Nanoparticles for in-vitro and in-vivo biosensing and imaging
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UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI MILANO BICOCCA<br />
Scuola di Dottorato di Scienze<br />
Corso di Dottorato di Ricerca <strong>in</strong> Fisica e Astronomia<br />
Laura Sironi<br />
Matricola 041003<br />
<strong>Nanoparticles</strong> <strong>for</strong> <strong>in</strong>-<strong>vitro</strong> <strong>and</strong> <strong>in</strong>-<strong>vivo</strong><br />
biosens<strong>in</strong>g <strong>and</strong> imag<strong>in</strong>g<br />
Tutore<br />
Prof. Giuseppe Chirico<br />
Coord<strong>in</strong>atore<br />
Prof. Claudio Destri<br />
Ciclo XXIII 2008-2010
Negli ultimi due decenni numerosi studi si sono concentrati sul cambiamento delle proprietà<br />
chimiche e fisiche di un materiale a seguito della riduzione a scale nanometriche delle sue<br />
dimensioni. Questi studi hanno rivelato molteplici applicazioni possibili per le nanostrutture, che<br />
sono impiegate, per esempio, <strong>in</strong> biologia e medic<strong>in</strong>a per ottenere immag<strong>in</strong>i, per <strong>in</strong>dividuare<br />
situazioni patologiche, per diagnosi, come sensori e per la terapia fototermica.<br />
I metalli nobili (soprattutto oro e argento) sono particolarmente versatili ai f<strong>in</strong>i di queste applicazioni<br />
grazie a un fenomeno conosciuto come oscillazione dei plasmoni di superficie (SPR): si tratta di<br />
un’oscillazione <strong>in</strong> fase degli elettroni della b<strong>and</strong>a di conduzione, <strong>in</strong>dotta da un campo<br />
elettromagnetico <strong>in</strong>cidente. Questa oscillazione è risonante con la radiazione <strong>in</strong>cidente stessa a<br />
una particolare frequenza dipendente da <strong>for</strong>ma, dimensioni, orientazione e costante dielettrica<br />
della nano particella (NP). L’accoppiamento tra SPR e campo elettromagnetico <strong>in</strong>cidente<br />
determ<strong>in</strong>a l'aumento della proprietà radiative (come assorbimento e scatter<strong>in</strong>g) della nano<br />
particella; la loro sezione d’urto di est<strong>in</strong>zione è 10 5 -10 6 volte maggiore rispetto ai coloranti organici<br />
e risultano <strong>in</strong>oltre altamente fotostabili e, a seconda della <strong>for</strong>ma, sono <strong>in</strong> grado i convertire <strong>in</strong> modo<br />
efficiente luce <strong>in</strong> calore.<br />
La risonanza plasmonica, variabile nella parte visibile (per NP sferiche) o del vic<strong>in</strong>o <strong>in</strong>frarosso dello<br />
spettro elettromagnetico (per NP anisotrope) può <strong>in</strong>oltre <strong>in</strong>teragire con l’emissione di fluorescenza<br />
dei coloranti e modificarne di conseguenza la brillanza e il tempo di vita dello stato eccitato.<br />
A seconda della distanza fluoro<strong>for</strong>o-NP e dell’anisotropia delle NP si può ottenere un aumento o<br />
una dim<strong>in</strong>uzione della fluorescenza. In entrambi i casi, ci si aspetta che <strong>in</strong> seguito a un<br />
cambiamento della costante dielettrica delle NP, <strong>in</strong>dotta ad esempio <strong>in</strong> seguito al riconoscimento di<br />
una prote<strong>in</strong>a che avviene sulla superficie della nanoparticella, avvenga un cambiamento nelle<br />
proprietà di emissione dei fluoro<strong>for</strong>i.<br />
Gli effetti della risonanza di superficie diventano <strong>in</strong>oltre particolarmente importanti se comb<strong>in</strong>ati con<br />
l’eccitazione a due fotoni (TPE), che consiste nell’assorbimento simultaneo di due fotoni, ciascuno<br />
di energia pari alla metà di quella necessaria ad eccitare una molecola dal livello fondamentale al<br />
primo stato eccitato. Questa tecnica risulta particolarmente utile nel contesto di questo lavoro di<br />
ricerca perché <strong>in</strong>fluisce anche sulla resa quantica di lum<strong>in</strong>escenza di NP anisotrope: grazie a<br />
fenomeni non l<strong>in</strong>eari come la TPE l'<strong>in</strong>tensità di lum<strong>in</strong>escenza (TPL) viene aumentata (se<br />
accoppiata con una appropriata risonanza plasmonica) di molti ord<strong>in</strong>i di gr<strong>and</strong>ezza rispetto a<br />
quanto si ottiene con eccitazioni a s<strong>in</strong>golo fotone di superici lisce, rendendo qu<strong>in</strong>di queste<br />
nanoparticelle particolarmente utili per imag<strong>in</strong>g <strong>in</strong>-<strong>vivo</strong> nella regione del vic<strong>in</strong>o <strong>in</strong>frarosso dello<br />
spettro elettromagnetico.<br />
La TPE offre una serie di vantaggi unici per studi biologici sia <strong>in</strong>-<strong>vitro</strong> che <strong>in</strong>-<strong>vivo</strong>. La b<strong>and</strong>a di<br />
assorbimento a due fotoni dei coloranti utilizzati tradizionalmente <strong>in</strong> biologia è ampia rispetto<br />
all’analogo caso a s<strong>in</strong>golo fotone permettendo l’eccitazione simultanea di piùfluoro <strong>for</strong>i con una<br />
s<strong>in</strong>gola lunghezza d’onda. Inoltre, il fatto di usare una lunghezza d’onda <strong>in</strong>frarossa permette<br />
un’alta penetrazione nei tessuti grazie al ridotto scatter<strong>in</strong>g. L’eccitazione ha luogo solamente nel<br />
piano focale poiché la probabilità di assorbire contemporaneamente due fotoni dipende dal<br />
quadrato dell’<strong>in</strong>tensità <strong>in</strong>cidente. Come conseguenza, i fenomeni di foto-tossicità e fotodanneggiamento<br />
risultano notevolmente ridotti. Questi vantaggi fanno della TPE una tecnica<br />
assodata per la ricerca scientifica biologica e medica, che può essere accoppiata all’utilizzo di<br />
nanoparticelle d’oro anisotrope.
