Cortisolo libero urinario in LC-MS/MS: una valida ... - ELAS Italia

INTRODUZIONE
Il Cortisolo, il più importante glucocorticoide nell’uomo,
è sintetizzato, a partire dal colesterolo, dalle cellule della
zona fascicolata e reticolare del corticosurrene sotto l’influenza
dell’ACTH, a sua volta secreto dall'ipofisi dopo la
stimolazione da parte del CRH (Corticotropin Releasing
Hormone) prodotto dai nuclei sopraottico e paraventricolare
dell’ipotalamo in seguito a diversi stimoli (quali lo
stress). Il cortisolo esercita un effetto di feed-back negativo
sia sull’ipofisi (feed-back corto) che sull’ipotalamo
(feed-back lungo) 1.
Nell’uomo non affetto da patologie ipofisarie o a carico
della corticale del surrene, e in assenza di importanti
stress, vengono secreti giornalmente circa 20 mg di cortisolo.
Le quantità secrete variano in rapporto ad un ritmo
circadiano. Generalmente il picco massimo di secrezione
La Spettrometria di massa nel laboratorio clinico
Cortisolo libero urinario in LC-MS/MS: una valida soluzione ai limiti
dei dosaggi immunometrici
Silvia Persichilli, Jacopo Gervasoni, Andrea Cocci, Cecilia Zuppi, Cinzia Carrozza
Istituto di Biochimica e Biochimica Clinica, Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma
RIASSUNTO Il cortisolo è un marcatore diagnostico importante per la produzione di ormoni steroidei, e le sue
misure accurate sono necessari per la diagnosi corretta della funzione surrenale. Inoltre, la
misurazione del cortisolo libero è comunemente utilizzato nelle indagini di sindrome di Cushing Negli ultimi anni sono
stati proposti diversi metodi per l'analisi del cortisolo libero urinario e quelli immunometrici sono senz'altro i più diffusi.
Numerosi studi evidenziano tuttavia una scarsa accuratezza di questi metodi dovuta alla significativa cross-reattività
degli anticorpi utilizzati. Nelle urine, infatti, la presenza di composti con una struttura simile a quella del cortisolo,
responsabili dell'interferenza nei dosaggi, non è trascurabile. Numerose evidenze indicano che i valori ottenuti con
metodi immunometrici sono mediamente 2,6 volte più alti rispetto a quelli ottenuti con metodi di riferimento. La
spettrometria di massa, per le sue caratteristiche di accuratezza, precisione e sensibiltà rappresenta sicuramente una
risposta ai problemi degli immunodosaggi. Nel nostro laboratorio è stato validato un metodo LC-MS/MS per la
determinazione di cortisolo libero urinario. In questo articolo vengono riportati i risultati della validazione, la definizione
degli intervalli di riferimento e la valutazione dell'effetto di sostanze interferenti nella misura immunometrica e nella
misura LC-MS/MS. Sono inoltre riportati i risultati del confronto con il metodo precedentemente utilizzato di routine nel
laboratorio. Il metodo è rapido nella preparazione dei campioni, sensibile e accurato. Attualmente viene utilizzato di
routine nel nostro laboratorio per eseguire circa 2000 esami/anno.
Parole Chiave: Cortisolo; LC-MS/MS; Immunodosaggio
ABSTRACT
Urinary free cortisol by LC-MS/MS: an effective solution to the limits of immunoassays.
Cortisol is an important diagnostic marker for the production of steroid hormones, and its accurate
measurements are necessary for correct diagnosis of adrenal function. Moreover, the measurement of urinary free
cortisol is commonly used in the investigation of possible Cushing's syndrome. In recent years several methods have
been proposed for analysis of urinary free cortisol and those immunoassays are the most common. Numerous studies
show, however, poor accuracy of these methods due to the significant cross-reactivity of the antibodies used. In the
urine in fact the presence of compounds structurally similar to cortisol was not negligible Several papers reported that
the values obtained by immunometric methods are on average 2.6 times higher than those obtained with reference
methods. Mass spectrometry, for its characteristics of accuracy, precision and sensitivity certainly represents an
answer to the problems of immunoassays. In our laboratory an LC-MS/MS method has been validated for the
determination of urinary free cortisol. This article reports the results of the validation, the definition of reference ranges.
