HPV: qualità del test e del percorso diagnostico.

Il controllo di qualità in anatomiapatologica e negli screening oncologiciTorino 9-10 giugno 2008HPV:qualità del test e del percorsodiagnosticoMassimo ConfortiniUO Citologia Analitica e Biomolecolare

PROGRAMMI DI SCREENINGCARATTERISTICHE DEL METODO• Altamente sensibile e specifico• Determinazione di un ampio spettro di HPV HR• Minime quantità di campione(prelevato in maniera non invasiva)• Alta riproducibilità intra/interlaboratorio• Possibilità di eseguire molti test• Semiautomatico o interamente automatico• Costo limitato

SENSIBILITA’ E SPECIFICITA’ ANALITICA• SENSIBILITA’ ANALITICA: la proporzione didonne HPV pos correttamente individuate da untest• SENSIBILITA’ CLINICA: la proporzione didonne con malattia (lesioni >= cin2) che sonocorrettamente identificate da un test HPV

SENSIBILITA’ E SPECIFICITA’ CLINICA• SPECIFICITA’ ANALITICA : la proporzione di donneHPV HR negative che sono correttamente identificate daun risultato negativo• SPECIFICITA’ CLINICA: la proporzione di donne senzalesioni >= cin2 che sono che sono correttamenteidentificate da un risultato negativo

IMMUNOCITOCHIMICA• Ricerca di antigeni capsidici, mediante l’uso dianticorpi policlonali o monoclonali• Valore diagnostico limitato in quanto nelle lesioniHPV-correlate gli antigeni strutturali non sonouniformemente presenti• Non consentono una identificazione del genotipovirale

METODI MOLECOLARI1. IBRIDAZIONE DIRETTA2. IBRIDAZIONE CON AMPLIFICAZIONEDEL SEGNALE3. AMPLIFICAZIONE DEL BERSAGLIO

Metodi per la individuazione di HPV DNADescrizioneSensibilitàCaratteristicheiFilter ISHIbridiz su filtro di estrattocrudo10-100 copie /cellBassa specificità esensibilitàDot BlotIbridizz su DNA purificatosu filtro1-10/cellAlta specificità,laboriosoSouthern BlotIbrid su DNA digerito suun supporto0,1-1/cellSpecificità molto alta,molto laboriosoISHIbridizzazione diretta sucellule o tessuti20/cellConservazione dellamorfologiaHybrid Capture IIIbridiz liquida con RNAprobes100/campioneAmplificazione delsegnalePCRAmplificazione di DNA invitro1/campioneAmplificazione target

IBRIDAZIONE DIRETTA1. Southern blot: ottima sensibilità ma laboriosa,costosa e richiede notevoli quantità di materiale2. Ibridazione in situ :permette di rivelare sequenzedi DNA e/o RNA in preparati citologici oistologici preservando la morfologia cellularema è di difficile standardizzazione

METODI DI AMPLIFICAZIONE DELBERSAGLIO• Reazione polimerasica a catena:permettel’amplificazione del bersaglio di sequenzespecifiche di acidi nucleici utilizzando cicliripetuti di sintesi del DNA

POLYMERASE CHAIN REACTION•MY09/MY11: identificano 25 tipi di HPVe generano un frammento di 450bp sulla regioneL1•GP5+/GP6+: Generano un frammento di 140bp sullaregione L1, identificando uno spettro di HPV simile, manon identico, a My09/11•pU-1M/pU2R: identificano HPV ad alto rischio16,18,31,33,35,45,52,58 ; generano un frammento di 233-268bp sulla regione E6.

HPV L1 general primer setsE6E2E5L1E7E1L2E40 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 7904My09/11GP5+/6+SPF 10450 bp150 bp65 bpinterprimer region

METODI DI IBRIDAZIONE CONAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE• Hybrid Capture 2: sono una evoluzione deimetodi di ibridazione diretta e consentono unaumento della sensibilità legate al sistema dirivelazione che utilizza legami multimerici dimolecole reporter

HYBRID CAPTURE• Ibridizzazione in fase liquida• sonda per 13 tipi di HPV HR(16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68)• sonda per 5 tipi HPV LR (6,11,42,43,44)• chemioluminescenza• qualitativo e semiquantitativo (RLU)

Digene’s Hybrid Capture ® TechnologyDenaturespecimenHybridizewith RNAprobeCaptureand detecthybridsLuminescence

Current technology for HPV DNAdetection of genital infectionsI test validati in trials di ampie dimensioni e instudi epidemiologici sono HC2 e metodi in PCRbasati sull’uso di primers consensus (MY09/11 EGP5/6)

PRESENTEPAP TESTCitologiaconvenzionaleCitologiaconvenzionale+lettura automaticaCitologiain fase liquidaCitologiain fase liquida+lettura automaticaTest HPV nellediagnosi borderlineTest HPV nellediagnosi borderline

