La Spettrometria di massa nella diagnostica di laboratorio - ELAS Italia

La Spettrometria di massa nel laboratorio clinico
La Spettrometria di massa nella diagnostica di laboratorio:
stato dell'arte e prospettive (Rassegna)
Gianluca Giorgi
Dipartimento di Chimica, Università degli Studi - Siena
INTRODUZIONE
La spettrometria di massa è una metodica che trova
sempre maggiori applicazioni in chimica clinica. Le pubblicazioni
su riviste scientifiche internazionali ne sono un
esempio: da circa 200 pubblicazioni all’anno nei primi anni
del 2000, si è assistito, a partire dal 2010, a un repentino
aumento fino a oltre 800 pubblicazioni per anno.
Questo notevole interesse è dovuto ai numerosi vantaggi
propri della spettrometria di massa: estrema sensibilità,
selettività e specificità, analisi di miscele complesse,
tempi di analisi ridotti, preparazione minima del campione,
alta efficienza, analisi qualitativa e quantitativa di
numerosi biomarcatori 1 in una singola analisi, ecc..
Lo screening neonatale, lo studio delle malattie
metaboliche, la determinazione dei livelli di farmaci e
biomolecole, lo studio di proteine, la mappatura di analiti
in tessuti tumorali sono solo alcune delle possibili
applicazioni in cui la spettrometria di massa riveste un
ruolo insostituibile nella moderna pratica di laboratorio
chimico-clinico.
Alcuni “miti” da sfatare e una terminologia ...
da imparare
Prima di addentrarci nel mondo della spettrometria
di massa dobbiamo fare chiarezza su alcuni punti
essenziali.
Sicuramente avrete sentito frasi del tipo: “Basta comprare
lo strumento. Poi è tutto automatico!”, oppure “Il
mio è uno strumentino che si autogestisce”. Tutto ciò è
assolutamente falso. Ovviamente l’acquisto della strumentazione
costituisce il primo passo, essenziale, per
poter condurre studi di spettrometria di massa.
La scelta del tipo di strumentazione non è banale.
Deve essere fatta in modo attento e oculato in base al
tipo di analisi che verranno condotte, alle molecole da
studiare, al tipo di informazione che si vuole ottenere, al
numero di analisi all’anno, al budget a disposizione,
ecc... 2. Non si devono acquistare spettrometri di massa
“alla moda” o quelli più costosi, che possono rivelarsi del
tutto inutili ed inefficienti per il tipo di problematica che
verrà affrontata, ma quelli che sono necessari al laboratorio
per risolvere le proprie esigenze.
Non solo nella scelta della strumentazione, ma anche
nell’attività di laboratorio è centrale e determinante la
figura di un operatore con una formazione solida, con
una profonda conoscenza e consapevolezza di ciò che
sta facendo, che gli permetta di condurre in modo appropriato
gli esperimenti, di progettarne di nuovi, di mettere
a punto nuove metodiche 3, di interpretare correttamente
i dati ottenuti.
Certamente oggi basta un click del mouse per gestire
una strumentazione che solo qualche decennio fa
richiedeva la regolazione di decine di parametri attraverso
manopole, interruttori, deviatori, ecc.. Oggi basta un
click, ma dietro a quel gesto deve esserci necessariamente
un sapere senza il quale quel click porterà a risultati
poco attendibili e di scarsa utilità.
Utilizzare correttamente uno spettrometro di massa e
saper interpretare i dati in modo razionale richiedono una
profonda conoscenza della strumentazione e dei processi
che avvengono durante l’esperimento. Basta forse
possedere uno spettrometro a risonanza magnetica
nucleare per poter essere un esperto radiologo e saper
fare diagnosi attendibili?
Con il diffondersi dell’utilizzo, si parla sempre più di
spettrometria di massa e la terminologia ha subìto strane
“deformazioni”. Sicuramente quella più diffusa in Italia è
l’uso dei termini “tandem mass”, “tandem max”, o “Tmax”,
che ci ricorda animali primordiali, che dovrebbero
essere totalmente eliminati dal linguaggio sia scritto che
parlato. La terminologia corretta in lingua italiana è “spettrometria
di massa tandem”, mentre è “tandem mass
spectrometry” in inglese.