Moreover, LC-MS/MS measurements were compared with those obtained by the immunoassay previously used in the
laboratory. The method is rapid sample preparation, sensitive and accurate. It is now used routinely in our laboratory
to perform about 2000 exams/year.
Key-words: Cortisol; LC-MS/MS; Immunoassay
del cortisolo si verifica al momento del risveglio. Dal risveglio
fino alla sera la caratteristica di questa secrezione cortisolemica
è rappresentata dalla progressiva e costante
riduzione verso valori < a 5μg/dL.
Il bioritmo di secrezione del cortisolo e dell’ACTH, che
ha un andamento speculare rispetto al cortisolo, può subire
variazioni in conseguenza di un’alterazione del ritmo
sonno-veglia 2.
Nel plasma il cortisolo circola legato a delle proteine di
trasporto. La più importante è la transcortina o
Corticosteroid-Binding Globulin (CBG), una α-2-globulina
prodotta a livello epatico, che lega il 95% del cortisolo circolante
in condizioni normali. Il rimanente 5% costituisce
la frazione libera e metabolicamente attiva dell’ormone.
Quando il cortisolo viene prodotto in eccesso, la CBG
viene saturata e la quantità eccedente dell’ormone viene
legata labilmente all’albumina. L’emivita del cortisolo circo-
LigandAssay 17 (1) 2012 43

La Spettrometria di massa nel laboratorio clinico
lante è di circa 90-100 minuti; esso viene catabolizzato
principalmente dal fegato.
I principali metaboliti del cortisolo si generano per riduzione
del doppio legame e dei gruppi chetonici con formazione
di tetraidrocortisolo, tetraidrocortisone, cortolo e cortolone.
Questi metaboliti vengono secreti con le urine
coniugati con acido glucuronico e costituiscono circa dal
60 al 70% del cortisolo totale prodotto. Una piccola parte
del cortisolo prodotto (fino a circa 150 μg al giorno) viene
escreta come tale e rappresenta il cortisolo circolante in
forma libera che viene filtrato dal rene (cortisolo libero urinario,
CLU).
Dal punto di vista chimico strutturale il cortisolo contiene
un sistema tetraciclico di atomi di carbonio (ciclopentanoperidrofenantrene)
caratterizzato da due ossidrili (OH)
in posizione 11 e 21 e un gruppo chetonico (-C=O) in posizione
3 3,4.
A partire dai primi anni ’60 sono stati sviluppati diversi
metodi per la determinazione del CLU 5.
I primi metodi sviluppati si basavano sulla determinazione
del cortisolo mediante dosaggio di tipo radioimmunologico
ma, sia per problemi relativi allo smaltimento di
rifiuti radioattivi, sia per la complessità della metodica
sono stati quasi completamente abbandonati. I metodi
basati sulla cromatografia liquida ad alte prestazioni
(HPLC) sebbene più affidabili, si sono rivelati inadeguati
per problemi di scarsa sensibilità e di scarsa selettività
dovuta alla coeluizione di sostanze interferenti.
Attualmente i metodi più diffusi per la determinazione
del CLU sono gli immunodosaggi in chemiluminescenza,
basati sul riconoscimento mediante anticorpi diretti contro
il cortisolo. Numerosi studi condotti negli ultimi anni hanno
però evidenziato una serie di limiti riguardo i metodi immunochemiluminescenti;
limiti che portano a dubitare fortemente
dell’attendibilità dei risultati forniti 6-8. Il principale
problema è rappresentato dalla reattività crociata dell’anticorpo
nei confronti di molecole strutturalmente simili al
cortisolo come metaboliti del cortisolo stesso o steroidi sintetici.
