione nei confronti dei tradizionali allergeni ma chiare informazioni circa la reale componente molecolare
coinvolta nelle manifestazioni cliniche del paziente. La caratteristica peculiare di tali molecole allergeniche è proprio
quella di rappresentare singole componenti molecolari indipendentemente dalla fonte biologica di provenienza
(animale e/o vegetale, respiratoria e/o alimentare) e di consentire (soprattutto con l’utilizzo della tecnica ISAC) la
definizione di un profilo allergologico del paziente. Una insostituibile informazione per il clinico soprattutto nelle
diagnosi differenziali tra possibili co-sensibilizzazioni ed eventuali cross-reattività. Nel rendere disponibile ai nostri
allergologi tale opportunità abbiamo ritenuto proficua, in termini di adeguatezza delle determinazioni alla reale
necessità dei singoli pazienti, utilizzare lo stesso percorso già sperimentato con successo per la diagnostica con gli
allergeni estrattivi: l’utilizzo dei test riflessi automatici, eseguiti direttamente dal laboratorio in funzione dei valori
ottenuti sul singolo campione con la diagnostica tradizionale. Vengono eseguiti in maniera automatica i relativi
allergeni ricombinanti per concentrazioni dell’allergene estrattivo superiori a 1 KUA/L. In tal modo, previa scelta
adeguata degli allergeni estrattivi e dei relativi componenti molecolari da utilizzare, si evita l’esecuzione di dosaggi con
allergeni ricombinanti ove chiaramente non utile e si forniscono invece le informazioni adeguate ove la diagnostica con
allergeni estrattivi ne evidenzia la necessità. Nel contributo viene riportata la esperienza del nostro laboratorio relativa
al primo anno di attività con tale modello organizzativo evidenziando i dati epidemiologici ottenuti: Occorre precisare
che le scelte degli allergeni molecolari utilizzati ed i livelli di concentrazione per cui far scattare il test riflesso sono stati
scelti in maniera arbitraria ma concordata con gli specialisti allergologi (cui per altro sono destinati in maniera esclusiva
i risultati) e quindi oggetto di opportune revisioni periodiche alla luce delle esperienze man mano acquisite.
Parole chiave: Screening allergologici; Test riflessi; Allergeni molecolari; Component Resolved Diagnosis
ABSTRACT
Molecular diagnosis in allergology: clinical requests and laboratory answers; our
experience with reflex tests. The significant increase of allergic diseases in progress gives rise
to a similar increase of requests for allergists with a non acceptable delay, in particular seasons, on patients clinical
management. The General Practitioners (GP) need to reduce the diagnostic time and the best availability of laboratory
methods increase the requests of in vitro tests for preliminary definition of clinical suspects for allergic disease. In these
situations we decide to introduce, for the GP’s requests, a diagnostic protocol with, as first step, a screening test
(Phadiatop or Phadiatop infant in function of the patent’s age) and, with a screening positivity, automatic reflex test with
a agreed allergens panel. With this organization we are able, in a short time, to identify about 50% of patients as
sensitized and to orient them to allergist; patients with negative screening, in absence of clinical indications, are
investigated for others purposes. The traditional diagnostics for allergy based on evidence (with in vivo tests) or/and
quantification (with in vitro tests) of specific IgE with allergens extracts is evolving with molecular diagnostics with
recombinant allergens availability, in particular for in vitro determinations. This possibility is introducing (and more will
66 LigandAssay 15 (1) 2010

Component Resolved Diagnosis (CRD): l’utilizzo dei componenti molecolari nella diagnostica allergologica in vitro
be possible with microarray technology as the Immuno-Sorbent Allergen Chip, ISAC system) a significant change in
clinical use of laboratory data: not only indications about patients sensitization for a particular allergen but also
information about the molecular component clinically relevant (independently form biological source) for a differential
diagnosis within co-sensitizations or multi-sensitization and for a patients allergenic profile definition (more completely
with ISAC technology). Introducing Component Resolved Diagnostics (CRD) in our laboratory we have decided to
maintain the some organization model based on laboratory reflex test automatically performed when the extractive
allergens give a positive result with a concentration above 1 KUA/L. So, with a correct choice of extractive and
recombinant allergens, we can generally avoid CRD when not clinically helpful and perform it only when necessary. In
this paper we report our experience in the first year of activity with CRD and epidemiological data obtained. Is
necessary to specify that the type of recombinant allergens and the cut-off for reflex test employed are arbitrary, but
made in agreement with allergists and will be adjusted with cooperative experience
Key words: Allergy screening; Reflex test; Molecular allergen; Component Resolved Diagnosis
INTRODUZIONE
Negli ultimi anni si sta registrando un significativo
incremento nella incidenza (attualmente valutata a oltre il
20% della popolazione occidentale ma stimata a quasi il
50% nei prossimi 10 – 20 anni 1-4) delle malattie allergiche
e, di conseguenza, delle problematiche derivanti dalla
gestione dei pazienti con il sospetto clinico di tale patologia.
