Mieczysława I Boguś - Instytut Badawczy Leśnictwa

Instytut Parazytologii PAN
Zakład Biologii Molekularnej
Pracownia Fizjologii
prof. dr hab. Mieczysława I. Boguś
dr Emilia Włóka
mgr Marta Ligęza
oraz
dr Elżbieta Kędra
dr Wioletta Wieloch
dr Maria Czygier
dr Jarosłw Samborski
mgr Joanna Mazgajska

Straty gospodarcze powodowane
przez owady
Produkcja roślinna – rocznie ok. 30%
Sadownictwo – rocznie ok. 5% strat
Magazyny żywności – znaczne straty
Leśnictwo – 6 mln ha (70% polskich lasów)
Hodowla zwierząt – brak danych
Zagrożenie zdrowia ludzi – brak danych

Zwalczanie owadów szkodliwych
Klasyczne insektycydy
Zagrożona bioróżnorodność
Naturalni wrogowie owadów: wirusy, bakterie, grzyby
Działanie selektywne
bakulowirus
Metarhizium anisopliae
Bacillus thuringiensis
Beauveria bassiana

Tematyka
Badanie mechanizmu porażania owadów przez
pasożytnicze grzyby ze szczególnym
uwzględnieniem roli toksycznych metabolitów oraz
enzymów grzybowych
Badanie reakcji obronnych owadów na atak
pasożytniczych grzybów
Cel:
Opracowanie nowej generacji skutecznych i
bezpiecznych insektycydów y w oparciu o metabolity
grzybowe

Ability of various Entomophthoralean
fungi to kill Galleria mellonella larvae
Fungus: Mortality (%)
Basidiobolus ranarum 0
Conidiobolus coronatus 100
Conidiobolus thromboides 24
Paecilomyces species novum, cinnabar colonies 0
Paecilomyces species novum, pink colonies 13
Paecilomyces species novum, yellow colonies 78
Verticillium lecanii 32
Zoopthora sp. 15
Zoopthora arginis 0
Zoopthora muscivora 7
Zoopthora neoaphidis 7
Zoopthora opomyzae 10
Zoopthora petchii 0

Conidiobolus coronatus
Glebowy grzyb entomopatogenny
t
Pożywka Sabouraud
Pożywka płynna
(początek hodowli)
Pożywka płynna
(hodowla zaawansowana)

Zdolność C. coronatus do infekowania
owadów została przetestowana na 43
gatunkach.
L – larwy
P – poczwarki
N – nimfy
A – imago
m – samce
f - samice
+ owady infekowane przez C. cornatus
- owady odporne na infekcję

Larwy Galleria mellonella
zainfekowane C. coronatus
Zainfekowane owady umierają w ciągu 1-2 dni.
Śmiertelność: 70 – 100%

Saprophytic development of
C. coronatus on insects’ cadavers
is rarely observed
Boguś M.I. Szczepanik M. (2000). Histopathology of Conidiobolus coronatus infection in Galleria mellonella larvae. Acta Parasitologica 45:48-54

Infection-induced changes in
G. mellonella Malpighian tubules
A-control, B-dissection at the termination of 18 h exposure, C-
dissection 24 h later (survivor), Scale bars = 100μm
Boguś M.I. Szczepanik M. (2000). Histopathology of Conidiobolus coronatus infection in Galleria mellonella larvae. Acta Parasitologica 45:48-54

Fat body of mycosed Galleria
mellonella larva
Fat bodies of dying insects remain intact and
contain lipid droplets (ld)
Boguś M.I. Szczepanik M. (2000). Histopathology of Conidiobolus coronatus infection in Galleria mellonella larvae. Acta Parasitologica 45:48-54

Infection-induced changes in
G. mellonella hemocytes
A
OE
PL
B
SF
GR
Hemocytes from control (A) and mycosed
(B) Galleria mellonella larvae
Notice degranulating granulocytes (GR),
apoptic blebs of plasmatocytes (PL) and
deformed oenocytiod (OE)

Negative control - hemocytes from uninfected larva
2a 1a 2b 1b 2c 1c
C. coronatus infection of G. mellonella
larvae induce hemocytes to come into
pathway of programmed cell death
Positive control - hemocytes incubated with staurosporine
2a
2b
2c
Negative control - hemocytes from uninfected larva
N A/N N A/N N
A/N
SSC-H
7AAD
7AAD
7AAD
FSC-H
A A A
Annexin Annexin Annexin
Positive control - hemocytes incubated with staurosporine
N A/N N A/N N
A/N
Hemocytes from infected larva (24 h after infection)
SSC-H
7A AAD
7AAD
7A AAD
3a 3b 3c
A A A
FSC-H
Annexin Annexin Annexin
Hemocytes from infected larva (24 h after infection)
N A/N N A/N N
A/N
SSC-H
7AAD
7AAD
7AAD
A A A
FSC-H Annexin Annexin Annexin
Phase-contrast microscopy (1a, 2a, 3a). FM: filter for Apoptosis Detection
Reagent; binding to phosphatidylserine - hallmark of early apoptosis (1b,
2b, 3b). FM: filter for Necrosis Detection Reagent; binding to nucleus -
hallmark of late apoptosis and necrosis.
Flow cytometry (FACSCalibur, Becton Dickinson).
A - apoptosis, N -necrosis.

Pathogenicity of C. coronatus
colonies
25,0
20,0
% of colonies
15,0
10,0
5,0
0,0
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Mortality of G. mellonella larvae (%)
141 colonies derived from single spores were examined
Wieloch W., Sacharczuk M., Boguś M.I., Jaszczak K. (2004). A study for minisatellitic markers of Conidiobolus coronatus’ pathogenicity to
Galleria mellonella larvae. Journal of Invertebrate Pathology 85:63-69

C. coronatus cuticle-degrading
enzymes
Lipase
(nmol/min/mg
/
protein ±SEM)
Chymotrypsin
(nmol/min/mg
/
protein ±SEM)
Chitinase
(nmol/min/m
/
g protein
±SEM)
NGA-se
(nmol/min/m
/
g protein
±SEM)
Mycelial homogenate
0 72 ± 19 20 ± 8 674± 155
(A+)
Mycelial homogenate 0 26 ± 9 4 ± 2 231± 82
(A-)
Culture filtrate 0.3 ± 0.1 355 ± 49 127 ± 22 335 ± 39
(A+)
Culture filtrate
(A-)
0.4 ± 0.1 482 ± 92 103 ± 14 312 ± 43
A(+), A (-) high and low virulent strains (100% and 20% mortality, respectively). Fungi
were cultivated in MM liquid medium.

