Nanoparticles for in-vitro and in-vivo biosensing and imaging

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Negli ultimi due decenni numerosi studi si sono concentrati sul cambiamento delle proprietà chimiche e fisiche di un materiale a seguito della riduzione a scale nanometriche delle sue dimensioni. Questi studi hanno rivelato molteplici applicazioni possibili per le nanostrutture, che sono impiegate, per esempio, in biologia e medicina per ottenere immagini, per individuare situazioni patologiche, per diagnosi, come sensori e per la terapia fototermica. I metalli nobili (soprattutto oro e argento) sono particolarmente versatili ai fini di queste applicazioni grazie a un fenomeno conosciuto come oscillazione dei plasmoni di superficie (SPR): si tratta di un’oscillazione in fase degli elettroni della banda di conduzione, indotta da un campo elettromagnetico incidente. Questa oscillazione è risonante con la radiazione incidente stessa a una particolare frequenza dipendente da forma, dimensioni, orientazione e costante dielettrica della nano particella (NP). L’accoppiamento tra SPR e campo elettromagnetico incidente determina l'aumento della proprietà radiative (come assorbimento e scattering) della nano particella; la loro sezione d’urto di estinzione è 10 5 -10 6 volte maggiore rispetto ai coloranti organici e risultano inoltre altamente fotostabili e, a seconda della forma, sono in grado i convertire in modo efficiente luce in calore. La risonanza plasmonica, variabile nella parte visibile (per NP sferiche) o del vicino infrarosso dello spettro elettromagnetico (per NP anisotrope) può inoltre interagire con l’emissione di fluorescenza dei coloranti e modificarne di conseguenza la brillanza e il tempo di vita dello stato eccitato. A seconda della distanza fluoroforo-NP e dell’anisotropia delle NP si può ottenere un aumento o una diminuzione della fluorescenza. In entrambi i casi, ci si aspetta che in seguito a un cambiamento della costante dielettrica delle NP, indotta ad esempio in seguito al riconoscimento di una proteina che avviene sulla superficie della nanoparticella, avvenga un cambiamento nelle proprietà di emissione dei fluorofori. Gli effetti della risonanza di superficie diventano inoltre particolarmente importanti se combinati con l’eccitazione a due fotoni (TPE), che consiste nell’assorbimento simultaneo di due fotoni, ciascuno di energia pari alla metà di quella necessaria ad eccitare una molecola dal livello fondamentale al primo stato eccitato. Questa tecnica risulta particolarmente utile nel contesto di questo lavoro di ricerca perché influisce anche sulla resa quantica di luminescenza di NP anisotrope: grazie a fenomeni non lineari come la TPE l'intensità di luminescenza (TPL) viene aumentata (se accoppiata con una appropriata risonanza plasmonica) di molti ordini di grandezza rispetto a quanto si ottiene con eccitazioni a singolo fotone di superici lisce, rendendo quindi queste nanoparticelle particolarmente utili per imaging in-vivo nella regione del vicino infrarosso dello spettro elettromagnetico. La TPE offre una serie di vantaggi unici per studi biologici sia in-vitro che in-vivo. La banda di assorbimento a due fotoni dei coloranti utilizzati tradizionalmente in biologia è ampia rispetto all’analogo caso a singolo fotone permettendo l’eccitazione simultanea di piùfluoro fori con una singola lunghezza d’onda. Inoltre, il fatto di usare una lunghezza d’onda infrarossa permette un’alta penetrazione nei tessuti grazie al ridotto scattering. L’eccitazione ha luogo solamente nel piano focale poiché la probabilità di assorbire contemporaneamente due fotoni dipende dal quadrato dell’intensità incidente. Come conseguenza, i fenomeni di foto-tossicità e fotodanneggiamento risultano notevolmente ridotti. Questi vantaggi fanno della TPE una tecnica assodata per la ricerca scientifica biologica e medica, che può essere accoppiata all’utilizzo di nanoparticelle d’oro anisotrope.
