La somministrazione di Lactobacillus paracasei subsp paracasei ...

La somministrazione di Lactobacillus paracasei ssp. ceppo paracasei F19
ai neonati durante lo svezzamento
Effetti sull’Immunità Adattativa e sulla Funzione della Flora Batterica Intestinale
Christina West
1

TAVOLA DEI CONTENUTI
ABSTRACT………………………………………………………………………………………….7
ARTICOLI ORIGINALI…………………………………………………………………………….9
ABBREVIAZIONI NELLA SELEZIONE…………………………………………………………10
PREFAZIONE………………………………………………………………………………………11
PREMESSE........……………………………………………………………………………………12
FORMAZIONE DELLA FLORA BATTERICA INTESTINALE ……….............……………………………………12
Effetti dei fattori esogeni……………………………………………………………12
Gli acidi grassi a catena corta………………………………………………..…….14
LA FLORA BATTERICA INTESTINALE ED IL SISTEMA IMMUNITARIO…………………………….15
Il sistema immunitario intestinale…………………………………………………..15
La difesa immunitaria……………..……………..………………………………………….15
La tollerabilità orale…..…….……..………………………………………………………..16
L’influenza dell’immunità sulla colonizzazione intestinale..………....………………17
LA MALATTIA ALLERGICA……………………………………….………………………….18
Nomenclatura…………………………………………….………………………….18
Il concetto Th1/Th2, cellule T regolatorie ed attivazione delle cellule T……..…….19
La reazione di ipersensibilità IgE-mediata………….……………………………....22
La manifestazione atopica…………………………………………………………..22
La permeabilità intestinale nei soggetti allergici…………………………………...24
ALTERAZIONI DELLA FLORA BATTERICA INTESTINALE E MALATTIE…………………………...24
L’ipotesi delle condizioni igieniche…………………………………………………24
La flora batterica intestinale e l’allergia………………………………………...….24
I PROBIOTICI…………………………………………………………………………...…….25
Cenni storici e definizione…………………………………………………………..25
Sicurezza e linee guida………………………………………………………………26
Meccanismi d’azione proposti dei probiotici………………………………….……27
I probiotici nel trattamento delle malattie infettive……………………………...….28
I probiotici nel trattamento e nella prevenzione della malattia allergica…………..29
Lactobacillus F19.......................................................................................................29
Isolamento, colonizzazione e sicurezza.....................................................................29
Effetti immunologici in vitro e nei modelli animali....................................................30
OBIETTIVI........................................................................................................................................31
PAZIENTI E METODI......................................................................................................................32
DISEGNO DELLO STUDIO.........................................................................................................32
RISULTATI.......................................................................................................................................33
CARATTERISTICHE DEI PARTECIPANTI...................................................................................33
EFFETTI DELL’ASSUNZIONE DEI PROBIOTICI DURANTE LO SVEZZAMENTO SULLO STATO
FUNZIONALE DELLA FLORA BATTERICA INTESTINALE NEI NEONATI (PROTOCOLLO I)..........34
2

ABSTRACT
Introduzione: La composizione della flora batterica intestinale è stata associata a patologie
immuno-mediate. Il latte materno contiene una flora ricca di bifidobatteri e promuove la
colonizzazione da parte dei lattobacilli. I bifidobatteri ed i lattobacilli sono considerati salutari e
vengono utilizzati come probiotici, ossia integratori alimentari contenenti batteri vivi che, quando
ingeriti in quantità adeguate, esercitano sull’ospite benefici effetti. Nel corso dello svezzamento, il
sistema immunitario intestinale in via di sviluppo è esposto ad una varietà crescente di antigeni sia
di origine alimentare sia derivanti dalla flora batterica intestinale.
Scopi: Il nostro scopo era di valutare se l’assunzione giornaliera di 1x10 8 UFC del probiotico
Lactobacillus paracasei ssp. ceppo paracasei F19 (LF19) da parte di neonati definiti in buone
condizioni di salute dall’età di 4 mesi fino ai 13 mesi di età fosse in grado di mantenere alcuni dei
benefici effetti esercitati dall’allattamento materno sulla composizione della flora batterica
intestinale, con possibili effetti sulla funzione della flora intestinale, sull’attività’ delle cellule T,
sull’equilibrio immunitario tra risposta di tipo Th1 e di tipo Th2, e sull’incidenza di eczema.
Disegno dello studio: I neonati sono stati randomizzati all’assunzione giornaliera di cereali con
(n=89) o senza l’aggiunta di LF19 (n=90) dall’età di 4 mesi fino ai 13 mesi di età. La valutazione
dei risultati clinici è stata monitorizzata mediante diarie ed un questionario. Campioni fecali ed
ematici sono stati prelevati a 4, 6½, 9, 13 mesi ed a 5½, 6½, 12 e 13 mesi, rispettivamente. I
campioni fecali sono stati analizzati al fine di quantificare la presenza dei lattobacilli mediante
convenzionali metodi di coltura, mentre la presenza di LF19 è stata verificata mediante l’utilizzo
random della polymerase chain reaction (RAPD-PCR). La composizione degli acidi grassi a catena
corta (SCFA) fecali, che rappresenta un indice della funzionalità della flora batterica intestinale, è
stata determinata mediante cromatografia gas-liquido. In seguito all’attivazione policlonale o
specifica delle cellule T, i livelli di espressione dell’mRNA delle citochine [interleuchina 2 (IL2),
IFN-γ, IL4 ed IL10] sono stati valutati su mRNA isolato mediante real time reverse transcriptase-
PCR. Le concentrazioni sieriche degli anticorpi IgE totali e specifici, degli anticorpi specifici IgG
verso Haemophilus influenzae tipo b, la tossina difterica e quella tetanica sono state analizzate
mediante immunofissazione enzimatica.
Risultati: L’assunzione di LF19 ha mantenuto elevate conte fecali di lattobacilli durante lo
svezzamento. La persistente colonizzazione di LF19 ha determinato differenze nella composizione
degli SCFA fecali. L’incidenza cumulativa di eczema è risultata inferiore nel gruppo dei probiotici,
in associazione con un rapporto più elevato di mRNA per IFN-γ/IL4 nelle cellule T attivate in
maniera policlonale. Anche se è stato riscontrato un effetto da parte dell’LF19 sull’equilibrio
immunitario Th1/Th2, non è stato osservato alcun effetto sulla sensibilizzazione IgE. I neonati di
entrambi i gruppi hanno presentato un incremento della loro capacità di esprimere sia citochine di
tipo Th1 che Th2 nella seconda fase dell’infanzia, ma l’espressione risultava essere comunque
inferiore rispetto a quella degli adulti. I neonati appartenenti al gruppo dei probiotici hanno
mostrato a 13 mesi livelli di IL2 inferiori dopo l’attivazione policlonale delle cellule T rispetto ai
neonati appartenenti al gruppo placebo. I neonati che avevano assunto LF19 non hanno mostrato un
minor numero di infezioni, ma la durata del trattamento antibiotico e’ risultata inferiore rispetto a
quella nei neonati nel gruppo placebo. Inoltre, rispetto al gruppo placebo, la persistente
colonizzazione di LF19 migliorava la risposta vaccino-specifica verso gli antigeni proteici nel corso
delle vaccinazioni.
Conclusioni: L’assunzione di LF19 e’ risultata sicura, sulla base della mancata osservazione di
effetti avversi nel corso dello studio. I neonati di entrambi i gruppi hanno sviluppato una
maturazione della risposta immunitaria adattativa nel corso dello svezzamento. Integrare
l’alimentazione con i probiotici nel corso dello svezzamento riduce il rischio di sviluppo di eczema
di circa il 50% con un concomitante incremento del rapporto Th1/Th2. La riduzione dell’eczema
potrebbe essere spiegata dagli effetti dei probiotici sulla risposta immunitaria T cellulo-mediata e da
una rafforzata funzione della flora batterica intestinale.
3

PREMESSE
Formazione della flora batterica intestinale
La colonizzazione dell’intestino, in principio sterile, avviene immediatamente dopo la nascita e
dipende dai microrganismi che derivano dall’intestino della madre, dai microrganismi vaginali e
cutanei in associazione con alcune specie ambientali. E’ un processo complesso e multifattoriale
che si basa sulle interazioni tra l’ambiente, la dieta, fattori associati ai batteri ed all’ospite.
L’intestino di un neonato non è un ambiente anaerobio (assolutamente privo di ossigeno) e di
conseguenza la quota di batteri aerobi è superiore rispetto al resto della vita. I batteri aerobi
rappresentano una parte della normale flora batterica intestinale ma possono essere causa di
infezioni se traslocano in altre parti dell’organismo. La colonizzazione dell’intestino nelle prime
settimane di vita è dominata da batteri aerobi e da batteri anaerobi facoltativi. Nel momento in cui
l’ossigeno viene consumato, possono stabilirsi i batteri anaerobi. Molti batteri anaerobi sono
innocui e lottano per lo spazio ed i nutrienti contenendo il numero dei batteri aerobi ed anaerobi
facoltativi. Escherichia coli (E. coli) si ritrova tipicamente nelle feci ed è uno dei più frequenti
batteri anaerobi facoltativi presenti nell’intestino. Decenni fa, si riteneva che i batteri intestinali,
ossia E. coli, e gli enterococchi fossero i colonizzatori iniziali dell’intestino, seguiti dai batteri
anaerobi ossia i bifidobatteri, i Bacteroides e gli streptococchi (1). Dati recenti forniti da uno studio
prospettivo multicentrico europeo su una coorte di neonati, lo studio AllergyFlora, hanno
dimostrato che tra i batteri anaerobi facoltativi, gli stafilococchi coagulasi-negativi sono i primi
colonizzatori, seguiti dagli enterococchi. E. coli ed altri batteri intestinali, tradizionalmente
considerati colonizzatori precoci, compaiono tardivamente, e la maggior parte dei neonati vengono
colonizzati da E. coli non prima dei 6 mesi di vita. Infatti, lo Staphylococcus aureus (S. aureus) è
spesso di più frequente riscontro nei campioni fecali rispetto a E. coli durante i primi 2 mesi di vita.
Tra i batteri anaerobi, i bifidobatteri compaiono prima, seguiti dai clostridi e dai Bacteroides.
Questo indica che la colonizzazione da parte dei batteri fecali tipici, ossia E. coli, avviene
lentamente nelle società sviluppate, suggerendo una diffusione molto limitata dei batteri. In loro
assenza, i batteri che colonizzano la cute come gli stafilococchi e altri batteri che normalmente non
risultano essere dominanti nella flora batterica intestinale diventano i primi colonizzatori, indicando
una minor competizione da parte degli altri batteri intestinali (2, 3).
Effetti dei fattori esogeni
I fattori esogeni, ossia i fattori ambientali, le misure igieniche, il parto prematuro, il tipo di parto, le
terapie antibiotiche somministrate alla madre prima del parto o al neonato e la dieta, modulano le
dinamiche e l’esito della colonizzazione (4). Nei paesi in via di sviluppo, la colonizzazione
intestinale avviene precocemente e la flora batterica intestinale comprende un’ampia variabilità di
batteri con un più rapido ricambio dei ceppi batterici rispetto a quello che avviene nelle aree
industrializzate (5). La colonizzazione ad opera di E. coli, bifidobatteri e Bacteroides avviene
tardivamente nei bambini nati da parto cesareo, con un incremento della colonizzazione da parte dei
clostridi, della Klebsiella e dei batteri intestinali diversi da E. coli (2, 6). La somministrazione di
antibiotici alla madre in corso di gravidanza o al neonato nei primi 6 mesi di vita è legata ad un
ridotto rapporto dei batteri obbligati anaerobi rispetto ai batteri facoltativi (2).
Gli effetti della dieta sulla composizione della flora batterica intestinale iniziale sono stati studiati in
maniera approfondita. Sebbene non sia stato chiaramente dimostrato, si pensa che i neonati allattati
al seno abbiano una flora batterica dominata da bifidobatteri, la cui composizione differisce poco da
quella dei neonati svezzati con il latte in polvere (1, 4, 7). I bifidobatteri sono considerati salutari e
possono inibire la crescita di batteri patogeni in vitro (8). Il latte materno ha uno scarso potere
tampone rispetto al latte in polvere, è ricco di oligosaccaridi e può favorire la crescita dei
bifidobatteri (9). E’ stato suggerito che il latte materno possa anche fornire bifidobatteri e
lattobacilli (10, 11). I neonati svezzati con il latte in polvere sembrano sviluppare una flora batterica
intestinale più complessa, sebbene questo dipenda dalla composizione del latte in polvere. Nei
4

neonati svezzati con latte in polvere anaerobi facoltativi, Bacteroides e clostridi sono stati osservati
in maggiore quantità e con una frequenza più elevata rispetto ai neonati allattati al seno materno (1,
7, 12). I lattobacilli compaiono e scompaiono dalla nascita fino allo svezzamento, suggerendo un
fenomeno di colonizzazione transitoria (1, 2). Molti neonati sono nutriti in maniera mista (latte
materno + latte in polvere), ma si sa poco circa l’influenza di un’alimentazione mista sulla
composizione della flora batterica intestinale (13). Un piccolo studio longitudinale che includeva 11
neonati inizialmente allattati e poi svezzati con latte in polvere ha dimostrato un’elevata variabilità
inter-individuale della composizione della flora batterica intestinale, il mantenimento di elevati
livelli di bifidobatteri durante lo svezzamento e la maturazione della flora batterica intestinale fecale
(14). Al momento dell’introduzione di alimenti complementari, ossia alimenti solidi, la
composizione della flora batterica intestinale si modifica, con cambiamenti più pronunciati nei
neonati allattati al seno. Successivamente, la flora batterica intestinale si modifica ancora, fino ad
assomigliare a quella degli adulti all’età di due anni (Fig. 1) (12, 15). Tuttavia, si sa
sorprendentemente poco circa lo sviluppo della flora batterica intestinale durante il periodo
compreso tra la fine dell’allattamento e l’introduzione degli alimenti complementari, e degli effetti
esercitati da singoli alimenti in un determinato periodo (16).
Didascalia alla Figura 1. Illustrazione schematica dello sviluppo della flora batterica intestinale
durante i primi due anni di vita. Adattata da S Salminen et al, 2005 (15), e stampata con il permesso
dell’editore.
Breastfeeding= allattamento al seno
Weaning= svezzamento
Complementary food= alimenti complementari
Established gut microbiota= flora batterica intestinale definitiva
Increase in microbial diversity= aumento della variabilità dei ceppi microbici
Unculturable bacteria= batteri non coltivabili
Bifidobatteri
Anaerobi
Aerobi ed anaerobi facoltativi
Age (years)= età (anni)
Gli acidi grassi a catena corta
Lo studio della flora batterica intestinale richiede una metodologia composta. Un metodo prevede lo
studio dei prodotti metabolici dell’ecosistema microbico. L’attività metabolica della flora intestinale
è complessa e le sue attività biochimiche possono risultare più importanti per l’organismo
dell’ospite rispetto al numero dei singoli microrganismi a livello di un particolare compartimento
dell’intestino. I batteri metabolizzano i carboidrati non assorbibili in acidi grassi a catena corta
(SCFA), CO2 e H2 nel colon. Gli SCFA sono il prodotto intermedio o finale della fermentazione dei
carboidrati da parte di un gruppo di batteri nel colon. Sono acidi monocarbossilici con una catena
costituita da almeno 6 atomi di carbonio ossia acido acetico, propionico, butirrico, iso-valerico,
valerico, iso-caproico e caproico. La composizione fecale degli SCFA riflette lo stato funzionale
della flora batterica intestinale. Così, l’analisi degli SCFA rappresenta un metodo complementare ad
altri metodi consolidati per lo studio della composizione della flora intestinale (17). Evidentemente,
i due prerequisiti chiave per la formazione degli SCFA sono la presenza dei substrati e di una flora
batterica intestinale in grado di fermentarli. La fermentazione dei polisaccaridi produce acido
acetico, propionico e butirrico, mentre gli acidi a catena ramificata, (gli iso-acidi), e ed altri acidi
minori sono probabilmente prodotti dalla digestione delle proteine e dei lipidi. Gli SCFA prodotti
dalla flora batterica rappresentano un carburante importante per i colonociti, e possono inoltre
contribuire al bilancio energetico complessivo. I tre principali SCFA, acetico, propionico e
butirrico, sono importanti per la proliferazione e la differenziazione delle cellule epiteliali (18).
Inoltre, gli SCFA possono risultare importanti nello stabilire un ecosistema bilanciato nell’intestino.
5

