stabilizarea pe cale biotehnologica a preparatelor ... - uefiscdi

• Enzimelor exogene = aditivi furajeri• Necesitatea stabilizarii enzimelor• Imobilizarea enzimelor:• stabilizarea moleculei enzimatice• blocarea moleculei cu retentia activitatii catalitice

Realizare obiectiv 1/2007• Studiu privind stabilizarea prin imobilizare aproteazelor, amilazelor şi celulazelor pe suporturianorganice şi utilizarea lor în hrana animalelor:• 90 titluri bibliografice studiate• peste 70% din referintele bibliografice sunt din anii2002-2007

PLAN DE REALIZARE A PROIECTULUI2007Obiective Activităţi Rezultate livratepe etapă2. Obtinereapreparatuluiproteoliticstabilizatprin legarefizica pesuportanorganic2.1. Testarea tulpinilor microbiene dinpunct de vedere al activitatiiproteolitice prin realizarea de culturi lanivel de laborator.2.2. Testarea suporturilor anorganice invederea obtinerii unui produs stabilizatcu activitate proteolitica superioara sirandament de imobilizare cat mai bun.2.3. Optimizarea procesului de imobilizareprin legare fizica (raportulenzima/suport, temperatura si timpulde imobilizare, etc.).Parametri defunctionareParametri defunctionareMetoda de laborator

Conţinutul în proteină şi activitatea proteolitică apreparatului enzimatic obţinut prin fermentaţiaBacillus licheniformis B40CulturaConţinutul înproteinămg BSA·ml -1I 24 h 2,3148 h2,85Activitate Activitateproteoliticăμmol·min-1·ml-10,3000,310proteoliticăspecificăμmol·min -1·mg prot-10,130,11II – 48 h 2,53 0,995 0,40III – 48 h 5,65 1,330 0,24

Activitate proteolitica(micromol/g.min)Influenţa cantităţii de enzimă asupra activităţiiproteolitice a Alcalasei imobilizate prin legarefizică pe zeolitNr.crt.SoluţieenzimaticămlCantitateade suportgRaportenzimă/zeolitU/g zeolitActivitate Activitateproteoliticăμmol·min-1·g-1relativă%Randamentdeimobilizare%1. 5,2 0,50 170,22 1,26 25,47 0,632. 5,2 1,00 85,11 1,61 32,58 1,903. 5,2 1,50 56,74 4,95 100,00 8,924. 5,2 1,75 48,63 2,75 55,52 5,65randamentul de imobilizare = A f·100/A i, unde A ieste activitatea totală iniţială,iar A feste activitatea totală din solidele uscate654321048.63 56.74 85.11 170.22U/g zeolit

Activitate proteolitica(micromol/g.min)Influenţa timpului de agitare asupra activităţii proteolitice aAlcalasei imobilizate prin legare fizică pe zeolitNr. crt.Timpul deagitarehActivitate Activitateproteoliticăμmol·min-1·g-1relativă%Randamentde imobilizare%1. 1 3,05 78,52 3,492. 2 3,88 100,00 4,603. 3 3,17 81,63 3,574. 4 1,19 30,71 1,315. 6 1,18 30,42 1,27randamentul de imobilizare = A f·100/A i, unde A ieste activitatea totală iniţială,iar A feste activitatea totală din solidele uscate4.543.532.521.510.501 2 3 4 6Timp agitare (h)

Conţinutul în proteine şi activitatea proteoliticăa enzimei imobilizateSuportCantitategConţinutul înproteinămg BSA·g -1Activitate Gradproteoliticăμmol·min-1·g-1deimobilizareal proteinei aRandamentdeimobilizare b%Zeolit 1,99 2,98 0,14 0,89 9,33Alumină 2,09 1,74 0,09 0,90 6,20aG I= (P i– P a)/P i, unde P ieste cantitatea totală de proteină iniţială iar P aeste proteina din apele de spălare; b Randamentul deimobilizare = A f·100/A i, unde A ieste activitatea totală iniţială iar A feste activitatea totală din solidele uscate.