Dalla provetta .... allo spettrometro di massa
La spettrometria di massa consente di poter identificare
un determinato analita e di determinarne la sua
quantità. Prima di essere introdotto nello spettrometro di
massa, il campione potrà subire una estrazione e una
purificazione preliminari 4. La scelta del tipo di esperimento
da effettuare dipende da vari fattori: dalla natura della
molecola che si vuole analizzare, dalla sensibilità richiesta,
dalla presenza di sostanze interferenti, dal numero di
campioni da analizzare, dal tipo di informazione che si
vuole ottenere. Tutto ciò determinerà la scelta dell’esperimento
più appropriato da condurre.
Al termine dell’esperimento si otterrà un risultato che
per essere affidabile richiede di aver fatto la scelta corretta
del tipo di esperimento e la sua corretta esecuzione.
Il dato sperimentale dovrà essere poi interpretato
correttamente. Tutto ciò richiede il possesso di una cultura
e di una solida formazione in spettrometria di massa.
Quasi sempre il campione da analizzare è costituito
da una miscela complessa per cui è richiesto un sistema
separativo interfacciato allo spettrometro di massa.
L’accoppiamento cromatografia-spettrometria di massa è
ormai di routine sia per quanto riguarda la gas cromatografia
5, che verrà utilizzata nel caso di miscele di molecole
volatili, che per la cromatografia liquida ad alte prestazioni
(HPLC) 6, l’elettroforesi capillare e la più recente
cromatografia liquida ad altissime prestazioni (UHPLC) 7
che sono utilizzate per la separazione di molecole polari.
A seconda del tipo di separazione utilizzata, saranno
impiegate le tecniche di ionizzazione più appropriate
(Tab. 1).
10 LigandAssay 17 (1) 2012

Tabella 1
Accoppiamento della spettrometria di massa con tecniche separative
per l'analisi di miscele.
Natura della
miscela
Tecnica
separativa
Metodo di
ionizzazione a
Molecole
volatili
Gas cromatografia (GC) EI, CI
Molecole polari Cromatografia liquida ad alte
prestazioni (HPLC)
Cromatografia liquida ad
altissime prestazioni (UHPLC)
Elettroforesi capillare (CE)
ESI, APCI, APPI
a EI = ionizzazione elettronica; CI = ionizzazione chimica; ESI =
ionizzazione electrospray; APCI = ionizzazione chimica a pressione
atmosferica; APPI = fotoionizzazione a pressione atmosferica
Figura 1
Lo spettrometro di massa.
molecola
(fase gassosa)
EI
- e –
Figura 2
La ionizzazione elettronica e uno spettro di massa caratteristico.
La Spettrometria di massa nel laboratorio clinico
LA SPETTROMETRIA DI MASSA
La spettrometria di massa8,9 studia gli ioni in fase gassosa,
ma nella pratica, quasi sempre manipoliamo molecole.
Ne consegue che il primo evento che deve accadere
all’interno di uno spettrometro di massa (Fig. 1) è la ionizzazione,
ovvero la trasformazione di una molecola in ione,
che avviene nella prima parte dello strumento: la sorgente
ionica.
Le tecniche di ionizzazione
Sono disponibili varie tecniche per ionizzare molecole
volatili (ionizzazione elettronica, EI e chimica, CI) e altre,
come l’electrospray (ESI) 10, la ionizzazione chimica a
pressione atmosferica (APCI), la fotoionizzazione a pressione
atmosferica (APPI), la ionizzazione laser assistita da
una matrice (MALDI) 10 per la ionizzazione di molecole
polari.
In base all’energia impiegata, le tecniche di ionizzazione
sono raggruppabili in due grandi categorie: hard e soft
(Fig. 2).
Tecniche di ionizzazione hard
Le tecniche di ionizzazione hard sono ormai limitate
alla sola EI che è in grado di ionizzare molecole apolari,
volatili, termostabili, a basso peso molecolare. Nella EI, la
molecola interagisce con un fascio di elettroni ad elevata
energia che, allontanando un elettrone dalla molecola,
producono lo ione molecolare M +•. Poiché l’energia in
gioco è elevata, lo ione molecolare ha un eccesso di energia
che dissipa attraverso la frammentazione (Fig. 2).
Gli spettri di massa ottenuti con la EI sono perciò
caratterizzati dalla presenza di molti ioni frammento, indispensabili
per l’identificazione e la caratterizzazione strut-
LigandAssay 17 (1) 2012 11

La Spettrometria di massa nel laboratorio clinico
turale di un determinato analita.
