Determinazione degli intervalli di riferimento di ... - ELAS Italia

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Determinazione degli intervalli di riferimento di Troponina I
cardiaca, mioglobina e CK-MB nei neonati
Roberta Duca 1, Marco Bruno Rocchi 2, Nazzareno Filomeni 3, Oriano Tiberi 4, Enzo Pazzaglia 4, Giuseppe Bianchi 4,
Gianfranco Carnevali 1, Daniela Vandini 4
1 Facoltà di Scienze e Tecnologie, Università degli studi “Carlo Bo”, Urbino
2 Dipartimento di Scienze Biomolecolari, gruppo di Statistica Medica, Università degli studi “Carlo Bo”, Urbino
3 UO di Pediatria, Ospedale Santa Maria della Misericordia - ASUR 2, Urbino
4 UOC Diagnostica di Laboratorio, Ospedale Santa Maria della Misericordia - ASUR 2, Urbino
RIASSUNTO La diagnosi precoce di danno miocardico nel neonato rappresenta una sfida permanente per il
pediatra di terapia intensiva, sempre più frequentemente impegnato ad affrontare condizioni
avverse spesso associate a patologie cardiache neonatali quali le insufficienze cardiache causate da cardiopatie
congenite o acquisite e l’ischemia miocardica transitoria. In letteratura sono presenti poche pubblicazioni riguardo la
determinazione degli intervalli di riferimento sui neonati, perciò lo scopo di questo lavoro è stato quello di determinarli
per Troponina I cardiaca (cTnI), Mioglobina (Myo) e la frazione della creatina chinasi (CK-MB) nella popolazione
neonatale di Urbino (254 soggetti per CK-MB, 296 per il parametro Myo e 279 per il parametro cTnI). Per
l’elaborazione statistica si è proceduto dapprima a verificare la congruità dei dati con l’ipotesi di una distribuzione
normale gaussiana, sia globalmente che separatamente per maschi e femmine. In caso di distribuzione non
gaussiana, si è proceduto a un tentativo di normalizzazione dei dati mediante trasformazione logaritmica, seguito da
nuova verifica della normalità, e successivamente si è proceduto all’impiego di tecniche parametriche o non
parametriche. Come da letteratura, per Myo e CK-MB si sono utilizzati gli intervalli ai percentili 2,5 e 97,5, mentre per
cTnI ci si è limitati al 99o percentile. I risultati hanno confermato valori differenti rispetto a quelli indicati dal produttore
e dalla letteratura per l’adulto, nel dettaglio gli intervalli ottenuti sono: CK-MB maschi = 1,38-14,87 e femmine = 2,0-
11,42 ng/mL; Myo maschi = 10,74-67,43 e femmine = 12,41-66,42 ng/mL. I cut-off ottenuti per cTnI sono: maschi
0,065, femmine = 0,091 con un cut-off unico a 0,077 ng/mL.
Parole chiave: Intervalli di riferimento; Neonati; CK-MB; Mioglobina; Troponina I cardiaca
ABSTRACT Cardiac Troponin I, Myoglobin And Ck-Mb Neonatal Reference Ranges Estabilishment.
Early neonatal miocardic demage diagnosis represents a continue challenge for intensive care
units. Pediatrician, more and more facing adverse conditions related to neonatal cardiac diseases caused from
congenital or acquired cardiac diseases and transient myocardial ischemia. Few publications report neonatal reference
ranges, so the purpose of our study was to define them for cardiac Troponin I (cTnI), Myoglobin (Myo) and creatin
kinase fraction MB (CK-MB) in Urbino’s newborns (254 samples for CK-MB, 296 for Myo and 296 for cTnI).
These the steps we have followed in the statistical analysis: to verify the hypotesis for Gaussian distribution, even for
males and females; to normalize with logarithmic transformation the non-Gaussian distributions; to adopt both
parametric and non-parametric techniques. As per literature, we suggest 2,5° and 97,5° percentile for CK-MB and Myo,
and 99° percentile for cTnI. Obtained results confirm a difference with adults reference ranges or cut-off reported by
the manufacturer: CK-MB for males = 1.38-14.87 and for females = 2.0-11.42 ng/mL; Myo for males = 10.74-67.43 and
for females = 12.41-66.42 ng/mL; cut-off for cTnI: males = 0.065, females = 0.091 and unique at 0.077 ng/mL.