Come accennato, l’intestino è sterile alla nascita e di conseguenza non avviene la produzione di
SCFA. Nella prima infanzia la produzione di acido acetico risulta predominante, seguita dalla
produzione di acido propionico e butirrico. Con l’età, la percentuale di acido acetico diminuisce
mentre quella di altri SCFA aumenta, riflettendo lo sviluppo di una flora batterica intestinale più
complessa. I neonati allattati al seno hanno una composizione di SCFA in cui sono prevalenti
l’acido lattico e l’acido acetico, con una minor quota di acido butirrico, mentre nei neonati svezzati
con latte in polvere sono predominanti l’acido acetico e l’acido propionico, con una scarsa quantità
di acido butirrico (19). Durante il periodo di introduzione degli alimenti complementari, molti
carboidrati complessi non digeribili vengono introdotti nella dieta del neonato ed il profilo fecale
degli SCFA cambia. La capacità di fermentare questi carboidrati complessi può risultare lenta
soprattutto nei neonati allattati al seno. Il cambiamento nel profilo degli SCFA differisce tra neonati
che vengono solamente allattati al seno e quelli invece nutriti con latte in polvere. All’inizio, l’acido
propionico tende ad aumentare quando si inizia lo svezzamento, e le concentrazioni dell’acido
butirrico aumentano più lentamente. La percentuale di acido lattico diminuisce nel primo anno di
vita. Nei neonati nutriti con latte in polvere il cambiamento del profilo degli SCFA risulta meno
marcato, poiché sono più rapidi nello sviluppare la loro capacità di fermentare i carboidrati
complessi, per la diversa flora batterica intestinale dalla nascita. Nei neonati nutriti con latte in
polvere vi è un lento e graduale aumento dell’acido butirrico durante il periodo di introduzione
degli alimenti complementari (13, 16) (Fig. 2).
Didascalia alla Figura 2: Descrizione schematica dello sviluppo della flora batterica intestinale e
della produzione degli SCFA sulla base del tipo di alimentazione. Adattata da C Edwards, 2006
(16) e stampata con il permesso dell’editore.
La flora batterica intestinale ed il sistema immunitario
I batteri intestinali sono indispensabili per l’attivazione del sistema immunitario dell’ospite, e si
ritiene possano contribuire ad un appropriato bilancio delle risposte immunitarie nel corso della
vita. Modelli animali gnotobiotici (ossia, privi di germi) hanno dimostrato che i batteri intestinali
sono indispensabili per lo sviluppo delle risposte immunitarie intestinali e sistemiche (20-22). La
costituzione della flora batterica intestinale è considerata il prerequisito per la formazione
dell’equilibrio immunitario anche negli esseri umani (23, 24).
Il Sistema Immunitario Intestinale
La difesa immunitaria
Il sistema immunitario intestinale riveste un doppio ruolo sia nell’innescare le risposte immunitarie
verso i patogeni sia nel non reagire verso i batteri innocui e gli allergeni alimentari. Poiché
numerose infezioni patogene penetrano nell’organismo attraverso le mucose, è necessario poter
instaurare delle risposte immunitarie efficienti. Tuttavia, risposte immunitarie attive verso allergeni
alimentari innocui possono risultare dannose, come nel caso delle reazioni di ipersensibilità
responsabili di allergie alimentari e come avviene nella malattia celiaca (25, 26). La risposta
immunitaria intestinale agisce primariamente con il fine di prevenire l’adesione e l’invasione dei
patogeni attraverso la peristalsi e rivestendo l’epitelio della mucosa del tratto gastrointestinale con
uno strato di muco. Inoltre uno strato superficiale di componenti secretori non specifici, ossia
mucine e defensine, e specifici ossia IgA secretorie (sIgA), proteggono dall’adesione e
dall’invasione da parte di patogeni. L’acidità e gli enzimi proteolitici scindono le proteine ingerite
in peptidi, distruggendo quindi epitopi immunogenici, ossia la regione immunologicamente reattiva
di un antigene complesso. Tuttavia, se gli antigeni entrano in contatto con l’epitelio, incontrano il
tessuto linfoide intestinale (GALT). Negli esseri umani il GALT costituisce 2/3 del sistema
6

immunitario del corpo riflettendo l’enorme sfida immunologica esercitata dal contenuto luminale
intestinale. I linfociti sono presenti lungo tutto l’intestino, sia in aggregati organizzati, ossia in
follicoli singoli (solitari) nella mucosa, più numerosi nel colon, nell’appendice e negli aggregati di
follicoli linfoidi presenti a livello del piccolo intestino chiamati placche di Peyer (PP). I linfociti
sono inoltre distribuiti all’interno dell’epitelio (IEL) e nel tessuto connettivo sottostante (LPL). Gli
IEL sono costituiti prevalentemente da linfociti T (cellule T) mentre gli LPL sono costituiti sia da
cellule B che da cellule T. Nell’intestino sono presenti numerose plasmacellule in grado di produrre
anticorpi.
Gli antigeni possono penetrare all’interno dei follicoli attraverso cellule epiteliali specializzate, le
cellule dei microvilli (cellule M) ed interagiscono con le cellule presentanti l’antigene (APC), le
cellule B e le cellule T. Le cellule dendritiche (DC) sono cellule APC mature localizzate nelle PP e
nella lamina propria. Le cellule APC mature sono specializzate nel catturare, processare e
presentare gli antigeni alle cellule T. Si pensa che le cellule DC presenti nella lamina propria
possano venire in contatto con gli antigeni alimentari presentandoli poi alle cellule T. Gli IEL ( i
linfociti intraepiteliali) intestinali e le cellule T dell’LPL (tessuto connettivo sottostante) in
condizioni fisiologiche sono attivati e producono citochine con attività inibitoria ed antiinfiammatorie,
contribuendo ad uno stato che può essere considerato di infiammazione controllata.
Anche le cellule T citotossiche (CTL) sono presenti nel piccolo intestino, e sono in grado di
eliminare i patogeni penetrati mediante un meccanismo di citotossicità (27). Quando i linfociti
incontrano l’antigene a livello del tessuto linfatico, si attivano. Quindi lasciano gli organi linfoidi
come cellule effettrici ed entrano nel circolo sanguigno migrando verso il sito dove è avvenuto
l’incontro con l’antigene iniziale. I vasi linfatici afferenti drenano la linfa dalla lamina propria dei
villi e dalle PP verso i linfonodi mesenterici (MLN). L’espressione delle molecole di adesione Lselectine
sulla superficie dei linfociti è necessaria per permettere loro di penetrare nei tessuti
periferici mentre l’espressione delle integrine α4β7 è necessaria affinché i linfociti possano penetrare
nei tessuti mucosali, rispettivamente, (25, 28-30). Tuttavia, l’ingresso dei linfociti nei MLN richiede
anche l’espressione di molecole di adesione (31). Così, i MLN rappresentano un punto di incontro
per le vie di ricircolo periferiche e mucosali.
La tollerabilità orale
L’introduzione con la dieta di proteine solubili spinge la risposta immunitaria verso uno stato di
specifica ed attiva non risposta, chiamato tollerabilità orale. I dati sull’induzione della tollerabilità
orale provengono principalmente da modelli di roditori, ed i meccanismi alla base della tollerabilità
orale rimangono incerti. Sembra trattarsi di un’interazione molto complessa tra genetica, età, dose e
tempi dell’alimentazione postnatale, così come sembra dipendere dalla struttura e dalla
composizione antigenica delle proteine alimentari, dai meccanismi di barriera mucosa e dalla
risposta locale immunitaria. Si tratta di un processo antigene-mediato e le forze trainanti sono
rappresentate sia dai batteri intestinali che dagli antigeni alimentari. Sebbene manchino dati a
supporto, si pensa che la tollerabilità orale sia presente anche negli esseri umani. Schematicamente,
l’iper-responsività verso antigeni innocui penetrati nel GALT attraverso le cellule-M o attraverso
l’epitelio di superficie intestinale può essere mediata da 1) anergia delle cellule T, questo significa
che quando le cellule T incontrano l’antigene in assenza di segnali co-stimolatori, diventano
refrattarie ad un’ulteriore stimolazione da parte dell’antigene 2) delezione clonale di cellule T
antigene-specifiche attraverso il processo di apoptosi e 3) soppressione attiva citochina-mediata
attraverso l’interleuchina 10 (IL10) ed il fattore di crescita-β trasformante (TGF-β) prodotti dalle
cellule T regolatorie. E’ stato considerato che un’alta dose di antigeni induce anergia e delezione
clonale mentre multiple somministrazioni di piccole dosi di alimenti sembrano in grado di indurre
una soppressione attiva citochina-mediata. Tuttavia, questa dicotomia viene contestata poiché si
pensa che l’anergia e la regolazione attiva non siano aspetti separati della funzione delle cellule T,
(28-30, 32).
7

L’influenza dell’immunità sulla colonizzazione intestinale
Come precedentemente detto, la stimolazione batterica durante l’infanzia sembra essere un
prerequisito per lo sviluppo del sistema immunitario della mucosa intestinale. Ciò si fonda su studi
in modelli animali. E’ stato dimostrato che la stimolazione con batteri intestinali nello stadio
neonatale è necessaria per l’induzione della tollerabilità orale in topi privi di germi. Tuttavia, se la
colonizzazione batterica avviene più tardivamente può non essere in grado di instaurare la
tollerabilità orale (20). In un altro modello murino, una flora intestinale complessa è stata in grado
di instaurare la tollerabilità orale, al contrario della monocolonizzazione (22). Per un periodo di
tempo variabile dopo la nascita, la funzione di barriera intestinale, fornita in parte dagli anticorpi
secretori e dalle funzioni immunoregolatorie, non risulta pienamente sviluppata. Immediatamente
dopo la nascita, la superficie delle mucose viene colonizzata da un’ampia variabilità di
microrganismi ed esposta a vari antigeni proteici, questi ultimi maggiormente espressi nei neonati
nutriti con latte in polvere rispetto ai neonati nutriti con latte materno. Durante lo svezzamento,
l’esposizione agli antigeni alimentari aumenta e la flora batterica intestinale subisce dei
cambiamenti, stimolando il sistema immunitario in via di sviluppo nell’intestino. In un modello
murino è stata osservato un progressivo cambiamento della flora batterica intestinale nelle fasi
precoci dello svezzamento, dovuto probabilmente ad una diminuzione della quota delle
immunoglobuline secretorie materne di classe A (sIgA) assunte attraverso il latte. Gli anticorpi
sIgA presenti nel latte materno sono diretti verso i microrganismi presenti nell’ambiente materno e
forniscono protezione verso questi microrganismi anche alla prole. La funzione principale delle
sIgA è quella di impedire ai batteri ed ai virus già presenti sulla superficie delle mucose di legarsi
alle cellule epiteliali e di penetrare nel tessuto. Per diversi giorni, i livelli di sIgA risultano essere
bassi fino a quando non si sviluppa la secrezione endogena di sIgA. La produzione di sIgA da parte
dei neonati viene quindi seguita da una modifica della composizione della flora batterica intestinale,
suggerendo che il sistema immunitario sviluppato a livello intestinale è in grado di regolare il
processo di diversificazione della flora batterica intestinale (33). Inoltre questo dato suggerisce che
durante il periodo in cui le scorte di sIgA materne diminuiscono e la produzione endogena di sIgA
non è ancora pienamente sviluppata, avviene un periodo di aumentata vulnerabilità della superficie
della mucosa intestinale da parte di antigeni derivanti dai cibi e dai batteri intestinali. I dati circa
questo processo negli esseri umani sono scarsi. Tuttavia in un trial clinico controllato condotto per
valutare gli effetti dell’aggiunta di Lactobacillus acidophilus LAVRI-A1 (LAVRI-A1) sui livelli di
sIgA nei neonati è stato dimostrato che il fattore predittore ambientale più forte in grado di indurre
la produzione di sIgA è l’introduzione di alimenti complementari prima dei 6 mesi di età. In questo
studio, la colonizzazione da parte di bifidobatteri è risultata associata ad un aumento dei livelli
sierici di TGF-β (34).
La maturazione del sistema immunitario della mucosa intestinale e l’induzione della tollerabilità
orale sono influenzati dalla composizione della flora batterica intestinale, dalla natura degli
antigeni alimentari e dal periodo di esposizione ad essi, da fattori propri dell’ospite e
dall’allattamento al seno materno.
La malattia allergica
La prevalenza dell’allergia e dell’asma ha subito un incremento negli ultimi 50 anni e circa il 20%
della popolazione mondiale soffre di malattie allergiche IgE-mediate. In Svezia, circa un terzo dei
bambini nell’età prescolare presentano eczema, asma e/o rinocongiuntiviti allergiche (35). Sebbene
sembra esserci una forte componente ereditaria, il ruolo dei fattori genetici e gli altri meccanismi di
malattia rimangono sconosciuti. Gli individui con una storia familiare di atopia presentano un
aumentato rischio di sviluppare una sensibilizzazione IgE e sviluppano sintomi tipici di eczema,
asma allergico, riniti allergiche e/o congiuntiviti allergiche. Tuttavia, si tratta di una malattia
poligenica e ad oggi non esistono sicuri markers genetici ed immunologici in grado di identificare
8

un neonato a rischio rendendo così complicata la prevenzione primaria della sensibilizzazione delle
IgE. Nondimeno, un’anamnesi positiva familiare rappresenta il più sicuro predittore di allergia nei
bambini (36).
Nomenclatura
La terminologia nelle reazioni allergiche ed allergia-simili risulta essere ambigua. La nomenclatura
è stata revisionata da una Task Force dell’Accademia Europea di Allergologia ed Immunologia
Clinica (EAACI) nel 2001, e successivamente revisionata dalla Commissione per la recensione
della Nomenclatura dell’Organizzazione Mondiale dell’Allergia (WAO) nel 2004 (37, 38). Così,
l’ipersensibilità viene definita come “sintomi oggettivabili riproducibili o segni insorti in seguito
all’esposizione ad uno stimolo definito ad una dose tollerata da persone normali”. L’allergia è
definita come “una reazione di ipersensibilità indotta da meccanismi immunologici specifici”.
L’allergia può essere sia anticorpo-mediata che cellulo-mediata. L’allergia viene quindi
ulteriormente suddivisa in IgE-mediata e non IgE-mediata. Nella maggior parte dei pazienti con
sintomi allergici a carico delle membrane delle mucose del tratto gastrointestinale e delle vie
respiratorie, gli anticorpi responsabili appartengono alla famiglia delle IgE. Nel caso delle allergie
non IgE-mediate i mediatori possono essere linfociti allergene-specifici o anticorpi IgG. L’atopia è
“una tendenza personale e/o familiare, dell’infanzia o dell’adolescenza, ad essere sensibilizzati ed a
produrre anticorpi IgE in risposta ad esposizioni ordinarie ad allergeni, generalmente proteine.
Come conseguenza, queste persone possono sviluppare sintomi tipici di asma, rino-congiuntiviti, o
eczema”. Il termine atopia non dovrebbe essere utilizzato a meno che non risulti una documentata
sensibilizzazione IgE, ossia mediante un incremento documentato degli anticorpi specifici IgE od
un prick test cutaneo positivo (SPT). Infine, un allergene è definito come “un antigene in grado di
causare una malattia allergica”.
Il termine completo per definire l’infiammazione locale della cute è dermatite. La dermatite viene
quindi divisa in eczema, dermatite da contatto e in altre forme di dermatite. Il termine eczema
comprende la vecchia dicitura di dermatiti atopiche e di sindrome eczematosa/dermatitica atopica.
L’eczema può essere meglio definito come atopico o non-atopico, vecchio termine con cui prima ci
si riferiva a pazienti con una costituzione atopica (Fig.3). Un altro modo per distinguere tra tipi di
eczema è quello di usare i termini eczema IgE-associato e non-IgE-associato. Di seguito, il termine
eczema IgE-associato viene utilizzato quando è confermata la sensibilizzazione.
Didascalia alla Figura 3. Nomenclatura dei sintomi cutanei secondo la classificazione della WAO
(38).
L’asma viene suddiviso in asma allergico e non allergico. L’asma allergico è prevalentemente
scatenato dagli anticorpi IgE, ma si pensa che possano esistere altri meccanismi immunologici in
grado di promuovere l’infiammazione nell’asma allergico. I meccanismi alla base
dell’infiammazione nella forma di asma non-allergico non sono stati completamente definiti.
Il concettoTh1/Th2, cellule T regolatorie ed attivazione delle cellule T
I linfociti rappresentano gli elementi cellulari centrali dell’immunità adattativa. Vengono divisi in
linfociti B e linfociti T (cellule B e cellule T). Entrambi possiedono sulla superficie cellulare i
recettori per gli antigeni, cosiddetti recettori delle cellule B e recettori delle cellule T (BCR e TCR,
rispettivamente). Le cellule B sono fondamentali per l’immunità umorale mentre le cellule T sono
responsabili dell’immunità cellulo-mediata e della regolazione immunitaria. L’immunità umorale è
mediata dagli anticorpi che si legano agli epitopi. Nell’immunità cellulo-mediata, le cellule T
citotossiche e le cellule T produttrici di citochine risultano essere gli effettori. Le citochine sono
polipeptidi bioattivi secreti che regolano l’attività della cellula che le produce o di un’altra cellula.
9

Quindi, le citochine prodotte da specifici tipi cellulari in corso di attivazione sono in grado di
influenzare e regolare la conseguente risposta immunitaria. Le cellule T vengono inoltre suddivise
in 2 sottogruppi maggiori; cellule T helper (Th) CD4+ e cellule T citotossiche CD8+ (CTL). Le
cellule Th vengono chiamate cellule T helper poiché in grado di attivare altre cellule immunitarie
ossia cellule B, CTL e macrofagi, e sono essenziali per la produzione di anticorpi verso proteine e
glicoproteine. Le differenze nella tipologia delle citochine prodotte dalle cellule Th attivate sono
responsabili dei diversi tipi di risposta immunitaria.
Le cellule Th naïve (cellule Th0) producono interleuchina 2 (IL2), IL4 e interferon-γ (IFN-γ). Sulla
base della complessa interazione fra le cellule APC che presentano l’antigene alla cellula Th naïve,
questa può essere polarizzata in differenti direzioni sulla base della genetica, del tipo e della carica
di antigene, della presenza o assenza di molecole specifiche co-stimolatorie ed altri fattori
ambientali ossia l’ambiente della citochina predominante (Fig. 4).
Si possono ottenere due tipi di risposte immunitarie polarizzate sostenute dalle cellule Th che
vengono chiamate risposta Th1 e risposta Th2, rispettivamente (Fig. 4). Questi due tipi di risposte
sono stati prima dimostrati in modelli murini, e successivamente in modelli umani, anche se il
processo di polarizzazione negli umani non segue una così netta suddivisione come nei topi. Inoltre,
il concetto Th1 e Th2 serve come un modello di lavoro, benché ultra-semplificato. La produzione
iniziale di IL4 determina la polarizzazione verso Th2 mentre la produzione di IL2 e IFN-γ in
assenza di IL4 supporta la polarizzazione verso Th1. Le cellule del sistema immunitario innato,
ossia le cellule dendritiche (DC) e le cellule Natural Killer (NK), producono sia IL2 che IFN-γ
determinando la risposta di tipo Th1. Essa è caratterizzata da elevati livelli di citochine proinfiammatorie
interferon-gamma (IFN-γ), tumor necrosis factor beta (TNF-β) ed IL2 senza la
produzione di IL4, IL5, IL9 e IL13. Il rilascio di citochine pro-infiammatorie avrà effetti sulla
produzione di anticorpi opsonizzanti ed in grado di fissare il complemento da parte delle cellule B,
l’attivazione di macrofagi e la citotossicità cellulare. Le cellule Th1 aiutano i precursori delle
cellule T citotossiche a diventare CTL causando l’infiammazione locale. La risposta di tipo Th1 è
tipiche delle malattie autoimmunitarie ossia il diabete e la malattia celiaca. La risposta di tipo Th2,
o risposta umorale, è caratterizzata dalla produzione di IL4, IL5, IL9 ed IL13, senza la produzione
di IFN-γ e TNF-β. La risposta di tipo Th2 induce le cellule B a trasformarsi in plasmacellule,
secernere immunoglobuline, favorire la differenziazione e l’attivazione degli eosinofili ma inibisce
la funzione delle cellule fagocitarie. Questa è la tipica risposta nelle reazioni allergiche
caratterizzate dalla reattività delle IgE. IL4 e IL13 spingono le cellule B alla produzione di IgE
mentre IL5 attiva gli eosinofili (39-41).
Fino a poco tempo fa, i sottogruppi Th1 e Th2 venivano considerati le uniche risposte effettrici
CD4. Tuttavia, è stata scoperta una terza via chiamata Th17 (Fig.4). Le cellule Th17 producono
IL17, IL17F, IL22, IL6 e TNF-α ed è stato suggerito possano prendere parte sia al processo di
infiammazione tissutale che all’attivazione dei neutrofili. La risposta di tipo Th17 viene distinta ed
antagonizzata dalle risposte di tipo Th1 e Th2 (41,42).
Le cellule T in grado di sopprimere la risposta immunitaria, sia mediante il contatto cellula/cellula
che/o mediante la produzione di citochine inibitorie, vengono dette cellule T regolatorie. Le cellule
T regolatorie governano l’equilibrio immunitario (Fig.4). Esistono diverse famiglie di cellule T
regolatorie che includono le cellule T regolatorie CD4+ CD25+ (Treg), in grado di avere effetti di
repressione mediante il contatto cellulare e le cellule T regolatorie di tipo 1 (Tr1) e le cellule Th3
che esercitano i loro effetti attraverso citochine, ossia IL10 e TGF-β. Le cellule Treg derivano dal
timo e si caratterizzano per l’espressione di CD25 (recettore per IL2) e la trascrizione del fattore
Foxp3. La produzione delle cellule Treg è indotta dall’espressione timica di auto-antigeni e si pensa
che le cellule Treg abbiano un ruolo nella prevenzione dell’autoimmunità. La funzione soppressiva
delle cellule Treg sembra dipendere in parte dal TGF-β, ed in misura minore dall’IL10. Le cellule
10

