1. CITOCHIMICA ENZIMATICA - CusMiBio

CITOCHIMICA ENZIMATICAQueste reazioni prevedono l’incubazione di cellule o tessuti in una soluzione contenente:1. il substrato specifico per il sistema enzimatico oggetto di studio;2. un tampone in grado di mantenere il pH ottimale per il sistema enzimatico;3. qualsiasi cofattore necessario all’enzima;4. una molecola in grado di rendere il complesso enzima-substrato insolubile e colorato(“catturante o cromogeno”) in modo che sia visibile, al microscopio, nella sede specifica in cuisi trova in natura.

XSECELLULAIEPRXE+XCROMOGENOEECONTROLLI1. omissione2. inibitorePRODOTTO DIREAZIONE- COLORATO(=visibile)- INSOLUBILE- “in situ”

Istochimica enzimatica per localizzarel’ enzima Fosfatasi alcalina (FA)Sono fosfomonoesterasi che catalizzano l’idrolisi di esteridell’acido ortofosforico con attività ottimale a pH basicoOFAOR-O-P-O-H+ HOHR.OH +HO-P-O-HOHOHSi trovano in membrane cellulari implicate in processi attivi di trasporto

Nell’intestino tenue la Fosfatasi alcalina è nella membranaapicale delle cellule epiteliali, a livello dei microvilli

REAGENTI reazione istochimica per FOSFATASI ALCALINACampioni = sezioni in paraffinaSOLUZIONE TAMPONE = Tris-HCl 0,1 M pH 9,2-9,4MEZZO DI INCUBAZIONEANaftil fosfato di sodio = substratoFast Blue B = catturanteBNaftolo AS MX fosfato = substratoFast Red = catturanteN-N dimetilformamide = solvente del naftoloMEZZO DI MONTAGGIO = PBS/Glicerolo 1:3PREPARATO NON PERMANENTE

Protocollo reazione istochimica per FOSFATASI ALCALINA1 Delimitare sezioni con matita vetrografica2Sparaffinare le sezioni e portarle all’acqua distillata con lascala discendente degli alcoli34Lavaggio in tampone Tris-HCl 0,1 M pH 9,2-9,4 per 5 minutiIncubazione nel mezzo di incubazione A o B,preparato immediatamente prima dell’uso, per3-15 minuti al buio e a temperatura ambiente,in camera umida5Lavaggio in acqua distillata emontaggio delle sezioni in PBS/glicerolo 1:3

MEZZO DI INCUBAZIONE A(-> PRODOTTO DI REAZIONE NERO)• Naftil fosfato di sodio: 1mg/ml in Tris-HCl 0,1 M, pH 9,2-9,4• Fast Blue B : 1 mg/ml in Tris-HCl 0,1 M, pH 9,2-9,4MEZZO DI INCUBAZIONE B(-> PRODOTTO DI REAZIONE ROSSO e fluorescente)• Naftolo AS MX fosfato: 0,5 mg/ml in Tris-HCl 0,1 M, pH 9,2-9,4• Fast Red : 1 mg/ml in Tris-HCl 0,1 M, pH 9,2-9,4• N-N dimetilformamide 0,05 ml

CONTROLLISono possibili due tipi di controlli:1. omettere il substrato nel mezzo di incubazione(es. incubazione in solo Fast Blue B)2. inibire preventivamente l’attività enzimatica mediantepreincubazione della sezione di controllo in un INIBITORESPECIFICO (L-fenilalanina 0,05M in tampone Tris-HCl 0,1M, pH 9,2-9,4 per 10 minuti)

RISULTATI ATTESICromogeno = FAST BLU

RISULTATI ATTESICromogeno = FAST RED

APPLICAZIONI DELLACITOCHIMICAENZIMATICA

MuscoloagoBIOPSIA MUSCOLARE

GHIANDOLA MAMMARIAENDOMETRIOTONSILLAPROSTATACOLONLINFONODO