Da un albero genealogico al DNA e ritorno - CusMiBio - Università ...

1.3. Alcuni concetti base e terminologia essenziale sulle malattie monogeniche e le leggi di MendelLe malattie ereditarie monogeniche sono determinate da mutazioni in singoli geni che si trasmettono nellefamiglie secondo leggi ben definite scoperte dall’abate Gregorio Mendel nella seconda metàdell’Ottocento. Per questo motivo le malattie monogeniche o monofattoriali vengono anche chiamate“mendeliane”. In particolare bisogna ricordare che: I geni possono avere alleli diversi (varianti alternative di uno stesso gene) ossia essere polimorfici;Gli organismi diploidi hanno due copie di ogni gene, cioè due alleli. Se i due alleli sono uguali,l’individuo è omozigote (ad es, ha genotipo AA oppure aa). Se i due alleli sono diversi, l’individuo èeterozigote (ad es, il genotipo è Aa);La I legge di Mendel o legge dell’uniformità della prima generazione ibrida, afferma che l’incrociotra individui della generazione parentale ciascuno omozigote per due alleli diversi di uno stesso gene(ad es, AA x aa) e che quindi differisce dall’altro genitore per una caratteristica (ad es, pelo nero omarrone), dà una progenie costituita da individui tutti identici tra loro (tutti eterozigoti; ad es, Aa);Durante la meiosi i due alleli di un gene segregano e si distribuiscono ciascuno in un gamete aploide(II legge di Mendel, legge della segregazione). Un individuo omozigote produce un solo tipo digamete (A oppure a) relativamente a un dato locus (la posizione occupata da un gene in uncromosoma). Un individuo eterozigote produce due tipi di gameti (A e a) in ugual quantità, cioè inrapporto (50%) ciascuno. Una buona rappresentazione grafica della segregazione si ottienecostruendo il “quadrato di Punnett” (Fig. 1.2 e 1.3);Alleli appartenenti a geni diversi localizzati su cromosomi diversi segregano in modo indipendente(III legge di Mendel, legge della segregazione indipendente);Allele dominante: allele che si manifesta allo stato eterozigote;Allele recessivo: allele mascherato dall’allele dominante, che si manifesta solo allo stato omozigote;Allele codominante: due alleli entrambi espressi allo stato eterozigote, che agiscono sul fenotipo inmodi indipendenti e distinguibili. Un esempio classico si ha nel caso degli alleli I A e I B del grupposanguigno ABO.L’1% circa dei neonati è affetto da una malattia genetica monogenica. La mutazione genica è presente findal concepimento, quindi anche alla nascita, anche se non sempre si manifesta fenotipicamente allanascita. Alcune di queste malattie comportano conseguenze già apprezzabili nel neonato. Altre malattiemonogeniche si manifestano, invece, durante le età successive della vita. La corea di Huntington, adesempio, è una malattia genetica a insorgenza tardiva che si manifesta solo in età adulta.Fig. 1.2 Rappresentazione della legge dellasegregazione dei caratteri (I legge di Mendel): nelquadrato di Punnett sono riportati i possibili genotipidei figli di genitori eterozigoti per un carattererecessivo (sopra) e per un carattere dominante (sotto).Fig. 1.3 Il quadrato di Punnett illustra la modalità ditrasmissione di un carattere recessivo legato alcromosoma X e i possibili genotipi dei figli di unpadre malato (a sinistra) o di una madre portatrice (a4destra).