Th3 derivano dall’intestino e si caratterizzano per la produzione di TGF-β (±IL10), svolgono il loro
ruolo mediando la tollerabilità a livello della mucosa e producendo IgA antigene-specifiche. Le
cellule Tr1 derivano dalla periferia e producono IL10 (±TGF-β). Tuttavia, la loro origine non è
chiara, e tuttora non è noto se rappresentino una distinta via di sviluppo o se derivino dalle cellule
Th o Treg. Dati suggeriscono che la produzione di IL10 da parte di cellule CD4+ possa indurre
risposte di tolleranza immunitaria (32, 43).
Didascalia alla Figura 4. Le cellule Th0 naïve possono differenziarsi in cellule Th1, Th2 o Th17. Le
cellule T regolatorie (Treg, Tr1 e cellule Th3) sono in grado di sopprimere la risposta immunitaria.
Durante la gravidanza le risposte mediate da cellule T potenzialmente dannose vengono inibite al
fine di proteggere il feto. Di recente, il concetto prevalente di una forte risposta immunitaria di tipo
Th2 in corso di gravidanza è stato messo in dubbio, ed è stato suggerito che una risposta
immunitaria bilanciata di tipo Th1/Th2 sia necessaria per portare a termine la gravidanza con
successo (44). Tuttavia, esistono dati che suggeriscono la mancanza di meccanismi di difesa
immunitaria cellulo-mediata durante il periodo neonatale responsabili di una risposta di tipo Th1
attenuata. Molti gruppi hanno dimostrato che le risposte IFN-γ nel neonato sono minori rispetto agli
adulti (45, 46) ed i livelli fetali di IL13 sono risultati maggiori mentre quelli di IL4, IL10 e IFN-γ
risultano inferiori rispetto ai livelli riscontrati negli adulti, a supporto di un’inclinazione Th2 (47).
Si pensa che la sensibilizzazione avvenga nell’utero, e allergeni degli acari della polvere domestica
sono stati riscontrati nel liquido amniotico e nel sangue del cordone ombelicale (48, 49). Il
significato di questi reperti per la futura sensibilizzazione e per l’espressione di allergie non è noto
(46). Recentemente è stato suggerito che IgE allergene-specifiche presenti nel sangue cordonale
siano il risultato di un passaggio di IgE materne al feto piuttosto che espressione della
sensibilizzazione fetale (50). Sembra che il sistema immunitario viri verso una forma di risposta
immunitaria bilanciata nel corso della prima infanzia. Nei bambini allergici questo non avviene,
piuttosto vi è un’aumentata reattività di tipo Th2 (46, 51).
L’elemento centrale alla base sia della risposta immunitaria di tipo umorale che di quella cellulomediata
è l’attivazione e l’espansione clonale delle cellule Th. Le cellule Th riconoscono gli
antigeni solamente quando questi sono legati alle molecole del complesso maggiore di
istocompatibilità (MHC) di classe II presente sulle cellule APC mature, ossia DC, cellule B e
macrofagi. In breve, l’interazione del complesso TCR-CD3 con un peptide antigenico processato
legato alle molecole MHC di classe II presenti sulla superficie delle cellule APC induce una serie di
eventi biochimici che porta le cellule ferme Th a proliferare e a differenziarsi in cellule di memoria
o cellule effettrici. Per una completa attivazione delle cellule T sono richiesti segnali co-stimolatori.
Questo segnale deriva dall’interazione tra CD28, una glicoproteina espressa sulla membrana delle
cellule T, e la molecola B7/CD80 presente sulle cellule APC. In questa tesi, le cellule T venivano
attivate in maniera policlonale dall’anticorpo monoclonale anti-CD3 (mAb) e dall’anticorpo anti-
CD28 e la conseguente risposta citochinica veniva valutata quale indice dell’attività delle cellule T.
Le differenze nei modelli delle citochine prodotte dalle cellule Th1 attivate determinano differenti
tipi di risposte immunitarie. Abbiamo studiato l’IL2 quale marker generico di attivazione delle
cellule T, l’IL4 quale marker di attivazione delle cellule Th2, l’IFN-γ quale marker di attivazione
delle cellule Th1 e l’IL10 quale marker dell’attività delle cellule T regolatorie.
La reazione di ipersensibilità IgE-mediata
La reazione di ipersensibilità IgE-mediata inizia in seguito all’esposizione ad un allergene in grado
di attivare le cellule B trasformandole in plasmacellule secernenti IgE. Le molecole di IgE secrete si
legano ai recettori Fc IgE-specifici, ossia glicoproteine di membrana con affinità per l’entità Fc
delle molecole di anticorpo (la parte terminale dell’anticorpo), presenti sulla superficie delle mast
11

cellule tissutali e dei basofili presenti nel sangue. Le cellule che vengono in contatto con le IgE
vengono sensibilizzate. La successiva esposizione allo stesso allergene determina il legame di
questo con le IgE presenti sulla superficie cellulare delle cellule sensibilizzate determinandone la
degranulazione. La degranulazione consiste nel rilascio di mediatori attivi, ossia istamina, citochine
e proteasi che determinano la contrazione della muscolatura liscia, l’incremento della permeabilità
vascolare e la vasodilatazione. L’avvenuta sensibilizzazione può essere confermata mediante la
valutazione degli anticorpi IgE specifici circolanti o attraverso il prick test cutaneo (SPT). Nel
momento in cui l’allergene viene inoculato sottocute in un individuo precedentemente
sensibilizzato, va ad incrociare le molecole di IgE presenti sulla superficie cellulare delle mast
cellule ed avviene la degranulazione di queste ultime. I granuli pre-costituiti contenenti istamina
vengono rilasciati con successiva infiltrazione progressiva del derma da parte di eosinofili e
neutrofili e conseguente formazione reattiva di un pomfo iperemico della cute che può essere
misurato (52).
La manifestazione atopica
Con il termine di manifestazione atopica si descrive un insieme di manifestazioni cliniche di
allergia, che insorgono come eczema ed allergia alimentare, fino a progredire verso un quadro di
allergie respiratorie (Fig. 5), (53, 54), anche se questa concezione è contestata (55). L’allergia
alimentare insorge prevalentemente nei primi 2 anni di vita con un processo di sensibilizzazione,
ossia il sistema immunitario risponde al contatto con proteine alimentari specifiche con la
produzione di IgE allergene-specifiche. In seguito alla sensibilizzazione, l’esposizione a quel cibo
può scatenare reazioni avverse. Tuttavia, mentre le allergie alimentari negli adolescenti sono
prevalentemente IgE-mediate, in bambini di età inferiore si riconoscono meccanismi non IgEmediati,
sebbene non siano pienamente compresi. Molte allergie verso gli alimenti vengono perse
durante l’infanzia. Per esempio, nei paesi industrializzati l’allergia verso le proteine del latte di
mucca (CMA) colpisce il 2-3% dei bambini al di sotto dei 2 anni ma scompare in circa il 50% dei
bambini di un anno e nel 90% dei bambini in età pre-scolare. I sintomi clinici della CMA sono vari,
potendo variare dalle reazioni anafilattiche all’eczema, alla dispnea correlata ai cibi, la colica
infantile, il reflusso gastro-esofageo, la diarrea e la stipsi (56). L’SPT e la valutazione degli
anticorpi specifici di classe IgE risultano essere utili ai fini dell’approccio diagnostico ma un test di
provocazione controllato con gli alimenti rappresenta il gold standard (57).
L’eczema è una manifestazione comune nei bambini piccoli. In un grande studio prospettivo di
coorte, svolto su neonati svedesi, lo studio BAMSE, l’incidenza cumulativa di eczema tra 0-4 anni
era del 33%. Il 21% dei pazienti presentava un eczema non-IgE mediato, ed il 12% dei pazienti un
eczema IgE-mediato. Il 27% dei bambini senza una storia familiare positiva (da parte della madre o
del padre) per allergie aveva manifestato la comparsa di eczema prima dei 4 anni. Il corrispettivo tra
i bambini con storia di familiarità in uno o due casi era del 38% e 50%, rispettivamente (35).
L’eczema è caratterizzato da lesioni cutanee croniche eritematose con decorso ricorrente, intensa
disidratazione della cute e prurito. Nella prima infanzia le lesioni eczematose colpiscono
prevalentemente il volto (specialmente le guance ed il mento), il cuoio capelluto, il tronco e la
superficie esterna delle estremità. L’area a contatto con il pannolino viene generalmente
risparmiata. Durante l’infanzia l’eczema assume un andamento più cronico con lichenificazione,
formazione di papule ed escoriazioni che colpiscono il collo, i polsi, le caviglie e le pieghe delle
articolazioni (54, 58). La funzione della barriera cutanea viene pregiudicata nell’eczema, soprattutto
nell’eczema atopico (59).
Nello studio BAMSE, il 9% dei bambini ed il 4% delle bambine presentavano asma all’età di 4 anni
(60). La fase I dello studio ISAAC ha messo in risalto differenze universali nella prevalenza di
sintomi di asma con una prevalenza a 12 mesi dell’8% nei bambini svedesi di 6-7 anni (61). Nello
studio OLIN, la prevalenza della diagnosi medica di asma nei bambini del nord della Svezia
12

aumentava con l’età, dal 6% a 7-8 anni all’8% a 11-12 anni (62). Nella fase III dello studio ISAAC,
il centro svedese ha riportato una prevalenza a 12 mesi di rino-congiuntiviti del 7% nei bambini di
13-14 anni (63).
Didascalia alla Figura 5. Descrizione schematica della manifestazione atopica. Adattata da JM
Spergel et al (54) e stampata con il permesso dell’editore.
Food allergy = allergia alimentare
Eczema
Rino-congiuntivite
Asma
Nel bambino atopico la manifestazione atopica progredisce. Una recente meta-analisi ha dimostrato
che 1 bambino su 3 con eczema sviluppa asma durante le fasi tardive dell’infanzia, un dato che è
inferiore rispetto ai precedenti riportati (64). Tuttavia, una precoce sensibilizzazione con IgE ed una
forma severa di eczema risultano associati ad un rischio aumentato di sviluppare asma (54).
La permeabilità intestinale nei soggetti allergici
Il tasso di incidenza piuttosto elevato delle allergie alimentari nell’infanzia e nella prima
adolescenza potrebbe essere spiegato dalla presenza di una barriera mucosa incompleta, da
un’aumentata permeabilità intestinale verso grandi molecole e da una risposta immunitaria
mucosale e sistemica immatura. La sensibilizzazione verso allergeni alimentari può essere
considerata come il fallimento del normale processo di induzione di tollerabilità o come
l’annullamento di una tollerabilità stabilita, ed è più frequente durante l’infanzia quando i
meccanismi di tollerabilità non sono completamente sviluppati.
L’aumento della permeabilità intestinale con l’aumentato assorbimento di macro-molecole è stato
riscontrato in bambini e giovani adulti con eczema e/o allergia alimentare, (65) ed in bambini con
asma (66). Quindi, l’intero sistema immunitario della mucosa può essere coinvolto nella malattia
allergica. Tuttavia, se questo aumento della permeabilità intestinale sia un tratto primitivo ereditario
o rifletta un danno della barriera mucosa intestinale guidato dall’infiammazione non è noto e
necessita di ulteriori studi (66).
Alterazione della flora batterica intestinale e malattia
L’ipotesi delle condizioni igieniche
Nel 1989, Strachan ha dimostrato in uno studio epidemiologico la relazione inversa tra la grandezza
del nucleo familiare ed il rischio di riniti allergiche. Egli ipotizzava che nei bambini, le infezioni
trasmesse dai familiari più anziani potessero proteggere dalla malattia allergica e che dietro
l’aumento delle allergie nel mondo Occidentale potesse nascondersi una minore esposizione agli
allergeni nel corso dell’infanzia (67). A sorpresa, è stata dimostrata una forte associazione nella
popolazione tra l’insorgenza del diabete di tipo 1, una patologia Th1-mediata, ed i sintomi di asma,
quale esempio di malattia Th2-mediata (68). In seguito, una versione modificata dell’ipotesi delle
condizioni igieniche proponeva che l’incontro di microbi generici potesse stimolare il sistema
immunitario verso una risposta immunitaria di tipo Th1, e che la flora batterica intestinale,
formatasi nel corso dell’infanzia, potesse avere un impatto maggiore nel guidare tali risposte (23).
Inoltre, è stato proposto che un carico di microrganismi potrebbe incrementare l’attività delle cellule
T regolatorie con un’inibizione delle malattie Th1- e Th2-mediate (69).
Quindi, è stato ipotizzato che una ridotta esposizione ai microrganismi nelle prime fasi della vita
possa essere responsabile della formazione di modelli aberranti della risposta immunitaria.
13

La flora batterica intestinale e l’allergia
La ridotta esposizione microbica durante le prime fasi dell’infanzia rappresenta uno dei più
probabili motivi dell’aumentata incidenza delle malattie allergiche nel mondo occidentale. Come
accennato, sia gli studi epidemiologici che i modelli animali gnotobiotici hanno supportato questa
ipotesi. Alla fine degli anni 90, Sepp e colleghi hanno dimostrato le differenze circa la
composizione della flora batterica intestinale tra bambini di un anno in buona salute svedesi ed
estoni. I lattobacilli e gli eubatteri erano molto più comuni nella flora batterica intestinale dei
bambini estoni, mentre i bambini svedesi presentavano una maggiore quota di clostridi,
specialmente il Clostridium difficile (C. difficile), rispetto ai bambini estoni (70). La flora microbica
dei bambini estoni, infatti, era simile a quella dei bambini svedesi negli anni 60. Lo stesso gruppo
ha poi studiato la composizione della flora batterica intestinale nei bambini sani e nei soggetti
allergici di entrambi i paesi. Inoltre, la conta dei germi facoltativi aerobi risultava essere maggiore
nei soggetti allergici, con un aumento della conta di S. aureus nei bambini svedesi e di coliformi nei
bambini estoni (71). In uno studio successivo, lo stesso gruppo ha seguito prospettivamente la
composizione della flora batterica intestinale e lo sviluppo delle allergie nei bambini svedesi ed
estoni. Quello studio ha dimostrato una minor colonizzazione da parte dei bifidobatteri durante il
primo anno di vita dei bambini che successivamente hanno sviluppato allergie (72). Da un altro
gruppo è stata riportata una minor conta di bifidobatteri nei bambini piccoli con eczema rispetto ai
controlli sani (73). Anche un altro gruppo ha dimostrato un rapporto ridotto di bifidobatteri rispetto
ai clostridi in bambini che successivamente sono diventati allergici (74). In neonati allergici e sani
allattati al seno è stato studiato se alcuni ceppi di bifidobatteri possano essere correlati oppure no
allo sviluppo di allergie. La frequenza della colonizzazione da parte del Bifidobacterium bifidis (B.
bifidis) è risultata maggiore nei neonati sani mentre i neonati allergici venivano più spesso
colonizzati dal B. adolescentis (75). Successivamente, due recenti ampi studi prospettivi di coorte,
condotti su neonati e che hanno impiegato tecniche di biologia molecolare, non sono riusciti a
dimostrare un effetto protettivo da parte di una precoce colonizzazione con bifidobatteri verso lo
sviluppo successivo di allergie (2, 76). Altri gruppi hanno studiato gli effetti del parto cesareo, che
risulta essere associato ad una ritardata ed alterata formazione della flora batterica intestinale
rispetto al parto naturale (2, 6), sulla successiva manifestazione dell’allergia. E’ stato osservato che
i neonati nati da parto cesareo presentano un aumentato rischio di sviluppare successivamente asma
e riniti allergiche (77, 78).
Quindi, esistono indicazioni circa un’associazione tra un’alterata composizione della flora
batterica intestinale e lo sviluppo di allergia, con differenze nella composizione della flora
batterica anche prima che insorgano i sintomi della malattia. Tuttavia, sono necessari ulteriori
studi al fine di chiarire questo problema.
I probiotici
Cenni storici e definizione
Il concetto di modulare la composizione della flora batterica intestinale per scopi terapeutici è senza
dubbio un concetto nuovo. La modulazione può essere effettuata rimuovendo microrganismi
mediante l’uso di antibiotici o aggiungendo nuovi organismi, ossia i probiotici. Inoltre,
l’introduzione di diversi fattori nutrizionali, ossia fibre alimentari o amidi indigeribili, può
influenzare la flora batterica. L’uso di latte fermentato risale a diversi secoli prima dell’era prebiblica.
Tuttavia, è stato non più di un secolo fa che gli studi sugli effetti salutari del consumo del
latte acido sono stati promossi dal lavoro pionieristico del vincitore del premio Nobel Elie
Metchnikoff. Egli proponeva che il latte acido potesse antagonizzare i batteri nocivi nel colon e la
regolare ingestione di latte acido poteva avere un impatto sulla longevità della popolazione bulgara
(79). Nello stesso periodo, Henri Tissier aveva dimostrato che i bifidobatteri rappresentavano la
classe predominante della flora batterica intestinale nei neonati allattati al seno. Egli quindi
14

proponeva che la somministrazione di questi bifidobatteri potesse ristabilire l’equilibrio nella flora
batterica intestinale e risolvere patologie diarroiche. Così, è nato il concetto dei probiotici.
Il termine probiotici sta per “in favore della vita”. Fuller li aveva definiti come “integratori
alimentari contenenti batteri vivi che influiscono in maniera vantaggiosa sull’animale ospite
migliorando l’equilibrio della sua flora microbica” (80). Questa definizione è stata poi
successivamente modificata dalla FAO/WHO che li ha denominati “microrganismi vivi che quando
ingeriti in adeguate quantità conferiscono effetti benefici all’ospite” (81). Le specie più
comunemente usate sono i lattobacilli ed i bifidobatteri, ma altri ceppi batterici sono stati usati come
probiotici e anche il lievito Saccharomyces boulardi. I prebiotici sono “ingredienti alimentari nondigeribili
che influiscono in maniera vantaggiosa sull’ospite stimolando in maniera specifica la
crescita e/o l’attività di uno o di un numero limitato di batteri nel colon, migliorando così la salute
dell’ospite” (82). Questi ingredienti alimentari sono oligosaccaridi non-digeribili ossia il galattooligosaccaride
(GOS) ed il frutto-oligosaccaride (FOS). Il latte materno è ricco di oligosaccaridi.
Con il termine simbiotici si fa riferimento ai prebiotici in combinazione con i probiotici (83).
Sicurezza e linee guida
I probiotici sono un gruppo di batteri che vengono Generalmente Riconosciuti Sicuri (Generally
Recognized As Safe, GRAS) (84). I bifidobatteri ed i lattobacilli sono comuni commensali della
flora batterica dei mammiferi e sono stati usati in vari tipi di alimenti per un lungo periodo.
Raramente sono responsabili di infezioni negli esseri umani. Tuttavia, teoricamente i probiotici
possono causare infezioni sistemiche, attività metaboliche potenzialmente dannose, un’eccessiva
stimolazione immunitaria ed il trasferimento di geni (85). Studi epidemiologici condotti in
Finlandia dopo l’introduzione nei mercati finlandesi del probiotico L. rhamnosus GG (LGG), hanno
dimostrato che non vi è incremento della batteriemia indotta dai lattobacilli dopo un aumentato
consumo di LGG (86). In uno studio svedese è stata valutata per cinque anni l’incidenza della
batteriemia indotta dai lattobacilli e la presenza nelle colture ematiche di tre tipi di probiotici
disponibili in commercio, incluso il L. paracasei ssp. ceppo paracasei F19. L’incidenza della
batteriemia causata dai lattobacilli costituiva