Analiza preparatului enzimatic obţinut după 24 ore de fermentaţieAluminăVolummlg*Conţinutul înproteinămg BSA·ml -1mg BSA·g -1 *Activitateproteoliticăμmol·min-1·ml-1μmol·min -1·g-1 *Grad deimobilizareal proteinei aRandamentdeimobilizare b%Iniţial 45 2,31 0,30 - -Eluatul coloanei 45 1,42 0,15Ape de spălare 15 1,77 0,05Enzimaimobilizată9,87* 1,35* 0,12* 0,13 8,53aGI = (Pi – Pa)/Pi, unde Pi este cantitatea totală de proteină iniţială iar Pa este proteina din apele de spălare; b Randamentul deimobilizare = Af·100/Ai, unde Ai este activitatea totală iniţială iar Af este activitatea totală din solidele uscate.

Analiza preparatului enzimatic obţinut după 48 ore de fermentaţieAluminăVolummlg*Conţinutul înproteinămg BSA·ml -1mg BSA·g -1 *Activitateproteoliticăμmol·min-1·ml-1μmol·min -1·g-1 *Grad deimobilizarealproteinei aRandament deimobilizare b%Iniţial 30 2,85 0,31 - -Filtrat 30 1,22 0,10Ape de spălare 10 2,05 0,18Solide 9,92* 2,84* 0,13* 0,33 13,86aGI = (Pi – Pa)/Pi, unde Pi este cantitatea totală de proteină iniţială iar Pa este proteina din apele de spălare; b Randamentul deimobilizare = Af·100/Ai, unde Ai este activitatea totală iniţială iar Af este activitatea totală din solidele uscate.

Varianta A 3• imobilizare sub agitare magnetică• suporturi de imobilizare: ceramică «Procema SA»• timp de agitare - două ore• stabilizare peste noapte - nu• spălare cu acetonă răcită• uscare la temperatura camerei şi în exicator

Ceramică II• Aspect: granule ceramice poroase• Culoare: cărămizie• Porozitate aparentă: min 75%• Granulometrie: sortul I 4-6 mm, sortul II 7-10 mm, sortul III11-16 mm• Rezistenţă la agenţi chimici: rezistă

Conţinutul în proteine şi activitatea proteoliticăa enzimei imobilizateSuportulCantitategConţinutul înproteinămg BSA·g -1Activitate Gradproteoliticăμmol·min-1·g-1deimobilizareal proteinei aRandamentdeimobilizare b%Ceramică I 58,03 3,80 0,99 0,89 74,98Ceramică II 4,40 5,01 2,29 0,34 63,22aGI = (Pi – Pa)/Pi, unde Pi este cantitatea totală de proteină iniţială iar Pa este proteina din apele de spălare; b Randamentul deimobilizare = Af·100/Ai, unde Ai este activitatea totală iniţială iar Af este activitatea totală din solidele uscate.

PLAN DE REALIZARE A PROIECTULUIObiective Activităţi Rezultate livrate peetapă1. Obtinereapreparatuluiproteolitic stabilizatprin entrapare ingel de silice sientrapare –depunere pe suportanorganic20081.1. Optimizarea procesului deimobilizarea prin entrapare in gelde silice in functie de raportulapa/TEOS, incarcarea cuenzima, prezenta agentului deprofilare, modul de prelucrare algelului.1.2. Punerea la punct a metodeicombinate de entrapare –depunere prin utilizareavariantelor cele mai buneobtinute prin legare fizica sientrapare in gel de silice.Parametri defunctionareMetoda de laboratorSchema tehnologicaParametri defunctionareMetoda de laboratorSchema tehnologica