DNA fingerprinting of
C. coronatus
13 colonies representing 6
variants of pathogenicity
(ranged from 100 to 10%
effciency), derived from
single spores, were tested for
the presence of hypervariable
loci by hybridization with
Jeffreys’ human minisatellite
probe 33.6.
(A) DNA fingerprinting of C. coronatus colonies analyzed. Lanes: 1, 2, 3, 4, 5 – 100% pathogenicity. Lanes 6, 7 –
70%. Lane 8 – 50%. Lanes 9, 10 – 30%. Lanes 11, 12 – 20%. Lane 13 – 10%.
(B) Pattern comparision of high (HP) and low (LP) pathogenicity.
Wieloch W., Sacharczuk M., Boguś M.I., Jaszczak K. (2004). A study for minisatellitic markers of Conidiobolus coronatus’ pathogenicity to
Galleria mellonella larvae. Journal of Invertebrate Pathology 85:63-69

Czym C. coronatus zabija owady
1. Toksyczne białko 30 kDa
Izolacja:
dwustopniowe FPLC
LD50< 5 ng / larwę G. mellonella (Boguś ś M.I., Scheller K. (2002). Acta Parasitol. 47, 66-72)

Specific recognition of 30 kDa toxin
Western blot of C. coronatus
polypetides probed with anti-30kDa
rabbit IgGs. (1) 30kDa, (2) conidia,
(3) hyphae, (4) culture filtrate
Dot blot: (1) 30kDa toxin, (2) fungal
proteins accumulated in culture medium,
(3) BSA. NC filters were incubated with
anti- 30 kDa toxin (A) or anti-32kDa C.
coronatus proteinase (B).
Boguś M.I., Scheller K. (2002). Extraction of an insecticidal protein fraction from the pathogenic fungus Conidiobolus coronatus.
Acta Parasitologica 47(1):66-72

Czym C. coronatus zabija owady
1. Toksyczne białko 30 kDa
Izolacja:
dwustopniowe FPLC
LD50< 5 ng / larwę G. mellonella (Boguś ś M.I., Scheller K. (2002). Acta Parasitol. 47, 66-72)
2. Coronatin-1, toksyczne białko 36 kDa o
aktywności elastazy i chitynazy, tworzące kanały K +
LD50> 2,5 μg g / larwę ę G. mellonella
Izolacja:
dwustopniowe HPLC
(Wieloch W., Boguś M.I., MI Ligęza M.,
Koszela-Piotrowska I., Szewczyk A. (2011).
Toxicon 58:369–379 )

Coronatin-1 disrupts
G. mellonella hemocytes
Effects of addition of coronatin-1 (50 µg/ml) into
primary in vitro cultures of G. mellonella hemocytes.
Net formed by control hemocytes (A), disintegrated
nets (B – D), control plasmatocyte (E), shrinking
plasmatocytes (F – H), control spherulocyte (I),
disintegrating spherulocytes (J – L), vacuolized
plasmatocytes (M, R), apoptic hemocyte (N),
expanding hemocytes (O – P), disintegrated
hemocyte (Q).
Wieloch W., Boguś M.I., Ligęza M., Koszela-Piotrowska I., Szewczyk A. (2011).
Coronatin-1 isolated from entomopathogenic fungus Conidiobolus coronatus
kills Galleria mellonella hemocytes in vitro and forms potassium channels in
black lipid membrane. Toxicon 58:369–379.

Czym C. coronatus zabija owady
1. Toksyczne białko 30 kDa
LD50< 5 ng / larwę G. mellonella
Izolacja:
dwustopniowe FPLC
(Boguś ś M.I., Scheller K. (2002). Acta Parasitol. 47, 66-72)
2. Coronatin-1, toksyczne białko 36 kDa o
aktywności elastazy i chitynazy, tworzące kanały K +
LD50> 2,5 μg / larwę G. mellonella
Izolacja:
dwustopniowe HPLC
(Wieloch W., Boguś M.I., Ligęza M.,
Koszela-Piotrowska I., Szewczyk A. (2011).
Toxicon 58:369–379 )
3. Coronatin-2, Toksyczne białko 14,5 kDa
LD50> 2,5 μg / larwę G. mellonella
Izolacja:
dwustopniowe HPLC

Coronatin-2 disrupts
G. mellonella hemocytes
Effects of addition of coronatin-2 (177 µg/ml) into
primary in vitro cultures of G. mellonella hemocytes.
Disintegrating oenocyte (1-5), plasmatocytes
expelling cytoplasm (6-10), vacuolized
plasmatocytes (11-18), unhurt spherulocyte (19),
disintegrated nets (20 - 23), dividing control
plasmatocytes (24), nets formed by control
hemocytes (25 - 29).