La frammentazione non è un processo casuale ma,
operando nelle stesse condizioni sperimentali, dipende
esclusivamente dalle proprietà chimico-fisiche delle molecole
11. Questo ha permesso la costruzione di numerose
banche dati di spettri EI, alcune generiche 12,13, e altre specialistiche
nei vari settori 14-18.
Tecniche di ionizzazione soft
Le tecniche di ionizzazione soft (Fig. 3) costituiscono la
gran parte delle tecniche di ionizzazione attualmente
impiegate in chimica clinica. Tra queste, l’ESI 10 e il
MALDI 10 consentono lo studio anche di grandi molecole
con peso molecolare di centinaia di migliaia di Dalton.
Nell’ESI la ionizzazione avviene ad opera di un potenziale
(4-5 kV) applicato a un capillare entro cui fluisce la soluzione
dell’analita (Fig. 4a), mentre nel MALDI la ionizzazione
avviene ad opera di un impulso laser che ionizza
una matrice la quale, a sua volta, ionizza l’analita (Fig. 4b).
Con l’impiego di tecniche di ionizzazione soft, gli spettri
di massa sono caratterizzati da molecole
Figura 3
Classificazione delle tecniche di ionizzazione e spettri di massa caratteristici per ciascun gruppo.
a b
soluzione
gas di nebulizzazione
kV
controelettrodo skimmer
PRESSIONE ATM. VUOTO
Figura 4
La sorgente electrospray (a) e quella MALDI (b).
analizz.
protonate/deprotonate e dall’assenza di ioni frammento
(Fig. 3). Poiché la frammentazione è indispensabile per
una analisi strutturale, e poiché nelle tecniche soft questa
non avviene nella sorgente, c’è la necessità di accoppiare
le ionizzazioni soft con la spettrometria di massa tandem
in modo da produrre frammenti nella zona degli analizzatori.
L’analizzatore: separazione degli ioni nello
spazio e nel tempo
Una volta formati, gli ioni devono essere analizzati,
ovvero si deve determinare il loro rapporto massa/carica
(m/z). Questo avviene ad opera dell’analizzatore (Fig. 1)
che costituisce una parte fondamentale dello spettrometro
di massa e da cui dipendono gran parte delle sue prestazioni.
Per separare gli ioni, gli analizzatori possono utilizzare
un campo elettrico, una radiofrequenza, un campo magnetico
o una loro combinazione (Tab. 2).
12 LigandAssay 17 (1) 2012

Tabella 2
Gli analizzatori e le loro caratteristiche.
Analizzatore Forza
Doppio fuoco
(EB, BE)
Quadrupolo
(Q)
Tempo di volo
(TOF)
Campo
magnetico +
campo
elettrostatico
Campo elettrico
+
radiofrequenza
Analizzatore Forza
Trappola ionica
(3D, 2D)
Cella a
risonanza
ciclotronica
(ICR)
Orbitrap
Campo
elettrico
Campo elettrico
+
radiofrequenza
Campo
magnetico +
campo
elettrostatico +
radiofrequenza
Campo elettrico
Separazione degli ioni nello spazio
Separazione
basata su
Momento +
energia cinetica
Stabilità/
instabilità
La Spettrometria di massa nel laboratorio clinico
m/z max Risoluzione
Accuratezza di
massa
10.000 10.000 < 10 ppm
2.000-4.000
Unitaria
(0.5 u
FWHM)
LigandAssay 17 (1) 2012 13
No
Velocità >100.000 >10.000 2-5 ppm
Separazione degli ioni nel tempo
Separazione
basata su
Frequenza delle
orbite
Frequenza delle
orbite
Frequenza delle
oscillazioni
armoniche
m/z max Risoluzione
Accuratezza di
massa
4.000 100.000

La Spettrometria di massa nel laboratorio clinico
A seconda di come operano, gli analizzatori sono classificabili
in due gruppi principali:
a) Analizzatori che separano gli ioni nello spazio: gli ioni,
mentre percorrono una determinata distanza, da pochi
centimetri a qualche metro, subiscono l’azione di una
o più delle forze citate. Appartengono a questa categoria
gli strumenti a doppio fuoco, il quadrupolo, il TOF.
b) Analizzatori che separano gli ioni nel tempo: gli ioni
sono intrappolati in una regione di spazio limitato
(pochi mm 3) nella quale subiscono l’azione di una o più
forze. Appartengono a questa categoria la trappola
ionica, sia tridimensionale che lineare, la cella a risonanza
ciclotronica, l’Orbitrap (Tab. 2).