- Valutazione degli effetti avversi negli studi condotti su esseri umani
- Sorveglianza degli effetti avversi nei consumatori durante la fase post-vendita
Meccanismi d’azione proposti dei probiotici
La caratteristica comune ai probiotici è quella di essere microrganismi non-patogeni. Tuttavia,
esiste un’enorme diversità nei meccanismi di azione dei singoli ceppi di probiotici. Così, sembrano
esistere diversi meccanismi coinvolti nella mediazione degli effetti dei probiotici. I probiotici posso
avere effetti diretti sul chimo, sulla flora batterica ed effetti correlati ai cambiamenti dell’ecosistema
della flora batterica. Inoltre, possono esercitare effetti sugli enterociti e sulle cellule
immunocompetenti presenti nella mucosa intestinale (90).
I batteri colonizzanti interagiscono con la mucosa gastrointestinale e comunicano con i costituenti
linfocitari del sottostante strato epiteliale e mucosale, stimolando la difesa da parte dell’ospite a
livello intestinale. Questa comunicazione viene chiamata ”comunicazione-crociata” batteri-epitelio
(91). Con la scoperta della famiglia dei recettori Tool-like (TLR), questa comunicazione è stata
compresa meglio. I TLR sono prevalentemente espressi sulle cellule APC ed interagiscono con gli
assetti molecolari presenti sia sui batteri patogeni che sui batteri commensali, includendo quindi i
batteri probiotici. Negli esseri umani, sono noti 11 TRL che riconoscono le strutture molecolari
presenti sui microrganismi, i cosiddetti pattern molecolari associati ai patogeni (PAMP). I TRL
avviano l’espressione dei geni antimicrobici e dei geni che codificano per le citochine
infiammatorie attraverso diversi tipi di cellule, mentre attivano le cellule DC, cellule APC mature,
ad innescare le risposte dell’immunità adattativa. Le cellule DC hanno come unica capacità quella
di attivare le cellule T näive in stato di fermo ed hanno un ruolo intermedio tra l’immunità innata e
quella adattativa al fine di aiutare la formazione della risposta immunitaria in via di sviluppo.
Nei mammiferi, la via dei Toll determina l’attivazione del fattore di trascrizione chiamato fattore
Nucleare kβ (NFkβ). I costituenti dei batteri ossia il lipopolisaccaride (LPS) presenti nella parete
cellulare dei batteri Gram-negativi possono attivare l’NFkβ presente nei linfociti attraverso questo
percorso di segnali. NFkβ attiva geni che contribuiscono alla risposta immunitaria adattativa ed alla
secrezione di citochine pro-infiammatorie. L’LPS comunica per mezzo del TRL4 in associazione
con un altro recettore per l’LPS, chiamato CD14. Un altro esempio è il TRL2 che si lega all’acido
lipoteico (LTA) presente nella parete cellulare dei batteri Gram-positivi. Il TRL9 riconosce il DNA
genomico dei batteri. NFkβ attiva i geni che contribuiscono all’immunità adattativa ed alla
secrezione delle citochine pro-infiammatorie (92).
Le cellule DC potrebbero essere bersagli potenziali dei batteri probiotici. Si pensa che le cellule DC
immature presenti nella lamina propria possano estendere i dendriti tra gli enterociti nel lume
intestinale. Attraverso la via di segnale-TRL le cellule DC si attivano, rilasciando citochine che
spingono le cellule Th näive a maturare in sottogruppi bilanciati di cellule Th1, Th2 e cellule T
regolatorie (93) (Fig. 6)
Didascalia alla Figura 6. I batteri probiotici possono mediare i loro effetti attraverso la via di
segnale-TRL, rilasciando IL10 ed IL12 che possono indurre le cellule Th näive a maturare in
sottogruppi equilibrati di cellule Th1, Th2 e cellule T regolatorie.
I probiotici nel trattamento della malattia infettiva
I probiotici sono stati usati nel trattamento della diarrea acuta infettiva sulla base del presupposto
che agiscano contro i patogeni presenti nell’intestino. Numerosi trial clinici hanno valutato
l’efficacia dei probiotici nel trattamento della diarrea infettiva. Una meta-analisi su trial
randomizzati controllati condotti per valutare l’ utilizzo dei probiotici nella diarrea acuta infettiva
(definita come > 3 evacuazioni liquide o acquose nelle 24 ore) nei neonati e nei bambini ha
16

dimostrato che i probiotici sono efficaci, soprattutto nelle gastroenteriti da rotavirus (94). Una
review Cochrane del 2004 ha identificato 23 trial controllati randomizzati per un totale di 1927
pazienti, valutando il trattamento con probiotici della diarrea infettiva. I probiotici hanno ridotto il
rischio di diarrea al 3° giorno e la durata media della diarrea di circa 1 giorno. Gli autori
concludevano che i probiotici sembravano essere un utile supporto alla terapia reidratante orale nel
trattamento della diarrea acuta infettiva nei bambini e negli adulti. Tuttavia, vi è ancora carenza di
trial condotti nei paesi in via di sviluppo dove ci si aspetta che gli effetti siano maggiori (95).
I probiotici nel trattamento e nella prevenzione della malattia allergica
Come discusso, sia i modelli epidemiologici che i modelli animali gnotobiotici suggeriscono che la
flora batterica intestinale rappresenti il maggiore stimolo alla maturazione del sistema immunitario.
Da qui l’idea di usare i probiotici, soprattutto bifidobatteri e lattobacilli, per il trattamento e la
prevenzione delle malattie allergiche. I meccanismi dei probiotici proposti sono l’omeostasi della
flora batterica intestinale, la stabilizzazione della barriera intestinale ed il controllo
dell’infiammazione (96). Esistono numerosi studi che hanno valutato l’efficacia dei probiotici nel
trattamento dell’eczema. Il primo studio si è occupato di neonati con eczema ed allergia al latte di
mucca (CMA). In quello studio l’indice di Punteggio della Dermatite Atopica (Scoring Atopic
Dermatitis Index SCORAD) si riduceva del 50% quando i neonati venivano nutriti con il siero
idrolizzato del latte in polvere arricchito con LGG rispetto allo stesso latte in polvere senza
l’aggiunta di LGG (97). In un altro piccolo studio, l’aggiunta di LGG o del B. lactis determinava
una più rapida risoluzione dell’eczema rispetto al placebo (98).
Inoltre, uno studio con un disegno simile a quello di Isolauri e colleghi (98), ha dimostrato la
mancata efficacia della somministrazione di LGG sull’eczema (99), ed in altri 2 studi non risultava
alcun effetto dell’LGG nei neonati con eczema lieve o moderato rispetto al placebo (100, 101).
Tuttavia, in uno studio più ampio, l’LGG ha ridotto l’indice SCORAD nei neonati con eczema IgEassociato
mentre ciò non è avvenuto utilizzando un MIX di 4 ceppi probiotici (102).
In uno studio condotto per valutare gli effetti dei probiotici sull’eczema da moderato a severo, il L.
fermentum ha determinato un significativa riduzione dell’indice SCORAD rispetto al placebo (103).
Effetti moderati della somministrazione dei probiotici sono stati anche osservati in uno studio
condotto su bambini più grandi. Questo studio prevedeva un disegno crociato (crossover), ed una
combinazione di L. reuteri e L. rhamnosus ha migliorato i sintomi soggettivi nei bambini con
eczema ma non è stata in grado di ridurre l’indice SCORAD (104).
Tre studi randomizzati controllati hanno dimostrato gli effetti preventivi della somministrazione
perinatale di probiotici sull’eczema, che includeva anche o solo l’eczema IgE-associato (105-107),
mentre due studi non hanno dimostrato alcun effetto protettivo (108,109).
Lactobacillus F19
Isolamento, colonizzazione e sicurezza
Il Lactobacillus paracasei ssp. ceppo paracasei F19 (LF19) è stato originariamente isolato dallo
strato profondo della mucosa colica in pazienti che non presentavano una malattia gastrointestinale.
E’ stato dimostrato che il ceppo si legava alla mucina ed era in grado di sopravvivere
all’esposizione al pH acido ed alla bile.
Quindi, si è pensato che il ceppo avesse una buona possibilità di sopravvivere al transito attraverso
il tratto gastrointestinale (GI) stabilendosi nella mucina GI (110).
La sopravvivenza, l’ecologia e la sicurezza dell’LF19 nei soggetti umani è stata inoltre valutata in
un progetto di ricerca multicentrico europeo, il progetto PROBDEMO. Il probiotico veniva
introdotto attraverso capsule e latte contenenti LF19 congelato-essiccato o nello yoghurt. Le dosi di
LF19 variavano tra 10 8 -10 10 UFC. L’LF19 colonizzava in maniera transitoria il lume colico e la
mucosa (111). La valutazione della flora batterica fecale dopo il termine dell’assunzione di LF19 ha
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dimostrato che alcuni bambini piccoli erano stati colonizzati 2 settimane dopo il termine, e 2
soggetti anziani erano ancora colonizzati da LF19 dopo 8 settimane. Il trials ha mostrato inoltre che
ceppi indistinguibili dall’LF19 venivano identificati mediante la metodica della polymerase chain
reaction ad amplificazione randomizzata (RAPD-PCR) nei campioni fecali di alcuni soggetti prima
della somministrazione di LF19. Al momento del trials l’LF19 non era ancora stato prodotto per
essere commercializzato e quindi i soggetti non potevano essere stati esposti a questo ceppo con i
cibi (112, 113).
Riassumendo, questi trials condotti sull’alimentazione negli esseri umani hanno dimostrato che
LF19 era ben tollerato dai bambini piccoli, dagli adulti e dagli anziani senza effetti avversi
osservati. Inoltre, i trials hanno dimostrato che LF19 o ceppi strettamente correlati, fanno parte della
flora batterica indigena in alcune persone dei paesi nordici (111).
Il profilo di antibiotico-resistenza dell’LF19 assomiglia a quello del gruppo del L. casei, inclusa la
resistenza alla Vancomicina. I lattobacilli sono intrinsecamente resistenti alla Vancomicina, e
questo tratto è considerato non-trasmissibile (89). Non si conosce alcuna resistenza antibiotica
dell’LF19 derivata da plasmidi (114). L’LF19 produce acido L-lattico, ma non acido D-lattico e non
è in grado di deconiugare i sali biliari (R Fondèn, comunicazione personale 2003).
Effetti immunologici in vitro e nei modelli animali
La stimolazione delle cellule mononucleate del sangue umano periferico (PBMC) con diversi ceppi
di lattobacilli vivi (incluso l’LF19) determina la produzione di TNF-α, IL6 ed IL10 in vitro (115).
L’incubazione di una sospensione contenente LF19 su una linea cellulare monocitaria determina la
trascrizione di NFkβ e causa la produzione di IL1β, IL8 ed IL10 (110). In un modello murino
creato per studiare l’espressione genica globale nell’ileo distale dopo l’ingestione di LF19, alcuni
componenti del recettore di segnale presente sulle cellule B venivano maggiormente espressi nei
topi monocolonizzati (116).
Quindi, LF19 risponde ai criteri del probiotico, ed è stato dimostrato avere effetti immunostimolatori
in vitro.
OBIETTIVI
L’obiettivo generale di questo studio è stato di valutare se l’assunzione del probiotico LF19 durante
lo svezzamento fosse in grado di mantenere alcuni dei benefici effetti conferiti dal latte materno
sulla composizione della flora batterica intestinale, con possibili effetti sull’attività della flora
intestinale, sull’immunità adattativa, sull’equilibrio tra risposta immunitaria Th1/Th2 e sullo
sviluppo dell’allergia.
Gli obiettivi specifici da valutare sono stati i seguenti:
- Gli effetti dell’assunzione di LF19 sui livelli fecali di lattobacilli e sulla composizione degli
SCFA come indice dell’attività della flora batterica intestinale
- Gli effetti dell’ingestione di LF19 sulle infezioni e le risposte di anticorpi IgG specifici ai
vaccini coniugati contro difterite, tetano ed Haemofilus influenzae tipo b
- La maturazione dell’attività delle cellule T in base all’età e gli effetti su di essa
dell’ingestione di LF19
- Gli effetti dell’ingestione di LF19 sull’incidenza cumulativa di eczema a 13 mesi di età,
l’equilibrio immunitario ed livelli di IgE allergene-specifiche.
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PAZIENTI E METODI
Disegno dello studio
Arruolamento allo studio
Vaccinazione
Prelievo di sangue
Ingestione di LF19
Diario
Questionario
Campionamento fecale
Didascalia alla Figura 7. Diagramma per l’arruolamento, le vaccinazioni, l’ingestione dei cereali, la
registrazione della morbidità mediante diari e questionari, campioni di sangue e di feci. I metodi
usati vengono descritti nella rispettiva sezione Pazienti e Metodi di ogni protocollo.
RISULTATI
Caratteristiche dei partecipanti
Abbiamo arruolato 180 neonati dell’età di 4 mesi. Dopo aver escluso un neonato per via dei criteri
di esclusione, (nato da parto cesareo), 89 neonati sono stati randomizzati a ricevere cereali con
l’aggiunta di LF19 e 90 a ricevere cereali senza aggiunta di LF19 (placebo). Il tasso di pazienti persi
(drop-out) è risultato minimo. Il 94% (n=84) ed il 97% (n=90) dei neonati hanno completato lo
studio nel gruppo probiotico e nel gruppo placebo, rispettivamente. Quindi, 171 neonati hanno
completato lo studio. Non si sono osservate differenze statisticamente significative tra i gruppi per
quanto riguarda il sesso, l’età gestazionale, il peso alla nascita, il numero dei fratelli maggiori, i
giorni di ospedalizzazione, l’esposizione ad animali domestici con il pelo o l’esposizione domestica
al fumo. Non si sono osservate differenze tra i due gruppi per quanto riguarda l’ereditarietà
dell’atopia; il 66% ed il 61% dei neonati nel gruppo probiotico e nel gruppo placebo avevano
almeno un parente di primo grado con allergia ed erano stati classificati come soggetti ad alto
rischio per lo sviluppo di allergia, rispettivamente, (p=0.5).
Non sono state osservate differenze tra i gruppi rispetto al numero di evacuazioni ed alla
consistenza delle feci o nella frequenza di rigurgito (dati non pubblicati). La CMA è stata
diagnosticata mediante un test provocativo alimentare in 6 ed in 3 neonati nel gruppo del probiotico
e nel gruppo placebo, rispettivamente (p=0.3). Tutti i neonati con CMA hanno reagito con sintomi
da interessamento cutaneo o del tratto gastrointestinale subito dopo aver introdotto il cereale, che ha
rappresentato il primo alimento per lo svezzamento basato sulle proteine del latte introdotto
nell’alimentazione del bambino, e tutti i bambini sono migliorati dopo aver eliminato le proteine del
latte. Non si sono osservate differenze tra i due gruppi per quanto riguarda la crescita (dati non
pubblicati). Quindi, i cereali sono stati ben accettati, determinando una normale crescita senza
effetti avversi dimostrati.
Figura 8. La somministrazione di cereali ad uno dei bambini dello studio.
Effetti dell’assunzione di probiotici durante lo svezzamento sullo stato
funzionale della flora microbica intestinale (Protocollo 1)
Nel primo protocollo, abbiamo voluto determinare se l’assunzione di probiotici durante lo
svezzamento potesse far aumentare la conta dei lattobacilli fecali e fosse in grado di prolungare gli
effetti benefici conferiti dal latte materno sulla composizione della flora batterica intestinale con
conseguenti effetti sulla composizione degli SCFA.
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La conta totale dei lattobacilli risultava maggiore durante l’integrazione nel gruppo probiotico
rispetto al gruppo placebo (p