Czym C. coronatus zabija owady
1. Toksyczne białko 30 kDa
Izolacja:
dwustopniowe FPLC
LD50< 5 ng / larwę G. mellonella (Boguś ś M.I., Scheller K., 2002. Acta Parasitol. 47, 66-72)
2. Coronatin-1, toksyczne białko 36 kDa o
aktywności elastazy i chitynazy, tworzące kanały K +
LD50> 2,5 μg g / larwę ę G. mellonella
Izolacja:
dwustopniowe HPLC
(Wieloch W., Boguś M.I., Ligęza M.,
Koszela-Piotrowska I., Szewczyk A. (2011).
Toxicon 58:369–379 379 )
3. Coronatin-2, Toksyczne białko 14,5 kDa
Izolacja:
LD50> 2,5 μg / larwę G. mellonella
dwustopniowe HPLC
(praca przygotowywana do druku)
4. Toksyczne białko 36 kDa
LD50> 5 μg / larwę G. mellonella
5. Niskocząsteczkowe niebiałkowe toksyny (grant MNiSW N303 341035)

Grant MNiSW nr N303 341035:
Owadobójcze metabolity glebowego grzyba Conidiobolus
coronatus: izolacja, charakterystyka chemiczna, mechanizm
uśmiercania owadów
Wykonane prace:
Grant został zakończony 9.09.2011
Frakcjonowanie filtratu poinkubacyjnego C. coronatus:
- ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi,
- rozdział na kolumnach z żelem krzenionkowym,
- analiza uzyskanych frakcji za pomocą TLC.
Identyfikacja związków chemicznych obecnych we frakcjach
- sprzężona chromatografia gazowa i spektrometria mas (GC-MS)
Badanie toksyczności uzyskanych frakcji wobec owadów i roztoczy:
- mucha domowa (Musca domestica)
- przędziorek chmielowiec (Tetranychus urticae)
Metody testowania:
- karaczan wschodni (Blatta orientalis)
nakraplanie na kutikulę, ekspozycja na bibule,
- mol woskowy (Galleria mellonella)
dodawanie do pokarmu, wstrzykiwanie do jamy
ciała.
- mucha plujka (Calliphora vicina)
Stosowane dawki: 0,025 – 50 µg/owada.
- lucila skórnica (Lucilia sericata)
- ścierwica mięsówka (Sarcophaga carnaria)
Badanie wpływu owadobójczych frakcji na tkanki i komórki owadzie:
- analiza histopatologiczna owadów
-wpływ na hemocyty G. mellonella oraz komórki Sf9 hodowane in vitro
Techniki:
mikroskopia fluorescencyjna,
cytometria przepływowa

Wyniki – podsumowanie
‣ Zidentyfikowano 49 związków uwalnianych przez grzyb do płynu hodowlanego.
‣ Otrzymano dwie wysoce aktywne biologicznie frakcje:
-A złożoną z 24 składników
- B zawierającą 1 składnik
Frakcja A:
- bardzo szybko i skutecznie zabija dorosłe muchy C. vicina, L. sericata i S. carnaria
-wywołuje patologiczne zmiany w cewkach Malpighiego much.
Przekrój przez cewki Malpighiego samicy L. sericata potraktowanej frakcją A.
A- cewka z owada kontrolnego, B – cewka z owada potraktowanego frakcją A.

Wyniki – podsumowanie
Dodanie frakcji A do hodowli in vitro:
- hemocytów G. mellonella
- powoduje zanik adherencji komórek do podłoża
Hodowla pierwotna hemocytów
G. mellonella (1,5 godziny od
założenia).
Hodowla pierwotna hemocytów
G. mellonella z dodatkiem d Frakcji A (200 µg/ml;
1,5 godziny od założenia)
- komórek Sf9 - stymuluje apoptozę
Hodowla komórek Sf9
kontrola
Hodowla komórek Sf9
z dodatkiem frakcji Frakcji A
(200 µg/ml)

Wyniki – podsumowanie
Frakcja B:
- zabija dorosłe muchy C. vicina, L. sericata i S. carnaria
- powoduje zaburzenia morfogenetyczne u larw C. vicina
- lekko upośledza wytwarzanie sieci in vitro przez hemocyty
G. mellonella
Zaburzenia rozwojowe C. vicina po
podaniu larwom Frakcji B
(50 µg/osobnika )
Hodowla pierwotna hemocytów
G. mellonella (20 godzin od założenia)
Hodowla pierwotna hemocytów G. mellonella
z dodatkiem Frakcji B (200 µg/ml; 20 godzin od założenia)

Reakcje obronne owadów zainfekowanych
C. coronatus
Larwy G. mellonella
podejmują próbę obrony.
Hemocyty podążają do
miejsca inwazji i próbują
wytworzyć kapsułę wokół
intruza.
Błona podstawna (bm), kutikula (c), epiderma (e), ciało tłuszczowe (fb),
hemocyty (hc), mięśnie (ms).
Boguś M.I. Szczepanik M. (2000). Histopathology of Conidiobolus coronatus infection in Galleria mellonella larvae. Acta. Parasitol. 45:48-54

In vitro response of insect
hemocytes to fungal conidia
5 min 1 h
15 min 6 h
Boguś M. I., Kędra E., Bania J., Szczepanik M., Czygier M., Jabłoński P., Pasztaleniec A., Samborski J., Mazgajska J., Polanowski A. (2007).
Different defense strategies of Dendrolimus pini, Galleria mellonella, and Calliphora vicina against fungal infection. Journal of Insect Physiology 53, 909–922

In vitro response of insect
haemocytes to fungal hyphae
2h
Weak response of hemocytes to
growing fungal hyphae
Boguś M. I., Kędra E., Bania J., Szczepanik M., Czygier M., Jabłoński P., Pasztaleniec A., Samborski J., Mazgajska J., Polanowski A. (2007).
Different defense strategies of Dendrolimus pini, Galleria mellonella, and Calliphora vicina against fungal infection. Journal of Insect Physiology 53, 909–922

Inne mechanizmy obronne owadów
zainfekowanych C. coronatus
1. Wzrost aktywności fagocytarnej plazmatocytów
Kędra E, Boguś M.I. (2006). The influence of Conidiobolus coronatus on phagocytic activity of insect hemocytes. Journal of Invertebrate Pathology 91: 50-52
Boguś M. I., Kędra E., Bania J., Szczepanik M., Czygier M., Jabłoński P., Pasztaleniec A., Samborski J., Mazgajska J., Polanowski A. (2007).
Different defense strategies of Dendrolimus pini, Galleria mellonella, and Calliphora vicina against fungal infection. Journal of Insect Physiology 53, 909–922