Key words: Reference ranges; Newborn; CK-MB; Myoglobin; Cardiac Troponin I
INTRODUZIONE
La diagnosi precoce di danno miocardico nel neonato
rappresenta una sfida permanente per il pediatra di terapia
intensiva, sempre più spesso impegnato ad affrontare
delle situazioni di emergenza, come frequenti parti difficoltosi
dovuti a gravidanze in età avanzata, o prematuri conseguenti
a trattamenti medici. Queste condizioni avverse
sono spesso associate a patologie cardiache neonatali
quali le insufficienze cardiache causate da cardiopatie
congenite (incidenza circa 1/4000 - 8000 nati vivi) o acquisite
(anomalie metaboliche) e l’ischemia miocardica transitoria
in neonati con asfissia prenatale e perinatale (incidenza
del 3-4/1000 nati vivi con valori più alti di 20-30
volte in Paesi sottosviluppati). Nonostante il continuo
incremento di queste condizioni, in letteratura sono pre-
senti poche pubblicazioni riguardo la determinazione degli
intervalli di riferimento di quelli che sono i marcatori di
lesione cardiaca neonatale.
E’ giusto chiedersi, a questo punto, se il neonatologo
in fase di elaborazione di una diagnosi neonatale, possa
far riferimento agli stessi intervalli di riferimento dei marcatori
cardiaci utilizzati per gli adulti.
Per tale motivo, lo scopo di questo lavoro sperimentale,
è stato quello di determinare gli intervalli di riferimento
di marcatori cardiaci, altamente specifici e sensibili, quali
la Troponina I cardiaca (cTnI), Mioglobina (Myo) e la frazione
della creatina chinasi (CK-MB) nella popolazione
neonatale utilizzando i nati in Urbino nel periodo ottobre
2009 - novembre 2010.
Le Troponine (cTnI e cTnT) sono considerate i gold
274 LigandAssay 16 (3) 2011

standard per la rilevazione della lesione del miocardio; tuttavia,
per quanto riguarda il periodo perinatale, ancora non
sono stati definiti gli intervalli di riferimento normali della
cTnI per i neonati, mentre pochissime riviste hanno riportato
le concentrazioni di cTnT materna e neonatale in condizioni
normali e patologiche 2.
Risulta comunque molto difficile fare una diagnosi neonatale
di una patologia cardiaca, soprattutto per il fatto che,
avendo appunto come pazienti dei neonati, questi non possono
fornire aiuto nell’esprimere il loro stato di salute. Oltre
al dosaggio di questi marcatori, attualmente, gli strumenti di
diagnosi di patologie cardiache sono l’auscultazione cardiaca,
la radiografia del torace, l’ecocardiografia, ecc..
Nello studio sono stati presi in considerazione i tre principali
marcatori di lesione miocardica anche se, nella maggioranza
dei casi, non è più consigliato il loro dosaggio contemporaneo
3.
MATERIALI E METODI
Selezione della popolazione di studio
In questo tipo di sperimentazione, il campione clinico
utilizzato era costituito dal residuo di siero di neonati, per i
quali veniva richiesto alla UOC Diagnostica di Laboratorio
la determinazione della bilirubina totale alla nascita (tempo
prelievo 0’ rispetto alla nascita), conservato poi come aliquota
a -20°C ± 5 fino al momento dell’utilizzo. I neonati
risultavano essere provenienti da gestanti di varie nazionalità
con settimane di gestazione comprese tra le 35 e 42
e nati sia da parto naturale che da taglio cesareo.
La selezione del campione è stata eseguita in accordo
con le linee guida dello standard C28-A2 del National
Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS),
oggi Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), le
quali hanno permesso di selezionare accuratamente i soggetti
sui quali effettuare poi la determinazione dei parametri
di cTnI, Myo e CK-MB e stabilire, quindi, i nuovi intervalli
di riferimento neonatali.
Dal punto di vista procedurale, nell’arco di tempo specificato
sono nati circa 400 bambini; 319 di essi sono stati
reclutati per lo studio in quanto rispondenti ai criteri di
esclusione e ripartizione stabiliti nel protocollo. (254 dei
319 sono stati utilizzati per lo studio del parametro CK-MB,
296 dei 319 sono stati utilizzati per il parametro Myo e 279
dei 319 sono stati utilizzati per il parametro cTnI). Le popolazioni
utilizzate derivano dalla eliminazione dei neonati
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con apparenti problematiche cardiache alla nascita, da settimane
di gestazioni inferiori a 35, da indice di emolisi superiore
a 2, dalla mancanza di informazioni relative al sesso
e dalla incongruenza tra i valori per singolo individuo.