Nella Tabella 1.2 sono riportate alcune delle principali malattie monogeniche di cui è indicata lafrequenza nella popolazione adulta, il tipo di trasmissione, la localizzazione cromosomica e il numero delcatalogo OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man).MalattiemonogenicheFrequenza in popolazione adulta Tipo ditrasmissioneIpercolesterolemia eterozigoti 1 / 500AutosomicafamiliaredominanteCorea di Huntington 1 / 20000AutosomicadominantePolicistite renale 1 / 1000 nati vivi Autosomicadell’adultodominanteFibrosi cistica 1 / 2000 – 4000Autosomicapopolazione caucasicarecessivaAnemia(HbS)falciformeMolto rara in Europa, moltodiffusa nella popolazione nera inAfrica (1 / 400 – 600) e inAmerica (1 / 50)Talassemia Molto frequente nel bacinoMediterraneo (1 / 250)AutosomicarecessivaAutosomicarecessivaFenilchetonuria 1 / 10000 nati vivi AutosomicarecessivaIpofosfatemia 1 / 20000 X-linkedfamiliaredominanteEmofilia A 1 / 5000 – 10000 nei maschi X-linkedrecessivaDaltonismo 8% nei maschi; 0,64% nelle X-linked(Cecità al verde e al femminerecessivorosso)Localizzazione Ref. OMIMcromosomicaCromosoma 19 143890Cromosoma 4 143100Cromosoma 16 173900Cromosoma 7 219700Cromosoma 11 141900.0243Cromosoma 11 catenebeta; cromosoma 16catene alfaAlfa:141800Beta:141900Cromosoma 12 261600Cromosoma X 307800Cromosoma X 306700Cromosoma X 303800Miopatia di 1 / 6000 nei maschi X-linked Cromosoma X 310200DuchennerecessivaTab. 1.2 Alcune malattie monogeniche di cui è indicata la frequenza nella popolazione adulta, il tipo di trasmissione,la localizzazione cromosomica e il numero del catalogo OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man).6

Ma tu ce l’haiil pedigree???!!2. Malattie genetiche monogeniche e analisi dei pedigree2.1 Che cosa e’ il pedigree?Uno degli aspetti della genetica è lo studio dei meccanismi con cui i geni sono trasmessi dai genitori aifigli. A tale scopo i genetisti effettuano accoppiamenti tra organismi della stessa specie, per analizzare latrasmissione dei caratteri. Nella genetica umana, gli accoppiamenti sperimentali ovviamente non sonopossibili. Molte delle nostre conoscenze sull’ereditarietà dei caratteri umani derivano perciò dalla analisidegli alberi genealogici o pedigree.In pratica, il pedigree è la rappresentazione sistematica della storia familiare attraverso l’uso di simbolistandardizzati (Fig.2.1). Il pedigree viene stilato partendo da un’intervista ai componenti di una famiglia,al fine di ricostruirne la storia (anamnesi); in questo modo è possibile seguire la trasmissione di un datocarattere attraverso parecchie generazioni in una data famiglia (Fig.2.2).L’analisi del pedigree permette di determinare se il carattere ha una modalità di trasmissione recessiva odominante, e se il gene in questione è localizzato su un autosoma o su un cromosoma sessuale, permettein ultima analisi di informare i membri di unafamiglia sulla probabilità di trasmettere questemalattie ai propri figli.Fig.2.1. I simboli usati nell’analisi del pedigreeadottati nel 1995 dalla Società Americana diFig.2.2. Un pedigree che mostra la trasmissioneereditaria di un carattere (i simboli scurirappresentano gli individui affetti) attraversonumerose generazioni di una famiglia.Nell’analisi del pedigree ci si basa sui principi dell’eredità di Mendel per escludere le modalità ditrasmissione che sono incompatibili con il pedigree. Ad esempio, la presenza nell’albero genealogico difemmine malate ci permette di escludere la trasmissione legata all’Y.7

3. I polimorfismi di restrizione (RFLP) e il loro utilizzo nella diagnostica dellemalattie genetiche3.1 Gli enzimi di restrizioneGli enzimi di restrizione (ER) riconoscono una sequenza di nucleotidi nella doppia elica del DNA etagliano il DNA in frammenti di lunghezza definita (Tab.3.1). Sono enzimi prodotti dai batteri che liutilizzano per difendersi dagli attacchi di un DNA estraneo, per esempio di un virus (Fig.3.1). Sono statifino ad ora purificati più di 1000 enzimi di restrizione prodotti da altrettanti tipi di batteri diversi.coesiveTab 3.1 Gli enzimi direstrizione si indicano con unsistema di lettere e numeri chesi riferisce al ceppo batterico dacui sono stati isolati. Sonomostrati alcuni esempi dienzimi di restrizione, lesequenze di DNA che questitagliano e i prodotti discissione. Alcuni