Infatti l’anticorpo utilizzato in molti dei metodi immunochimici
riconosce il gruppo chetonico presente sul carbonio
3 caratteristico del cortisolo ma anche di numerosi altri
steroidi. La presenza di queste sostanze interferenti, in particolare
la frazione glucoronata, può essere limitata utilizzando
delle procedure di estrazione liquido/liquido. Queste
purificazioni , oltre ad essere molto complesse e lunghe
dal punto di vista operativo, permettono di eliminare solo
la frazione idrosolubile delle specie interferenti lasciando
nella fase organica (di solito diclorometano o etile acetato)
molte specie contenenti il gruppo chetonico responsabile
del legame con l’anticorpo e della conseguente reattività
crociata. La mancanza di uno standard interno per valutare
il recupero durante la fase di estrazione contribuisce
inoltre ad aumentare in maniera significativa la variabilità
dei risultati anche ottenuti con la stessa metodica.
I metodi immunochimici attualmente in commercio utilizzano
calibrazioni in matrice sierica anche per la determinazione
del CLU, e questo può essere considerato un
ulteriore limite in quanto le due matrici (sierica e urinaria)
presentano caratteristiche notevolmente diverse in particolar
modo per la presenza di sostanze interferenti (i
metaboliti del cortisolo, ad esempio, sono molto più diffusi
nella matrice urinaria).
I limiti attribuibili a questa metodica sono stati ben evidenziati
in uno studio recente nel quale i risultati ottenuti
con metodi immunochimici sono stati confrontati con quelli
ottenuti con metodi di riferimento (GC-MS, LC-MS) evidenziando
un importante sovrastima di risultati dei primi
rispetto ai secondi 9.
I recenti risultati dell’American College of Pathologists
Proficiency Testing Program hanno chiaramente evidenziato
l’inadeguatezza dei metodi immunochimici, ciò unito
alle indicazioni fornite dai clinici ha fatto emergere la
necessità di sviluppare metodi più affidabili.
Per le sue caratteristiche di specificità e selettività, la
spettrometria di massa tandem (MS/MS) rappresenta la
tecnica analitica ideale per risolvere questi problemi.
In questo lavoro viene descritto un metodo analitico in
MS/MS robusto, affidabile e adatto alla routine di un grande
laboratorio
MATERIALI E METODI
Reagenti
Acqua, metanolo, acido formico (LC-MS grade) sono
state acquistate da Baker (Mallinckrodt Baker Italia,
Milano). Cortisolo, prednisone, prednisolone, 17α-idrossiprogesterone,
11-deossicortisolo, deossicorticosterone
acetato sono stati acquistati dalla Sigma (Sigma-Aldrich,
Milano). Il Cortisolo-9,11,12,12-d 4 (arricchimento isotopico
>98%) è stato acquistato da Cambridge Isotope
Laboratories (Cambridge Isotope Laboratories Andover,
MA, USA). Le soluzioni madre di cortisolo e cortisolo-d 4
(2.7 mmol/L) sono state preparate in metanolo e conservate
a -80°C. Le determinazioni di CLU effettuate mediante
metodo immunochemiluminescente sono state eseguite
sul sistema utilizzato presso il nostro laboratorio (Modular
E, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim DE).
Soggetti
Sono stati selezionati campioni di urina delle 24 ore da
180 soggetti (18-65 anni, 100 maschi) apparentemente
sani arruolati come gruppo di controllo. Per la valutazione
dei valori patologici sono stati reclutati 50 pazienti provenienti
dal reparto di endocrinologia del nostro policlinico
(35-65 anni, 20 maschi). Tutti i campioni sono stati raccolti
dopo aver ottenuto il consenso informato dei soggetti
arruolati. Tutti i campioni sono stati suddivisi in due aliquote
e conservati fino al momento delle analisi in LC-MS/MS
e ECLIA, eseguite contemporaneamente.
Preparazione del campione
Sono state valutate due differenti procedure per la
deproteinizzazione del campione di urina, la prima basata
sul trattamento con solvente organico (metanolo), la
seconda sulla rimozione mediante filtri a taglio molecolare
(10 kDa cut-off).
Nella prima procedura una aliquota di 0,5 mL di urina,
dopo l’aggiunta di 50 ng di standard interno (corisolo deuterato)
viene trattata con 1 mL di metanolo. Dopo una vigorosa
agitazione su vortex il campione viene centrifugato a
12000g per 10 minuti e il sovranatante trasferito in una
44 LigandAssay 17 (1) 2012

provetta di vetro per autocampionatore.