Contestualmente lo sviluppo metodologico e tecnologico
ha determinato un indubbio miglioramento delle
potenzialità operative del laboratorio relativamente alla
diagnostica in vitro delle allergopatie facendo assumere a
questo tipo di valutazione un ruolo di primaria importanza
nel percorso diagnostico del paziente allergico (o presunto
tale). In genere un paziente che si rivolge al proprio
medico curante segnalando segni e sintomi riconducibili
ad una problematica allergologica viene, nella maggioranza
dei casi, indirizzato verso una struttura specialistica di
allergologia, a volte anche per la sola ipotesi di esclusione
del ruolo della reazione allergica nelle sintomatologie evidenziate.
L’incremento quasi esponenziale delle richieste
crea in molte strutture specialistiche, particolarmente in
alcuni periodi dell’anno, un sovraccarico non gestibile in
tempi compatibili con un corretto e tempestivo soddisfacimento
delle necessità cliniche dei pazienti.
Tipicamente la diagnosi di malattia allergica prevede
indagini a diversi livelli di approfondimento con un ruolo
prioritario da assegnare, in ogni caso, alla valutazione clinico
– anamnestica del paziente. Proprio in relazione alle
tempistiche di accesso alle strutture specialistiche l’inquadramento
clinico iniziale ricade sempre più frequentemente
sul medico cui per primo viene posta la problematica: il
medico di medicina generale o, in funzione dell’età del
paziente il pediatra di libera scelta (in termini più familiari “il
medico di base”). In tale situazione risulta fondamentale la
possibilità di avere a disposizione strumenti rapidi ed affidabili,
gestibili direttamente dal medico non specialista, utili
ad orientare correttamente il percorso diagnostico del singolo
paziente: l’invio all’allergologo di chi realmente necessita
di questo specialista o la ricerca di altre cause e diversi
percorsi diagnostici nelle situazioni in cui si possa ragionevolmente
escludere la presenza di una malattia allergica.
La recente disponibilità di strumenti di approfondimento
legati all’utilizzo della diagnostica molecolare ha sicuramente
messo a disposizione degli allergologi uno strumento
estremamente potente in termini diagnostici e terapeuti-
ci ma indubbiamente, almeno in questa fase, di non facile
comprensione da parte di utilizzatori non specialisti.
In tale contesto ha assunto un ruolo significativo il contributo
derivante dalle indagini di laboratorio, eseguibili
praticamente senza tempi di attesa e in grado di fornire, a
fronte di una richiesta appropriata, informazioni utili ad un
corretto inquadramento della problematica allergica. In un
percorso diagnostico condiviso tra le varie componenti
coinvolte (paziente, medico di base, allergologo) il laboratorio
può assumere un ruolo centrale anche dal punto di
vista organizzativo fungendo da gestore e razionalizatore
delle richieste che spesso sono di tipo estremamente
generico, per altro dettate proprio dall’approccio iniziale
nei confronti del paziente.
COSA PUÒ OFFRIRE IL LABORATORIO
Ricordiamo che con il termine “allergia” intendiamo la
situazione in cui un individuo (con predisposizione genetica
e in particolari contesti ambientali) inizia a produrre
immunoglobuline di classe E specifiche nei confronti di
antigeni, abitualmente innocui, e che in quel determinato
paziente e nel particolare contesto divengono allergeni
(sIgE). Le manifestazioni cliniche che ne derivano sono
determinate dal legame a ponte che si stabilisce tra l’allergene,
nel momento in cui viene a contatto con l’organismo,
e le molecole di IgE presenti sulle cellule effettrici (fondamentalmente
mastociti e basofili) con conseguente liberazione
di mediatori dell’infiammazione (tipicamente istamina
e leucotrieni). Tale reazione immunologica viene definita,
secondo la classificazione di Gelle Coombs 5, di tipo I ed è
caratterizzata da una imponente reazione immunitaria cellulare.
La manifestazione allergica è spesso associata a
manifestazioni più tardive derivanti dalla attivazione degli
eosinofili e dei linfociti T allegene specifici.
Da questa successione di eventi e dalla disponibilità di
sistemi per misurare in maniera adeguata le sIgE risultano
facilmente intuibili le possibilità che le indagini di laboratorio
consentono per una corretta comprensione e valutazione
dei diversi componenti in grado di condurre alla manifestazione
della malattia allergica che, è opportuno ribadire,
rimane in quanto tale una diagnosi definitiva di tipo
esclusivamente clinico.
A fini esclusivamente classificativi e di schematizzazione,
come per altro evidenziato in maniera estremamente dettagliata
ed esaustiva nel contributo di Melioli in questa stessa
LigandAssay 15 (1) 2010 67

Component Resolved Diagnosis (CRD): l’utilizzo dei componenti molecolari nella diagnostica allergologica in vitro
parte monografica, possiamo suddividere le possibili indagini
di laboratorio nei diversi livelli di approfondimento (Tab. 1) 6.