enzimitagliano le sequenze in modo dadare origine ad estremitàcoesive, altri effettuano untaglio che determina laformazione di estremità piatte.Il DNA endogeno viene protetto dall’aggiunta di gruppi metile (-CH 3 ) ai residui di adenina e citosina(Fig.3.1). Dal punto di vista biochimico gli ER sono delle endo-desossi-ribonucleasi che scindono unlegame fosfodiesterico. Gli ER si possonosuddividere in varie classi a seconda della specificitàe della modalità di taglio; ER diversi riconoscono etagliano, in linea di massima, sequenze diverse; unostesso enzima taglia qualsiasi tipo di DNA dovunquetrovi la propria sequenza di riconoscimento, dettasito di restrizione. I siti di restrizione sono sequenzepalindromiche (cioè che possono essere lete inentrambe le direzioni, come le parole ANNA, ETNAGIGANTE …) di poche (in genere 4, 5 o 6) coppiedi nucleotidi.Gli ER sono uno strumento fondamentale perl’analisi del DNA.Fig. 3.1 I batteri producono enzimi di restrizione perdifendersi dagli attacchi di DNA esogeno, peresempio DNA fagico. Altri enzimi (metilasi)proteggono il DNA batterico dall’azione delleproprie endonucleasi di restrizione.A causa del tipo di sequenze riconosciute (sequenzepalindromiche) e della loro modalità di taglio (lamaggior parte degli ER fa un taglio asimmetrico),tagliando due DNA diversi con uno stesso enzimasi mettono allo scoperto le stesse sequenzenucleotidiche, si generano cioè le stesse estremità(estremità adesive o coesive) nei due tipi dimolecole. Questo permette di costruire molecole diDNA ricombinante (Fig.3.2)11

Fig 3.2 Costruzione di una molecola di DNAricombinante a partire da due molecole diDNA (una bianca e una nera) provenienti dafonti diverse ed entrambe tagliate con lostesso enzima di restrizione EcoRI.3.2 Polimorfismi del DNAIl termine polimorfismo significa “esistenza di forme diverse”. In genetica, il polimorfismo può essereanalizzato a livello di proteina (polimorfismo proteico) oppure di materiale genetico (polimorfismogenetico). In questo secondo caso, le forme diverse (ossia le varianti genetiche) possono riguardare ungene, vale a dire un tratto di DNA codificante una proteina (polimorfismo allelico), oppure un tratto diDNA non codificante (polimorfismo di sequenza).polimorfismo proteicoPolimorfismopolimorfismo geneticopolimorfismo allelicopolimorfismo di sequenza3.3 Polimorfismi di sequenza del DNAE’ stato osservato che il DNA di due individui differisce per circa un nucleotide ogni 500/1000. Questediversità di sequenza si definiscono polimorfismi e dato che >98% del DNA umano è DNA noncodificante, e che quindi la maggior parte di queste differenze è localizzata in sequenze non codificanti, ilfenotipo di un polimorfismo di sequenza del DNA non è riconoscibile dall’esterno (come nel caso, adesempio, dell’albinismo, o individuabile biochimicamente, come per i gruppi sanguigni). Dato l‘elevatonumero di loci polimorfici (1 coppia di basi ogni 500/1000), i polimorfismi di sequenza del DNA sonomolto più frequenti dei polimorfismi allelici tradizionali (albinismo, gruppi sanguigni, alleli delladeterminazione del colore degli occhi, etc, etc…) e conseguentemente più utili nella ricerca biologica emedica.3.4 I polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP)Quando un polimorfismo interessa una sequenza riconosciuta da un dato ER, la variazione, creando odistruggendo siti di restrizione, darà luogo a differenze nei siti di taglio di quel dato enzima all’internodella popolazione. Digerendo il DNA di individui diversi con quell’enzima, si osserva quindi unpolimorfismo di lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP, che per semplicità si usa leggere RIFLIP),e cioè dal DNA di individui diversi si generano frammenti di restrizione diversi.Come tutti i polimorfismi, i RFLP sono ereditabili come caratteri mendeliani semplici (Fig. 3.3) e sonotrasmessi come caratteri codominanti. Il fenotipo di un RFLP è evidenziabile in termini di differenze dinumero e/o dimensione dei frammenti di DNA ottenuti dalla digestione con un certo enzima direstrizione. I frammenti sono visibili dopo migrazione elettroforetica su un gel (Fig. 3.3 in basso).12