Nella seconda procedura 0,5 mL di urina, dopo l’aggiunta
di 50 ng di standard interno (corisolo deuterato)
viene trasferita in una provetta dotata di un filtro a taglio
molecolare (Amicon Ultra, Millipore, Co. Cork, Ireland).
Dopo centrifugazione a 12000g per 10 minuti il filtrato
viene trasferito in una provetta per autocampionatore e 10
µL iniettati nell’HPLC.
Il confronto dei valori di CLU ottenuti con le due procedure
ha mostrato una completa sovrapposizione dei risultati,
tuttavia non prevedendo una diluizione del campione,
la metodica di deproteinizzazione con provette dotate di filtro
si è dimostrata più adatta alla routine.
Metodo LC-MS/MS
L’analisi cromatografica viene eseguita su una colonna
a fase inversa (BetaBasic C-18 150x2.1 mm; 5 µm,
Thermo Fisher, Palo Alto, CA, USA) con un gradiente di
due fasi (A:acqua, 0,05% di acido formico; B: metanolo,
0,05% di acido formico), al flusso di 0,200 mL/min alla
temperatura di 35° C, secondo il seguente schema: 0-1
min, 95% A; 1-8 min, 95%-30% A; 8-11 min, 30%-5% A;
11-12 min, 5%-95% A 12-16 min 95% A.
Il triplo quadrupolo opera in Selected Reaction
Monitoring (SRM) identificando il cortisolo con la transizione
m/z 363,2 121,1 (energia di collisione 16 eV) e il cortisolo
deuterato con la transizione m/z 367,2 121,1
(energia di collisione 25 eV). Il primo quadrupolo ha operato
sempre in alta risoluzione (0,4 a.m.u. FWHM, Full
Width Half Maximum).
Tutte le misure sono state eseguite su un HPLC Accela
(Thermo Fisher, Palo Alto, CA, USA) accoppiata ad uno
spettrometro di massa TSQ Quantum Access (Thermo
Fisher, Palo Alto, CA, USA) equipaggiato con una sorgente
APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization).
Validazione
La validazione del metodo ha riguardato misure di
linearità, limite di detezione (LOD), limite di quantificazione
(LOQ), effetto matrice, recupero, imprecisione, accuratezza,
studi di interferenza, valutazione degli intervalli di
riferimento. Il metodo è stato inoltre confrontato con il
metodo in uso nel laboratorio.
La linearità è stata valutata diluendo serialmente la
soluzione madre di cortisolo in un intervallo compreso tra
2 e 10.000 nmol/L. Il valore di concentrazione più basso
che fornisce una risposta 10 volte superiore al fondo strumentale
(S/N signal to noise ratio >10) viene definito LOQ.
Il valore di concentrazione più basso che fornisce una
risposta tre volte superiore al fondo strumentale (S/N
signal to noise ratio >3) viene definito LOD.
La curva di calibrazione a sei punti è stata preparata
aggiungendo concentrazioni scalari di cortisolo (0, 14, 27,
55, 110, 220, 441 nmol/L) e 50 ng di standard interno sia
ad una matrice urinaria che a metanolo. La curva di calibrazione
viene costruita riportando in ordinata il rapporto tra le
aree dei picchi del cortisolo e del cortisolo deuterato (d 0/d 4)
e in ascissa la concentrazione nominale. La valutazione dei
parametri della curva (R 2, pendenza e intercetta) viene
effettuata utilizzando il software in dotazione allo strumento
(Excalibur 2.0.7, Thermo Fisher Palo Alto, CA, USA).
La Spettrometria di massa nel laboratorio clinico
L’imprecisione del metodo è stata valutata utilizzando
tre campioni (basso, medio, alto) di urine. Per la valutazione
dell’imprecisione entro la serie, ciascun campione di
controllo è stato misurato 10 volte in un’unica seduta analitica,
mentre l’imprecisione tra le serie è stata valutata per
dieci giorni consecutivi misurando gli stessi campioni.
L’imprecisione totale è stata calcolata misurando i CV%
dei valori del controllo di qualità, per due sedute analitiche
al giorno per 30 giorni per un totale di 60 replicati.