Test specifici o di conferma
La ricerca e la quantificazione delle sIgE è sicuramente
l’indagine di laboratorio che fornisce il maggior contributo
informativo alla diagnostica allergologica. La prima metodica
di dosaggio disponibile (Radio Allergo Sorbent Test) 7, che
utilizzava dischetti di carta come supporto e 125I come tracciante,
pur se del tutto obsoleta continua a tutt’oggi a identificare
con l’acronimo corrispondente (RAST) molte delle
richieste che pervengono, in maniera del tutto inadeguata, al
laboratorio. L’evoluzione di questa metodica è passata attraverso
diversi passaggi significativi sia dal punto di vista
metodologico e strumentale che per quanto riguarda le
caratteristiche analitiche (sensibilità delle misure e accuratezza
della calibrazione) arrivando a fornire risultati quantitativi
e riferiti ad uno standard internazionale condiviso (2nd
IRP WHO IRP per IgE totali 75/502). Le più attuali metodiche
di determinazione delle sIgE utilizzano soluzioni strumentali
ad elevata automazione e produttività in grado di
fornire, anche se questo non è un aspetto prioritario per questo
tipo di richieste, i risultati entro la stessa giornata di campionatura
e fanno riferimento a sistemi di calibrazione tarati
sullo standard internazionale esprimendo i valori in KU A/L e
con intervalli di misurabilità estesi da 0 ad almeno 100
KU A/L. L’utilizzo di tali metodiche ha reso possibile superare
del tutto la tradizionale espressione dei valori in classi di
positività (nata agli albori della diagnostica in vitro per consentire
agli utilizzatori clinici un termine di confronto con la
diagnostica in vivo) per arrivare alla più corretta espressione
in termini di concentrazione e consentendo al clinico, attraverso
le specifiche curve di probabilità, di ricavare dal dato
analitico informazioni circa la probabilità che un certo livello
di sIgE per un dato allergene sia associato alla relativa
manifestazione clinica 8-10. In tal modo si può trasferire correttamente
un dato di laboratorio che esprime la possibile
presenza di sensibilizzazione dell’organismo verso un determinato
allergene, insieme agli altri parametri di valutazione,
alla corretta diagnosi clinica del paziente in esame.
Al momento la quasi totalità delle misurazioni delle sIgE
(come d’altro canto avviene per la diagnostica in vivo)
avviene con l’utilizzo di estratti allergenici. Tali preparazioni
Tabella 1
Indagini di laboratorio nelle allergopatie
sono costituite, in genere, da miscele di sostanze allergeniche
e non allergeniche ottenute per estrazione e purificazione
(più o meno accurata a seconda del materiale di partenza
e della tecnica di preparazione) da fonti biologiche definite.
La tradizionale misurazione delle sIgE con l’utilizzo
degli estratti allergenici rappresenta tutt’ora un passaggio
irrinunciabile nelle indagini di laboratorio ma un passaggio
generazionale nella diagnostica allegologica in vitro (cui
dovrà necessariamente seguire un analoga evoluzione per
quanto riguarda la eventuale immunoterapia desensibilizzante)
è rappresentato dalla possibilità di utilizzare, senza
particolari problemi metodologici o organizzativi da parte del
laboratorio, allergeni ottenuti con tecnologia ricombinante.
La caratteristica peculiare di tali molecole allergeniche è
proprio quella di rappresentare singole componenti molecolari
indipendentemente dalla loro presenza in un definita
fonte biologica (animale e/o vegetale, respiratoria e/o alimentare)
e di consentire la definizione del profilo allergologico
del paziente tramite la Component Resolved Diagnosis
o Diagnostics (CRD). La diagnostica molecolare si sta rivelando
di estremo interesse nelle problematiche differenziali
tra le possibili co-sensibilizzazioni e le eventuali cross reattività,
in particolare nei pazienti che risultino, con la diagnostica
tradizionale, come polisensibilizzati a pollini diversi o a
pollini ed alimenti. In tal modo il laboratorio è in grado di
porre nelle mani dello specialista strumenti utili a definire il
reale stato di sensibilizzazione del singolo paziente, a prevedere
la gravità di una possibile reazione allergica e le probabilità
di successo di una eventuale ITS 11,12.
Chiaramente questo tipo di determinazioni non può
prescindere, come per altro la diagnostica con allergeni
estrattivi, da sistemi analitici e metodiche dotati di adeguate
caratteristiche di sensibilità e di standardizzazione.