Measurements of the in vivo and in vitro phagocytizing
activity of hemocytes from the three insect species
% of phagocytizing plasmatocytes ± SEM
Insect species N Control larvae N Infected
larvae
Dendrolimus pini
in vivo 12 13 ± 2 a 12 16 ± 3 c
in vitro 15 7 ± 1 ab 18 18 ± 2 bc
Galleria mellonella
in vivo 7 14 ± 2 b 5 65 ± 5 abc
in vitro 18 12 ± 3 b 13 33 ± 6 abc
Calliphora vicina
in vivo 7 4 ± 1 bc 4 8 ± 1 abc
in vitro 18 3 ± 1 c 7 2 ± 2 ac
a - differences between measurements performed in vivo and in vitro statistically significant at P

Inne mechanizmy obronne owadów
zainfekowanych C. coronatus
1. Wzrost aktywności fagocytarnej plazmatocytów
2. Wzrost aktywności oksydazy polifenolowej w hemolimfie
Boguś M I Kędra E Bania J Szczepanik M Czygier M Jabłoński P Pasztaleniec A Samborski J Mazgajska J Polanowski A (2007)
Boguś M. I., Kędra E., Bania J., Szczepanik M., Czygier M., Jabłoński P., Pasztaleniec A., Samborski J., Mazgajska J., Polanowski A. (2007).
Different defense strategies of Dendrolimus pini, Galleria mellonella, and Calliphora vicina against fungal infection. Journal of Insect Physiology 53, 909–922

Phenoloxidase activity of the larval hemolymph
from the three insect species
PO activity (U/ml of hemolymph ± SEM)
Insect species N Control larvae N Infected larvae
Dendrolimus pini 35 3708 ± 294 a 6 3928 ± 612 a
Galleria mellonella 127 2020 ± 119 a 32 1020 ± 160 b
Calliphora vicina 44 1064 ± 163 a 24 1192 ± 280
a - differences between insect species statistically significant at P

Inne mechanizmy obronne owadów
zainfekowanych C. coronatus
1. Wzrost aktywności fagocytarnej plazmatocytów
2. Wzrost aktywności oksydazy polifenolowej w hemolimfie
3. Wzrost poziomu lizozymu
Boguś M I Kędra E Bania J Szczepanik M Czygier M Jabłoński P Pasztaleniec A Samborski J Mazgajska J Polanowski A (2007)
Boguś M. I., Kędra E., Bania J., Szczepanik M., Czygier M., Jabłoński P., Pasztaleniec A., Samborski J., Mazgajska J., Polanowski A. (2007).
Different defense strategies of Dendrolimus pini, Galleria mellonella, and Calliphora vicina against fungal infection. Journal of Insect Physiology 53, 909–922

Influence of fungal infection on the lysozyme-like
activity in hemolymph of the three insect species
EWL equivalents (µg / ml of hemolymph h ± SEM)
Insect species N Control
larvae
N
Infected
larvae
Dendrolimus pini 5 21 ± 1 a 6 102 ± 31 ab
Galleria mellonella 6 290 ± 61 a 6 504 ± 94 ab
Calliphora vicina 3 3 ± 0 a 3 6 ± 0 ab
EWL Egg White Lysozyme (EC 3.2.1.17)
a - differences between insect species statistically significant at P

Inne mechanizmy obronne owadów
zainfekowanych C. coronatus
1. Wzrost aktywności fagocytarnej plazmatocytów
2. Wzrost aktywności oksydazy polifenolowej w hemolimfie
3. Wzrost poziomu lizozymu
4. Wzrost poziomu cekropiny
Boguś M I Kędra E Bania J Szczepanik M Czygier M Jabłoński P Pasztaleniec A Samborski J Mazgajska J Polanowski A (2007)
Boguś M. I., Kędra E., Bania J., Szczepanik M., Czygier M., Jabłoński P., Pasztaleniec A., Samborski J., Mazgajska J., Polanowski A. (2007).
Different defense strategies of Dendrolimus pini, Galleria mellonella, and Calliphora vicina against fungal infection. Journal of Insect Physiology 53, 909–922

Influence of fungal infection on the cecropin-like
activity in hemolymph of the three insect species
Cecropin equivalents (µg / ml of hemolymph h ± SEM)
Insect species N Control
larvae
N
Infected
larvae
Dendrolimus pini 5 0 5 0
Galleria mellonella 7 0 7 1.1 ± 0.7
Calliphora vicina 4 1.5 ± 1.5 5 3.5 ± 2.0
Differences statistically insignificant
Boguś M. I., Kędra E., Bania J., Szczepanik M., Czygier M., Jabłoński P., Pasztaleniec A., Samborski J., Mazgajska J., Polanowski A. (2007).
Different defense strategies of Dendrolimus pini, Galleria mellonella, and Calliphora vicina against fungal infection. Journal of Insect Physiology 53, 909–922

Inne mechanizmy obronne owadów
zainfekowanych C. coronatus
1. Wzrost aktywności fagocytarnej plazmatocytów
2. Wzrost aktywności oksydazy polifenolowej w hemolimfie
3. Wzrost poziomu lizozymu
4. Wzrost poziomu cekropiny
5. Obecność lipidów na powierzchni kutikuli
Gołębiowski M., Boguś M. I., Paszkiewicz M., Stepnowski P. (2010). The composition of the free fatty acids from Dendrolimus pini exuviae.
Journal of Insect Physiology 56:391-397
Boguś M.I., Czygier M., Gołębiowski M., Kędra E., Kucińska J., Mazgajska J., Samborski J., Wieloch W., Włóka E. (2010) Effects of insect
cuticular fatty acids on in vitro growth and pathogenicity of the entomopathogenic fungus Conidiobolus coronatus. Experimental
Parasitology 125:400-408