Fig. 3.3 Sono mostrati due frammenti di restrizione ottenuti con digestione con l’enzima EcoRI (E = sito direstrizione di EcoRI) di due alleli (1e 2) di un gene. L’allele 1 èinterrotto da un sito di taglio perl’enzima EcoRI (GAATTC), l’allele2, a causa di una mutazione di unasingola base, non presenta il sito ditaglio (GACTTC). Trattando questidue alleli con l’enzima direstrizione EcoRI, si otterrannosegmenti di lunghezza diversa: duesegmenti (350 e 150 bp) nel casodell’allele 1 e un solo segmentonon tagliato (500 bp, 350 + 150) nelcaso dell’allele 2. Negli individuieterozigoti sono presenti entrambigli alleli e quindi si evidenzierannotutti e tre i segmenti.Nella parte in basso della figura èmostrato un pedigree di unafamiglia e sotto il simbolo deisingoli individui è indicato ilgenotipo relativamente agli alleli 1e 2. Dal pedigree mostrato sicapisce come i RFLP abbiano ereditarietà mendeliana semplice e siano codominanti. Nel caso osservato, una coppiaeterozigote ha una figlia omozigote per l’allele 1 e un figlio omozigote per l’allele 2. Quando il DNA dei genitori edei figli è digerito con l’enzima di restrizione EcoRI e i frammenti di DNA vengono separati mediante corsaelettroforetica, il DNA dei genitori eterozigoti mostrano 3 bande corrispondenti a frammenti da 500, 350 e da 150bp; la figlia omozigote 1/1 mostra 2 bande corrispondenti a frammenti da 350 e 150 bp; il figlio omozigote 2/2mostra una sola banda da 500 bp.3.4.1 La tecnica della PCR per l’analisi degli RFLPL’introduzione della PCR, la tecnica che consente di amplificare selettivamente un tratto di DNA, harivoluzionato la genetica molecolare. (Per la descrizione della tecnica, vedere più avanti al § 5.1).Le applicazioni della PCR sono praticamente infinite. Uno degli ambiti di utilizzo è la diagnosi dimalattie genetiche mediante analisi dei RFLP. L’utilizzo della PCR semplifica molto le cose. Ad esempio,la PCR consente di analizzare uno specifico tratto di DNA, invece di dover lavorare su tutto il DNAnucleare di una cellula, ossia sul DNA genomico.Come è illustrato nella Fig. 3.4, i primer (inneschi) della PCR vengono disegnati a monte e a valle delsito di restrizione. Il segmento di DNA amplificato viene sottoposto a digestione con l’enzima direstrizione e i prodotti della digestione vengono analizzati dopo separazione elettroforetica.Fig.3.4 I primer della PCRvengono disegnati a monte e avalle del sito di restrizione (sito ditaglio dell’ER, cut site). Dopol’amplificazione, il DNA vienedigerito con l’enzima direstrizione e i frammenti di DNAvengono separati mediante corsaelettroforetica. Gli omozigoti e glieterozigoti sono distinguibili inbase alle diverse bande ottenutedalla digestione con l’ER. Gliomozigoti 1/1 e 2/2 darannorispettivamente due bande e 1banda; gli eterozigoti daranno 3bande.13

3.5 I polimorfismi di restrizione (RFLP) nella diagnosi delle malattie genetiche3.5.1 Utilizzo di un RFLP nella diagnosi diretta. Diagnosi di anemia falciformeGli individui affetti da anemia falciforme sono omozigoti per la mutazione HbS, che consiste nellasostituzione di un singolo amminoacido dei 146 che formano la catena dell’emoglobina.Nell’emoglobina HbS, l’acido glutammico (Glu) nella sesta posizione della catena è sostituito dallavalina (Val). La sostituzione amminoacidica è dovuta alla mutazione A T nella posizione mediana delcodone 6 (Fig. 3.5).La sostituzione che converte il codone GAG (acido glutammico) nel codone GTG (valina) modifica lasequenza CCTGAGG (che interessa i codoni 5, 6 e 7) riconosciuta e tagliata dall’enzima direstrizione MstII. Gli individui omozigoti ed eterozigoti sono distinguibili in base al tipo dibande ottenute dal loro DNA dopo digestione con l’enzima MstII (Fig. 3.5, in basso).Fig. 3.5 La figura mostra l’enzima direstrizione Mst II che riconosce e tagliala sequenza CCTGAGG. Il DNAdell’allele A viene tagliato dall’enzimadi restrizione. Una mutazione di unasingola base fa perdere il sito di tagliodell’enzima MstII e il DNA dell’allele Snon viene tagliato dall’enzima. Nellaparte bassa della figura si vede ilrisultato della corsa elettroforeticarelativa ai DNA di un individuo normale,di un portatore sano e di un individuoaffetto amplificati con PCR (utilizzandoi primer indicati dalle frecce orizzontali)e successivamente digeriti con l’enzimaMstII. L’individuo normale ( A A )mostra 2 bande, il portatore sano ( A S )mostra 3 bande e l’individuo affetto ( S S ) mostra una sola banda di