L’accuratezza è stata valutata misurando la differenza
tra il valore teorico e il valore misurato nei tre campioni
(basso, medio e alto) di urine utilizzati per lo studio di
imprecisione. Il risultato dell’accuratezza, espresso come
percentuale, viene giudicato accettabile se la differenza
risulta essere inferiore al 15%.
Gli studi di interferenza sono stati eseguiti utilizzando i
5 composti (strutturalmente analoghi al cortisolo) che
mostravano una reattività crociata maggiore con l’anticorpo
utilizzato nel metodo ECLIA.
A diverse aliquote di uno stesso pool di urine, la cui
concentrazione di cortisolo era stata precedentemente
misurata con il metodo LC-MS/MS e con il metodo ECLIA,
sono state aggiunte quantità note (20 e 100 ng/mL) di ciascuna
di queste sostanze. Successivamente ogni aliquota
è stata analizzata con entrambi i metodi.
I risultati ottenuti utilizzando il metodo ECLIA sono stati
confrontati con quelli ottenuti utilizzando il metodo LC-
MS/MS mediante un’analisi di regressione lineare in
accordo con il metodo di Passing e Bablok 10. L’analisi
delle differenze tra i valori ottenuti con i due metodi è stata
eseguita utilizzando il metodo di Bland-Altman 11.
Il recupero è stato valutato suddividendo una aliquota
di urine in due frazioni. Alla prima è stata aggiunta una
quantità nota di cortisolo, quindi è stata deproteinizzata.
La seconda è stata prima deproteinizzata quindi addizionata
della stessa quantità di cortisolo della prima aliquota.
Lo standard interno è stato aggiunto solo prima dell’iniezione
ad entrambi i campioni. I risultati sono stati espressi
come rapporto delle aree cortisolo-d 0/cortisolo-d 4 e il recupero,
espresso come percentuale, è stato misurato come
differenza dei risultati ottenuti tra il primo e il secondo campione.
La misura è stata eseguita a 5 diversi livelli di concentrazione.
Effetto matrice
Lo spettrometro di massa è stato settato in modalità
highly selected reaction monitoring sulla transizione m/z
367,2 121,2. Una soluzione con concentrazione di 50
nmol/L di cortisolo-d 4 è stata infusa mediante una siringa
al flusso di 10 µL/min nello spettrometro di massa.
Contemporaneamente, acqua o un campione di urina preparato
come descritto precedentemente, è stato iniettato
nel sistema HPLC. Prima della sorgente APCI, grazie a
una valvola a T, il flusso proveniente dall’HPLC e quello
proveniente dalla siringa si miscelavano. Quando nel
sistema HPLC viene iniettata acqua, il cortisolo-d 4 infuso
nello spettrometro di massa genera una risposta stabile
nel tempo. Qualsiasi variazione del segnale APCI che si
presenta quando nel sistema viene iniettato il siero è considerata
come un effetto, positivo o negativo, dovuto alla
matrice urinaria.
LigandAssay 17 (1) 2012 45

La Spettrometria di massa nel laboratorio clinico
RISULTATI
Il metodo LC-MS/MS è lineare da fino alla concentrazione
di 10.000 nmol/L; il LoD è risultato di 2,0 nmol/L
mentre il LoQ di 7,0 nmol/L.
L’esperimento di post column infusion testimonia la
presenza di un contenuto effetto matrice che porta ad una
non significativa diminuzione del segnale in corrispondenza
del tempo di ritenzione del cortisolo.
Le curve preparate in metanolo e in matrice urinaria
sono completamente sovrapponibili come evidente in
figura 1.
Le equazioni delle due curve hanno valori di pendenza
e intercetta non significativamente differenti (Y cortisolo/cortisolo-d4=-0,18+0,05X,
r=0,997; Y cortisolo/cortisolo-d4=-0,05+0,04X,
r = 0,995; rispettivamente). Questo risultato suggerisce
che l’effetto matrice presente in misura ridotta, è adeguatamente
corretto dall’utilizzo dello standard interno. Infatti
la leggera diminuzione della risposta osservata quando la
curva viene preparata in matrice rispetto alla curva in solvente
organico, si riflette sullo standard di cortisolo e sullo
standard deuterato con la stessa entità, lasciando i rapporti
cortisolo-d 0/cortisolo-d 4 inalterati.