Amplicor® HPV Test• Amplificazione del DNA target con PCR• Test qualitativo in vitro• Permette la determinazione di HPV in campionicitologici in fase liquida (PresevCyt® eSurePath TM)• Individua 13 tipi di HPV ad alto rischio:16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59 e 68.• Permette la simultanea amplificazione in PCR delDNA HPV target e del gene umano β-globina(controllo interno)

Kappa di concordanza tra HCII e PCR.(per i soli tipi di HPV presenti nella Sonda B)10,80,60,40,20,68 0,62 0,650,7150Peyton** Alts Study* CSPO 2000°STM PC Pcr/HCII HCII/PCR HR- * Risultati di: ALTS study- J Nat Canc Inst 2000-** Risultati di: Peyton C.L. et al, J Clin Micr 1998° Risultati di: Carozzi et al, Acta Citol, 2001

Quando tipizzare ?• Tipizzazione tipo-specifica nelle infezionipersistenti• Nel follow-up delle lesioni trattate• Studi epidemiologici• Hpv Survey• Studi vaccini

FUTURO PROSSIMOTEST DI SCREENINGPRIMARIO HPVTriageCITOLOGIATriageP16TriageRNAmessaggero E6/E7TriageCarica viraleGenotipizzazioneColposcopia Colposcopia Colposcopia ColposcopiaColposcopiaControllo citologico

HPV DNA QUANTITATIONMelting curvesHPVβ-globin

INTEGRATION

10075Integrated50Concomitant25Episomial0CINMicro-invasivecancerInvasivecancerJ. Clin. Microbiol. 2002; Nagao S. et alPeitsaro et al

p16 ink4• La proteina di E7 inattiva il prodotto del gene delretinoblastoma , che inibisce la trascrizione delgene p16• Quindi nelle cellule displastiche l’aumentataespressione degli oncogeni virali potrebberiflettersi nell’incrementata espressione di p16 ink4Determinabile in ICC

Determinazione di trascritti di RNAmdi E6/E7• La determinazione dell’RNA messaggero checodifica per gli oncogeni virali E6/E7 conmetodiche PCR “Real time” o NASBA ( Nucleiacid sequence –based amplification assay) puòrappresentare un più specifico predittore , rispettoal DNA HPV test di infezione progressiva.

Screening 25-64 con HPV DNA TestHPV eseguitocon prelievo in STMHPV-HPV+/inconcl.RICHIAMO ALNORMALE INTERVALLODI SCREENINGCitologia negativaCitologia positivaASCUS+/Inadeguato tecnicoInadeguatoper flogosiRipete test HPV+Citologia ad un annoColposcopiaRipete test HPV+Citologia a sei mesi

Follow-upHPV+Citologia ad un annoHPV+Cito ASCUS+HPV-Cito ASCUS+HPV-Cito-HPV+Cito-ColposcopiaRipete ad un annocitologiaRientro nel normaleintervallo di screeningRipete ad un annoCito+HPV

Test molecolare per ricerca HPV hrPunti critici che dovrebbero essereoggetto di valutazione• Prelievo• Tipo di test• Grado di automazione del test• Costo del test in termini di reattivi e personale• Controlli di qualità• Tipologia del laboratorio che esegue i test• Specificità del test

Hybrid Capture 2 HPV TestsSpecimen CollectionDigene Cervical The ThinPrep ®Sampler Pap Test

PrelievoSistemi di prelievo e conservazione utilizzati per lacitologia in fase liquida sono sistemi utilizzabiliper:• Ricerca hpv (Preservcyte HC2 10 years)• Tipizzazione hpv (Preservcyte PCR 4 Years)• Test immunocitochimici ( 56 gg)• Valutazione overespressione m-RNA

Confronto fra i diversi costi• LBC 88 campioni circa € 800 per vial + test diconversione che comporta 5 ore lavoro prima dieseguire HC2• STM 88 campioni circa €220 + 2.30 di lavoro perdenaturazione prima di eseguire HC2

Prelievo• Prelievo in vial per LBC con test molecolarepreceduto dalla conversione e successivaeventuale citologia sullo stesso vial• Prelievo nella stessa seduta per Test HPV e perCitologia Convenzionale da colorarsi e leggersisolo nel caso di test molecolare positivo

‘StabilityStability of liquid pap specimens for the detection ofHigh-riskHPV types with Roche Amplicor HPV test’21st International Conference HPV, 2004Kosarikov and Rita Sun• Cervical specimens collected in Surepathpreservative fluid remained stable for testingwhen stored for up to 2 weeks at 2-8°C.

I test molecolari devono essere eseguiti inlaboratori qualificati con esperienza di analisimolecolari , con requisiti strutturali che dianoampie garanzie rispetto al rischio di contaminazionee che eseguano almeno 500 test ogni anno.

Individuazione di un laboratorio• TrainingBiomolecolare di riferimento• Scelta delle metodologie• Standardizzazione procedure preanalitiche edanalitiche• Controlli di qualità• Identificazione di genotipi controversi