In accordo con queste considerazioni, il progetto di ricerca si è sviluppato lungo due l<strong>in</strong>ee<br />
pr<strong>in</strong>cipali, legate all’uso delle nano particelle come sensori e mezzi di contrasto per imag<strong>in</strong>g non<br />
l<strong>in</strong>eare.<br />
Lo scopo della prima parte del progetto di ricerca è quello di sfruttare il cambiamento del tempo di<br />
vita e della brillanza di un colorante, <strong>in</strong>dotto dall’<strong>in</strong>terazione con i plasmoni di superficie, per<br />
rilevare piccole quantità di prote<strong>in</strong>a <strong>in</strong> soluzione <strong>in</strong> condizioni fisiologiche. Il sistema studiato è<br />
basato sull’uso di nanoparticelle d’oro del diametro di 5 e 10 nm a cui vengono legati (grazie a un<br />
ponte streptavid<strong>in</strong>a-biot<strong>in</strong>a) il colorante FITC e l’anticorpo specifico per la prote<strong>in</strong>a da riconoscere.<br />
L’<strong>in</strong>terazione del fluoro<strong>for</strong>o con la risonanza dei plasmoni della superficie d’oro, che avviene<br />
pr<strong>in</strong>cipalmente attraverso il quench<strong>in</strong>g, <strong>in</strong>fluenza il tempo di vita dello stato eccitato, misurato<br />
dall’analisi dei burst di fluorescenza <strong>in</strong> soluzione. Il legame della prote<strong>in</strong>a alla NP d’oro, grazie al<br />
riconoscimento antigene-anticorpo, modifica ulteriormente il tempo di vita della FITC, permettendo<br />
così una misura della concentrazione della prote<strong>in</strong>a.<br />
In particolare, il costrutto è stato utilizzato per misurare i cambiamenti nel tempo di vita del<br />
colorante <strong>in</strong>dotti dal legame della prote<strong>in</strong>a modello BSA (bov<strong>in</strong>e serum album<strong>in</strong>e); <strong>in</strong> seguito è<br />
stato applicato al riconoscimento della prote<strong>in</strong>a p53, la cui rilevazione è di particolare <strong>in</strong>teresse<br />
come segnale per diagnosi e prognosi di tumori, sia <strong>in</strong> soluzioni st<strong>and</strong>ard sia <strong>in</strong> estratti cellulari<br />
totali. Inoltre è stata valutata la selettività della sonda rispetto a prote<strong>in</strong>e globulari. I dati <strong>in</strong>dicano<br />
che il tempo di vita della FITC risulta essere un parametro sensibile per rilevare piccole quantità di<br />
prote<strong>in</strong>e <strong>in</strong> soluzione con un limite di circa 5 pM, determ<strong>in</strong>ato pr<strong>in</strong>cipalmente dall’accuratezza<br />
statistica con cui avviene la misura del tempo di vita.<br />
Nella seconda parte del progetto, mi sono focalizzata sull’utilizzo di nanoparticelle anisotrope d’oro<br />
come mezzi di contrasto per imag<strong>in</strong>g di cellule. Le loro proprietà di fotolum<strong>in</strong>escenza (TPL) sono<br />
state studiate sfrutt<strong>and</strong>o l’eccitazione a due fotoni; mi sono <strong>in</strong> particolare focalizzata su<br />
nanoparticelle d’oro ellissoidali (nanorod), che possono essere facilmente ottenute grazie a una<br />
s<strong>in</strong>tesi che fa uso di un surfattante st<strong>and</strong>ard, il CTAB (cetyl trimethulammonium bromide). Le<br />
nanoparticelle anisotrope asimmetriche con bracci ad elevato rapporto assiale sono state ottenute<br />
<strong>in</strong> collaborazione con l’Università di Pavia, utilizz<strong>and</strong>o per la prima volta il surfattante zwitterionico<br />
LSB (laurylsulphobeta<strong>in</strong>e) nel metodo di s<strong>in</strong>tesi mediato da “seed”. La concentrazione di LSB<br />
presente nella soluzione di crescita permette di controllare le dimensioni delle NP e la posizione<br />
del picco di risonanza plasmonica, che può essere variato nell’<strong>in</strong>tervallo del vic<strong>in</strong>o <strong>in</strong>frarosso da<br />