Caratteristiche peculiari degli analizzatori sono l’intervallo
di valori di m/z che possono esplorare e la risoluzione
che sta assumendo notevole importanza in ambito chimico-clinico.
La risoluzione
La risoluzione è la capacità di un analizzatore di separare
ioni aventi valori m/z vicini. Può essere definita considerando
la separazione tra due picchi ad un determinato
valore di valle tra essi (Fig. 5a), oppure la larghezza di un
singolo picco a una determinata altezza (Fig. 5b).
m
a b
Figura 5
Risoluzione definita come valle tra due picchi (a) e come larghezza del
picco a metà altezza (full width at half maximum, FWHM) (b).
a b
La risoluzione dei vari analizzatori è riportata in Tabella
2. Una elevata risoluzione consente di aumentare notevolmente
la selettività e specificità dell’analisi eliminando le
specie isobariche interferenti (Fig. 6a). L’alta risoluzione è
requisito indispensabile anche per poter misurare la
massa accurata di uno ione con una significatività su quattro
cifre decimali da cui è possibile determinare la sua formula
bruta (Fig. 6b).
LA SPETTROMETRIA DI MASSA TANDEM
La spettrometria di massa tandem (MS/MS) è una
metodologia che interessa esclusivamente gli analizzatori
e impiega due o più stadi di analisi di massa per esaminare
selettivamente le frammentazioni di una famiglia di ioni.
Generalmente tali frammentazioni sono indotte da collisioni
con un gas (elio, azoto, argon, aria) che avvengono
all’interno di una cella di collisione (collision-induced dissociations,
CID), ma possono essere prodotte anche da
interazioni con fotoni, elettroni, superfici. Il termine “tandem”
si riferisce al numero di analizzatori. Come nel caso
della bicicletta tandem, il numero di analizzatori minimo
richiesto è due, ma ci possono essere spettrometri di
massa con tre, quattro o più analizzatori.
Tutto ciò è vero per gli analizzatori che separano gli
ioni nello spazio: ogni volta che si deve fare una separazione
di massa si deve aggiungere un analizzatore e una
cella di collisione. Perciò sono necessari un sistema di
analizzatori a doppio fuoco (analizzatore magnetico e analizzatore
elettrostatico), o un triplo quadrupolo (QqQ),
costituito da un quadrupolo (Q), una cella di collisione, che
è un quadrupolo a sola radiofrequenza (q) e un terzo quadrupolo
(Q), un accoppiamento TOF-TOF, o sistemi ibridi,
per esempio quadrupolo-TOF (QqTOF).
Nel caso di analizzatori che separano nel tempo, ne
basta uno: ad esempio, una trappola ionica è sufficiente
per poter effettuare esperimenti di spettrometria di massa
tandem. Non solo, ma con un singolo analizzatore che
separa gli ioni nel tempo è possibile effettuare separazioni
di massa anche superiori a due (MS n).
La spettrometria di massa tandem utilizza tre modalità
di scansione: scansione degli ioni prodotto (product ion
[C2H32O4N9] +
errore 0.2 ppm
R = 30.000 FWHM
Figura 6
Peculiarità dell’alta risoluzione: a) eliminazione delle specie interferenti nella determinazione del cloruro di metilene nel sangue 19
b) misura della massa accurata e determinazione della formula bruta.
14 LigandAssay 17 (1) 2012

Intensità relativa (%)
ESI (+)
MS
MS/MS
a b
Analizzatore 1 cella collisione Analizzatore 2
scan, Fig. 7a), scansione degli ioni precursore (precursor
ion scan, Fig. 7b) e scansione per identificare frammentazioni
che coinvolgono eliminazioni di specie neutre
(neutral loss scan, Fig. 7c). Tutte queste modalità sono
ampiamente utilizzate in chimica clinica insieme al monitoraggio
di una reazione di frammentazione (selected
reaction monitoring, SRM) o più reazioni (multiple reaction
monitoring, MRM).