Semi-thin sections of
C. coronatus - infected
insect larvae:
(a) Dendrolimus pini
(b) Galleria mellonella
(c) Calliphora vicina
Abbreviations:
bm - basement membrane
cu - cuticle
ep - epidermis
fb - fat body
co - fungal conidia
hy - fungal hyphae
mc - melanotic capsule
ms - muscles
Scale bars - 100 nm
Boguś M. I., Kędra E., Bania J., Szczepanik M., Czygier M., Jabłoński P., Pasztaleniec A., Samborski J., Mazgajska J., Polanowski A. (2007).
Different defense strategies of Dendrolimus pini, Galleria mellonella, and Calliphora vicina against fungal infection. Journal of Insect Physiology 53, 909–922

zarodniki C. coronatus nie kiełkują na kutikuli Calliphora vicina

Wpływ kwasów tłuszczowych obecnych w pożywce na
wzrost ti patogeniczność C. coronatus
Wytwarzanie zarodników:
stymulacja: C50 C5:0, C60 C6:0, C62 C6:2, C70 C7:0
hamowanie: C8:0, C9:0, C10:0, C12:0,C16:0, C16:1, C18:0, C18:1, C18:2, C18:3,
C20:0, C20:1
Zdolność do infekowania owadów:
stymulacja: C16:1
hamowanie: C5:0, C6:0, C6:2, C7:0, C10:0, C12:0, C14:0, C15:0, C16:0, C18:0, C18:1,
C18:3, C20:0, 0 C20:1
Biomasa grzyba:
stymulacja: C15:0
hamowanie: C6:2, C9:0, C12:0, C14:0, C16:0, C16:1, C18:0, C18:1, C18:2, C18:3,
C20:0, C20:1
Uwalnianie do medium toksycznych metabolitów:
stymulacja: C6:2
hamowanie: C16:1, C18:3, C20:0, C20:1
Kwasy obecne na kutikuli Calliphora vicina
K
w

Mechanizmy komórkowej
odpowiedzi immunologicznej mola
woskowego Galleria mellonella
mgr Marta Ligęza‐Żuber

Model badawczy ‐ Galleria mellonella
Szkodnik:
• niszczy plastry wosku podczas składowania
• zjada zapasy pierzgi
• zanieczyszcza ul odchodami
• zmienia bilans termiczny w ulu
Galleria mellonella = mol woskowy = barciak większy

Hodowla w warunkach laboratoryjnych
1. Temp.30-34 ºC
2. Ciemność
3. Pokarm syntetyczny według
receptury Sehnala (1966)

Wrodzone mechanizmy odpowiedzi immunologicznej owadów
Szkielet zewnętrzny
chityna i nabłonki
Jama ciała
z
a
k
a
ż
e
n
i
e
Odpowiedź systemowa
Odpowiedź komórkowa
Odpowiedź humoralna
-Fagocytoza
-Nodulacja
-Enkapsulacja
-Koagulacja
-Melanizacja
-Peptydy
odpornościowe
-ROI i RNI
Odpowiedź lokalna
-Inhibitory
metaloproteinaz

Hodowla komórkowa – in vitro
Medium hodowlane zmodyfikowane dfk dla hemocytów G. mellonella:
• GIM (Grace insect medium) wzbogacone o NaCl oraz o NaHCO 3 (pH 6,6)
• Dodatek PTU (fenylotiomocznik) – zabezpiecza przed melanizacją,
• Gentamycyna (75µg/ml) –chroni przed zakażeniami bakteryjnymi
• Amfoterycyna B (0,75 µg/ml) –chroni przed zakażeniami grzybiczymi
• Hodowla prowadzona w cieplarce (30°C),na płytkach 24 dołkowych,
obserwowana co 24h(lub częściej) pod mikroskopem z odwróconym
układem optycznym – komórki potrafią
przeżyć do ok. 10 dni
PTU
27.02.2011

Typy komórek owadzich (hemocytów) występujących
w hemolimfie Galleria mellonella
sferulocyty
prohemocyty
plazmatocyty
granulocyty
oenocyty
małe plazmatocyty
20 µm

a)
Sf
Hemocyty Galleria mellonella
c)
Oe
Pr
Gr
Pl
b)
Sf
Gr a) Obraz świeżej hodowli hemocytów in vitro
Pl
b) Obraz świeżej hemolimfy na szkiełku podstawowym
c) Próba rozdziału hemocytów przy pomocy cytometrii
przepływowej

Hodowla hemocytów in vitro
10 min 24h 48h
melanizacja
3 doba 5 doba 5 doba 200x powiększenie

Podstawowe mechanizmy komórkowej
odpowiedzi immunologicznej
25 µm
bakterie
25 µm
25 µm
nodulacja melanizacja fagocytoza

Sortowanie komórek przy pomocy cytometru FACSAria
Inkubacja rozdzielonych
komórek z bramki P1
1h inkubacji
16h inkubacji

Wpływ homogenatu C. coronatus na hodowle
komórkowe in vitro G. mellonella
K K+BSA 60µg/ml 120µg/ml
1h
24h
48h

Wpływ ‘przesączu’ grzybowego na hodowle komórkowe in vitro
oraz na larwy G. mellonella
5 min
10min
20 min
30 min
50 min
Larwy po iniekcji 5µl
‘przesączem’ grzybowym
1h sf 1,5h Kontrola
Kontrola
Larwa nastrzyknięka 5 µl IPS

Typy śmierci komórkowej
Programowana śmierć komórkowa Przypadkowa śmierć komórkowa
Śmierć komórki zaprogramowane genetycznie Śmierć komórki nie kontrolowana genetycznie
„samobójstwo komórki”, eliminacja komórek wywołana przez czynniki patologiczne, zewnątrzniepotrzebnych
lub nieprawidłowych komórkowe
APOPTOZA NEKROZA

Indukowana apoptoza
Substancje chemiczne
‐ staurosporyna –hamuje działanie różnych kinaz proteinowych, łączy się z ATP
blokując wiążącą domenę. Zaburza cytoszkielet komórek.
‐ nadtlenek wodoru (H 2 O 2 ) – wolne rodniki, uszkadzanie DNA
‐ aktynomycyna D –blokada syntezy RNA
Czynnik fizyczny
‐światło UV –uszkadza materiał genetyczny
50s UV, 24h inkubacji 6h inkubacji ze staurosporyną (2µM) H 2 O 2 0, 6%
M K 3 6
15 h inkubacji z aktynomycyną D (3‐6 µg/ml)

