Localizzazione delle proteine in situ 1°parte - CusMiBio

LOCALIZZAZIONE in situ DI PROTEINEIN CELLULE E TESSUTI1

Che cosa sono le proteine?Indispensabili per il corretto funzionamento2

Dove si trovano le proteine?Le proteine sono macromolecole ubiquitarie,essenziali per la costituzione di tutti gli organismi,dai più semplici ai più complessiVIRUSPROCARIOTIEUCARIOTI3

Dove si trovano le proteine?EUCARIOTIUNICELLULARIPLURICELLULARI4

Dove si trovano le proteine?Le proteine sono presenti in ogni regione della cellula- sia a livello della MEMBRANA (plasmatica e dei vari organuli)- sia nel CITOSOL o nel lume degli organuli dotati di membrana5

Dove si trovano le proteine?Negli organismi pluricellulari, in cui le singole cellule siorganizzano a costituire i tessuti, le proteine sonopresenti anche nella sostanza extracellulare6

Che funzioni svolgono le proteine?In tutti gli organismi le proteine svolgono molteplici funzioni:RECETTORI - CANALI - TRASPORTATORISTRUTTURALIMOVIMENTOTRASPORTOENZIMATICHE7

Come si studiano le proteine?La struttura e le funzioni delle proteine possono essere studiate conmetodiche biochimiche e di biologia molecolare, maper localizzare le proteine nella loro sede cellulare o extracellularespecifica (“in situ”) occorrono tecniche particolari che impiegano reazionivisualizzabili mediante l’impiego di vari tipi di microscopi.8

LOCALIZZAZIONE “in situ”9

Entrambe le tecniche:12

Preparazione di campioni biologiciper l’indagine istologicaPer l’osservazione al microscopio sono necessari campioni1. sottili (attraversabili dalla luce)2. coloraticampione13

1. CAMPIONI SOTTILI (micrometri µm)Solo CELLULE ISOLATE in sospensione o COLTURE CELLULARI sonosufficientemente sottili per poter essere direttamente osservate al microscopioSanguePIASTREFIASCHEStriscioCITOLOGIA ESFOLIATIVA- PAP test- Broncoaspirato14

1. CAMPIONI SOTTILI (micrometri µm)Per avere un campione sottile bisogna normalmente tagliarlomediante speciali apparecchi (MICROTOMI)I campioni biologici in genere sono molli e non possono esserefacilmente tagliati ad uno spessore adeguato2. CAMPIONI COLORATII campioni biologici non sono normalmente coloratiNECESSITA’ DI TRATTAMENTI PRELIMINARIPericolo di alterare la proteina in esame15

Fasi della preparazione• Prelievo• Fissazione• Disidratazione• Inclusione• Taglio• ColorazionePrelievoE’ l’operazione con la quale si ottiene il campione.Deve essere eseguito il più velocemente possibile da materialebiologico vivente (tranne le autopsie).Pericolo di alterare la proteina in esame16

• Prelievo• Fissazione• Disidratazione• Inclusione• Taglio• ColorazioneFissazionePericolo di alterare la proteina in esame17

• Prelievo• Fissazione• Disidratazione• Inclusione• Taglio• ColorazioneDisidratazioneSCOPO:sostituzione dell’acqua contenuta nel tessuto con unsolvente del mezzo di inclusione (paraffina)MODALITA’:1. scala alcolica crescenteEtanolo 70%Etanolo 90%Etanolo 100%2. Chiarificazione in solvente della paraffina3. Infiltrazione in paraffina fluida diluita in solventePericolo di alterare la proteina in esame18

• Prelievo• Fissazione• Disidratazione• Inclusione• Taglio• ColorazioneInclusioneSCOPO:permette di inglobare il campione in un materiale abbastanzaduro ed omogeneo per poter essere tagliato in sezioni sottiliPARAFFINA Miscela di idrocarburi saturisolida a T ambientepunto di fusione a 54-60°insolubile in H 2 O, solubile in xiloloIl campione viene- immerso in paraffina pura liquida- trasferito in stampini, fatti poisolidificare a temperatura ambienteCAMPIONE PERMANENTEPericolo di alterare la proteina in esame19

• Prelievo• Fissazione• Disidratazione• Inclusione• Taglio• ColorazioneTaglio delle sezioniMICROTOMOStrumento che permette di sezionarei blocchetti di paraffina contenenti ilcampione in fette spesse 3-10 µm (micrometri o micron)Sezioni distese in acqua tiepida, raccolte su vetriniCAMPIONE PERMANENTE20

• Prelievo• Fissazione• Disidratazione• Inclusione• Taglio• ColorazioneTaglio delle sezioniVIBRATOMOConsente di tagliare campioni non inclusiin sezioni spesse 30-100 µm (micrometri o micron)Sezioni raccolte econservate “libere”in una SoluzioneTampone,in frigorifero o incongelatoreCAMPIONE NON PERMANENTE21

• Prelievo• Fissazione• Disidratazione• Inclusione• Taglio• ColorazioneTaglio delle sezioniCRIOSTATOConsente di tagliare a freddo (-20°C) campioni non inclusie non fissati in sezioni di 5-30 µm (micrometri o micron)Sezioni raccolte suvetrino oconservate “libere”in una SoluzioneTampone INCONGELATORECAMPIONE NON PERMANENTE22

• Prelievo• Fissazione• Disidratazione• Inclusione• Taglio• ColorazioneCOLORAZIONE1. PRETRATTAMENTII coloranti sono in soluzione acquosa, quindi le sezioni devono essere prima- sparaffinate in xilolo (10 min)- reidratate con scala decrescente di alcool- 100 (5 min)- 95 (5 min)- 75 (5 min)- acqua (5 min)2. COLORAZIONE (o REAZIONE CITOCHIMICA/IMMUNOCITOCHIMICA)3. MONTAGGIOPer avere campioni permanenti nel tempo, le sezioni devono essere poi- disidratate con scala crescente di alcool- 75 (5 min)- 95 (5 min)- 100 (5 min)- Ricoperte da vetrino coprioggetto, sigillato da “colla”CAMPIONE PERMANENTE23

MICROSCOPIO AFLUORESCENZAE CONFOCALEMICROSCOPIO ELETTRONICO24