Metodiche utilizzate
Per la determinazione del dosaggio dei tre marcatori
cardiaci, è stato utilizzato il sistema automatico
UniCel®DxI800 Beckman Coulter (Milano) che utilizza
metodi immunometrici con determinazione del segnale in
chemiluminescenza indiretta potenziata; dagli inserti di
prodotto forniti dalla ditta è possibile ricavare gli intervalli
di riferimento (applicabili a siero e plasma raccolto in eparina
di litio) di questi analiti e riguardanti soggetti adulti:
CK-MB = 0,6 - 6,3 ng/mL; Myo maschi = 14,7 - 105,7
ng/mL e femmine = 14,3 - 65,8 ng/mL; cTnI cut-off al 99o
percentile = 0,04 ng/mL 4-6.
Metodi statistici
Per l’elaborazione statistica si è proceduto dapprima a
verificare la congruità dei dati con l’ipotesi di una distribuzione
normale gaussiana, sia globalmente che separatamente
per le popolazioni maschile e femminile, utilizzando
sia metodi grafici (P-P plot) che inferenziali (Test di
Kolmogorov-Smirnov, KS).
In caso di distribuzione non gaussiana, si è proceduto
a un tentativo di normalizzazione dei dati mediante trasformazione
logaritmica, seguito da nuova verifica della normalità.
A seconda dell’esito di questa verifica, si è proceduto
all’impiego di tecniche parametriche (intervallo di normalità
sui dati trasformati e trasformazione inversa) o non
parametriche (metodo dei quantili di Efron).
Come da letteratura, per Myo e CK-MB si sono utilizzati
gli intervalli al 2.5° e 97.5° percentile, mentre per cTnI
ci si è limitati al 99° percentile.
Tutte le analisi sono state elaborate con SPSS 13.0
SPSS inc. (Chicago).
RISULTATI
Dall’analisi della caratterizzazione delle popolazioni in
esame, ed in accordo con il Pediatra di riferimento, non si
è ritenuto necessario effettuare l’elaborazione statistica e
la determinazione degli intervalli di riferimento in base alle
Tabella 1
Intervalli di riferimento per la popolazione neonatale della ASUR2 di Urbino. Gli stessi verranno introdotti nella refertazione della UOC Diagnostica
di laboratorio
Popolazione maschile
Popolazione femminile
Popolazione globale
n Limite
inferiore
127
127
277
CK-MB (ng/mL) Mioglobina cTnI (ng/mL)
1,38
2,00
limite
superiore
14,87
11,42
n Limite
inferiore
limite
superiore
n Cut-off
IC 95%: limiti di confidenza al 95%; NR: non riportato.
La sensibilità e la specificità indicano il valore di NGAL che massimizza la somma dei veri postivi più i veri negativi, quando questo valore è
reperibile nell’articolo.
LigandAssay 16 (3) 2011 275
149
147
296
10,74
12,41
67,43
66,42
139
140
296
0,065
0,091
0,077

Altri Contributi
A
B
Figura 1
CK-MB: Istogramma in trasformata logaritmica (log naturale) e relativa
interpolazione della normale gaussiana. A= popolazione maschile; B=
popolazione femminile
settimane di gestazione e alla razza, poiché non si sarebbero
evidenziate sostanziali differenze.
Nella Tabella 1 si possono osservare gli intervalli di
riferimento ottenuti e proposti per i tre marcatori cardiaci,
mentre nelle Figure da 1 a 3 ne sono riportati gli istogrammi
in trasformata logaritmica (log naturale) e le relative
interpolazioni della normale gaussiana suddivisi per sesso
dei neonati.
DISCUSSIONE
Per quanto riguarda la mioglobina, la prima cosa da
notare è che il limite superiore di riferimento indicato dal
produttore per la popolazione maschile adulta, non è
riscontrato e confermato né in letteratura 7 né nella routine
degli utilizzatori del metodo Access. Presso l’Ospedale di
Prato nel 2007, infatti, è stato introdotto il limite superiore
di riferimento della popolazione maschile con un valore di
68,2 ng/mL, che poco si discosta dal valore neonatale
ottenuto in questa sperimentazione.
Inoltre, il limite inferiore della popolazione femminile
risulta essere più alto di quello della popolazione maschile;
questo dato è dovuto quasi sicuramente ad una minore
dispersione della distribuzione del gruppo campione
della popolazione femminile.