GFP certified Apoptosis/Necrosis kit (Enzo)
Aneksyna V – EnzoGold –białko wiążące się z fosfolipidami skoniugowane z barwnikiem
fluorescencyjnym, posiada wysokie powinowactwo do fosfatydyloseryny (składnik
wewnętrznej części błony komórkowej, który podczas apoptozy przechodzi do warstwy
zewnętrznej).
Czerwony barwnik (7AAD) – posiada powinowactwo do DNA, barwi jądro. Detektor
późnej apoptozy i nekrozy kiedy to błona cytoplazmatyczna traci swoją ciągłość i staje
się przepuszczalna.
Staurosporyna – induktor apoptozy, wykorzystywana jako pozytywna kontrola

Infekowanie larw Galleria mellonella grzybem
entomopatogennym Conidiobolus coronatus
• Hodowano C.coronatus na podłożu stałym
Saburauda (6 dni, 20’C, zmieniające się warunki
oświetlenia 12:12)
• Na zarodnikującego grzyba nakładano larwy
G. mellonella
Conidiobolus coronatus
• Po 24h zdejmowano larwy z grzyba i
umieszczano je na szalce wraz z ich pokarmem
• Z larw z oznakami zainfekowania (czarne plamki)
pobierano hemolimfę ę do dalszych badań (Enzo
kit, cytometria przepływowa)
Zdrowe larwy Zifk Zainfekowane larwy

Cytometria przepływowa
Negatywna kontrola – hemocyty ze zdrowych larw
Pozytywna Kontrola –hemocyty inkubowane ze staurosporyną
Hemocyty z larwy zainfekowanej – 24h po infekcji grzybowej
A –apoptoza, N –nekroza A/N –stan przejściowy pomiędzy apoptozą a nekrozą

Mikroskopia fluorescencyjna
1a
1b
1c
Kontrola pozytywna – indukcja staurosporyną
2a 2b 2c
Kontrola negatywna –hemocyty ze zdrowych
larw
3a 3b 3c
Hemocyty z larw zainfekowanych (24h po kontakcie z grzybem)

WNIOSKI
• C. coronatus produkuje toksyczne matabolity, które upośledzają działanie
układu odpornościowego owadów poprzez zaburzanie fizjologicznych funkcji
hemocytów – owadzich komórek immunologicznie kompetentnych
• Część substancji przetestowanych w naszych badaniach prowadzi do
uśmiercania komórek na drodze wzmożonej apoptozy
• Związki te w przyszłości mogą posłużyć jako potencjalne bioinsektycydy do
Związki te w przyszłości mogą posłużyć jako potencjalne bioinsektycydy, do
zwalczania szkodników owadzich

Enzymy grzyba Conidiobolus coronatus
badane w
Instytucie Parazytologii PAN w Warszawie
dr Emilia Włóka

Mechanizm porażania owadów przez grzyb entomopatogenny
(wg Ferron, 1985; Clarkson i Charnley, 1996; Vilcinskas i Götz, 1999 z modyfikacjami)
1
.
.
.
.
7
.
.
.
.
2
Z Z A 3
.
.
.
.
epikutikula
.
.
4
.
. .
prokutikula
P
L .
CH
.
.
epiderma
hemocel
6
CS
CS
CS
CS
CT
5
.
.
.
.
Z - zarodnik, A - appresorium, P - proteazy, CH - chitynazy, L - lipazy, CS - ciała strzępkowe, CT - ciało
tłuszczowe

Materiał badawczy
C. coronatus na pożywce Sabouraud z
dodatkiem homogenatu z larw Galleria
mellonella (SAPG)
C. coronatus na pożywce
Sabouraud (SAP)
Hodowla C. coronatus płynna w pożywce
minimalnej MM
Hodowla C. coronatus płynna w
pożywce bogatej LB

Enzymy wytwarzane przez grzyb C.coronatus:
• PR1, PR2 (1)
• proteaza serynowa, będąca prawdopodobnie odpowiednikiem PR3 (2)
• niskocząsteczkowa proteaza (32 kDa) (3)
• niskocząsteczkowa proteaza 27-28,5 kDa (4)
•białko o aktywności elastolitycznej oraz białko wykazujące aktywność
zarówno elastylityczną jak i chitynolityczną (5)
(1) Phadatar SU,. Srinivasan MC, Deshpande VV. (1992) Evidence for controlled autoproteolysis of alcaline protease. A
mechanism for physiological regulation of conidial discharge in Conidiobolus coronatus. Eur J Biochem. 205.679-886
(2) Bania J., Polanowski A., Boguś M.I. (2000). Specifity of an extracellular proteinase from Conidiobolus coronatus and its
inhibition by selected inhibitors. Acta Parasitol. 45, 247
(3) Okafor J.I. (1994). Purification and characterization of protease enzymes of Basidiobolus and Conidiobolus species. Mycoses
37, 265-269
269
(4) Tanksale A.M., Vernekar J.V., Ghate M.S., Deshpande V.V. (2000). Evidence for tryptophan in proximity to histidine and
cysteine as essential to the active site of an alkaline protease. Biochemical and Biophysical Research Communications 270,
910-917.
(5) Wieloch W (2007) Toksyczne metabolity wytwarzane przez pasożytniczy grzyb Conidiobolus coronatus Wiadomości
(5) Wieloch W. (2007) Toksyczne metabolity wytwarzane przez pasożytniczy grzyb Conidiobolus coronatus. Wiadomości
Parazytologiczne 53(4) 355-357

Enzymy badane w Instytucie Parazytologii PAN:
• elastaza
• N-acetyloglukozaminidaza (NAGaza)

Enzymy badane w Instytucie Parazytologii PAN:
• chitobiozydaza
• lipaza

Opracowanie metod oznaczania enzymów:
• optymalna objętość mieszaniny reakcyjnej
A410
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0 10 20 30 40 50
0,5ml
0,6ml
0,7ml
0,8ml
0,9ml
1ml
A405
16
,6
1,4
1,2
1
0,8
06
,6
0,4
0,2
0
0 10 20 30 40 50
0,5ml
1ml
czas (min)
czas (min)
elastaza
N-acetyloglukozaminidaza
350
300
250
200
150
100
50
0
0 20 40 60 80 100
0,5ml
1ml
2ml
inten nsywność fluoresc cencji
6
5
4
3
2
1
0
0 20 40 60 80 100
0,5ml
1ml
2ml
czas (min)
czas (min)
chitobiozydaza
lipaza