La sempre più estesa disponibilità per la diagnostica di
allergeni ricombinanti associata allo sviluppo di tecnologie
basate sui microarray 13 ha costituito la base per un ulteriore
passaggio verso una diagnostica ancora più sofisticata
(Immuno-Sorbent Allergen Chip, ISAC) di cui la applicazione
pratica è il sistema ImmunoCAP ISAC (Phadia AB,
Uppsala –SW) anche se, al momento, ancora riservata a
pochi laboratori (pur non presentando particolari problemi
dal punto di vista analitico) e, soprattutto, non di facile
gestione clinica da parte di molti specialisti. L’approccio è
sicuramente interessante dal punto di vista teorico: avere
Test aspecifici o di presunzione Test specifici o di conferma Indagini di approfondimento
Ricerca e conteggio granulociti eosinofili in:
- sangue periferico,
- secreto nasale,
- scrapings congiuntivali,
- liquido di lavaggio bronco alveolare
Dosaggio IgE totali
Dosaggio proteina cationica eosinofili (ECP) in:
- siero
- altri fluidi biologici
Dosaggio IgA specifiche
Dosaggio IgE allergene specifiche
- utilizzo allergeni estrattivi
- utilizzo allergeni ricombinanti
- utilizzo diagnostica su Microarray
(Immuno-Sorbent Allergen Chip - ISAC)
Dosaggio sottoclassi IgG
- short term sensiting (IgG-STS)
- IgG4 bloccanti specifiche
Caratterizzazione epitopica degli allergeni
(Immunoblot)
Ricerca allergeni crocianti (RAST inibizione)
Test rilascio mediatori chimici della flogosi
allergica
- istamina (EPX)
- metil istamina (U-EPX)
- mielo perossidasi granulocitaria (MPO)
- triptasi
Test di degranulazione dei basofili
Test di rilascio dei sulfido-leucotrieni (CAST)
Ricerca precipitine
68 LigandAssay 15 (1) 2010

Component Resolved Diagnosis (CRD): l’utilizzo dei componenti molecolari nella diagnostica allergologica in vitro
a disposizione un allergogramma completo del paziente
costituito da oltre 100 allergeni ricombinanti determinabili
in un unico passaggio analitico, su un unico campione e di
cui necessitano quantità ridottissime (20 μL). L’aspetto
che il laboratorio dovrà valutare, soprattutto in base a considerazioni
di appropriatezza e di costi (siano essi a carico
del sistema sanitario o direttamente dell’utente), riguarda
la reale necessità di testare in maniera sistematica tutti
gli allergeni (non è possibile per ora una selezione preventiva)
a pazienti per i quali la valutazione anamnestica e le
indagini precedenti hanno già escluso un coinvolgimento
di alcune tipologie di allergeni. Altra considerazione riguarda
l’aspetto della quantificazione dei risultati: si tratta di un
test semiquantitativo che potrebbe sembrare una involuzione
di quanto sino ad ora sostenuto dal laboratorio vale
a dire l’abbandono delle valutazioni in classi dei risultati
per una più corretta espressione quantitativa in KU/L.
Relativamente alla determinazione delle IgG e delle
relative sottoclassi (in particolare le IgG4 bloccanti specifiche)
le opinioni sono discordanti; appare proponibile il loro
utilizzo solo nel caso di necessità di valutare la avvenuta
risposta alla ITS specifica. Con tale presupposto potrà
assumere un ruolo l’impiego delle tecnologie ISAC in quanto
in grado, con idoneo microarray,di rilevare oltre alle sIgE
anche le sIgG con l’utilizzo di allergeni ricombinanti.
LA RICHIESTA DEL CLINICO E LA RISPOSTA
DEL LABORATORIO: LA NOSTRA ESPERIENZA
La diagnostica tradizionale
Una delle problematiche che affliggono il laboratorio
Figura 1
CMEM – Ospedale “G.Fornaroli”, Magenta: modello per richiesta indagini allergologiche in vitro
che si occupa di dosaggi allergologici in vitro è, da sempre,
la difficile interpretazione delle richieste che pervengono da
prescrittori non specialisti: termini come RAST, RAST completo,
allergeni inalanti e/o alimentari, indagini allergologiche,
sono di riscontro corrente sulle prescrizioni indirizzate
al laboratorio. Ne conseguono diverse possibilità di gestione
da parte del laboratorio: adesione letterale a quanto
indicato (con conseguente esecuzione, a volte interessata,
di un elevato numero di allergeni), rinvio del paziente al
richiedente per le opportune chiarificazioni (spesso non
ottenibili e sempre disagevoli per il paziente), tentativo di
interpretazione da parte del laboratorista (a volte basata su
una breve anamnesi volante eseguita in laboratorio e finalizzata
a ridurre lo spettro di allergeni da processare) 15.
Una via che, nella nostra realtà, stiamo percorrendo da
alcuni anni in maniera più che soddisfacente per tutte le
componenti (paziente, medico richiedente, laboratorio, specialista)
che hanno condiviso la messa a punto del percorso
si basa sulla disponibilità e sull’utilizzo dei test di screening;
Phadiatop con la versione pediatrica Phadiatop infant
(Phadia AB, Uppsala, SW) nella nostra realtà, ma potenzialmente
anche Alatop (Siemens Healthcare Diagnostics,
Products Limited, Llanberis, UK) o similari. Il prescrittore è
al corrente che in caso di positività del test di screening il
laboratorio procede direttamente alla esecuzione di un pacchetto
di allergeni concordato con gli specialisti e periodicamente
aggiornato in funzione delle prevalenze nella popolazione
della nostra area geografica e della età del paziente
(Fig.1). Nella Tabella 2 è riportato lo schema di approfondimento,
eseguito in maniera automatica, attualmente in uso
presso il laboratorio nel caso di positività dei test di screening.