Si(OR) 4, EtOH,H 2O, HClSOLEtOH, NH 3 ,Solutie enzimatica tamponataGELMaturareSpalareUscareSinteza sol-gel indoua etapePrecursori –tetraalcoxisilani:•tetraetoxisilan (TEOS)•tetrametoxisilan (TMOS)XEROGEL

Realizare obiectiv 1/2008Optimizarea procesului de imobilizare prin entrapareîn gel de silice• raportul stoichiometric r apă/silan• 6 < r < 36• r activitate max = 30• încărcarea cu enzimă• 14,19 < unităţi enzimatice totale < 141,85• activitate si randament maxim de imobilizare - 56-114 U tot• utilizarea unor agenti formatori de pori• D-glucoza – 0,04 g glucoză /mL sol - 0,16 g glucoză /mL sol• activitate enzimatică mărită comparativ cu a martorului• prelucrarea xerogelului cu enzima imobilizată:• maturare 24 ore la temperatura camerei• spălare• filtrare la vid• uscare la temperatura camerei până la greutate constantă• mojarare pentru obţinerea unor probe omogene

Stabilizarea prin metoda combinatăentrapare-depunere• combinarea avantajelor metodelor de stabilizare prinadsorbţie fizică şi entrapare în gel de silice• minimizarea dezavantajelor celor două metode• condiții optime de entrapare• suport anorganic de depunere: ceramică

Conţinutul în proteine și activitatea proteolitică apreparatului enzimatic imobilizatSuport/PrecursorMetoda de imobilizareConţinutul înproteinămg BSA·g -1Activitatea Randamentproteoliticăμmol·min-1·g-1deimobilizare a%Ceramică Adsorbţie fizică 5.01 2.29 63.22TEOS Entrapare 8.31 0.31 7.40Entrapare (Glucoză) 4.77 1.24 72.33Entrapare /Depunere (Ceramică)2.76 0.45 45.27TMOS Entrapare 5.24 0.27 17.08Entrapare (Glucoză) 5.00 0.71 57.33Entrapare /Depunere (Ceramică)3.53 0.14 16.15Randamentul de imobilizare = A f·100/A i , unde A i este activitatea totală iniţială iar A f este activitatea totală din solidele uscate.

PLAN DE REALIZARE A PROIECTULUI2008Obiective Activităţi Rezultate livratepe etapă2. Caracterizareapreparatelorproteazicelibere sistabilizate2.1. Determinarea si comparareaactivitatilor proteolitice apreparatelor stabilizate prin legarefizica, entrapare si entraparedepunere.2.2. Caracterizarea fizico-chimica sibiochimica a imobilizatelor biologice(caracteristici structurale, parametrioptimi de actiune (pH, temperatura,efectori)).2.3. Studiul cinetic pe substrat model,cu determinarea parametrilorcinetici.Buletin de analizaParametri de functionareBuletin de analizaParametri de functionareBuletin de analiza

Activitate relativa, %Activitate relativa, %Realizare obiectiv 2/2008Caracterizarea preparatelor proteazice libere şistabilizate1101009080706050Enzima liberaEntrapata (TEOS)Entrapata (TEOS)-GlucozaEntrapata/depusa (TEOS/Ceramica)1101009080706050Enzima liberaEntrapata (TMOS)Entrapata (TMOS)-GlucozaEntrapata/depusa (TMOS/Ceramica)404030302020101000 2 4 6 8 10 12pH00 2 4 6 8 10 12pHInfluenţa pH-ului asupra activităţii proteolitice apreparatului enzimatic liber şi imobilizat

Activitate relativa, %Activitate relativa, %Profilul de temperatură al activităţii proteolitice apreparatului enzimatic liber şi imobilizat100Enzima liberaEntrapata (TEOS)Entrapata (TEOS)-GlucozaEntrapata/depusa (TEOS/Ceramica)100Enzima liberaEntrapata (TMOS)Entrapata (TMOS)-GlucozaEntrapata/depusa (TMOS/Ceramica)808060604040202000 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Temperature, o C00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Temperatura, o C