Opracowanie metod oznaczania enzymów:
• optymalna dawka homogenatu
czas (min)
A dA/min ( SD)
09
410 (SD)
0,9
1
2
25 2,5
3
4
5
elastaza - 1l
0,224 ( 0,009)
0,321 ( 0,007)
0437( 0,437 ( 0,005) 005)
0,447 ( 0,012)
0,644 ( 0,001)
0835( 0,835 0,006) 006)
0,224 ( 0,009)
0,160 ( 0,015)
0175( 0,175 ( 0,012) 012)
0,149 ( 0,036)
0,161 ( 0,003)
0167( 0,167 0,028) 028)
A405
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
N-acetyloglukozaminidaza
czas (min)
350
300
250
200
150
100
50
0
0 25 50 75 100
czas (min)
chitobiozydaza
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0 20 40 60 80 100
czas (min)
lipaza

Opracowanie metod oznaczania enzymów:
• temperatura
elastaza
N-acetyloglukozaminidaza
chitobiozydaza
lipaza

Opracowanie metod oznaczania enzymów:
• optymalne pH
aktywność (%)
100
80
60
40
20
24
30
54,5
100
64
42
21
15
0
4 5 6 7 8 9 10 11
pH
elastaza
N-acetyloglukozaminidaza
chitobiozydaza
lipaza

• optymalne stężenie substratu
substrat: N-sukcynylo-Ala-Ala-Pro-Leu p-nitroanilid
aktywność ć (dA/min)
0,1
2 mM
0,08
1 mM
0,06
0,5 mM
0,04
0,25 mM
0,02
0,125 mM
0,625 mM
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
S [mM]
elastaza
substrat: 4-MU- β-D-N-N’-diacetylochitobiozyd
aktywność (dF F/min)
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0,01 mM
0005mM 0,005 0,0025 mM
0,00125 mM
0,02 mM
0,04 mM
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
chitobiozydaza
S [mM]
substrat: 4-nitrofenylo-N-acetylo-ß-D-glukozaminid
aktywnoś ść (dA/min)
0,035
0,03
0,025
0,02
0,015
0,01
0,005005
0
0,075 mM
0,0375 mM
0,15 mM
0,3 mM
0,6 mM
0 2 4 6 8 10 12
S [mM]
N-acetyloglukozaminidaza
substrat: oleinian 4-MU
aktywność (dF F/min)
2,5
2
1,5
1
0,5
0
lipaza
0,05 mM
0025 mM
0,0125 mM
0,00625mM
0,003125 mM
01mM 0,1 0,2 mM
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
S [mM]

•stałe katalityczne
substrat: N-sukcynylo-Ala-Ala-Pro-Leu p-nitroanilid
Stężenie substratu
substrat: 4-nitrofenylo-N-acetylo-ß-D-glukozaminid
Stężenie substratu
Roztwór
podstawowy
[mM]
W
mieszaninie
reakcyjnej
[mM]
dA/min ( SD)
K m
[mM]
V max
(dA/min)
Roztwór
podstawowy
[mM]
W
mieszaninie
reakcyjnej
[mM]
dA/min ( SD)
K m
[mM]
V max
(dA/min)
40 2 0,092 ( 0,025)
20 1 0,067 ( 0,052)
10 0,5 0,041 ( 0,011)
5 0,25 0,025 ( 0,007)
2,5 0,125 0,014 ( 0,004)
21,2525 014 0,14
12 0,6 0,027 ( 0,010)
6 0,3 0,029 ( 0,010)
3 0,15 0,026 ( 0,008)
1,5 0,075 0,019 ( 0,008)
0,6 0,03
1,25 0,0625 0,009 ( 0,012)
elastaza
0,75 0,0375 0,012 ( 0,008)
N-acetyloglukozaminidaza
substrat: 4-MU- β-D-N-N’-diacetylochitobiozyd
Stężenie substratu
Roztwór
podstawowy
[mM]
W
mieszaninie
reakcyjnej
[mM]
dF/min ( SD)
K m
[mM]
V max
(dF/min)
substrat: oleinian 4-MU
Stężenie substratu
W
Roztwór
i i
dF/min (SD) K m [mM]
mieszaninie
podstawowy
reakcyjnej
[mM]
[mM]
10 0,2 2,115 ( 3,955)
V max
(dF/min)
4 0,04 3,220 ( 1,567)
5 0,1 1,787 ( 4,154)
2 0,02 3,246 ( 1,287)
2,5 0,05 1,763 ( 4,450)
1 0,01 2,268 ( 1,038)
0,5 0,005 1,249 ( 0,429)
1,2 4,35
1,25 0,025 1,586 ( 6,524)
0,625 0,0125 1,260 ( 1,893)
0,45 2,13
0,25 0,0025 0,689 ( 0,311)
0,3125 0,00625 1,096 ( 2,093)
0,125 0,00125 0,353 ( 0,487)
chitobiozydaza
0,15625 0,003125 0,869 ( 1,711)
lipaza

Izolacja NAGazy przy pomocy HPLC
Rozdział homogenatu grzyba
C. coronatus na kolumnie DEAE
Frakcja
Aktywność
enzymatyczna
NAGaza
Chitobiozydaza
Lipaza
dA/min dF/min dF/min
( SD) ( SD) ( SD)
Homogenat
Fr1
0,0200 1,680
2,60
( 0,00020002 ) ( 0,140) ( 0,31)
0,0100
( 0,0005)
Fr2 -
Fr3 -
Fr4 -
1,250
( 0,290)
0,020
( 0,120)
0,070
( 0,005)
0,070
( 0,005)
0,14
( 0,13)
-
0,38
( 0,05)
0,14
( 0,17)
Bufor E: 20 mM Na 2 HPO 4 /NaH 2 PO 4 pH 8,0
Bufor F: 20 mM Na 2HPO 4/NaH 2PO 4 pH 8,0 + 1M NaCl.
Szybkość przepływu: 0,5 ml/min
granice zbieranych frakcji, — gradient buforu F