Le analisi statistiche sono state quindi aggiustate per la colonizzazione persistente da parte
dell’LF19 durante l’integrazione e suddivise in persistentemente colonizzato, (isolato in tutti e tre i
campioni fecali nel corso dell’integrazione) o non colonizzato (isolato in

pubblicati). I neonati del gruppo probiotico hanno assunto antibiotici per un numero di giorni
lievemente inferiore a quello nel gruppo placebo (p=0.044).
Come ci si aspettava, la risposta anticorpale verso tutti e tre gli antigeni e’ stata marcatamente più
elevata dopo la terza dose rispetto alla seconda. Nell’insieme, non sono stati riscontrati effetti da
parte di LF19 sulla risposta anticorpale specifica verso nessuno degli antigeni. Tuttavia, LF19 ha
aumentato le concentrazioni della tossina difterica durante il corso della vaccinazione dopo
correzione in rapporto alla durata dell’allattamento al seno e colonizzazione di LF19 (p=0.024).
C’era un’interazione tra l’integrazione e la colonizzazione persistente di LF19 sulle concentrazioni
della tossina antitetanica durante il corso della vaccinazione (p=0.035). Tuttavia, le analisi di
follow-up non hanno raggiunto una significatività statistica in nessuno periodo. Al contrario, le
concentrazioni di anti-HibPS risultavano essere maggiori dopo la prima e la seconda dose del
vaccino Hib nei neonati allattati al seno < 6 mesi rispetto ai neonati allattati ≥6 mesi, (p=0.05), in
assenza di effetti da parte di’LF19.
Quindi, gli effetti dell’LF19 sulle risposte ai vaccini potrebbero essere stati mediati dai cambiamenti
indotti sulla flora batterica intestinale con successivi effetti di immuno-stimolazione. Tuttavia, gli
effetti dell’LF19 sono stati influenzati dalla durata dell’allattamento al seno e dalla colonizzazione
persistente da parte dell’LF19, (Fig.11).
Dopo la terza dose non vi era influenza da parte dell’assunzione di probiotici o della durata
dell’allattamento al seno sulle concentrazioni degli anticorpi specifici IgG verso alcuno degli
antigeni. Tutti i neonati hanno raggiunto concentrazioni di anticorpi specifici IgG verso la tossina
difterica e tetanica superiori a 1.0 UI, considerato indice di protezione a lungo termine verso la
difterite ed il tetano. Tutti i neonati hanno raggiunto concentrazioni di anticorpi anti-HibPS al di
sopra dei livelli di protezione 0.15 μg/ml quando l’immunizzazione risultava completata, e tutti i
neonati hanno raggiunto concentrazioni superiori a 1.0 μg/ml, considerato il valore soglia per una
protezione a lungo termine, eccetto uno nel gruppo probiotico e due nel gruppo placebo
rispettivamente.
Figura 11. Gli effetti dell’LF19 sulla risposta di anticorpi specifici IgG veniva modulata dalla durata
dell’allattamento al seno e dalla persistente colonizzazione da parte dell’LF19 durante
l’integrazione.
Riassumendo, i neonati che hanno ricevuto LF19 non hanno presentato un minor numero di
infezioni. La durata della terapia antibiotica risultava lievemente inferiore in termini di giorni nel
gruppo probiotico. Tuttavia, la colonizzazione persistente da parte di LF19 ha aumentato la capacità
di innescare le risposte immunitarie verso antigeni proteici durante il periodo delle vaccinazioni con
effetti più marcati nei neonati allattati al seno per un periodo inferiore ai 6 mesi. Al contrario, le
concentrazioni degli anticorpi anti-HibPS sono state fortemente influenzate dalla durata
dell’allattamento al seno , senza alcun effetto da parte dell’LF19.
Maturazione della funzione delle cellule T nei neonati e gli effetti su di essa
dell’assunzione di probiotici durante lo svezzamento (Protocollo III)
Abbiamo studiato il processo di maturazione dell’attività delle cellule T in base all’età ed abbiamo
valutato se l’assunzione di LF19 durante lo svezzamento potesse avere alcun impatto su di essa.
Abbiamo valutato i livelli di espressione dell’mRNA di IL2, IL10, IL4 ed IFN-γ sulle PBMC
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soggette all’attivazione policlonale o specifica delle cellule T. La funzione delle cellule T è stata
valutata come la capacità delle PBMC di rispondere agli attivatori policlonali delle cellule T mAb
anti-CD3 associati all’mAb anti-CD28 in vitro, usando l’IL2 come marcatore dell’attivazione
generale delle cellule T, IL4 come marcatore Th2, IFN-γ come marcatore Th1 e l’IL10 come
marcatore per l’attività delle cellule T regolatorie. L’analisi è stata eseguita a 5½ e 13 mesi di vita,
ossia dopo 1½ e 9 mesi di assunzione del probiotico. La funzione delle cellule T nell’immunità
adattativa è stata monitorizzata seguendo l’espressione di IL2, IL4, IL10 e IFN-γ dopo l’esposizione
in vitro delle PBMC con l’antigene T-dipendente della tossina tetanica (TT), che risulta anche
essere un componente della combinazione di vaccini pentavalente (vaccini per la tossina difterica e
tetanica, la pertosse acellulare, la polio e l’Hib-coniugato) che veniva somministrata ai neonati a 3,
5½ e 12 mesi di vita.
In seguito all’attivazione policlonale delle cellule T, i neonati di entrambi i gruppi esprimevano
livelli di IL2 maggiori rispetto alle altre citochine, sia a 5½ che a 13 mesi di vita, seguiti dall’ IFNγ,
mentre l’espressione di IL4 ed IL10 risultava bassa (Tabella 2 e dati non mostrati). L’espressione
di IL2 nel gruppo placebo risultava aumentata a 13 mesi rispetto a 5½ mesi (p=0.005), mentre nel
gruppo probiotico i livelli risultavano paragonabili (dati non mostrati). I neonati in entrambi i
gruppi presentavano una maggiore capacità di esprimere sia l’mRNA dell’IFN-γ che dell’IL4 dai
5½ ai 13 mesi, (p

contrario, i livelli di mRNA dell’ IL10 rimanevano bassi, senza alcuna differenza tra i due
campionamenti (dati non mostrati).
A 13 mesi di età, dopo 9 mesi di assunzione di probiotico, abbiamo osservato differenze tra i gruppi
nella risposta all’attivazione policlonale. L’espressione di IL2 e’ risultata maggiore nel gruppo
placebo, con una mediana (25-75 mo percentile) di 175 (94-290) copie di mRNA/18S rRNA U
rispetto a 117 (57-242) nel gruppo probiotico, (p=0.02). A quella età, l’espressione mediana di IFNγ
risultava maggiore nel gruppo probiotico, 40 (12-85) copie di mRNA/18S rRNA U rispetto a 26
(12-104) copie di mRNA/18S rRNA U, sebbene la differenza non risultasse statisticamente
significativa.
Non esistevano differenze tra i gruppi in risposta all’esposizione in vitro di TT. Poiché la
somministrazione di LF19 in questa popolazione di studio ha determinato un incremento della
capacità di generare risposte immunitarie IgG specifiche verso la tossina difterica nel corso delle
vaccinazioni, con un’analoga tendenza per la TT, abbiano analizzato la correlazione tra le
concentrazioni sieriche delle IgG specifiche per la TT e la risposta all’esposizione in vitro alla TT.
A 13 mesi di età, ossia 4 settimane dopo la terza dose, le concentrazioni degli anticorpi specifici per
TT correlavano con l’espressione di IL2 e IFN-γ dopo l’aggiunta di TT in vitro, (rs=0.31 e 0.26,
p

Nei neonati ad alto rischio, ossia neonati con almeno un parente di primo grado allergico,
l’incidenza cumulativa di eczema era pari a 6/55 [(11%) (2-19%, 95% CI)] nel gruppo probiotico,
rispetto a 14/53 [(26%) (14-39%, 95% CI)] nel gruppo placebo (p=0.038). L’asma è stato
diagnosticato da un medico in 2/84 neonati, (2%) ed in 5/87 neonati, (6%) nel gruppo probiotico e
nel gruppo placebo, rispettivamente (p=0.4). Le cifre corrispondenti nei neonati ad alto rischio
erano 2/55, 4% e 5/53, 9%, rispettivamente, (p=0.3). Tutti i neonati in cui è stato diagnosticato
l’asma avevano una storia familiare di allergie, (Fig. 12). In un neonato nel gruppo probiotico e’
stata diagnosticata una rino-congiuntivite allergica da un medico.
A 13 mesi di età il rapporto tra l’mRNA IFN-γ/IL4 risultava maggiore nel gruppo probiotico con
una mediana (25-75 mo percentile) di 26 (12-71) rispetto a 16 (6-48) nel gruppo placebo (p=0.040).
Anche nei neonati ad alto rischio, questo rapporto risultava maggiore a 13 mesi nel gruppo LF19
anche se questa differenza non raggiungeva una significatività statistica, (dati non mostrati). A 13
mesi di età, sono stati analizzati i livelli di IgE totali e di IgE specifiche verso il latte di mucca, la
chiara dell’uovo, il pelo del gatto e del cane. Anche se persisteva un effetto di LF19 sull’equilibrio
immunitario Th1/Th2, non vi era alcun effetto di LF19 sulla frequenza della sensibilizzazione.
Riassumendo, l’assunzione di LF19 durante lo svezzamento ha ridotto l’incidenza cumulativa di
eczema durante l’infanzia, e noi suggeriamo che il meccanismo potrebbe essere mediato, almeno in
parte, da un più elevato rapporto Th1/Th2 nei neonati che ricevono LF19.
DISCUSSIONE GENERALE
La composizione iniziale della flora batterica intestinale, associata ai periodi critici per la sua
formazione, rappresentati dal periodo postnatale e dallo svezzamento, sembra avere un ruolo sullo
sviluppo del sistema immunitario, sia a livello intestinale che a livello sistemico. Nel presente
studio, abbiamo cercato di mantenere alcuni dei benefici esercitati dall’allattamento al seno sulla
composizione della flora batterica intestinale, con possibili effetti sulla funzione della flora batterica
intestinale, sull’immunità adattativa, sull’equilibrio immunitario Th1/Th2 e sullo sviluppo di
allergia.
Gli effetti dei probiotici sull’omeostasi della flora batterica intestinale
Dose, compliance e tempo
Durante lo svezzamento, cessano gli effetti immunologici diretti esercitati dall’allattamento al seno,
ossia l’apporto di sIgA, e gli effetti stimolanti del latte materno sulla colonizzazione da parte di
bifidobatteri e lattobacilli. Il razionale della somministrazione dell’LF19 durante il periodo di
introduzione di alimenti complementari rappresentava un tentativo per mantenere la presenza dei
lattobacilli durante un periodo di cambiamenti in cui vi è un’aumentata esposizione ad antigeni
provenienti sia da una flora batterica più varia e sia da sostanze alimentari, con possibili effetti sulla
funzione della flora batterica intestinale e forse sulla formazione delle risposte immunitarie.
Abbiamo ipotizzato che l’assunzione del probiotico LF19 durante questo periodo potesse favorire la
stimolazione dell’attività della flora batterica intestinale e del sistema immunitario in via di
maturazione.
E’ stato scelto l’LF19 perché rispondeva a tutti i criteri del probiotico, ed in precedenti trials dosi
comprese tra 10 8 -10 10 UFC/giorno erano già state somministrate nell’alimentazione di soggetti
umani senza effetti collaterali (111, 113). All’inizio dello studio, non si conosceva la dose minima
necessaria per assicurare la colonizzazione da parte dei batteri probiotici, incluso l’LF19. Il presente
studio è stato condotto su neonati dai 4 mesi di età, mentre precedentemente erano stati studiati
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ambini di almeno un anno; questo ci ha spinto a scegliere una dose minima giornaliera di 10 8 UFC
per motivi di sicurezza. Più recentemente, uno studio disegnato per valutare la correlazione doserisposta
sulla colonizzazione dell’intestino in neonati alimentati con latte in polvere contenente
LGG alla dose di 10 8 , 10 9 , o 10 10 UFC/giorno, ha riportato una valida colonizzazione temporanea a
tutti i dosaggi (117). Diversi ceppi di probiotici differiscono per la capacità di colonizzare in
maniera temporanea l’intestino, motivo per cui questi risultati non possono essere estesi anche
all’LF19. Tuttavia, e’ stato dimostrato che la somministrazione di capsule di gelatina contenenti
LF19 alla dose di 10 10 UFC/giorno a soggetti sani, completamente svezzati dell’età di 1 anno e’
seguita dal ritrovamento fecale di LF19 alla dose mediana di circa log10 6 UFC/grammi di feci dopo
3 settimane di assunzione (113). Questo valore equivale a quello a 6½ e a 9 mesi nel gruppo
probiotico del seguente studio, utilizzando la dose minima giornaliera di 10 8 UFC. Tuttavia, a 13
mesi di età, la somministrazione di LF19, alla dose di 10 8 UFC/giorno, e’ stata seguita dal
ritrovamento fecale di LF19 di un log10 più basso rispetto alla dose di 10 10 UFC/giorno in bambini
di età simile nello studio condotto da Sullivan e colleghi (113). La minor presenza di LF19 a 13
mesi di età coincide con una ridotta frequenza di colonizzazione da parte dell’LF19, riflettendo
forse la formazione di una più diversificata flora batterica o lo sviluppo di resistenza alla
colonizzazione da parte dell’ospite. In questo studio non è stata valutata alcuna relazione doserisposta.
Quindi, non vi è la certezza che una maggiore dose di LF19 possa esercitare effetti
maggiori sulla funzione della flora batterica intestinale e sui markers immunologici ma è un dato
che non può essere escluso.
La compliance è risultata alta. L’assunzione raccomandata era di almeno una porzione di cereali al
giorno, e l’assunzione mediana è stata pari a 0.7 porzioni al giorno, senza differenze tra i gruppi.
Tuttavia, c’è stata una variazione circa l’assunzione di cereali tra i neonati durante il periodo di
integrazione durato nove mesi. Ovviamente, questa variazione è stata influenzata dalle differenze
riguardo l’assunzione giornaliera, ma anche dai periodi di ridotta assunzione di cereali da parte di
alcuni neonati per la mancanza di appetito, l’insorgenza di infezioni ecc. Inoltre, 9 neonati, 6 nel
gruppo probiotico e 3 nel gruppo placebo, rispettivamente, hanno avuto una diagnosi di CMA ed
hanno dovuto interrompere l’assunzione di cereali che contenevano proteine derivate dal latte di
mucca. Questo ha determinato una variazione della dose di LF19 assunto tra i neonati. Il consumo
medio quotidiano di cereali nel gruppo probiotico correlava moderatamente con l’isolamento
dell’LF19 in tutti i campionamenti, ed abbiamo deciso di aggiustare le analisi statistiche per la
colonizzazione persistente di LF19 durante lo studio come misura per colmare, almeno in parte, le
differenze circa la dose di LF19 assunta. Riconosciamo che i fattori propri dell’ospite in grado di
modificare la colonizzazione (12, 118) e la possibilità di ottenere colture falsamente negative, sono
aspetti che uniti all’assunzione di cereali (dose e regolarità), potrebbero avere influenzato la
colonizzazione persistente da parte dell’LF19 durante lo studio.
Colonizzazione con i lattobacilli
L’integrazione ha avuto successo in termini di mantenimento di un’alta conta fecale di lattobacilli
nel gruppo probiotico durante lo studio. Abbiamo osservato che l’intervallo tra i due gruppi si
ampliava sia in termini di quantità di lattobacilli coltivabili sia in termini di frequenza di campioni
fecali contenenti lattobacilli coltivabili. L’LF19 è stato isolato nel 71% dei neonati nel gruppo
probiotico a 13 mesi. I lattobacilli sono stati isolati nelle feci nell’87% dei neonati nel gruppo
probiotico rispetto al 46% nel gruppo placebo alla stessa età. A confronto, i lattobacilli erano stati
isolati nelle feci del 17% dei casi a 12 mesi di età nello studio AllergyFlora (119). Questo ultimo
studio aveva dimostrato una scarsa frequenza di lattobacilli nelle feci durante il primo anno di vita,
che raggiungeva i valori minimi a 12 mesi di età, con un ulteriore rialzo a 18 mesi di vita
presumibilmente per via dell’aumentato consumo di alimenti fermentati. In accordo con i risultati
dello studio AllergyFlora, nel nostro studio la condizione di allattamento al seno al momento del
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campionamento fecale a 6½ mesi nel gruppo placebo era associata ad un aumentata frequenza di
riscontro fecale di lattobacilli coltivabili, suggerendo un effetto stimolatore da parte del latte
materno. La condizione di allattamento al seno oltre i 6 mesi era inoltre associata ad una maggiore
frequenza di colonizzazione da parte dei lattobacilli e dei bifidobatteri in un altro studio (34). E’
stato suggerito che il latte materno potesse anche fornire questi batteri (10, 11). Tuttavia, l’aggiunta
del probiotico LF19 nell’alimentazione in corso di svezzamento manteneva la presenza dei
lattobacilli nelle feci sia nei neonati allattati al seno che nei neonati svezzati.
Scarseggiano dati recenti riguardo i cambiamenti dei microrganismi predominanti nell’intestino
durante il periodo di introduzione degli alimenti complementari negli esseri umani. Amarri e
colleghi hanno studiato gli effetti dell’assunzione degli alimenti complementari sulla composizione
della flora batterica intestinale dai 4 ai 9 mesi di vita nei neonati sani. Veniva raccomandata
un’alimentazione basata esclusivamente sul latte materno fino all’età di 4 mesi mentre
l’alimentazione complementare veniva iniziata a giudizio proprio dei genitori. La frequenza dei
neonati che venivano esclusivamente allattati con latte materno risultava alta, 73%, fino al 7° mese,
per poi ridursi al 36% alla fine dei 9 mesi. Gli autori hanno riscontrato una predominanza da parte
dei bifidobatteri in questi neonati che venivano esclusivamente allattati al seno prima che
iniziassero l’assunzione di alimenti complementari, ed i neonati allattati mantenevano un’alta conta
di bifidobatteri. Il numero degli enterobatteri e degli enterococchi aumentava con l’età.
I lattobacilli aumentavano e quindi diminuivano nel corso dello studio (120), dato che correla con
altri studi che hanno riportato forme di colonizzazione transitorie da parte dei lattobacilli dalla
nascita fino allo svezzamento (1, 2). Anche se i lattobacilli vengono considerati colonizzatori
transitori, è stato proposto che la somministrazione di probiotici nella prima infanzia possa indurre
una colonizzazione permanente dell’intestino. Tuttavia, 6 mesi dopo la cessazione dell’assunzione
perinatale di LGG, non si è osservato alcuna colonizzazione permanente da parte del ceppo nelle
feci del neonato (121). In accordo con questi dati, assumere latte in polvere con aggiunti LGG e B.
longum non determina una colonizzazione permanente, da parte di nessuno dei due ceppi (122). Nel
presente studio, non abbiamo monitorizzato la presenza di LF19 nelle feci dopo il termine
dell’assunzione.
Trials clinici hanno dimostrato gli effetti dell’assunzione di probiotici sulla composizione della flora
batterica intestinale. La somministrazione di latte in polvere arricchito con B. lactis a neonati
prematuri determinava un aumento del numero dei bifidobatteri e riduceva il numero degli
enterobatteri e dei clostridi rispetto al placebo (123). I neonati sensibilizzati svezzati con latte in
polvere molto idrolizzato arricchito con B. lactis presentavano un numero di E. coli e Bacteroides
inferiore rispetto ai neonati svezzati con lo stesso latte in polvere privo di ogni aggiunta (124). La
somministrazione di LGG o placebo alle madri prima del parto e poi ai neonati fino ai 6 mesi di età
ha dimostrato la presenza di una minore quantità di clostridi nel gruppo placebo a 6 mesi, ma a 2
anni di età vi era un minor numero di lattobacilli/enterococchi e clostridi nel gruppo probiotico
rispetto al gruppo placebo (125). La somministrazione di LAVRI-A1 ai neonati per 6 mesi
determinava un maggior tasso di colonizzazione da parte dei lattobacilli, con la tendenza ad una
minor frequenza di colonizzazione da parte dei coliformi ed una maggior frequenza di
colonizzazione da parte dei bifidobatteri (108). Al contrario, somministrare latte in polvere
arricchito con LGG e B. longum a neonati per 6 mesi dopo la nascita non alterava la composizione
generale della flora batterica intestinale (122). Anche se in maniera non inequivocabile, esistono
dati che supportano gli affetti dell’integrazione con probiotici durante l’infanzia non solo attraverso
l’aumento della carica e della frequenza del batterio probiotico ingerito, ma anche sulla
composizione generale della flora batterica intestinale.
27