In accordo con queste considerazioni, il progetto di ricerca si è sviluppato lungo due linee principali, legate all’uso delle nano particelle come sensori e mezzi di contrasto per imaging non lineare. Lo scopo della prima parte del progetto di ricerca è quello di sfruttare il cambiamento del tempo di vita e della brillanza di un colorante, indotto dall’interazione con i plasmoni di superficie, per rilevare piccole quantità di proteina in soluzione in condizioni fisiologiche. Il sistema studiato è basato sull’uso di nanoparticelle d’oro del diametro di 5 e 10 nm a cui vengono legati (grazie a un ponte streptavidina-biotina) il colorante FITC e l’anticorpo specifico per la proteina da riconoscere. L’interazione del fluoroforo con la risonanza dei plasmoni della superficie d’oro, che avviene principalmente attraverso il quenching, influenza il tempo di vita dello stato eccitato, misurato dall’analisi dei burst di fluorescenza in soluzione. Il legame della proteina alla NP d’oro, grazie al riconoscimento antigene-anticorpo, modifica ulteriormente il tempo di vita della FITC, permettendo così una misura della concentrazione della proteina. In particolare, il costrutto è stato utilizzato per misurare i cambiamenti nel tempo di vita del colorante indotti dal legame della proteina modello BSA (bovine serum albumine); in seguito è stato applicato al riconoscimento della proteina p53, la cui rilevazione è di particolare interesse come segnale per diagnosi e prognosi di tumori, sia in soluzioni standard sia in estratti cellulari totali. Inoltre è stata valutata la selettività della sonda rispetto a proteine globulari. I dati indicano che il tempo di vita della FITC risulta essere un parametro sensibile per rilevare piccole quantità di proteine in soluzione con un limite di circa 5 pM, determinato principalmente dall’accuratezza statistica con cui avviene la misura del tempo di vita. Nella seconda parte del progetto, mi sono focalizzata sull’utilizzo di nanoparticelle anisotrope d’oro come mezzi di contrasto per imaging di cellule. Le loro proprietà di fotoluminescenza (TPL) sono state studiate sfruttando l’eccitazione a due fotoni; mi sono in particolare focalizzata su nanoparticelle d’oro ellissoidali (nanorod), che possono essere facilmente ottenute grazie a una sintesi che fa uso di un surfattante standard, il CTAB (cetyl trimethulammonium bromide). Le nanoparticelle anisotrope asimmetriche con bracci ad elevato rapporto assiale sono state ottenute in collaborazione con l’Università di Pavia, utilizzando per la prima volta il surfattante zwitterionico LSB (laurylsulphobetaine) nel metodo di sintesi mediato da “seed”. La concentrazione di LSB presente nella soluzione di crescita permette di controllare le dimensioni delle NP e la posizione del picco di risonanza plasmonica, che può essere variato nell’intervallo del vicino infrarosso da 700 a 1100 nm. I campioni sono stati analizzati con diverse tecniche in modo da ottenere una loro completa caratterizzazione: dai dati ottenuti misurando il loro spettro di assorbimento nella regione UVvisibile dello spettro, tramite la miscoscopia a trasmissione (TEM), il Dynamic Light Scattering e la spettroscopia di correlazione della fluorescenza, sono stati determinati la forma, le dimensioni e il grado di aggregazione. Sono state trovate tre popolazioni: nanosfere con diametro inferiore a 20 nm, nanostars caratterizzate da bracci trapezoidali e nanoparticelle con bracci con un elevato rapporto assiale. Al fine di applicare le NP come sonde per imaging, è stata effettuata una loro caratterizzazione spettroscopica utilizzando l’eccitazione a due fotoni; in particolare sono state studiate la dipendenza del segnale di luminescenza emesso dalla potenza, dalla lunghezza d’onda e dalla polarizzazione della luce incidente.
Page 1: UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI MILANO

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