La valutazione statistica delle incidenze relative all’ul-
LigandAssay 15 (1) 2010 69

Component Resolved Diagnosis (CRD): l’utilizzo dei componenti molecolari nella diagnostica allergologica in vitro
Tabella 2
Protocolli diagnostici per indagini allergologiche di laboratorio (utilizzati per richieste non specialistiche)
Richieste per test allergologici in bambini (0 – 5 anni) Richieste per bambini oltre i 5 anni ed adulti
Eseguito: PHADIATOP INFANT
=
Positivo
⇓
timo anno di attività ha evidenziato una prevalenza di positività
per i test di screening intorno al 45% dei pazienti afferenti
(Tab. 3) confermando i dati degli anni precedenti e
significando che, a meno di valutazioni cliniche che anche
in caso di test negativi ne suggeriscano l’invio allo specialista,
oltre il 50% dei pazienti indagati a livello del medico di
base non appare meritevole di una valutazione da parte dei
servizi specialistici di allergologia. Lo specialista che prende
invece in carico i pazienti con indicazione di sensibilizzazione
da parte delle indagini di laboratorio ha già a disposizione
i risultati relativi ai singoli allergeni concordati ricavandone
un orientamento che deciderà di approfondire secondo
le sue valutazioni; lo stesso specialista è al corrente che per
30 giorni dalla esecuzione del test di screening è disponibile
presso il laboratorio il campione residuale relativo al
paziente su cui potrà chiedere,ove ritenuto opportuno, la
determinazione di allergeni aggiuntivi senza necessità di
ulteriori accessi al laboratorio.
Questo percorso ci ha consentito di gestire in maniera
accettabile i tempi di accesso alle strutture specialistiche
Eseguito: PHADIATOPa + W1 Ambrosia elatior
=
Positivo
⇓
Alimenti + PHADIATOPa + W1 Ambrosia elatior G2 Cynodon dactylon G5 Lolium perenne
F1 albume = W5 Artemisia absinthium W9 Plantago lanceolata
F2 latte Positivo W19 Parietaria officinalis T3 betulla
F3 pesce
⇓
T9 olivo T23 cipresso
F4 grano G5 Lolium perenne
D1 Dermatophagoides pter. D2 Dermatophagoides far
F13 arachidi W5 Artemisia absinthium
E1 epitelio di gatto E5 forfora di cane
F14 semi di soia W19 Parientaria officinalis
M2 Cladosporium M3 Aspergiullus fumigatus
F25 pomodoro T3 betulla
M6 Alternaria tenuis
F27 carne di bue
D1 Dermatophagoides pter.
F35 patate
D2 Dermatophagoides far.
E1 epitelio di gatto
se F2 = Positivo
E5 forfora di cane
⇓
F76 α lattoglobulina
F77 β lattoglobulina
F78 caseina
M6 Alternaria tenuis
a) La scelta degli allergeni eseguiti in caso di Phadiatop positivo tiene conto, oltre che delle valutazioni epidemiologiche e di prevalenza relative alla
popolazione locale, delle reazioni crociate esistenti e documentate in letteratura tra le diverse famiglie di allergeni. Analogamente si è proceduto nella
scelta degli alimenti del profilo alimentare
ospedaliere (che per altro utilizzano il laboratorio anche in
maniera diretta con richieste mirate) e di mantenere, negli
anni, entro livelli decisamente contenuti la media di allergeni
testati per singolo paziente (6-7 allergeni/paziente).
La diagnostica molecolare
Nel momento in cui gli specialisti della nostra struttura
hanno evidenziato la esigenza di avere a disposizione,
oltre alle tradizionali risposte basate sugli allergeni estrattivi,
anche la valutazione delle componenti molecolari dei
diversi allergeni ci è parso doveroso, alla luce di quanto
ormai consolidato dalla letteratura 16, venire incontro alla
richiesta. Una volta verificato che, in funzione della metodologia
in uso presso il laboratorio per le indagini allergologiche
(ImmunoCAP 250, Phadia AB, Uppsala, SW), non
sarebbero insorti problemi dal punto di vista analitico
l’aspetto da definire rimaneva la modalità operativa con
cui gestire questo tipo di determinazioni.
Occorre ricordare che non appare al momento ipotiz-
Tabella 3
Incidenze di risultati positivi sui test di prima esecuzione relativi a pazienti inviati da medici di medicina generale e pediatri non specialisti: confronto
fra due periodi temporalmente distanti
Test eseguiti Phadiatop Phadiatop infant
Risultati n Pazienti positivi
(%)
Pazienti negativi
(%)
n Pazienti positivi
(%)
Pazienti negativi
(%)
Anno 2003 1180 44,6 55,4 338 44,4 55,6
Anno 2009 1315 47,8 52,7 530 47,8 52,7
70 LigandAssay 15 (1) 2010

Component Resolved Diagnosis (CRD): l’utilizzo dei componenti molecolari nella diagnostica allergologica in vitro
zabile (per considerazioni di diverso genere: disponibilità,
costi e per alcuni allergeni anche una minore sensibilità)
una sostituzione in toto degli allergeni estrattivi con quelli
ottenuti con tecnologia ricombinante. Unica eccezione a
tale paradigma, nella nostra realtà e per ora, la sostituzione,
su indicazione degli specialisti, dell’allergene estrattivo
per Ambrosia elatior (w1) con il corrispondente allergene
ricombinante Amb a 1 in grado di fornire direttamente
informazioni utilizzabili per eventuali decisioni terapeutiche.