Masa cząsteczkowa NAGazy z grzyba C. coronatus (60 kDa)
M - wzorzec masy
H++T - homogenat + bufor próbkowy z –merkaptoetanolem
k t t l
(1:2),próby poddane denaturacji cieplnej
Żel wybarwiony w Coomassie
H1+
H1-
H2-
H3-
- homogenat + bufor próbkowy z –merkaptoetanolem
(1:2), próby nie poddane denaturacji cieplnej
- homogenat + bufor próbkowy bez –merkaptoetanolu
(1:2), próby nie poddane denaturacji cieplnej
- homogenat + bufor próbkowy bez –merkaptoetanolu
(1:3), próby nie poddane denaturacji cieplnej
- homogenat + bufor próbkowy bez –merkaptoetanolu
(1:1,5), próby nie poddane denaturacji cieplnej
, -położenie NAGazy
Zymogram (4-metylumbelliferylo-N-acetylo-β-D-glukozaminid)

Proponowany model penetracji kutikuli z udziałem
enzymów proteo- , chityno- i lipolitycznych grzyba
C. coronatus
Budowa kutikuli owadów
EPIKUTIKULA
egzokutikula
PROKUTIKULA
endokutikula
epiderma
błona podstawna
Kolejność penetracji
kutikuli:
1. lipazy i proteazy
(elastaza)
2. enzymy
chitynolityczne
GS
CT
hemocel
GS - gruczoł skórny, CT - ciało tłuszczowe

Wpływ ekstraktów
kutikularnych na wzrost grzyba C. coronatus
Test dyfuzyjny
C. coronatus na pożywce
SAPG
Pożywka SAP
A-DMSO (K), B-próba bez rozcieńczenia , C-5x , D-10x , E-50x , F-100x , G-500x , H-1000x

Wpływ ekstraktów z Blattella germanica i Blatta orientalis na grzyb
C. coronatus
Nr próbki
Owad
Stadium
rozwojowe
Wyjściowa ilość
ekstraktu (mg)
10 Blattella ll germanica Imago samice 502 5,02
11 Blattella germanica Imago samce 5,07
13 Blatta orientalis Imago samice 5,14
16 Blatta orientalis 22-dniowe nimfy 4,93
Samce po infekcji
18 Blatta orientalis grzybem C.
4,90
coronatus
19 Blatta orientalis
Samice po infekcji
grzybem C.
5,18
coronatus
Blattella germanica
Blatta orientalis
insetti.org
www.insectimages.org
Pożywka SAP, wzrost grzyba 14 dni (20 o C)
A-DMSO, B-próba bez rozcieńczenia, C-5x, D-10x, E-50x, F-100x, G-500x, H-1000x

Wpływ ekstraktów z Musca domestica na grzyb C. coronatus
Musca domestica imago
Musca domestica poczwarka
Musca domestica larwa
en.wikipedia.org
www.oregonfeederinsects.com
www.oregonfeederinsects.com
Nr próbki
Owad
Stadium
rozwojowe
Rodzaj
ekstraktu
Wyjściowa ilość
ekstraktu (mg)
25 Musca domestica Imago samice EN 2,3
26 Musca domestica Imago samice CM 19 1,9
27 Musca domestica Imago samice CM z owadami 4,4
28 Musca domestica Imago samce EN 2,5
29 Musca domestica Imago samce CM 2,7
30 Musca domestica Imago samce CM z owadami 22 2,2
31 Musca domestica Larwy EN 2,5
32 Musca domestica Larwy CM 3,2
33 Musca domestica Larwy CM z owadami 3,3
40 Musca domestica Poczwarki EN 1,0
41 Musca domestica Poczwarki CM 1,2
42 Musca domestica Poczwarki CM z owadami 2,0
EN - ekstrakcja eterem naftowym, CM – ekstrakcja chlorkiem metylenu, CM z owadami – połączone
ekstrakty

Pożywka SAP, wzrost grzyba 14 dni (20 o C)
A-DMSO, B-próba bez rozcieńczenia, C-5x, D-10x, E-50x, F-100x, G-500x, H-1000x

Wpływ substancji obecnych na kutikuli owadów
na wzrost i rozwój grzyba C. coronatus
Badane związki:
• Alkohol 10 (alkohol kaprylowy)
• Alkohol 12 (alkohol laurylowy)
• Alkohol 14 (alkohol mirystylowy)
• Alkohol 16 (alkohol cetylowy)
• Alkohol 18 (alkohol stearylowy)
• Alkohol l 20 (alkohol l arachidylowy)
• Alkohol 22 (alkohol behenylowy)
• Alkohol 24 (alkohol lignocerylowy)
• Alkohol 26 (alkohol cerylowy)
• Alkohol 28 (alkohol oktylowy)
• Alkohol 30 (alkohol melisylowy)
• Octan tokoferolu
• Oleinian butylu
• Oleinian glicerolu
• Skwalen
• Stearynian butylu
Badane elementy fizjologii grzyba:
• sporulacja (podłoże SAP)
• wirulencja (podłoże SAP)
• uzyskiwana biomasa (pożywka MM)
• toksyczność uwolnionych metabolitów (pożywka MM)
• aktywność enzymów proteo-, chityno- i lipolitycznych
(pożywka MM)

Hodowla stała – badanie wirulencji
C. coronatus na pożywce SAPG
1. 2. 3. 4. 5. 6.
1. – larwa nie zainfekowana 2. - 6. –różne stadia infekcji
Zarodniki grzyba Conidiobolus coronatus
C. coronatus na pożywce ż SAP
www.mpld.ph

Hodowla płynna – wpływ na wzrost grzyba
Elastaza
Filtrat
grzybowy
Białko (Bradford)
NAGaza
Chitobiozydaza
Lipaza
Pożywka minimalna MM
Elastaza
Białko (Bradford)
NAGaza
Chitobiozydaza
Zliofilizowana grzybnia dla kontroli i po
wzroście z dodatkiem octanu tokoferolu
Lipaza

DZIĘKUJEMY ZA UWAGĘ