Con l’utilizzo di tecniche di ionizzazione soft, la spettrometria
di massa tandem è un requisito pressoché indispensabile
per poter avere frammentazioni e quindi infor-
La Spettrometria di massa nel laboratorio clinico
Selezione dello Frammentazione CID Scansione degli ioni Scansione degli ioni Frammentazione CID Rivelaz. dello ione
ione precursore prodotto precursore prodotto
Si identificano tutti i prodotti dello ione precursore selezionato Si identificano tutti i precursori dello ione prodotto di interesse
Figura 7
Principali modalità di scansione in spettrometria di massa tandem.
c
Scansione degli ioni Framm. CID Scansione degli ioni prodotto
precursore con M dallo ione precursore
Si identificano le frammentazioni che coinvolgono eliminazioni di specie neutre
a
b
[M+H] +
[M+Na] +
mazioni strutturali (Fig. 8).
Ad esempio, la carnitina e tutte le acilcarnitine, a
seguito di butilazione e ESI positiva, se sottoposte a collisioni
con un gas formano, come prodotto finale di
decomposizione lo ione a m/z 85 (Fig. 9). Perciò, se si
vogliono identificare o quantificare la carnitina e/o le acilcarnitine,
è utile fare una scansione degli ioni precursori
dello ione a m/z 85.
Gli amminoacidi, a seguito di butilazione, ESI positiva
e collisioni con un gas eliminano formiato di butile,
specie neutra con peso molecolare 102 Da. Ne conse-
LigandAssay 17 (1) 2012 15
m/z
isolamento
m/z 556
ioni prodotto
Figura 8
Spettro di massa ESI(+) di un peptide (a) e spettro MS/MS (scansione degli ioni prodotto) ottenuto isolando lo ione a m/z 556 e sottoponendolo a collisioni
con elio (b).

La Spettrometria di massa nel laboratorio clinico
b
BuOH = CH3(CH2)2CH2OH
R = catena alchilica C2÷C20
gue che, se si vogliono identificare e quantificare gli
amminoacidi, sarà utile monitorare le frammentazioni che
coinvolgono l’eliminazione della specie neutra con PM
102.
L’accoppiamento dell’HPLC con la spettrometria di
massa tandem (HPLC-MS/MS) riveste un’importanza
sempre più crescente nella diagnostica di laboratorio 20-27.
PROSPETTIVE
BuOH
BuOH
H + H +
CID CID
Figura 9
Schema di dissociazioni indotte da collisione (CID) degli esteri butilici della carnitina (a) e delle acilcarnitine (b).
Le potenzialità applicative della spettrometria di massa
nella diagnostica di laboratorio e in chimica clinica sono
innumerevoli e fino ad oggi non pienamente utilizzate.
Negli ultimi anni si è avuto un interesse crescente
verso la ambient mass spectrometry 28,29, ovvero la messa
a punto di metodi di ionizzazione che non richiedono una
manipolazione preliminare del campione permettendo
tempi di analisi estremamente ridotti e alta efficienza.
Sicuramente qualcuno di questi entrerà nell’utilizzo routinario
dei laboratori di diagnosi e di chimica clinica.
La spettrometria di massa imaging, che permette non
solo di identificare e quantificare un determinato analita,
ma di determinarne la sua distribuzione spaziale all’interno
di un substrato, come ad esempio un tessuto, è già presente
in alcuni laboratori, ma sicuramente il suo utilizzo
sarà incrementato e esteso a un numero sempre maggiore
di biomarcatori.
Un’applicazione che presto entrerà nella routine diagnostica
è l’uso della spettrometria di massa direttamente
sul tavolo operatorio per circoscrivere in tempo reale la
zona di tessuto interessata da un tumore e quindi definire
l’area della sua asportazione 30,31.
La spettrometria di massa per affinità 32, per ora limitata
a poche applicazioni, potrà trovare maggiori utilizzi nella
diagnostica di laboratorio, come pure la ion mobility 33 che
permette di aggiungere un’ulteriore dimensione alla separazione
di miscele complesse.
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Per corrispondenza:
Prof. Gianluca Giorgi
Dipartimento di Chimica
Università degli Studi di Siena
Via A. Moro, 53100 Siena
Tel.: 0577234241 - Fax: 0577234233
e-mail: gianluca.giorgi@unisi.it
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