Un percorso maggiormente condiviso prevede il
ricorso a tale tipo di determinazioni esclusivamente in
caso di positività ad alcune tipologie di allergeni estrattivi.
In tale scenario ed in considerazione della positiva esperienza
acquisita con l’utilizzo dei test riflessi eseguiti direttamente
dal laboratorio in funzione del risultato dei test di
screening abbiamo proposto la stessa filosofia in uso per
la diagnostica basata sugli allergeni estrattivi anche agli
approfondimenti impieganti allergeni ricombinanti.
Alla luce delle informazioni della letteratura abbiamo
definito una serie di allergeni meritevoli di tale percorso di
approfondimento ed i relativi allergeni ricombinanti da utilizzare,
tramite applicazione automatica come test riflesso,
nel caso in cui gli allergeni estrattivi raggiungessero una
concentrazione di almeno 1 KU A/L (Tab. 4). Chiaramente
questa è da considerare una soglia del tutto arbitraria e
che dovrà essere verificata dopo l’acquisizione di sufficiente
esperienza nel loro utilizzo clinico. Come pure da
riconsiderare saranno le tipologie di allergeni ricombinanti
utilizzati in questa fase iniziale alla luce delle valutazioni
cliniche ottenute e delle ulteriori disponibilità di molecole.
La nostra attività
Ritenendo doveroso che il laboratorio, in quanto
responsabile dell’aspetto analitico e di refertazione della
diagnostica allergologica in vitro, fornisca agli utilizzatori,
in maniera sistematica le chiavi di letture dei propri referti,
a partire dalla esplicitazione della metodica utilizzata, al
sistema di standardizzazione e di interpretazione dei risultati
abbiamo predisposto per le indagini allergologiche
caratterizzate da positività ad almeno un allergene una
integrazione automatica del referto comprendente la curva
di probabilità (Fig. 2). Nel caso specifico dell’utilizzo degli
allergeni ricombinanti, stante la novità dell’argomento
abbiamo pensato potesse essere di aiuto, nella quotidianità
del loro utilizzo esplicitare, anche a costo di sembrare
ridondanti, il significato delle diverse componenti molecolari
indagate. (Fig. 3). L’analisi dei risultati ottenuti, ad un
anno di distanza dalla introduzione del modello organizzativo,
ha evidenziato, nonostante l’introduzione di un secondo
passaggio di approfondimento costituito dalla applicazione
dei test riflessi su alcuni allergeni estrattivi per livelli
di concentrazione superiori a 1 KU A/L, un mantenimento
del numero medio globale di allergeni per paziente.
Tabella 4
Approfondimento con allergeni ricombinanti (come test riflessi automatici) in funzione del relativo allergene estrattivo
Allergene estrattivo (con conc. sIgE > 1 KU A/L) Allergeni ricombinanti eseguiti
POLLINI - Graminacee
g 2 Cynodon datcylon - erba canina e/o g 205 r Phl p 1 (allergene maggiore)
g 5 Lolium perenne - loglierella g 215 r Phl p 5b (allergene maggiore)
g 210 r Phl p 7 (proteina legante il calcio)
g 212 r Phl p 12 (profilina)
POLLINI - Erbe varie
w 19 Parietaria officinalis - erba vetriola w 211 r Par j 2 (allergene maggiore)
POLLINI – Alberi
t 3 Betulla verrucosa - betulla e/o t 215 r Bet v 1 (proteina PR-10, allergene maggiore)
t 216 r Bet v 2 (profilina)
t 220 r Bet v 4 (proteina legante il calcio)
ALIMENTI DI ORIGINE VEGETALE - Rosacee
f 49 mela e/o f 419 r Pru p 1 (proteina PR-10, termolabile, omologo di Bet v 1)
f 95 pesca e/o f 420 r Pru p 3 (proteina per il trasporto dei lipidi, termostabile)
f 237 albicocca e/o f 421 r Pru p 4 (profilina)
f 242 ciliegia e/o
f 255 prugna
ALIMENTI DI ORIGINE ANIMALE – Crostacei
f 24 gamberi f 351 r Pen a 1 (tropomiosina)
ALLERGENI PROFESSIONALI
k 82 Latex - lattice k 215 r Hev b 1 (sensibilizzazione in portatori di spina bifida)
k 217 r Hev b 3 (sensibilizzazione in portatori di spina bifida)
k 218 r Hev b 5 (sensibilizzazione professionale)
k 219 r Hev b 6.01 (sensibilizzazione professionale)
k 220 r Hev b 6.02 (sensibilizzazione professionale)
k 221 r Hev b 8 (profilina)
k 224 r Hev b 11 (sensibilizzazione crociata a frutta tropicale)
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Component Resolved Diagnosis (CRD): l’utilizzo dei componenti molecolari nella diagnostica allergologica in vitro
Figura 2
CMEM – Ospedale “G. Fornaroli”, Magenta: esempio refertazione per determinazioni di sIgE
Figura 3
CMEM – Ospedale “G. Fornaroli”, Magenta: esempio di refertazione per determinazione di componenti molecolari di sIgE
72 LigandAssay 15 (1) 2010

Component Resolved Diagnosis (CRD): l’utilizzo dei componenti molecolari nella diagnostica allergologica in vitro
Per quanto riguarda i dati epidemiologici riferiti all’ultimo
anno di attività (aprile 2009 – aprile 2010) abbiamo
pensato di estrapolare alcune indicazione da sottoposte
alla valutazione degli specialisti che utilizzano tali parametri;
i dati nel dettaglio per i diversi gruppi di allergeni coinvolti
si possono evidenziare nella Figura 4. Come chiave
di lettura generale specifichiamo che il numero di allergeni
estrattivi testati derivano o dalla applicazione dei test
riflessi nel caso di Phadiatop o Phadiatop infant positivi
(considerando in tale valutazione il cut-off suggerito dal
produttore di 0,35 KU A/L) o da richieste mirate degli specialisti.