Studiul cinetic pe substrat model(acetat de para nitrofenil)proteaseH 3C-COO-C 6H 4-NO 2+ H 2O H 3C-COOH + HO-C 6H 4-NO 2Constante cineticeK Mμmol.mL -1 V max∙10 3μmol.mL -1 ∙min -1V max∙10 3 / K Mmin -1Nativa Michaelis-Menten 0.33 7.99 24.21Entrapata(TEOS)Entrapata(TEOS-glucose)Entrapata(TMOS)Entrapata(TMOS-glucose)Michaelis-Menten 0.37 2.54 6.86Michaelis-Menten 0.39 3.09 7.92Michaelis-Menten 0.27 2.07 7.67Michaelis-Menten 0.15 1.97 13.13

1/V i.10 3 , mL.min/mol1/V i.10 3 , mL.min/mol2.0NativaEntrapata (TEOS)Entrapata (TEOS-Glucose)2.22.0NativaEntrapata (TMOS)Entrapata (TMOS-Glucose)1.81.51.61.41.21.01.00.80.50.60.40.20.00 2 4 6 8 10 121/[S], mL/mol0.00 2 4 6 8 10 121/[S], mL/molLiniarizarea Lineweaver-Burke

PLAN DE REALIZARE A PROIECTULUI2008Obiective Activităţi Rezultate livrate peetapă3. Studiulcomparativ alstabilitatiiproteazelor libere siimobilizate3.1. Studiul stabilitatiiimobilizatelor latemperatura si pH.3.2. Studiul stabilitatiiin timp a preparatelorproteolitice imobilizate.Parametri de functionareParametri de functionare

Activitate relativa, %Realizare obiectiv 3/2008Stabilitatea preparatelor enzimatice imobilizateStabilitatea la pH 3 şi temperatura de 37ºC120100Entrapata (TEOS)Entrapata (TEOS-glucoza)Entrapata-depusa8060402000 10 20 30 40 50 60Timp, minute

Stabilitatea în timp a preparatelorenzimatice imobilizateMetoda de imobilizareActivitate relativa%Initial O luna Doua luni Patru luniEntrapare (TEOS) 100.00 67.10 63.25 51.54Entrapare (TEOS - glucoza) 100.00 63.63 59.44 48.06Entrapare/depunere(TEOS/ceramica)100.00 50.22 45.54 32.22Entrapare (TMOS) 100.00 78.17 69.87 52.74Entrapare (TMOS - glucoza) 100.00 74.82 66.66 49.23Entrapare/depunere(TMOS/ceramica)100.00 38.44 10.28 -

Parametri de funcţionarePrecursor TEOSPreparat enzimatic stabilizat prin entrapare•În absenţa glucozei•pHoptim = 8•toptim = 65°C•stabilitate operaţională, 1h, pH 3, t 37°C = 47.90% activitate remanentă•stabilitate în timp = 51,54% activitate remanentă după 4 luni păstrare la 4°CÎn prezenţa glucozei•pHoptim = 10•toptim = 65°C•stabilitate operaţională, 1h, pH 3, t 37°C = 27,12% activitate remanentă•stabilitate în timp = 48,06% activitate remanentă după 4 luni păstrare la 4°CPreparat enzimatic stabilizat prin entrapare-depunere•pHoptim = 7•toptim = 55°C•stabilitate operaţională, 1h, pH 3, t 37°C = 30,95% activitate remanentă•stabilitate în timp = 32,22% activitate remanentă după 4 luni păstrare la 4°C

Parametri de funcţionarePrecursor TMOS1. Preparat enzimatic stabilizat prin entrapareÎn absenţa glucozei•pHoptim = 8•toptim = 65°C•stabilitate în timp = 52,74% activitate remanentă după 4 luni păstrare la 4°CÎn prezenţa glucozei•pHoptim = 10•toptim = 65°C•stabilitate în timp = 49,23% activitate remanentă după 4 luni păstrare la 4°C2. Preparat enzimatic stabilizat prin entrapare-depunere•pHoptim = 7•toptim = 65°C•stabilitate în timp = 0% activitate remanentă după 4 luni păstrare la 4°C