Nel presente studio, la colonizzazione persistente da parte dell’LF19 ha indotto cambiamenti nella
composizione fecale degli SCFA, ossia differenze funzionali della flora intestinale. In accordo con i
nostri risultati, i bambini antroposofici molto giovani hanno mostrato dei cambiamenti nella
composizione di numerosi SCFA, con una maggiore proporzione di acido acetico ed una minore
proporzione di acido propionico, iso-butirrico, iso-valerico e valerico nelle feci rispetto ai bambini
che conducevano uno stile di vita tradizionale (126). I cambiamenti che abbiamo osservato nel
gruppo probiotico sono simili ai cambiamenti osservati nei bambini antroposofici giovani. Le
persone con uno stile di vita antroposofico presentano un’assunzione elevata e regolare di alimenti
prodotti organicamente e fermentati, e fanno un uso limitato di antibiotici e di vaccini. Nel presente
studio, non sono state osservate differenze tra i fattori riguardanti lo stile di vita ossia la presenza di
fratelli maggiori, l’esposizione ad animali domestici con il pelo, la durata dell’allattamento al seno e
le vaccinazioni. Tutti i neonati che hanno partecipato a questo studio sono stati vaccinati secondo il
protocollo nazionale di vaccinazione. I neonati del gruppo probiotico avevano fatto un uso
lievemente ridotto di antibiotici rispetto ai neonati del gruppo placebo, fattore che potrebbe aver
influito sulla composizione della flora batterica intestinale e, quindi, sulla sua funzione. Tuttavia, le
differenze circa la composizione fecale degli SCFA persistevano dopo aver aggiustato per l’uso di
antibiotici. La maggior parte dei neonati erano stati trattati con penicillina V, che non dovrebbe
influenzare la composizione della flora batterica intestinale come altri antibiotici a largo spettro.
Quindi, i cambiamenti osservati nella composizione fecale degli SCFA nel gruppo probiotico
sembrano essere stati indotti dalla somministrazione del probiotico. Attualmente, i bambini
secolarizzati che seguono uno stile di vita antroposofico presentano un numero inferiore di
manifestazioni allergiche e pochi risultano essere sensibilizzati rispetto ai bambini che conducono
uno stile di vita tradizionale (127). Non è chiaro se i cambiamenti indotti sull’attività della flora
batterica intestinale nel gruppo probiotico possano avere effetti sullo sviluppo successivo di allergie
e sulla sensibilizzazione.
Il prodotto finale principale del processo di fermentazione del glucosio da parte dei lattobacilli è
l’acido lattico, e riteniamo che l’aumento della quota di acido acetico nel gruppo probiotico sia
dovuta ad un incremento del numero di bifidobatteri che tra le altre specie sono in grado di
metabolizzare i carboidrati in acido acetico (12). L’ingestione di altri ceppi probiotici determina un
aumento del numero dei bifidobatteri (108). Quindi, ipotizziamo che la somministrazione di LF19
possa aver creato un ambiente intestinale in grado di favorire la permanenza dei bifidobatteri. Ci si
potrebbe aspettare che l’aggiunta di batteri probiotici ossia ceppi specifici di lattobacilli possano
competere per lo spazio ed i nutrienti con altri lattobacilli presenti nella loro nicchia ecologica.
Tuttavia, la somministrazione di LF19 negli anziani determina un aumento transitorio di lattobacilli
diversi dall’LF19 (113). Inoltre, la somministrazione di un probiotico, ossia LF19, potrebbe aver
creato un ambiente intestinale in grado di favorire la crescita di altri lattobacilli.
La produzione di SCFA è una caratteristica di numerosi batteri. Tuttavia, l’acido iso-caproico si
pensa indichi specificamente la presenza del C. difficile (128). Il C. difficile è stato associato in
passato allo sviluppo di allergia. Anche se precedentemente è stato dimostrato che l’LF19 riduce il
numero dei clostridi in un Simulatore dell’Ecosistema Microbico dell’Intestino Umano (SHIME) in
un modello in vitro (129), non abbiamo osservato effetti sulle concentrazioni o sulle proporzioni
dell’acido iso-caproico da parte dell’LF19. Tuttavia, i neonati con livelli valutabili di acido isocaproico
in tutti i campionamenti che potessero essere inclusi per un confronto statistico erano
pochi. Quindi, il potere di valutare le differenze tra i gruppi risultava scarso.
Il numero dei clostridi è risultato maggiore nei bambini con IgE specifiche per allergeni alimentari
o inalanti (130). Nel presente studio, si è osservato una tendenza verso una maggiore prevalenza di
acido iso-caproico nelle feci di neonati che avevano manifestato eczema durante l’integrazione,
suggerendo una relazione tra la presenza iniziale del C. difficile e lo sviluppo di eczema. Questi
28

isultati sono in accordo con i dati di uno studio di coorte prospettivo condotto su neonati, secondo
il quale i neonati allergici hanno un’alterata composizione di SCFA con maggiori concentrazioni di
acido iso-caproico rispetto ai neonati non allergici (131). Inoltre, due grandi studi prospettivi di
coorte condotti sui neonati sono giunti a differenti conclusioni circa l’associazione tra i clostridi e lo
sviluppo di allergia. La colonizzazione da parte del C. difficile ad 1 mese di età è risultata essere
associata allo sviluppo di allergia a 2 anni in uno degli studi (76), mentre non è stata riscontrata
alcuna associazione nell’altro (2).
E’ stato suggerito che la diversità della flora sia importante ai fini della maturazione dei meccanismi
di regolazione immunitaria. I neonati che vivono nei paesi in via di sviluppo ove vi è una bassa
prevalenza di allergie hanno un ricambio più rapido dei ceppi batterici rispetto ai neonati che
vivono nei paesi industrializzati (5). I bambini che conducono uno stile di vita antroposofico hanno
una maggiore diversità della flora batterica intestinale (132), e nello studio AllergyFlora era stata
riscontrata una ridotta diversità nella flora fecale ad 1 settimana di vita nei neonati che
successivamente hanno sviluppato un eczema IgE-associato (133). Per tale motivo, è necessaria una
conoscenza più approfondita circa i cambiamenti indotti dai prebiotici e dai probiotici sulla
composizione della flora batterica intestinale.
Effetti dei probiotici sull’immunità adattativa
Effetti sulle infezioni
Non si è verificato alcun effetto da parte di LF19 sul numero di infezioni contratte, forse per via
della lunga durata dell’allattamento al seno e dello scarso numero di infezioni contratte durante il
primo anno di vita in questi neonati sani svedesi. In un trial randomizzato condotto in Israele, il L.
reuteri ed il B. lactis hanno ridotto la durata in termini di giorni ed il numero degli episodi di diarrea
in neonati con un’età simile a quella del presente trial (134). In quello studio, il L. reuteri ha inoltre
ridotto i giorni di assenza per ospedalizzazione e la durata della terapia antibiotica. Nessun
probiotico agisce sulle malattie respiratorie. Tuttavia, tutti i neonati sono stati svezzati dal latte
materno all’ingresso al trial che è stato condotto in un ambiente ospedaliero, al contrario del
presente trial dove la maggior parte dei neonati venivano allattati al seno e curati a casa. A
differenza dei risultati dello studio in Israele, Abrahamsson e colleghi non hanno osservato alcun
effetto preventivo sulle infezioni dopo somministrazione di L. reuteri ai neonati sani svedesi
rispetto al placebo (107). Inoltre, in un trial randomizzato finlandese condotto su larga scala su
bambini in attesa di ricovero, l’assunzione di LGG riduceva l’incidenza delle infezioni respiratorie e
la durata della terapia antibiotica rispetto al placebo, sebbene aggiustando per l’età non sussistevano
più le differenze (135). La somministrazione di LF19 lentamente riduceva la durata della terapia
antibiotica in termini di giorni,, fattore che poteva suggerire un effetto preventivo da parte
dell’LF19 sulle infezioni batteriche. Contrariamente ai risultati osservati nel nostro studio e negli
studi condotti in Finlandia ed in Israele riguardo gli effetti preventivi da parte dei probiotici sulla
durata della terapia antibiotica, Abrahamsson e colleghi quasi inaspettatamente hanno osservato un
lento incremento nella durata della durata della terapia antibiotica nel gruppo sottoposto ad
integrazione con L. reuteri (107). In molti neonati di quello studio gli antibiotici erano stati
prescritti a causa di un’otite media. E’ stato dimostrato che l’allattamento al seno ha un effetto
protettivo verso l’otite media (136). Di conseguenza, l’elevata percentuale di allattamento al seno
presente in entrambi i gruppi di quello studio potrebbe aver protetto i neonati in entrambi i gruppi.
Infatti, vi era la tendenza a prolungare la durata dell’allattamento materno nel gruppo placebo
rispetto al gruppo probiotico (107). E’ da sottolineare che la differenza circa la durata in termini di
giorni della terapia antibiotica tra i due gruppi nel presente studio è piuttosto piccola, e che nello
studio finlandese l’aggiustamento per età aveva annullato la differenza circa la durata della terapia
antibiotica tra i gruppi. Quindi, l’effetto più evidente sulla prevenzione dell’infezione batterica da
parte dei probiotici (L. reuteri) è stata osservata nei neonati non allattati al seno in Israele.
29

Anche se le meta-analisi dimostrano un effetto moderato dei probiotici sulla riduzione della durata
delle gastroenteriti virali (94, 95), esistono studi condotti su neonati e bambini che mostrano che
non vi è alcun effetto preventivo svolto dall’assunzione dei probiotici sulle gastroenteriti virali. In
uno di questi, l’LGG non è stato in grado di prevenire l’infezione nosocomiale da rotavirus, mentre
il latte materno si è dimostrato protettivo (137). In uno studio svolto per valutare gli effetti
dell’LGG nei bambini peruviani malnutriti, l’incidenza della diarrea veniva ridotta nel gruppo
probiotico rispetto al gruppo placebo, ma solamente nei neonati non allattati al seno e nei bambini.
Gli autori suggeriscono che anche se i probiotici stimolano alcuni degli effetti del latte materno,
l’effetto del latte materno sulla flora batterica intestinale è superiore rispetto a quello dei probiotici
(138). Riassumendo, i probiotici potrebbero prevenire in qualche misura le infezioni ma gli effetti
appaiono più pronunciati nelle aree con un alto tasso di esposizione alle infezioni, nei neonati non
allattati al seno e nei bambini. I nostri dati supportano questa idea. Tuttavia, tutti gli studi
sopramenzionati sono relativamente piccoli, eccetto uno. Sono pertanto necessari ulteriori trials
controllati randomizzati su larga scala sia nei paesi industrializzati che in quelli in via di sviluppo.
Effetti sulle risposte degli anticorpi specifici vero i comuni vaccini
Sono stati studiati gli effetti dei probiotici sulle risposte antigene specifiche ai vaccini orali.
L’assunzione di LGG determina, nei neonati, l’aumento della secrezione di IgA in seguito alla
vaccinazione orale verso i rotavirus (139), e tende ad aumentare la secrezione di IgA specifiche
negli adulti sani in seguito al vaccino orale per la Salmonella typhii (140).
Le risposte degli anticorpi specifici IgG dipendono dall’interazione funzionale tra le cellule
presentanti l’antigene, le cellule T helper specifiche per l’antigene, la comunicazione intercellulare
mediata dalle citochine e la differenziazione delle cellule B antigene-specifiche in plasma-cellule in
grado di produrre anticorpi. Quindi, la valutazione della risposta anticorpale IgG specifica è un utile
indice per valutare le risposte dell’immunità adattativa. Abbiamo dimostrato che l’assunzione di
LF19 determina un aumento della risposta degli anticorpi specifici IgG verso la tossina difterica
durante il periodo della vaccinazione con un effetto maggiore nei neonati allattati al seno per meno
di 6 mesi, e ha un simile comportamento in risposta alla TT. Abbiamo osservato una correlazione
tra le concentrazioni degli anticorpi IgG specifici per TT e l’espressione di IL4 ed IFN-γ dopo
l’aggiunta di TT in vitro nel gruppo probiotico, mentre non vi è alcuna correlazione tra le
concentrazioni di anticorpi specifici per TT e IL4 ed esiste una debole correlazione con IFN-γ nel
gruppo placebo. Le carenze funzionali delle cellule T durante l’infanzia si manifestano con una
ridotta capacità di produrre diverse citochine, in particolare IFN-γ (141), con conseguente riduzione
delle funzioni CTL e della capacità di offrire un adeguato aiuto da parte delle cellule B per una
produzione efficace di anticorpi (142). Inoltre, è stato dimostrato che i monociti neonatali hanno
una risposta notevolmente inferiore verso i ligandi di numerosi TRL, inclusi i lipopeptidi batterici e
l’LPS, con un minor rilascio di TNF-α (143). Esistono dei dati che dimostrano che l’immaturità
delle cellule DC durante l’infanzia limita la capacità di esprimere cellule T di memoria vaccinospecifiche
dal momento che l’integrazione delle DC aumenta la reattività TT-specifica nei neonati
di 12 mesi (144). E’ stato dimostrato che i probiotici svolgono un ruolo sulle funzioni delle cellule
APC. I probiotici potenziano la funzione delle cellule DC nell’intestino umano di un adulto (145), e
la maturazione dei monociti nei cuccioli di animale (146). Quindi, riteniamo che l’LF19 possa aver
guidato il processo di maturazione delle cellule APC, con conseguenti effetti sulle cellule Th che si
riflettono su una maggiore capacità di innescare risposte immunitarie verso antigeni proteici durante
il corso delle vaccinazioni associata ad un rafforzamento delle correlazioni tra le risposte delle
cellule B e T TT-specifiche al termine dell’immunizzazione primaria. A confronto, uno studio ha
valutato gli effetti dell’integrazione con i probiotici sulle risposte delle cellule T TT-specifiche nei
30