Come già specificato la soglia di positività degli
allergeni estrattivi utilizzata per l’attivazione dei test riflessi
relativamente agli allergeni ricombinanti è stata invece
Legenda:
a) % di positività (campioni con concentrazione > 0,1 KUA /L)
fissata, arbitrariamente, a 1 KU A/L mentre nella valutazione
di positività (a fini epidemiologici) si è utilizzato il cut-off
di sensibilizzazione di 0,1 KU A/L utilizzando il laboratorio la
curva di calibrazione ad alta sensibilità. Tali differenze nei
cut-off impiegati spiegano le apparenti incongruenze negli
istogrammi tra positività per allergeni estrattivi e numero di
ricombinanti testati. Relativamente alle diverse famiglie di
allergeni considerate possiamo notare le particolarità di
seguito riassunte.
Pollini: Graminacee
In funzione di considerazioni legate alla cross reattività
delle diverse graminacee nella valutazione di approfondimento
dei test di screening positivi abitualmente vengo-
Figura 4
CMEM – Ospedale “G. Fornaroli”, Magenta. Epidemiologia determinazioni componenti molecolari per sIgE nel periodo aprile 2009 –
aprile 2010
LigandAssay 15 (1) 2010 73

Component Resolved Diagnosis (CRD): l’utilizzo dei componenti molecolari nella diagnostica allergologica in vitro
no utilizzati solo due allergeni estrattivi (g 2 - Cynodon
dactilon e g5 - Lolium perenne) che sono risultati positivi
rispettivamente nel 66,6% e nel 74,4% della nostra popolazione.
Di tali pazienti il 43,2% è stato testato con gli allergeni
ricombinanti che hanno suggerito una reale sensibilizzazione
(positività agli allergeni maggiori delle graminacee)
nel 90,5 e 65,0% dei casi. Circa il 46% degli stessi è
però risultato positivo anche a profiline e/o proteine leganti
il calcio fornendo al clinico informazioni riguardo eventuali
decisioni terapeutiche.
Pollini – Erbe varie: Parietaria
Hanno evidenziato possibile sensibilizzazione a questo
allergene il 56,8% dei pazienti testati, di cui il 25,8% a
un livello tale da far scattare il test riflesso per l’allergene
molecolare prescelto (r Par j 2) cui sono risultati positivi il
45,4% dei pazienti. In realtà quindi solo 76 pazienti su 643
(11,8%) hanno evidenziato una sensibilizzazione specifica
verso la parietaria riducendo in maniera significativa i
potenziali candidati alla ITS che in maniera ottimale
andrebbe effettuata con il corrispondente allergene ricombinante.
Alimenti di origine animale: Crostacei –
gambero
Ancora più bassa la percentuale (23,7%) di pazienti
positivi all’allergene estrattivo e di questi solo 19 su 464
(4,1%) a livelli tali da giustificare il test riflesso per la tropomiosina,
risultata positiva nel 38,8% dei casi. Data le
importanti implicazioni di questo allergene in termini di reazioni
crociate e di prescrizioni dietetiche e comportamentali
potrebbe essere utile considerare, per questo allergene,
un abbassamento del livello di concentrazione dell’allergene
estrattivo con cui eseguire la diagnostica molecolare.