700 a 1100 nm.<br />
I campioni sono stati analizzati con diverse tecniche <strong>in</strong> modo da ottenere una loro completa<br />
caratterizzazione: dai dati ottenuti misur<strong>and</strong>o il loro spettro di assorbimento nella regione UVvisibile<br />
dello spettro, tramite la miscoscopia a trasmissione (TEM), il Dynamic Light Scatter<strong>in</strong>g e la<br />
spettroscopia di correlazione della fluorescenza, sono stati determ<strong>in</strong>ati la <strong>for</strong>ma, le dimensioni e il<br />
grado di aggregazione. Sono state trovate tre popolazioni: nanosfere con diametro <strong>in</strong>feriore a 20<br />
nm, nanostars caratterizzate da bracci trapezoidali e nanoparticelle con bracci con un elevato<br />
rapporto assiale.<br />
Al f<strong>in</strong>e di applicare le NP come sonde per imag<strong>in</strong>g, è stata effettuata una loro caratterizzazione<br />
spettroscopica utilizz<strong>and</strong>o l’eccitazione a due fotoni; <strong>in</strong> particolare sono state studiate la<br />
dipendenza del segnale di lum<strong>in</strong>escenza emesso dalla potenza, dalla lunghezza d’onda e dalla<br />
polarizzazione della luce <strong>in</strong>cidente.
La TPL è stata qu<strong>in</strong>di sfruttata per valutare l’<strong>in</strong>ternalizzazione delle NPs <strong>in</strong> differenti l<strong>in</strong>ee cellulari<br />
(cellule HEK, epiteliali alveolari e macrofagi).<br />
Oltre all’utilizzo come mezzo di contrasto per imag<strong>in</strong>g e nella terapia fototermica, le NP possono<br />
essere sfruttate anche per il trasporto di farmaci e sono <strong>in</strong> grado di stimolare e/o sopprimere le<br />
resposte immunitarie. Inoltre possono essere funzionalizzate <strong>in</strong> modo da trasportare vacc<strong>in</strong>i e<br />
adiuvanti (agenti aggiunti ai vacc<strong>in</strong>i per aumentare la risposta immunitaria contro gli antigeni), che<br />
agiscono <strong>in</strong> modo da aumentare le risposte immunitarie <strong>in</strong>nate e adattive che generano una<br />
effettiva memoria immunologica.<br />
In questo scenario e al f<strong>in</strong>e di sfruttare <strong>in</strong> futuro le peculiari caratteristiche di emissione delle<br />
nanoparticelle per imag<strong>in</strong>g <strong>in</strong> tempo reale <strong>in</strong>-<strong>vivo</strong> e di studiarne gli effetti immunologici,<br />
parallelamente alle attività descritte, ho condotto uno studio <strong>in</strong>iziale riguardante processi di<br />
d<strong>in</strong>amica cellulare <strong>in</strong>-<strong>vivo</strong> <strong>in</strong> condizioni st<strong>and</strong>ard, ovvero con cellule marcate con sonde<br />
fluorescenti tradizionali.<br />
Con questo scopo sono stati condotti esperimenti sfrutt<strong>and</strong>o un sistema di microscopia <strong>in</strong>travital<br />
con eccitazione a due fotoni, che permette di studiare il comportamento di diverse popolazioni di<br />
cellule del sistema immunitario <strong>in</strong> organi l<strong>in</strong>foidi e <strong>in</strong> tessuti periferici.<br />
In particolare è stata studiata l’<strong>in</strong>terazione tra due specie cellulari appartenenti al sistema<br />
immunitario, le cellule dendritiche (DC) e natural killer (NK). In questo ambito ho sviluppato un<br />
metodo di analisi per caratterizzare il comportamento d<strong>in</strong>amico delle cellule NK basato<br />
sull’osservazione di un set di parametri (velocità media e istantanea, conf<strong>in</strong>ement ratio, distanza<br />
<strong>in</strong>ter-cellulare, spostamento quadratico medio) e, dal punto di vista biologico, ho verificato che uno<br />
dei meccanismi di attivazione delle capacità immunitarie delle NK è dovuto alla loro <strong>in</strong>terazione<br />
diretta con le DC.