neonati. Si è riscontrata una più scarsa risposta di IL10 verso TT nel gruppo probiotico, ma non vi
era alcuna differenza circa le risposte di IL4 ed IFN-γ tra i gruppi (147).
L’LF19 non ha avuto alcun effetto sulle concentrazioni degli anti-HibPS o sul numero di neonati
che raggiungevano le concentrazioni protettive di anti-HibPS. Questo dato è in contrasto con i
risultati di Kukkonen e colleghi, che hanno dimostrato che la somministrazione perinatale di un mix
di 4 ceppi probiotici e prebiotici GOS determinava un aumento della frequenza dei neonati che
raggiungevano le concentrazioni protettive di anti-HibPS dopo l’immunizzazione primaria rispetto
al placebo. In questo studio abbastanza piccolo, gli autori non hanno riportato alcuna differenza tra i
gruppi circa le concentrazioni di IgG specifiche verso HibPS o verso la tossina difterica o la tossina
tetanica (148). L’inconsistenza dei risultati potrebbe essere dovuta all’uso di differenti ceppi
probiotici aventi una diversa capacità immuno-stimolatoria, oppure potrebbe essere attribuita alle
differenze presenti in natura ed alla dose di antigeni, all’età del neonato ed ai livelli di anticorpi
materni (149).
Gli effetti dei probiotici nella prevenzione dell’ allergia
La prevenzione dell’eczema e delle allergie respiratorie
Abbiamo osservato una riduzione dell’incidenza cumulativa di eczema a 13 mesi nel gruppo
probiotico. In confronto, 3 trials randomizzati controllati con placebo hanno dimostrato effetti
preventivi della somministrazione perinatale di probiotici sull’eczema, che includeva anche o solo
l’eczema IgE-associato (105-107). Nel primo studio LGG è stato somministrato alle madri prima
del parto e successivamente alle madri o ai loro neonati fino ai 6 mesi di vita (106). L’incidenza
cumulativa di eczema è stata ridotta del 50% nel gruppo probiotico e l’effetto preventivo dell’LGG
sull’eczema si estendeva dai 4 ed ai 7 anni di vita (150, 151). Tuttavia, non vi era alcun effetto
dell’LGG sulla sensibilizzazione, ed è stato suggerito un meccanismo IgE-indipendente. In un altro
studio, la somministrazione di L. reuteri alle madri prima del parto ed ai neonati fino ai 12 mesi di
vita è risultato in grado di prevenire l’eczema IgE-associato, ma non l’eczema (107). Ancora, in uno
studio con un ampio campione, la somministrazione di quattro ceppi probiotici alle madri prima del
parto, e la somministrazione dello stesso mix di probiotici uniti al GOS ai loro neonati fino ai 6
mesi di vita era in grado di prevenire sia l’eczema che l’eczema IgE-associato (105). Al contrario,
l’assunzione di LAVRI-A1 dalla nascita fino ai 6 mesi non riduceva il rischio di sviluppare eczema
(108). Recentemente, uno studio con un disegno simile a quello di Kalliomäki e colleghi ha
dimostrato che non vi è alcun effetto preventivo dell’LGG sull’eczema o sulla sensibilizzazione
(109) (Tabella 3). Nessuno degli studi di prevenzione sopra-menzionati ha dimostrato un effetto
preventivo sulle allergie respiratorie.
Ad oggi, esistono solo pochi studi pubblicati sull’uso dei probiotici nella prevenzione dell’allergia,
e due meta-analisi giungono a diverse conclusioni riguardo le raccomandazioni sull’uso dei
probiotici nel trattamento e nella prevenzione dell’allergia (152, 153).
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Tabella 3. Effetti dell’integrazione con i probiotici nella prevenzione dell’eczema nei trials
randomizzati controllati contro placebo
Popolazione Integrazione Risultato/outcome Primo autore
/anno
≥1 Parente di L. rhamnosus Eczema a 2 anni di età Kalliomäki et al,
primo grado allergico GG1x10 10 UFC/die nel 23% dei pazienti nel 2001
(77 madri) e placebo gruppo probiotico vs il 46%
(82 madri) 2-4 settimane dei pazienti nel gruppo
prima del parto e poi ai loro placebo*
neonati (o alle madri se
allattavano) fino al 6° mese
≥1 Parente di L. rhamnosus Eczema a 2 anni di età Kopp et al,
primo grado allergico GG5x10 9 UFC/die nel 28% dei pazienti nel 2008
due volte al giorno gruppo probiotico vs il 27%
(54 madri) e placebo dei pazienti nel gruppo
(51 madri) 4-6 settimane placebo, (ns)
prima del parto e poi ai loro
neonati fino al 6° mese
≥1 Parente di L. reuteri Eczema a 2 anni di età Abrahamsson
primo grado allergico 1x10 8 UFC/die nel 36% dei pazienti nel et al, 2007
(117 madri) e placebo gruppo probiotico vs il 34%
(115 madri) 4 settimane dei pazienti nel gruppo
prima del parto e poi ai loro placebo, (ns)
neonati fino al 12° mese Eczema IgE-associato
a 2 anni nell’8% dei pazienti
del gruppo probiotico vs
il 20% del gruppo placebo*
≥1 Parente MIX di probiotici Eczema a 2 anni di età Kukkonem
allergico (610 madri) nel 26% dei pazienti nel et al, 2007
e placebo (613 madri) gruppo probiotico vs il 32%
2-4 settimane prima dei pazienti nel gruppo
del parto e MIX+GOS o placebo*
placebo ai neonati fino Eczema IgE-associato
al 6° mese a 2 anni nel 12% dei pazienti
del gruppo probiotico vs
il 18% del gruppo placebo*
Madre allergica L. acidophilus (LAVRI-A1) Eczema a 1anno di età Taylor et al,
3x10 8 UFC/die (n=115) nel 26% dei pazienti nel 2007
e placebo (n=111) gruppo probiotico vs il 23%
dalla nascita fino al 6° mese dei pazienti nel gruppo
placebo, (ns)
Neonati sani L. paracasei ssp. ceppo Eczema a 13 mesi di vita Questo studio
paracasei F19 1x10 8 nell’11% dei pazienti nel
UFC/die (n=89) gruppo probiotico vs il 22%
e placebo (n=90) dei pazienti nel gruppo
dal 4° fino al 13° mese placebo*
di vita
* La differenza è statisticamente significativa
32

La sensibilizzazione e l’allergia verso il latte di mucca
La programmazione immunitaria inizia nelle prime fasi della vita e nel corso degli anni sono stati
tentati numerosi approcci al fine di prevenire lo sviluppo dell’allergia e della sensibilizzazione delle
IgE. Le misure dietetiche utilizzate nella prevenzione dell’allergia hanno incluso l’eliminazione di
antigeni alimentari nel corso della gravidanza e dell’allattamento al seno senza alcuna evidenza di
una prevenzione a lungo termine dell’allergia (154). Studi condotti per valutare gli effetti
dell’allattamento al seno sulla prevenzione dell’allergia sono giunti a conclusioni discordanti, ed un
apparente aspetto negativo è rappresentato dalla mancanza di studi randomizzati per ragioni etiche
(155, 156). Una spiegazione dei risultati contrastanti circa il ruolo dell’allattamento al seno nella
prevenzione dell’allergia potrebbe essere dovuto al fatto che la composizione del latte materno varia
tra le donne (157). Ad oggi, l’opinione riguardo la prevenzione dell’allergia è passata
dall’allontanamento dell’allergene all’induzione della tollerabilità (158).
E’ stato osservato come alcuni ceppi batterici probiotici inducano la produzione di citochine Th1 o
regolatorie in vitro. In un modello murino, la somministrazione di L. casei ceppo Shirota determina
un aumento della produzione di citochine Th1 ed una riduzione delle citochine Th2, con
conseguente riduzione dei livelli di IgE (159). Studi condotti in vitro su esseri umani hanno
identificato batteri produttori di acido lattico in grado di indurre la produzione di IL10, che inibisce
le citochine Th2 (160).
Non abbiamo osservato alcun effetto sulla sensibilizzazione dopo assunzione di LF19. In
particolare, in entrambi i gruppi vi sono stati pochi neonati sensibilizzati poiché il potere statistico
per valutare le differenze risultava basso. Tuttavia, nessuno degli studi che aveva dimostrato gli
effetti preventivi dei probiotici sull’eczema e sull’eczema IgE-associato aveva riscontrato effetti
sulla sensibilizzazione (105-107), eccetto nelle analisi di un sottogruppo, (105, 107). A questa età, i
livelli degli anticorpi IgE totali e specifici si sovrappongono tra i bambini atopici e non atopici (161,
162), questo è il motivo per cui il follow-up in età successiva può mettere in luce gli effetti dei
probiotici sulla sensibilizzazione per se. Sono disponibili i dati provenienti da uno studio di follow
up sull’assunzione di LGG nella prevenzione dell’allergia. All’età di 4 e 7 anni, sono stati riportati
effetti sostanziosi da parte dell’assunzione di LGG sull’incidenza dell’eczema ma non è stato notato
alcun effetto sulla sensibilizzazione o sulle allergie respiratorie. Piuttosto, vi era la tendenza verso il
maggior tasso di sensibilizzazione ed allergie respiratorie nel gruppo probiotico rispetto al gruppo
placebo a queste età (150, 151). Uno degli studi di prevenzione ha addirittura riportato un tasso di
sensibilizzazione maggiore a 12 mesi nei neonati che ricevevano LAVRI-A1 rispetto al placebo
(108), sottolineando ulteriormente la necessità di un follow-up per i bambini più grandi. Nel
presente studio, l’incidenza di allergia al latte di mucca è stata in un certo senso superiore alle
aspettative, 5% verso i valori riportati del 2-3%. Una correlazione IgE (SPT positivo al momento
della diagnosi) è stata dimostrata in 5 neonati su 9. Di questi, 4 neonati erano stati nutriti con
probiotici ed 1 neonato con placebo. Tutti i neonati con CMA avevano sviluppato sintomi cutanei o
gastrointestinali subito dopo l’introduzione del cereale, che rappresentava il primo alimento dello
svezzamento a base di proteine del latte introdotto nella dieta del neonato, e tutti i neonati hanno
mostrato un miglioramento dopo l’eliminazione delle proteine derivate dal latte di mucca. Non
sembra possibile che la somministrazione di una così esigua dose di LF19 possa aver scatenato una
tale reazione verso le proteine derivate dal latte di mucca. In uno studio condotto per valutare gli
effetti dei probiotici sul trattamento del CMA e dell’eczema, l’eliminazione delle proteine derivate
dal latte di mucca in aggiunta all’assunzione di LGG aveva migliorato la severità dell’eczema e
dell’infiammazione intestinale (97). In uno studio più ampio, la somministrazione di LGG a
bambini molto piccoli con eczema IgE-associato e sospetta CMA aveva alleviato la severità
dell’eczema. In quello studio un mix di ceppi probiotici non aveva avuto alcun effetto sulla CMA al
contrario degli effetti benefici dell’LGG, ma il mix di probiotici non aveva neanche procurato alcun
effetto indesiderato dannoso (102).
33

La funzione di barriera intestinale
Abbiamo osservato una correlazione più forte tra gli acidi iso-butirrico ed iso-valerico nel gruppo
placebo rispetto al gruppo probiotico a 13 mesi di età. Inoltre, la concentrazione degli acidi isobutirrico
ed iso-valerico nei neonati con una colonizzazione persistente da parte di LF19 risultava
inferiore rispetto al gruppo placebo. Gli SCFA a catena ramificata, ossia le iso-forme, sono prodotti
metabolici che si ottengono dalla digestione parziale delle proteine e dei lipidi. Il follow-up di uno
studio di coorte condotto sui neonati ha dimostrato che la correlazione tra gli acidi iso-butirrico ed
iso-valerico era più forte nei bambini di 4 anni sensibilizzati rispetto ai bambini non sensibilizzati,
forse per via della maggiore desquamazione dell’epitelio intestinale nei bambini sensibilizzati (E
Norin, comunicazione personale). Nei bambini con la malattia celiaca, le concentrazioni degli acidi
iso-butirrico ed iso-valerico nelle feci erano maggiori rispetto ai bambini sani, suggerendo
un’alterata composizione della flora batterica intestinale nel piccolo intestino, un rapido passaggio
intestinale e/o una minore attività metabolica dovuta all’enteropatia del piccolo intestino, che fa sì
che un eccesso di nutrienti parzialmente digeriti raggiunga il colon (163).
Uno dei meccanismi proposto dei probiotici è rappresentato dalla stabilizzazione della barriera
intestinale. La somministrazione di LGG in ratti che allattavano aveva migliorato l’integrità della
mucosa intestinale (164). Gli individui allergici presentano un’aumentata permeabilità intestinale
(65, 66). In un piccolo studio l’eliminazione delle proteine derivate dal latte di mucca in aggiunta
all’assunzione di LGG aveva migliorato sia la severità dell’eczema che l’infiammazione intestinale,
che si rifletteva nei ridotti livelli di α1-antitripsina fecale e negli aumentati livelli di TGF-β (97). La
combinazione di L. reuteri e L. rhamnosus migliorava i sintomi gastrointestinali invertendo il
processo di incremento della permeabilità intestinale nei bambini con eczema (165).
Quindi, suggeriamo che la minore concentrazione degli acidi iso-butirrico ed iso-valerico, e la
minore correlazione tra questi iso-acidi nei neonati con colonizzazione persistente da parte
dell’LF19 durante l’integrazione rispetto al placebo, possa riflettere la presenza di una barriera
mucosa più integra ed una più completa digestione. Inoltre, proponiamo che l’effetto preventivo
dell’LF19 sull’eczema sia, in fondo, in parte dovuto ad un aumento dell’integrità della mucosa
intestinale. Se così fosse, i cambiamenti indotti nella composizione degli SCFA potrebbero influire
sulla successiva sensibilizzazione e è quindi necessario un approfondimento.
Effetti immuno-stimolatori
Le risposte immunitarie materne e fetali
E’ stato suggerito che la somministrazione di probiotici alla madre prima del parto possa
rappresentare il prerequisito per ottenere gli effetti preventivi sullo sviluppo di allergia e gli effetti
immuno-stimolatori (107, 166, 167). Questo dato lo si è evince dai risultati di tre studi che hanno
dimostrato come, la somministrazione dei probiotici prima del parto, potesse avere effetti preventivi
sull’eczema, che includeva anche o solo l’eczema IgE-associato (105-107), ed è in contrapposizione
con i risultati di uno studio in cui, somministrando i probiotici 48 ore dopo il parto, non è stato
osservato alcun effetto preventivo (108). In effetti, è stato dimostrato che l’assunzione di LGG da
parte delle madri in stato di gravidanza può influire sulla composizione delle specie di bifidobatteri
nei loro neonati, ma non sono stati riportati altri effetti in questo studio piuttosto piccolo (168). In
un altro studio, è stato dimostrato come l’LGG aumenti la produzione di IL10 ed IFN-γ in vitro, ma
non in vivo nelle PBMC delle madri sottoposte ad integrazione o nelle cellule mononucleate del
cordone ombelicale (CBMC) dei loro neonati (169). L’assunzione di prebiotici (GOS/FOS) da parte
delle madri in stato di gravidanza aumentava la carica dei bifidobatteri nell’intestino materno ma
34