Gli studi sull’imprecisione hanno evidenziato un’imprecisione
entro la serie sempre inferiore al 5% e un’imprecisione
tra le serie con un valore massimo di 7,5% (riscontrato
per il controllo basso). L’accuratezza, misurata sugli
stessi campioni è risultata sempre maggiore dell’85%.
La figura 2 mostra il grafico di Bland-Altman relativo ai
valori di CLU misurati mediante metodo ECLIA e mediante
metodo LC-MS/MS. Dal grafico emerge chiaramente
come il metodo ECLIA sovrastimi i valori di CLU rispetto a
quello in LC-MS/MS e questo fenomeno aumenta al crescere
dei valori di cortisolo.
La scarsa correlazione tra i due metodi risulta evidente
dal grafico della la regressione lineare tra i valori di CLU
misurati con i due metodi (Fig. 3). La curva di regressione
lineare, ottenuta in accordo con il metodo di Passing e
Bablok fornisce una pendenza di 1,51 (IC al 95% = 1,26-
1,75) un’intercetta di 29,22 µg/24h (IC al 95% = 37,48-
20,96) e un coefficiente di correlazione di 0,54.
I risultati dello studio di interferenza sono riassunti in
tabella 1. I valori di cortisolo, misurati mediante MS/MS
non sono significativamente differenti in seguito all’aggiun-
Tabella 1
Valutazione dell-effetto di molecole analoghe al cortisolo sulla misura
del cortisolo mediante metodo immunometrico e LC/MS&MS.
ng/ml
addizionati
LC-
MS/MS
Metodo
immunometrico
Cortisolo 0 10.1 25.9
Prednisone 20
100
Prednisolone 20
100
17 α-Hidroxyprogesterone 20
100
11-Deoxycortisol 20
100
Deoxicorticosterine
Acetate
20
100
10.9
11.6
10.2
10.7
9.7
10.8
11.0
10.0
10.6
8.9
67.1
73.0
88.5
141.2
83.1
107.8
90.2
112.9
92.3
100.0
Figura 1
Curve di calibrazione (n=6) preparate in acetonitrile (linea continua) e in
matrice urinaria (linea tratteggiata). Le curve sono ottenute riportando in
ordinata il rapporto tra le aree dei picchi del cortisolo e del cortisolo
deuterato (d0/d4) e in ascissa la concentrazione nominale (0, 14, 27, 55,
110, 220, nmol/441 L).
Figura 2
Confronto fra metodo LC-MS/MS e metodo immunometrico (ECLIA)
nella determinazione del cortisolo libero urinario secondo Bland Altman.
In ordinata sono riportate le differenze tra i valori ottenuti con il metodo
immunometrico e quelli ottenuti con il metodo LC-MS/MS, in ascissa è
riportata la media aritmetica tra i valori ottenuti con i due metodi.
Figura 3
Correlazione lineare secondo Passing e Bablok tra i valori di cortisolo
libero urinario ottenuti mediante il metodo immunometrico (ECLIA) e il
metodo LC-MS/MS. Pendenza: 1.51 (95%CI, 1.26-1.75). Intercetta: 29.22
µg/24h (95%CI, 37.48-20.96). Coefficiente di correlazione di 0.54.
46 LigandAssay 17 (1) 2012

ta delle sostanze interferenti. Al contrario gli stessi campioni
misurati con il metodo ECLIA mostrano dei valori completamente
differenti in seguito all’aggiunta di sostanze
che presentano reazione crociata con l’anticorpo.
Un caso interessante si è presentato quando è stato
confrontato il valore di CLU di un paziente al quale era
stato fornito un valore di CLU pari 4850 µg/24ore. Il valore
ottenuto con il metodo LC-MS/MS risultava invece nella
norma e pari a 6,3 µg/24 ore. L’analisi del tracciato cromatografico
(Fig. 4) indica la presenza di un picco a tempo di
ritenzione poco inferiore a quello del cortisolo con una
concentrazione approssimativa di 4000 µg/24 ore.
DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
Nel monitoraggio dell’attività surrenalica vengono
effettuati alcuni dosaggi mirati a valutare sia la stimolazione
del surrene (determinazione di ACTH) che la capacità
secretoria surrenalica (determinazioni del cortisolo serico
e della relativa frazione libera urinaria). Il cortisolo è presente
in circolo per più dell’80% legato ad a2-macroglobuline
dette transcortine o a globuline leganti i corticosteroidi
(CBG). Esse sono prodotte a livello epatico, anche sotto
stimolo degli estrogeni, e sono dotate di un singolo sito di
legame per la molecola di cortisolo. Il cortisolo è inoltre
legato dall’albumina in percentuale minore rispetto alle
La Spettrometria di massa nel laboratorio clinico
CBG (10%) e con bassa affinità 3,4.
In condizioni normali quindi la concentrazione plasmatica
di cortisolo libero è molto bassa (circa 0,3%). La molecola
legata alle proteine ha un’ emivita di circa 60-90 minuti,
ma è inattiva, e funge da riserva per la frazione libera
che rappresenta la quota attiva.
In generale il catabolismo del cortisolo avviene soprattutto
a livello epatico, attraverso sistemi enzimatici transferasici,
con formazione di glucuronidi di cortisone, 17-chetosteroidi
e diidro- o tetraidro-cortisolo (totalmente escreti
a livello urinario).
Il dosaggio del cortisolo urinario, eseguito sulle urine
delle 24 ore, viene espresso come concentrazione giornaliera
totale del cortisolo libero, e permette una visione integrata
e globale della secrezione nel periodo studiato (24
ore), con una valutazione attendibile dell’attività surrenalica
giornaliera.
Negli ultimi anni sono stati proposti diversi metodi per
la determinazione del CLU ma tra tutti, i metodi immunochimici
sono sicuramente i più diffusi perché sono completamente
automatizzati e presentano una sensibilità superiore
ai metodi HPLC.
Anche se negli ultimi 20 anni numerosi studi hanno evidenziato
che molti anticorpi forniscono valori falsamente
elevati di cortisolo, in particolare per CLU, questo aspetto
sembra essere stato sistematicamente ignorato. Solo
Figura 4
Tracciato cromatografico di un paziente con un valore di cortisolo ottenuto mediante metodo immunometrico pari a 4850 µg/24ore. Il valore ottenuto con
il metodo LCMS/MS risultava nella norma e pari a 6.3 µg/24 ore. L’analisi del tracciato cromatografico indica la presenza di un picco a tempo di ritenzione
poco inferiore a quello del cortisolo con una concentrazione approssimativa di 4000 µg/24 ore.
LigandAssay 17 (1) 2012 47

La Spettrometria di massa nel laboratorio clinico
pochi autori si sono preoccupati di convalidare i loro metodi
con metodi più affidabili come l’HPLC 6-9.
I metaboliti del cortisolo contenuti nelle urine infatti
mostrano reazione crociata con gli anticorpi utilizzati nel
dosaggio falsando il risultato che risulta in generale più
alto del valore osservato con i metodi di riferimento.
Negli ultimi dieci anni la MS ha assunto un ruolo sempre
più importante e si è candidata alla risoluzione di diverse
problematiche analitiche 12. I principali vantaggi di questa
tecnica sono l’elevata selettività e sensibilità. I problemi
connessi ai costi elevati e alle difficoltà di utilizzo sono
stati in parte superati con gli strumenti di ultima generazione.
Le sorgenti API che permettono di accoppiare la cromatografia
liquida alla MS favoriscono sicuramente l’entrata
di questa tecnica nel laboratorio di biochimica clinica,
infatti permettono la ionizzazione dei composti che eluiscono
dal sistema cromatografico senza richiedere procedure
di derivatizzazione per portare il campione in fase
gassosa come avviene per la gascromatografia.
L’analisi in H-SRM (Highly Selected Reaction
Monitoring) permette di selezionare in maniera altamente
selettiva solo gli ioni con rapporto m/z pari a 363,2 quindi
di frammentarli nel secondo quadrupolo e monitorare
esclusivamente la reazione di frammentazione che dallo
ione con m/z 363,2 genera il frammento con m/z 121,1.