Lattice
La richiesta di esecuzione di questo allergene estrattivo
è molto mirata ed a carico quasi esclusivamente di prescrittori
specialistici (56 pazienti sugli oltre 3700 sottoposti
ad indagini allergologiche nel nostro laboratorio nel periodo
considerato, dei quali solo 13 costituenti il 23,2% sottoposti
ad indagine molecolare). In fase iniziale abbiamo
deciso, stante proprio la non elevata numerosità della
popolazione indagata di utilizzare un pannello di approfondimento
piuttosto ampio (7 allergeni ricombinanti) in grado
di fornire informazioni differenziate. Data la scarsità della
popolazione considerata non ci sembrano significative le
positività, per altro molto simili tra loro, riscontrate per i
diversi ricombinanti. Considerata però la utilità finale di
questa valutazione (esposizione professionale o potenziali
rischi per i pazienti in ambito chirurgico o odontoiatrico)
potrebbe essere sufficiente una valutazione in termini di
predittività negativa; in tal caso potrebbe essere superato
lo schema del test riflesso automatico da parte del laboratorio
chiedendo allo specialista di fornire direttamente indicazioni
circa gli allergeni molecolari da testare in caso di
positività all’allergene estrattivo in funzione dell’utilizzo clinico
per il singolo paziente. Ricordiamo che tale possibilità
è per altro possibile per tutti gli allergeni ricombinanti, da
parte dello specialista, a partire dalla richiesta iniziale.
Alimenti di origine vegetale - Rosacee
Apparentemente opposta la scelta per questa tipologia
di allergeni: più elevato il numero di allergeni estrattivi di
partenza anche se in pratica nella maggioranza dei casi è
coinvolta la mela (28% di positività), presente nel pannello
di base alimentare predisposto dai nostri specialisti ma
utilizzato come indagine iniziale, mentre per pesca, albicocca,
prugna e ciliegia si tratta in genere di richieste mirate
(positività dal 60 al 77%) e solo tre i ricombinanti applicati
(con la finalità di fornire indicazioni al clinico circa
eventuali restrizioni o indicazioni di tipo alimentare da fornire
al paziente).
Pollini – Alberi: betulla
Molto simili numericamente a quelle della parietaria le
incidenze delle positività per gli estratti allergenici relativi
alla betulla (53, 4% dei 675 pazienti testati in quanto positivi
ai test di screening con il 24,9% degli stessi testati con
allergeni ricombinanti. Sono stati scelti r Bet v 1 come marcatore
di sensibilizzazione specifica verso la betulla (positività
nel 80,9% dei casi) e di conseguente potenziale
buona responsività alla ITS (anche se occorre ricordare, in
funzione delle valutazioni cliniche, la omologia strutturale
di questa proteina PR-10 alla analoga r Pru p 1 delle
Rosacee) e due marcatori di sensibilizzazione aspecifica:
una profilina (r Bet v 2 con riscontro di positività nel 55,3%
dei casi) e una proteina legante il calcio (r Bet v 4 positiva
nel 19% dei nostri pazienti).
CONCLUSIONI
Queste considerazioni, di tipo esclusivamente epidemiologico
generale e non associate alla valutazione clinica
dei singoli pazienti, possono essere, in un proficuo rapporto
di collaborazione e di scambio di informazioni con gli
utilizzatori clinici dei nostri dati, la base per un confronto
con gli specialisti per valutare le scelte effettuate e, ove
ritenuto opportuno, modificarle in modo da ottenere il massimo
di informativa clinica dai risultati resi disponibili dalla
attività del laboratorio con elevati livelli di appropriatezza e
di efficacia.
Riteniamo che il modello utilizzato per introdurre nella
diagnostica clinica della nostra struttura il contributo innovativo
portato dalla diagnostica molecolare con l’utilizzo
degli allergeni ricombinanti possa essere considerato in
termini del tutto positivi sia per la organizzazione delle attività
del laboratorio che per la ricaduta di utilizzo da parte
dei servivi di allergologia. Sicuramente sono possibili interventi
di miglioramento e di aggiustamento, da effettuare in
maniera coordinata con gli specialisti mantenendo però
l’attuale schema di gestione basato sui test riflessi eseguiti
in maniera automatica dal laboratorio con l’obiettivo di
fornire al paziente i test di cui realmente ha necessità per
una corretta e tempestiva gestione delle problematiche cliniche
evidenziate. In un percorso di questo genere emerge
pienamente quello che dovrebbe essere il ruolo del
laboratorio nella moderna diagnostica: stimolo culturale ed
operativo per il clinico ad utilizzare le risorse più evolute
disponibili mettendo a sua disposizione le soluzioni più
semplici dal punto di vista organizzativo per la gestione
delle problematiche poste dai pazienti.
Rimane da definire, almeno nella nostra realtà, l’appli-
74 LigandAssay 15 (1) 2010

Component Resolved Diagnosis (CRD): l’utilizzo dei componenti molecolari nella diagnostica allergologica in vitro
cabilità della successiva evoluzione della CRD: l’utilizzo
della diagnostica molecolare con l’utilizzo del sistema
ISAC basato sulla tecnologia con microarray. Sicuramente
tale metodica diagnostica potrà trovare maggiore facilità di
applicazione ove il clinico avrà arricchito, con il contributo
del laboratorio, il corredo di strumenti diagnostici a sua
disposizione con la diagnostica molecolare basata sugli
allergeni ricombinanti.
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Per corrispondenza:
Dott. Giulio Vignati
Centro Malattie Endocrine e Metaboliche
Ospedale “G. Fornaroli”
Via Donatori di sangue, 50 - 20013 Magenta (MI)
Tel.: 02 93963326 - Fax: 02 97290981
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