non aveva alcun effetto diretto sul trasferimento di batteri tra la madre ed il neonato. Non vi era
un’indicazione sull’effetto dell’assunzione di prebiotici da parte della madre sui parametri
immunitari del neonato, valutati mediante la fenotipizzazione dei sottogruppi linfocitari e della
distribuzione delle citochine nelle CBMC (170). Marshan e colleghi hanno studiato gli effetti della
somministrazione di un MIX di ceppi probiotici alle madri prima del parto e quindi ai loro neonati
in combinazione con prebiotici fino al 6° mese di vita sulle risposte immunitarie fetali. In accordo
con i risultati di Kopp e colleghi, l’assunzione di probiotici da parte delle madri durante la
gravidanza non influenzava le risposte immunitarie delle CBMC (169, 171).
Il sistema immunitario del neonato è influenzato dall’immunità della madre, sia durante la
gestazione che durante il periodo di allattamento al seno. E’ stato dimostrato che i livelli delle IgE e
le risposte citochiniche correlano tra i neonati e le loro madri (172). In particolare, nello studio di
Abrahamsson e colleghi, la reattività ai prick test cutanei era meno frequente nei neonati di madri
allergiche nel gruppo probiotico (107). Sono stati anche studiati gli effetti dell’ingestione di
probiotici da parte delle madri in stato di gravidanza sulla composizione del latte materno. La
somministrazione di LGG alle madri durante l’allattamento determinava l’aumento dei livelli di
TGF-β2 nel latte maturo, anche se non vi era alcuna associazione con lo sviluppo di allergia o
sensibilizzazione da parte dei loro neonati (173). L’assunzione di L. reuteri da parte delle madri
prima del parto riduceva i livelli di TGF-β2 nel colostro, e questa riduzione era associata ad una
minore sensibilizzazione delle IgE nella prima infanzia (167). Questo potrebbe in parte essere
spiegato dagli effetti preventivi di L. reuteri nella prevenzione dell’eczema IgE-associato (107). E’
da notare, tuttavia, che i livelli di TGF-β2 nel latte materno maturo non erano associati alla
successiva sensibilizzazione. In quel caso, la somministrazione prenatale alle madri potrebbe essere
stata cruciale per la modulazione della composizione del latte colostro, con possibili effetti sulla
futura sensibilizzazione. Tuttavia, i dati a disposizione provengono da un numero limitato di studi e
sono necessari ulteriori studi per valutare gli effetti dell’assunzione prenatale di probiotici sulle
risposte immunitarie materne e fetali.
Le risposte immunitarie dei neonati
In contrapposizione alla carenza di dati circa gli effetti sulle risposte immunitarie fetali da parte
dell’integrazione con probiotici nel periodo prenatale, il presente studio dimostra che i probiotici
somministrati durante lo svezzamento sono in grado di modulare la funzione delle cellule T. Ad
oggi, non è ben chiaro quale sia il momento ideale in cui somministrare un supplemento di
probiotici nei neonati del genere umano. Tuttavia, è stato studiato il periodo in cui iniziare
l’assunzione dei probiotici in un modello murino. Sono stati studiati gli effetti sulla produzione
delle sIgA da parte dei cuccioli in seguito alla somministrazione di L. johnsooni NCC533 (La1) nei
topi durante la fase iniziale, intermedia e tardiva dello svezzamento. La somministrazione di La1
durante la fase intermedia dello svezzamento determinava un aumento della produzione delle sIgA
da parte dei cuccioli, mentre la somministrazione di La1 durante la fase iniziale dello svezzamento
aveva effetti negativi sulla produzione delle sIgA. La somministrazione di La1 durante la fase
tardiva dello svezzamento non aveva effetti sulla produzione delle sIgA. Gli autori suggeriscono
che durante la fase iniziale dello svezzamento, l’intestino dei cuccioli è ancora protetto dalle sIgA
materne, mentre durante la fase tardiva dello svezzamento è già stata indotta la produzione
endogena delle sIgA, proteggendo l’intestino del cucciolo dal contatto con La1. Quindi, la fase
intermedia dello svezzamento rappresentava un periodo cruciale per il contatto tra il probiotico e la
mucosa intestinale con conseguenti effetti immuno-stimolatori. Gli autori hanno quindi valutato la
somministrazione di La1 durante la fase intermedia dello svezzamento in un modello murino di
eczema, riscontrando effetti preventivi sullo sviluppo di lesioni eczematose associati ad un aumento
dei livelli fecali delle sIgA (174).
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Nel presente studio, l’attività delle cellule T aumentava in seguito all’attivazione policlonale in
entrambi i gruppi durante la seconda metà dell’infanzia, sebbene i livelli fossero ancora inferiori
rispetto ai livelli presenti negli adulti. I nostri dati supportano lo sviluppo di entrambe i tipi di
risposta immunitaria, Th1 e Th2, durante questo periodo. Gli effetti dell’LF19 sulla funzione delle
cellule T risultavano modesti ma misurabili. A 13 mesi di età l’espressione di IL2 risultava inferiore
nel gruppo probiotico rispetto al gruppo placebo, mentre l’espressione di IFN-γ risultava maggiore
nel gruppo probiotico. Le cellule Th näive producono IL2 in seguito all’attivazione, mentre la
risposta da parte delle cellule Th1 determina la produzione di IFN-γ (175). Riteniamo che
l’assunzione di LF19 abbia guidato le cellule T verso una risposta immunitaria di tipo Th1 in
seguito all’attivazione policlonale mentre i neonati nel gruppo placebo esprimono una risposta di
tipo Th0. IL4 ed IFN-γ sono dei regolatori (176), e quando si è analizzato il rapporto dell’mRNA
IFN-γ /IL4 per avere un’indicazione sul tipo di risposta immunitaria verso cui si propende, questo
rapporto è risultato maggiore nel gruppo probiotico dopo 9 mesi di assunzione dell’LF19. Anche se
la risposta delle cellule PBMC all’attivazione policlonale può riflettere il grado di maturità del
sistema immunitario indotta nella mucosa attraverso le vie di ricircolo mucosali e sistemiche, questa
risposta potrebbe risultare inferiore rispetto a quella che avremmo trovato se avessimo studiato la
risposta nelle biopsie mucosali. Tuttavia, per ragioni etiche non è stata presa in considerazione
questa opzione in questi neonati sani.
Ne deduciamo che l’incremento del rapporto Th1/Th2 spieghi solo in parte la ridotta incidenza di
eczema nel gruppo probiotico. In tal caso, questo effetto concorda con gli effetti dati
dall’assunzione dei probiotici osservati nel trattamento dell’eczema. La somministrazione di LGG a
neonati ed a bambini molto piccoli affetti da CMA ed eczema IgE-associato migliora le loro
risposte IFN-γ all’attivazione policlonale di cellule T rispetto al placebo, mentre ciò non avviene
con un mix di quattro ceppi probiotici, incluso l’LGG (177). La somministrazione di Lactobacillus
fermentum PCC TM a neonati con eczema IgE-associato ha ridotto la severità della malattia e ha
aumentato le risposte policlonali IFN-γ da parte delle cellule T rispetto al placebo (178).
Ad ulteriore supporto degli effetti immuno-stimolatori da parte dei probiotici sulle risposte
immunitarie dei neonati, è stato osservato che la somministrazione di un mix di ceppi probiotici alle
madri prima del parto e quindi di simbiotici ai loro neonati per 6 mesi non altera i parametri
immunitari fetali, ma influenza i parametri immunitari del neonato (179). E’ stato osservato un
profilo coerente a quello di un’infiammazione di basso grado dopo 6 mesi di assunzione di
probiotici in neonati sottoposti a terapia con probiotici. I livelli plasmatici di IL10, PCR, IgA totali
ed IgE sono risultati aumentati nel gruppo probiotico rispetto al gruppo placebo. Gli autori hanno
inoltre osservato che aumentati livelli plasmatici di PCR a 6 mesi di età risultavano associati ad un
rischio ridotto di sviluppare eczema e malattie allergiche a 2 anni. L’aumento delle IgE totali nel
gruppo probiotico potrebbe risultare paradossale, ma gli autori hanno dimostrato che questo
aumento non era correlato ai livelli di IgE allergene-specifiche. Gli autori propongono che i
probiotici possano indurre un’infiammazione cronica di basso grado durante l’assunzione, mimando
la risposta immunologica ad un’infezione elmintica con un aumento dei livelli di IL10 ed IgE totali.
Nonostante induca una risposta di tipo Th2, l’infezione elmintica è in grado di proteggere verso
l’espressione di allergia, forse per via dell’induzione di meccanismi regolatori nell’intestino (180).
Marschan e colleghi hanno inoltre proposto che l’induzione dell’infiammazione possa rappresentare
l’anello di congiungimento tra gli effetti immuno-stimolatori indotti dai probiotici e l’induzione
della tollerabilità (179).
E’ possibile che l’aumento del rapporto IFN-γ/IL4 nel gruppo probiotico possa essere stato indotto
dalle popolazioni di cellule regolatorie. E’ stato dimostrato che i batteri probiotici sono in grado di
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indurre popolazioni di cellule T regolatorie. In un modello animale, i probiotici inducono le cellule
Treg nell’intestino (181) e, come accennato, studi in vitro condotti sugli esseri umani hanno
identificato batteri produttori di acido lattico in grado di indurre la produzione dell’IL10, che
inibiscono le citochine Th2 (160). Le cellule Trl vengono stimolate in presenza dell’IL10 ed
esercitano la loro attività inibitoria attraverso la produzione di IL10 (182). In precedenza, l’LF19
aveva indotto la produzione di IL10 da parte delle cellule PBMC umane in vitro, così come in una
linea cellulare monocitaria (110, 115). Non abbiamo osservato effetti da parte dell’LF19 sui livelli
di mRNA dell’IL10 in seguito all’attivazione policlonale delle PBMC. Tuttavia, in vitro ed in vivo
la risposta immunitaria può differire. Malgrado ciò, probabilmente un periodo di 6 ore dall’
attivazione policlonale non rappresenta il periodo ottimale per questa particolare citochina dal
momento che i livelli risultavano bassi anche negli adulti in seguito all’attivazione policlonale.
Un’altra citochina chiave immuno-regolatoria nell’induzione della tollerabilità orale è il TGF-β.
Sarebbe stato interessante studiare gli effetti dell’LF19 sull’espressione del TGF-β, ma durante gli
esperimenti tempo-curva precedenti, i livelli del TGF-β non erano cambiati in seguito
all’attivazione policlonale delle cellule PBMC, ecco perché questa opzione non è stata considerata
nel nostro studio.
In uno studio sono stati valutati gli effetti del LAVRI-A1 sulla frequenza delle cellule Treg e
sull’espressione della trascrizione del fattore Foxp3 nei neonati. E’ stata notata un’aumentata
espressione dell’mRNA del Foxp3 nelle cellule PBMC dopo l’attivazione con allergeni in neonati
con eczema rispetto ai neonati senza eczema. Tuttavia la somministrazione per 6 mesi nei neonati di
LAVRI-A1 non determinava effetti sull’espressione di cellule T CD4+CD25+ o sull’espressione
dell’mRNA di Foxp3 (183). Inoltre, sono stati usati ligandi specifici per valutare le funzioni di
TRL2 e 4, ed anche se non vi erano differenze statisticamente significative tra i gruppi, vi era la
tendenza verso una maggiore produzione di TNF-α ed IFN-γ in seguito all’attivazione del TRL2 nel
gruppo probiotico (184). Inoltre, come precedentemente discusso, in quello studio non vi erano
effetti da parte di LAVRI-A1 sull’incidenza di eczema, e nel gruppo probiotico vi era un numero
maggiore di neonati di 12 mesi sensibilizzati rispetto al gruppo placebo (184).
I ceppi probiotici dovrebbero essere considerati per i loro meriti individuali. L’inconsistenza dei
risultati sugli effetti immuno-stimolatori dei probiotici nella prevenzione primaria dell’allergia
potrebbe essere spiegata dall’uso di differenti ceppi di probiotici ma anche dalle differenze tra i
fattori propri dell’ospite ed i fattori ambientali (166), (Tabella 4).
Tabella 4. Fattori propri dei probiotici, dell’ospite e fattori ambientali che potrebbero avere un ruolo
sulle conseguenze cliniche nel neonato
Probiotico Madre Neonato
Ceppo Background genetico Background genetico
Dose Ambiente Ambiente
Viabilità Status allergico Modalità di parto
Tempo Composizione del latte materno Modalità di assunzione
Durata
Punti di forza e debolezze dello studio
Questo studio ha valutato gli effetti della somministrazione di LF19 in relazione ai risultati clinici
così come lo sviluppo della composizione della flora batterica intestinale ed il processo di
maturazione del sistema immunitario. Un punto di forza del disegno di questo studio è
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appresentato dal fatto che abbiamo seguito i neonati in modo prospettivo durante il periodo dello
svezzamento. La forza dei risultati è rappresentata dall’esigua percentuale di pazienti persi e
dall’elevato numero di campioni ematici e fecali disponibili per le analisi.
La diagnosi di eczema è stata basata su questionari e diari. Abbiamo utilizzato una definizione di
eczema precedentemente validata che ha dimostrato un’elevata sensibilità (92%) e specificità
(100%) rispetto alla diagnosi clinica posta da un dermatologo (185). Un punto debole dello studio è
rappresentato dalla mancanza di dati circa la severità dell’eczema. In alternativa, si poteva utilizzare
una valutazione clinica ed una classificazione della severità dell’eczema basata sull’indice
SCORAD. D’altro canto, l’aver valutato l’incidenza cumulativa come abbiamo fatto invece di
puntare sulla prevalenza potrebbe persino rappresentare un punto di forza. Se i bambini vengono
valutati solo una volta, l’eczema può non essere diagnosticato per via del decorso tipicamente
ricorrente della malattia e per via del fatto che in alcuni bambini può scomparire con il tempo.
Infine, sono state effettuate ripetute visite cliniche con la valutazione della severità dell’eczema e la
raccolta dei dati estrapolati dai diari e dai questionari.
In caso di diagnosi di CMA i neonati venivano sottoposti ad un regime alimentare che prevedeva
l’eliminazione delle proteine derivate dal latte di mucca e quindi l’introduzione del nuovo regime
alimentare risultava in aperto. In generale, i neonati raramente riportavano sintomi soggettivi, ma il
fatto che il cambiamento fosse in aperto e non in cieco potrebbe aver portato ad un incremento delle
diagnosi (57).
Un altro punto debole è rappresentato dal potere statistico relativamente scarso per le variabili
dell’outcome clinico. Un campione di studio maggiore avrebbe permesso di valutare gli effetti
dell’LF19 sull’insieme delle infezioni, delle allergie respiratorie, della sensibilizzazione delle IgE e
di eseguire un sottogruppo di analisi distinguendo tra l’eczema IgE e non-IgE mediato. Inoltre, con
un più ampio campione di studio, l’andamento degli effetti dei probiotici sulla funzione delle cellule
T sarebbe stato più evidente.
Riguardo le considerazioni etiche, il protocollo di studio può essere risultato impegnativo per alcune
famiglie. Nella maggior parte dei casi, le infermiere dello studio inviavano i cereali ed effettuavano
delle visite domiciliari per raccogliere i diari, completare i questionari, rilevare delle misure
antropometriche ed eseguire i prelievi venosi. Questi ultimi, potenzialmente stressanti per il
neonato, venivano eseguiti in un ambiente familiare, riducendo quindi la tensione sia nei neonati
che nei genitori. Prima del prelievo venoso veniva applicata una crema anestetica. Anche se
abbiamo preso tutte le precauzioni sopra elencate, non può essere escluso completamente che
alcune di quelle procedure siano risultate stressanti per alcuni neonati ed i loro genitori. Tuttavia,
alcuni genitori hanno apprezzato il supporto ed il rapporto diretto con le esperte infermiere dello
studio, e la possibilità di poter fissare un appuntamento con i medici dello studio in caso di malattia
del bimbo.
Aspetti futuri
Abbiamo acquisito alcune conoscenze e sono sorte molte altre domande. Le indagini circa gli
aspetti dell’ecosistema nell’intestino e l’intricato scambio con il sistema immunitario si scontrano
con la loro enorme complessità. Tuttavia, in un prossimo futuro proveremo ad aggiungere qualche
altro tassello a questo puzzle.
Prima di tutto, è in corso un’analisi più approfondita della composizione della flora batterica
intestinale e degli effetti dell’LF19 al di là di questo studio.
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Studieremo ulteriormente l’impatto dell’LF19 sulla funzione delle cellule T regolatorie in questo
ambito, così come i markers dell’infiammazione.
Inoltre, la principale necessità è seguire questi bambini e valutare se gli effetti preventivi
sull’eczema si estendono all’età scolare con effetti sullo sviluppo dell’immunità e sulle allergie
respiratorie.
Conclusioni
La composizione della flora batterica iniziale sembra avere un ruolo sullo sviluppo del sistema
immunitario, sia a livello dell’intestino che a livello sistemico. Durante lo svezzamento, avviene la
maggiore esposizione agli antigeni alimentari con una flora batterica intestinale che va
diversificandosi, sfidando il sistema immunitario in via di sviluppo. Nel presente studio abbiamo
cercato di mantenere alcuni degli effetti benefici conferiti dal latte materno sulla composizione della
flora batterica intestinale valutandone i possibili effetti sullo sviluppo del sistema immunitario,
mediante l’aggiunta del batterio probiotico LF19 ai cerali dello svezzamento.
L’integrazione ha ottenuto risultati positivi ed ha mantenuto alti i livelli dei lattobacilli nelle feci
durante lo svezzamento nel gruppo probiotico. L’assunzione di LF19 è risultata sicura senza
evidenza di effetti avversi. Nei neonati di entrambi i gruppi è stata osservata una maturazione del
sistema immunitario specifico e globale ed un aumento della capacità di esprimere citochine sia di
tipo Th1 che Th2. Tuttavia, non abbiamo osservato effetti preventivi sulle infezioni, ma solo una
lieve riduzione della durata della terapia antibiotica.
Inoltre, l’assunzione di LF19 ha ridotto il rischio di eczema associato ad un miglioramento del
rapporto Th1/Th2 in seguito all’attivazione policlonale delle cellule T. Abbiamo inoltre osservato
come l’LF19 induca differenze funzionali nella flora batterica intestinale, con possibili effetti sulla
funzione di barriera intestinale. Quindi, suggeriamo che la riduzione del rischio di eczema nel
gruppo probiotico in parte dipenda dagli effetti dell’LF19 sulla funzione delle cellule T ed in parte
dall’aumentata integrità della mucosa intestinale.
In ultimo, è stato ipotizzato che la flora batterica intestinale ed il sistema immunitario in via di
sviluppo possano essere modulati dalla somministrazione dei batteri probiotici nei neonati. I
risultati del presente lavoro supportano questa ipotesi, e dimostrano che l’assunzione dei probiotici,
se iniziata durante lo svezzamento, può influenzare la funzione della flora batterica intestinale, la
funzione delle cellule T nell’immunità adattativa e possa ridurre il rischio di eczema.
RINGRAZIAMENTI
Prima di tutto, vorrei ricordare tutti i neonati e le loro famiglie che hanno partecipato a questo
studio, rendendo possibile questo progetto. Grazie!
Questo lavoro ed il progetto alle spalle rappresentano lo sforzo comune di un gruppo dinamico di
persone dedicate alle quali vorrei esprimere tutta la mia più profonda gratitudine.
Olle Hernell- il mio principale superiore per avermi invitato ad occuparmi di questa parte così
appassionante della ricerca e per le sue idee, l’impegno, le grandi abilità scientifiche ed il supporto
resomi quando necessario.
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Marie-Louise Hammarstöm- il mio superiore per la sua vasta esperienza in campo scientifico, le
idee innovative, le fruttuose discussioni ed il supporto.
Leif Gothefors- il mio superiore per il suo entusiasmo contagioso e per essere stato mentore sia in
campo clinico che scientifico.
Sten Hammarstöm- per i preziosi consigli e per le discussioni avute nel corso di questo progetto.
Hans Stenlund- sempre pronto a dispensare preziosi consigli nel campo della Statistica, con
pazienza e grandi capacità di insegnamento.
Gisela Dahlquist- per aver condiviso i consigli lungo il percorso.
Margareta Henriksson and RuthGerd Larsson- per il contatto estremamente prezioso con i neonati
e le loro famiglie, per essersi prese cura dei neonati durante lo studio e per essere riuscite ad
ottenere con successo campioni ematici prelevati da vasi invisibilmente sottili. Margareta
Bäckman per il suo aiuto riguardo gli aspetti pratici quando le altre infermiere dello studio avevano
bisogno di una mano e per l’amicizia e l’ottima collaborazione in altri progetti.
Yvonne Andersson- per il tuo contributo estremamente prezioso a questo progetto sotto numerosi
aspetti, inclusa la tua abilità ed esperienza nel laboratorio, i consigli e l’amicizia condivisa in questi
anni.
Marianne Sjöstedt- per il lavoro dedicato alle analisi del qRT-PCR.
Anne Israelsson per aver elaborato i primers e le sonde per le analisi del qRT-PCR.
Helèn Fält, Elisabeth Granström, Carina Lagerqvist, e Lotta Westman per il vostro impegno,
l’abile assistenza con le analisi di laboratorio e le utili osservazioni.
Helena Brännström, Helena Harding, Karin Moström, Anna Nordström e Ulla Norman per
l’eccellente assistenza per quanto riguarda l’aspetto amministrativo.
Marta Granström per aver condiviso la tua vasta esperienza sulle risposte dei neonati ai vaccini, la
loro metodologia e per aver stimolato il dibattito. Ingrid Yones per l’abile assistenza con le analisi
di laboratorio.
Helena Käyhty per avermi accolto ad Helsinki e per aver condiviso la tua competenza nel campo
delle valutazioni sierologiche dei vaccini. Leena Saarinen per l’eccellente assistenza con le analisi
di laboratorio e Anu Nurkka per l’utile confronto.
Elisabeth Norin per aver condiviso la tua conoscenza nel campo della microbiologia e per gli utili
dibattiti. Anna-Karin Persson per l’abile assistenza con le analisi di laboratorio.
Catharina Tennefors e Lars-Börje Sjöberg del Semper AB per il prezioso contributo
all’organizzazione ed allo svolgimento di questo progetto, incluso lo sviluppo del prodotto dello
studio e per il supporto in tutti questi anni.
Ragne Fondèn e Ulla Svensson dell’Arla Foods AB per il supporto nel corso di questo progetto e
per gli interessanti dibattiti sull’LF19. Janet Håkansson e Astrid Walles-Granberg per le
stimolanti discussioni e l’eccellente assistenza con le analisi di laboratorio.
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Åsa Sullivan e Ann-Chatrin Palmgren per l’eccellente assistenza con le analisi di laboratorio.
Aamir Mukhdoomi- per il meticoloso lavoro di inserimento dei dati.
Anna Möllsten, Luis Cobian e Michael Haney per gli utili consigli riguardo l’impaginazione e la
revisione del corpo del testo.
I colleghi passati e presenti del Dipartimento di Pediatria per aver condiviso i pensieri ed i consigli
in tutti questi anni, ed in special modo, Anneli Ivarsson, Berit Kriström, Torbjörn Lind, Sussie
Lindquist, Christian Möller, Solveig Petersen, Auste Pundziute-Luckå, Olof Sandström, Sven-
Arne Silfverdal e Inger Öhlund.Magnus Domellöf, Göte Forsberg, Leif Gothefors, Ulrika Norèn
Nyström, Annida Rydberg, Svante Sjöstedt e Anna Winberg, che oltre ai buoni consigli hanno
condiviso con me l’amicizia, le canzoni e le risate.
I miei amici più stretti, in particolare Ulrika NN, per essere stata un’eccellente compagna di viaggio
in questo percorso e Mia Malby per avermi ricordato di godermi il viaggio.
I miei genitori Benita e Stig, per l’amore ed il supporto, e mio fratello Ulf e la sua famiglia per
esserci stati e per il loro sostegno durante le ultime frenetiche settimane di scrittura della tesi.
Il mio compagno di vita Björn, per essere stato sempre al mio fianco nei momenti belli ed in quelli
brutti e quello che ho di più caro, i miei figli David e Lukas per ricordarmi ogni giorno “il fine di
tutto questo”.
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