Questo permette di escludere una buona parte di steroidi
che non soddisfano questi criteri di selezione. La presenza
di altri composti isobari, responsabili di possibili fenomeni
di interferenza nelle transizioni (cross-talk), è stata
risolta scegliendo delle condizioni cromatografiche tali da
permettere una migliore separazione del cortisolo da possibili
interferenti (Fig. 5).
La scelta di utilizzare, per l’analisi del CLU, una corsa
cromatografica più lunga rispetto ad altri metodi LC-
MS/MS proposti, rappresenta un vantaggio importante per
l’applicazione alla routine del nostro metodo. Infatti un
punto cruciale nella messa a punto di un metodo in MS è
rappresentato dalla valutazione dell’effetto matrice. Una
volta appurata la sua presenza è possibile limitarne l’effetto
con processi di purificazione del campione (SPE, estrazione
liquido-liquido) o modificando i parametri cromatografici.
La maggior parte dei metodi proposti per l’analisi del
CLU in MS/MS utilizza una purificazione del campione
mediante estrazione in fase solida. Questa procedura,
anche se può essere automatizzata, risulta economicamente
svantaggiosa.
Altri metodi propongono invece la purificazione del
campione mediante estrazione liquido/liquido (con diclorometano
o altri solventi), procedura meno adatta alla routine
13-16.
La strategia da noi scelta è stata quella di preferire una
Figura 5
Tipico cromatogramma Selected Reaction Monitoring (SRM) di cortisolo (363.2 121.1) in alto e cortisolo-d4 (367.1 121.1) in basso di un campione
di urina con concentrazione di cortisolo 64,9 µg/24 h.
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cromatografia più lunga a favore di una preparativa più
rapida, a nostro giudizio più vantaggiosa per i tempi della
routine. Le provette dotate di filtri a taglio molecolare ci permettono
di preparare un elevato numero di campioni, in
tempi molto rapidi, senza usare solventi neurotossici e con
costi contenuti. Questo rapido trattamento del campione
non influenza in maniera negativa la stabilità dell’analizzatore
di massa in quanto i primi tre minuti dell’eluato (che
contengono sostanze che potrebbero limitare la prestazione
dello spettrometro di massa) sono indirizzati verso lo
scarico.
La sovrapposizione delle curve di calibrazione (una
preparata in metanolo e una preparata in matrice urinaria)
evidenzia come l’effetto matrice, presente in misura ridotta,
è perfettamente corretto dall’uso dello standard interno
deuterato. Questo ci ha permesso di utilizzare curve
preparate in metanolo con grande vantaggio in termini di
praticità.
Lo studio di correlazione con il metodo immunometrico
ha evidenziato quanto già riportato da altri autori, mostrando
la grande sovrastima dei risultati dei metodi immunochimici
rispetto al metodo LC-MS/MS. Queste differenze sono
in parte riconducibili alla reattività crociata di alcuni derivati
idrossilati del cortisolo la cui concentrazione infatti
aumenta all’aumentare della concentrazione del cortisolo.
Gli studi di interferenza confermano che gli anticorpi
utilizzati nel metodo ECLIA presentano reattività crociata
in maniera significativa con steroidi strutturalmente simili
al cortisolo.
L’analisi dei risultati ottenuti su un campione di 180
soggetti apparentemente sani ha fornito un intervallo di
riferimento perfettamente sovrapponibile a quanto riportato
in altri lavori che utilizzano la spettrometria di massa per
l’analisi di CLU 17,18.
In conclusione il nostro metodo si è dimostrato specifico,
preciso, sensibile e rappresenta una valida soluzione
per risolvere i problemi legati ai dosaggi immunochimica.
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Per corrispondenza:
Dott.ssa Silvia Persichilli
Istituto di Biochimica e Biochimica Clinica,
Università Cattolica del Sacro Cuore
Largo A. Gemelli 8, 00168 Roma
Tel.: 0630154222 - Fax: 0630156783
e-mail: spersichilli@rm.unicatt.it
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