lunghezzacorrispondente al DNA non tagliato.In questo caso specifico, la stessa mutazione che causa la malattia altera anche un sito di restrizione. Lasemplice digestione con l’enzima di restrizione rilevante consente di fare diagnosi diretta di malattia e diriconoscere i portatori (Fig. 3.5 e 3.6).Fig.3.6. E’ mostrato il pedigree di unafamiglia in cui soltanto il figlio 1 èaffetto da anemia falciforme. Entrambii genitori sono eterozigoti e per questomotivo hanno avuto un figlio malato.Le bande elettroforetiche per ognimembro della famiglia (visibili al disotto di ognuno) consentono diidentificare il genotipo di ogniindividuo (vedere legenda Fig.3.3 e3.5).14

13.5.2 Utilizzo di un RFLP nella diagnosi indiretta. Ricerca di un RFLP associato a un allelemalattiaA differenza di quello che avviene nel caso dell’anemia falciforme, la maggior parte delle malattiegenetiche sono dovute a numerose mutazioni diverse dello stesso gene (eterogeneità genetica, vedere pag.10). In questo caso la mutazione responsabile della malattia non corrisponde a un unico polimorfismo disequenza (e quindi a un unico eventuale RFLP).In questi casi non è quindi possibile utilizzare un RFLP per la diagnosi diretta. E’ invece possibile trovareuno o più RFLP associati al gene-malattia (in quanto localizzati all’interno o nelle vicinanze del gene) chepossono essere utilizzati per la diagnosi: si tratta in questo caso di diagnosi indiretta per associazione enon di diagnosi diretta.Per poter utilizzare il RFLP come marcatore occorre che il gene responsabile della malattia sia collocatocosì vicino al RFLP che quest’ultimo possa rivelare la presenza stessa del gene malato.Un particolare RFLP può essere associato in alcuni individui con l’allele–malattia ed in altri con l’allelesano. Pertanto, per poter utilizzare un RFLP nella diagnosi indiretta, è necessario esaminare non soltantoil DNA del malato ma il maggior numero possibile di membri della famiglia per identificare il tipo diassociazione presente in quel pedigree (Fig. 3.7).L’importanza dei RFLP come marcatori genetici di associazione sta nel fatto che consentono la diagnosidi malattia anche in casi in cui non è noto il gene responsabile. I marcatori RFLP (nel genoma umanosono stati identificati migliaia di RFLP e diverse centinaia sono stati assegnati a ciascun cromosoma)hanno consentito la mappatura di alcuni importanti geni-malattia (ad esempio, è stato possibile assegnareil gene della fibrosi cistica in posizione distale del braccio lungo del cromosoma 7).A differenza della diagnosi diretta, l’accuratezza della diagnosi per associazione è del 100% solo quandoil locus malattia e il RFLP sono strettamente associati (vicini sul cromosoma). In questo caso, infatti lafrequenza di crossing-over che può modificare l’associazione è trascurabile. Tanto maggiore è la distanzatra il RFLP e il locus genico di interesse, tanto più bassa è la probabilità di una diagnosi accurata.Un secondo aspetto da prendere in considerazione è che non sempre un dato RFLP può essere utilizzato aifini della diagnosi indiretta. E’ necessario che nella famiglia siano presenti i due alleli (se tutti gliindividui della famiglia sono portatori dello stesso allele del RFLP studiare quel RFLP in quella famiglianon è significativo!).I12 3 4II12IIIMW1 2 3 4 5 6 7 81Fig.3.7 Il pedigree mostra l’ereditarietà di un marcatore RFLP attraverso tre generazioni di una famiglia in cuiè presente una malattia recessiva legata al cromosoma X. Nella famiglia sono presenti gli alleli (+) e (-). Tuttigli individui malati sono maschi che presentano l’allele (+). Tutti gli individui portatori dell’allele (-) sonosani; si può dedurre che l’allele malattia sia strettamente associato all’allele (+) di questo RFLP. Sia la madre(II 1) che la nonna I 1 sono eterozigoti portatrici sane in cui l’allele (+) è associato all’allele malattia. L’allele(-) del RFLP è associato all’allele sano del gene malattia come dimostrato da I 2, III 5, III 6 e III 7.L’accuratezza della diagnosi dipende dal grado di associazione dei due loci. Se il marcatore e il locus malattianon sono strettamente associati, il crossing-over durante la formazione dei gameti potrebbe modificarel’associazione e un individuo portatore dell’allele (+) del RFLP non sarebbe portatore dell’allele malattia.15