PLAN DE REALIZARE A PROIECTULUI2009Obiective Activităţi Rezultate livratepe etapă1. Obtinereapreparatelorenzimatice cuactivitateamiloliticastabilizate prinlegare fizica,entrapare in gelde silice sientrapare –depunere pesuport anorganic1.1. Testarea tulpinilor microbienedin punct de vedere al activitatiiamilolitice prin realizarea deculturi la nivel de laborator.1.2. Optimizarea procesului deimobilizare a amilazelor prinlegare fizica, entrapare sientrapare-depunere, bazat pecele mai bune rezultate obtinutela imobilizarea proteazelor.Parametri de functionareMetoda de laboratorSchema tehnologicaParametri de functionareMetoda de laboratorSchema tehnologica

Testarea unor tulpini de Bacillus producătoare de amilazeTulpina bacteriana pH Durata defermentatiehActivitate Continutamilazicaμmol·min-1·mL-1proteinemg BSA·mL -1Bacillus subtilis 222 8 72 0.92 1.89Bacillus subtilis SML amy+ 8 72 0.94 2.28Bacillus subtilis 3218 8 72 2.03 2.34Bacillus globigi CMIT 1.44 8 72 2.36 2.46Bacillus amiloliquefaciensDSM 78 24 10.54 3.38

Testarea unor medii de culturaMedii de culturaDurata defermentatiehActivitatea Continutamilazicaμmol·min-1·mL-1inproteinemg BSA·mL -1I (amidon 2% ) 72 5.54 1.85II (amidon 1%)72 2.86 7.32III (srot de soia, faina de porumb) 48 5.98 2.50IV (faina de porumb) 24 10.54 3.38

Bacillus amiloliquefaciensfermentation kineticsDinamica fermentatiei celulelor de Bacillusamiloliquefaciens – mediu de cultura IV1110-1Glucoamylase activity, mol·min-1·mL-1Amylase activity, mg·min-1·mLProtein content, mg BSA.mL -198765432100 10 20 30 40 50 60 70Fermentation time, hours

Tetrakis(2-hydroxyethyl) orthosilicat (THEOS)Conţinutul în proteine si activitatea amilolitică apreparatului enzimatic imobilizatAmilaza de B. amyloliquefaciensContinut inproteinemg BSA·mL -1mg BSA·g -1Activitate Randamentamilazicaμmol·min-1·mL-1μmol·min-1·g-1deimobilizare a%PreparatenzimaticliberMediu de cultura b 3.38 10.54 -Enzima liofilizata c 278.36 1196.00 -Preparat Adsorbtie fizica 1.70 5.92 38.52enzimaticimobilizat c Entrapare TMOS 3.29 0.20 2.73TEOS 4.35 0.25 3.46THEOS 3.56 7.34 45.08TBOS 3.78 0.21 2.91Entrapare/Depunere(TEOS/Ceramica)2.21 4.80 19.16aRandamentul de imobilizare = A f·100/A i , unde A i este activitatea totală iniţială iar A f este activitatea totală din solidele uscate, b lichid, c solid

Relative activity, %Influenţa pH-ului asupra activităţii amilolitice apreparatului enzimatic liber şi imobilizat100806040200Free amylasePhysical bondedEntrapped/deposited - TEOS/CeramicsEntrapped - THEOS2 3 4 5 6 7 8pH

Relative activity, %Profilul de temperatură al activităţii amilolitice apreparatului enzimatic liber şi imobilizat110100Free amylasePhysical bondedEntrapped/deposited - TEOS/CeramicsEntrapped - THEOS908070605040302020 30 40 50 60 70 80 90 100Temperature, 0 C