Per discutere i dati relativi alla cTnI, è indispensabile premettere
che questo parametro richiede un comportamento
differente: si lavora infatti con un solo limite superiore di riferimento,
che dovrebbe, secondo le linee guida, coincidere
con il 99° percentile della popolazione di riferimento. E’ noto
che molti laboratori analisi utilizzano come cut-off il valore
276 LigandAssay 16 (3) 2011
A
B
Figura 2
Mioglobina (Myo): Istogramma in trasformata logaritmica (log
naturale) e relativa interpolazione della normale gaussiana. A=
popolazione maschile; B= popolazione femminile
A
B
Figura 3
cTnI: istogramma in trasformata logaritmica (log naturale) e relativa
interpolazione della normale gaussiana. A= popolazione maschile; B=
popolazione femminile

corrispondente al coefficiente di variazione del 10%, per
garantire l’affidabilità della misura, ma con le troponine di
ultima generazione questo può essere evitato. Con il
metodo utilizzato in questa sperimentazione, i campioni
possono essere misurati accuratamente nell’intervallo
analitico compreso fra il limite minimo di 0,01 ng/mL e il
valore del calibratore più elevato 100 ng/mL. Il valore
assegnato al 99° percentile per la TnI Access sulla popolazione
considerata risulta essere 0,04 ng/mL con corrispondente
CV pari al 14%.
Per quanto riguarda i dati del parametro cTnI, con il
Test KS (p = 0,995) non è stata osservata una differenza
significativa tra popolazione maschile e femminile, indicando
che le due popolazioni potevano essere trattate in
modo non separato; avendo comunque eseguito il test
anche separatamente, in realtà si è osservato sul 99° percentile
una certa discrepanza tra maschi e femmine che il
test KS non aveva evidenziato.
I dati in letteratura per quanto riguarda la differenza tra
maschi e femmine sono contrastanti, in quanto essa viene
o non viene osservata; inoltre, dove si osserva, non si
comprendono le cause della differenza, per la quale si
fanno varie ipotesi, tra cui un percorso differente di apoptosi
cellulare per i due sessi o una maggior sensibilità della
popolazione maschile a comorbidità 8-13.
Nel caso del CK-MB, il limite superiore di riferimento
osservato è sensibilmente più alto di quello degli adulti,
come osservato in precedenza da Trevisanuto con la
metodica Dade Behring (Siemens Healthcare-Milano)
(neonati: 11,97 ng/mL, adulti: >5 ng/mL). Inoltre, il limite
superiore di riferimento dei maschi risulta essere sensibilmente
più alto rispetto a quello delle femmine; questo dato
conferma quanto riportato nelle linee guida del 2007, che
raccomandano la differenziazione per sesso degli intervalli
di riferimento della CK-MB 3;14.
CONCLUSIONI
Dai dati ottenuti con le stesse tecniche analitiche nella
stessa popolazione ripartita in conformità a variazioni biologiche
(età, sesso), e trattati con metodi statistici robusti
per ottenere una stima corretta dei valori di riferimento dei
parametri cTnI, Myo, CK-MB, si evince che molto spesso,
come riportato ampiamente dalla letteratura, la strada per
ottenere campioni di popolazioni di riferimento numericamente
sufficienti e in tempi non lunghi non è sempre perseguibile,
per ragioni di costo, tempo, disponibilità di soggetti
idonei, e l’esempio della popolazione neonatale da
questo punto di vista è emblematico.
Secondo questa esperienza sperimentale, quindi, gli
intervalli di riferimento neonatali che verranno introdotti nel
referto della ASUR n.2 UOC Diagnostica di Laboratorio
Urbino sono riportati in Tabella 1.
Concludendo, si ricorda che questi dati sono il risultato
di un’elaborazione statistica della distribuzione dei valori
in una popolazione di riferimento, e questi stessi dati non
sono sempre, in tutte le situazioni, identificabili come limiti
decisionali.
Ringraziamenti: Si ringrazia la ditta Beckman Coulter
Diagnostici per aver reso disponibili i reattivi necessari alla
realizzazione del lavoro.
BIBLIOGRAFIA
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Per corrispondenza:
Dott.ssa Roberta Duca
UOC Diagnostica di Laboratorio,
Ospedale Santa Maria della Misericordia ASUR 2, Urbino
Viale Federico Comandino, 70 - 61029 Urbino (PU)
Telefono: 0722301290
e-mail: roberta_duca@yahoo.it
LigandAssay 16 (3) 2011 277