Relative activity, %Stabilitatea preparatelor enzimatice imobilizateStabilitatea la pH 3 şi temperatura de 37ºC110100Free amylasePhysical bondedEntrapped/deposited - TEOS/CeramicsEntrapped - THEOS90807060504030201000 10 20 30 40 50 60Time, minute

PLAN DE REALIZARE A PROIECTULUI2009Obiective Activităţi Rezultate livrate peetapă2. Obtinereapreparatelorenzimatice cuactivitatecelulozoliticastabilizate prinlegare fizica,entrapare in gel desilice si entrapare– depunere pesuport anorganic2.1. Testarea tulpinilor microbienedin punct de vedere al activitatiicelulozolitice prin realizarea deculturi la nivel de laborator.2.2. Optimizarea procesului deimobilizare a celulazelor prinlegare fizica, entrapare sientrapare-depunere, bazat pecele mai bune rezultate obtinutela imobilizarea proteazelor.Parametri defunctionareMetoda de laboratorSchema tehnologicaParametri defunctionareMetoda de laboratorSchema tehnologica

PLAN DE REALIZARE A PROIECTULUI2009Obiective Activităţi Rezultate livrate peetapă3. Caracterizareapreparatelorenzimatice libere sistabilizate3.1. Determinarea sicomparare activitatiloramilolitice si celulozolitice apreparatelor imobilizate prinlegare fizica, entrapare sientrapare depunere.3.2. Caracterizareapreparatelor imobilizate(caracteristici structurale,parametri optimi deactiune). Determinareastabilitatii acestora.Parametri de functionareBuletin de analizaParametri de functionareBuletin de analiza

Concluzii• Tehnologia sol-gel (precursori alcoxisilani):• geluri de silice biocompatibile• legătura dintre lumea vie şi nevie• imobilizarea diferitelor biospecii active• Enzimele entrapate în matrici sol-gel rămân biocatalitic active• Creşterea stabilităţii enzimatice la variaţia factorilor de mediu• Atât preparatul enzimatic nativ cât şi cel imobilizat urmează ocinetica Michaelis – Menten• Viteza de reacţie este influenţată de limitările difuzionaleimpuse de matricea de silice• Matricile compozite obţinute din precursori alcoxisilanicireprezinta gazde bune pentru imobilizarea biomoleculelor şiutilizarea lor ulterioara în biotransformări

Criterii minime de performanţăaşteptateAnNumăr de articoleacceptate sprepublicare în revisteindexate ISINumăr de articoleacceptate sprepublicare în revisteindexate în baze dedate internaţionaleNumăr cereri debrevete nationaledepuseNumăr cereri debreveteinternationaledepuse2007 0 0 0 02008 0 1 0 02009 1 1 0 02010 1 1 0 0TOTAL 2 3 0 0

Lucrari stiintifice publicatepe tematica proiectuluiStabilization of microbial enzymatic preparations used infeed industry, Dragomirescu Monica, Vintilǎ T., Vintila Daniela,Preda Gabriela, Lucrări ŞtiinţificeZootehnie si Biotehnologii, vol.41, 69, 2008Microbial enzymatic preparations entrapped in silica gels,Dragomirescu Monica, Vintilǎ T., Vlad-Oros Beatrice, PredaGabriela, International Conference on Chemistry and ChemicalEngineering, Timisoara, 28-30 Mai 2008Entrapment of microbial proteases in hybrid organicinorganicsilica-gels, Dragomirescu Monica, Vintilǎ T., PredaGabriela, INTERNATIONAL CONGRESS ON BIOCATALYSIS,Hamburg August 31 - September 4, 275, 2008

Sol-Gel Entrapment of Bacillus licheniformis CMIT 1.33Proteases, Dragomirescu Monica, Vintilǎ T., Preda Gabriela,International Enzyme Engineering Symposium IEES’08 Kusadasi,Turkiye, 1-5 october, 89, 2008Silica Gels as Hosts for Microbial Cells, Dragomirescu Monica,Vintilǎ T., Preda Gabriela, International Enzyme EngineeringSymposium IEES’08 Kusadasi, Turkiye, 1-5 october, 84, 2008Enzime sintetizate de celule bacteriene imobilizate prin tehnicasol-gel, Dragomirescu Monica, Vintilǎ T., Preda Gabriela, A XXX-aConferinţă Naţională de Chimie, 5-7 oct. 2008, Călimăneşti-Căciulata, România

Microbial hydrolases immobilized on porous matrices,Dragomirescu Monica, Vintilǎ T., Vintila Daniela, PredaGabriela, Lucrări ŞtiinţificeZootehnie si Biotehnologii, vol. 42,2009Microbial enzymatic preparation with protease activitystabilized by entrapment in silica gels, Preda Gabriela,Dragomirescu Monica, 8th International Conference on ProteinStabilisation – ProStab2009, 11-14 aprilie Gratz 2009

Lucrari stiintifice in curs de publicarepe tematica proiectuluiSol-gel Entrapment of Microbial Proteases in Silica-Gels,Dragomirescu Monica, Preda Gabriela, Vintilǎ T., Roum.Biotechnol. Lett., (ISI) 2009Synthesis and properties of different sol-gel matricescontaining bacterial α-amylase, Vlad-Oros Beatrice, DudasZ, Preda Gabriela, Dragomirescu Monica, Chiriac A., Rev.Chim. (Buc) (ISI), 7/2009Activity and stability of starch converting enzymesentrapped in silica gels, Dragomirescu Monica, Vintilǎ T.,Vintila Daniela, Preda Gabriela, Ann. West Univ. Timişoara,(B+) 2009

Microbial Amylases Immobilized in Silica Gels,Dragomirescu Monica, Vintilǎ T., Preda Gabriela, BIOTRANS2009, 5-9 iulie BernaEntrapment of Microbial Cells in Sol-Gel Derived SilicaMatrixes, Dragomirescu Monica, Vintilǎ T., Preda Gabriela,BIOTRANS 2009, 5-9 iulie Berna

Implicarea tinerilor cercetatori2007Nr.crt.StructurapersonaluluiValoaresalariu brut(inclusiv ch.angajator)-lei-Nr. depersoaneNr. orelucrateEchivalentnormaintreaga1Cercetatori cuexperienta10.974 3 155 0.462 Cercetatori in formare 1.026 1 23 0.07TOTAL 12000 4 178 0.53

Implicarea tinerilor cercetatori2008Nr. crt.StructurapersonaluluiValoaresalariu brut(inclusiv ch.angajator)-lei-Nr. depersoaneNr. orelucrateEchivalentnormaintreaga1Cercetatori cuexperienta42.263 3 610 0.452Cercetatori informare7.737 1 176 0.13TOTAL 50.000 4 786 0.58

Activitati in care au fost implicatitinerii cercetatori• Realizare fermentatii microbiene (proteaze, amilaze)• Preparare medii de cultura• Urmarire cultura in timpul fermentatiei• Urmarire pH• Determinarea activitatii enzimatice• Determinarea continutului in proteine• Imobilizarea prin adsorbtie fizica, entrapare sientrapare-depunere a preparatelor enzimatice• Caracterizarea preparatelor enzimatice stabilizate☺ Sustinerea tezei de doctorat in sedinta publica(aprilie 2009)

Dificultati intampinate in derulareaproiectului• Sensibilitatea mai mare a amilazelor comparativ cu cea a proteazelorin tehnologia de entrapare prin metoda sol-gel → utilizarea unui altprecursor (THEOS) pentru obtinerea de rezultate competitive• Necesitatea concentrarii enzimei din mediul de cultura – liofilizare• Sumele mari de bani ce trebuiesc sustinute de Universitate pana ladecontare fac ca aceasta sa fie in pericol de incapacitate de plata

Vǎ mulţumesc