Chi è il colpevole? - CusMiBio - Università degli Studi di Milano

“Sperimenta il BioLab”Chi è il colpevole?Università degli Studi di MilanoSettore Didattico, via Celoria 20, MilanoLaboratorio 105

1. Conoscenze propedeutiche1.1 Cos’è il DNA?DNA sta per Deoxyribo Nucleic Acid; è una complessa sostanza chimica che si trova nel nucleo di tutte lecellule e porta l’informazione per lo sviluppo degli organismi.• Il DNA è il materiale ereditario responsabile delle caratteristiche degli individui e quindi dellesomiglianze e differenze tra gli stessi.• Il DNA è unico per ogni individuo e diverso da individuo a individuo, eccetto che per i gemellimonozigotici, il cui DNA è identico.• Il DNA è visualizzato sotto forma di cromosomi durante la divisione cellulare.1.2 Struttura del DNALa molecola del DNA è un polimero, ossia è uninsieme di tanti monomeri: i nucleotidi. Ogninucleotide è costituito da tre componenti: un gruppofosfato, uno zucchero (desossiribosio) e una baseazotata. La molecola di DNA è formata da due catenepolinucleotidiche avvolte l’una intorno all’altra conandamento destrorso. Le due catene sonoantiparallele, ossia i due singoli filamenti sonoorientati uno in direzione 5’ → 3’ e l’altro 3’ → 5’. Glischeletri zucchero – fosfato si trovano all’esterno, lebasi azotate all’interno. Le basi delle due catene sonounite tra loro mediante legami a idrogeno (Fig. 1). Lebasi sono complementari e il loro appaiamento è:A=T Adenina - TiminaG≡C Guanina - CitosinaL’informazione genetica risiede nella sequenza dibasi.1.3 Dal DNA al cromosomaFig. 1. Struttura della doppia elica del DNA.Ciascun cromosoma eucariotico contiene una lunga doppia elica di DNA che si estende da una estremitàall’altra del cromosoma stesso. La lunghezza complessiva del DNA, che costituisce i 46 cromosomi di unacellula umana è di circa 2 metri; ne deriva quindi la necessità di compattare (spiralizzare) la molecolaaffinché la sua lunghezza sia compatibile con le dimensioni del nucleo.Alla molecola di DNA sono associati gli istoni (proteine basiche), che sono essenziali per permetterel’avvolgimento e il ripiegamento del DNA in strutture estremamente compatte, vale a dire i cromosomi,visibili solo durante la divisione cellulare. Il processo di spiralizzazione del DNA (Fig. 2) prevede livellisuccessivi di avvolgimento (compattamento).3

a)b)c)d)Fig. 2 I livelli di organizzazione della cromatinache danno origine ad un cromosoma euariotico.a) Doppia elica di DNAb) “Collana di perle” di nucleosomic) Fibre di nucleosomi addensati a forma disolenoided) Domini ad ansee) Spirali condensatef) Cromosoma metafasicoe)f)1.4 Aploidia e diploidiaNel nucleo delle cellule somatiche della maggior degliorganismi, i cromosomi sono presenti in coppie dimembri morfologicamente simili, detti cromosomiomologhi. Nel nucleo dei gameti (cellule riproduttive,gli spermatozoi e le cellule uovo), ogni cromosoma èinvece presente in singola copia. La condizione che siritrova nelle cellule somatiche è detta diploidia, quellanei gametiaploidia.Un individuo diploide è quindi tale perché nelle sue cellulesomatiche sono presenti due copie di ogni tipo di cromosoma. Nellecellule somatiche umane osserviamo ad esempio 46 cromosomi,ovvero 23 paia. Un cromosoma di ciascuna coppia di cromosomiomologhi è ereditato dal genitore femminile e l’altro dal genitoremaschile.4

Noi ci occuperemo solo deipolimorfismi di ripetizione (VNTR),vale a dire i polimorfismi dovuti allapresenza di un numero variabile disequenze nucleotidiche ripetute intandem (in orientamento testa-coda, unadi seguito all'altra). I VNTR comprendono i microsatelliti e i minisatelliti, che differiscono tra loro perla lunghezza dell’unità di ripetizione. Nei minisatelliti, le ripetizioni sono più lunghe (qualche decina oun centinaio di basi). Nei microsatelliti, le ripetizioni sono più corte, di-, tri- o tetra- nucleotidi, adesempio (AC) n oppure (CAG)n. Per questo motivo, i microsatelliti sono detti anche STR (Short TandemRepeats, ripetizioni brevi in tandem).Per un determinato microsatellite possono di conseguenza esistere numerosi alleli diversi, chedifferiscono tra loro per il numero di ripetizioni, ad esempio da 1 a 20 ripetizioni. I microsatelliti sonoquindi un esempio di polimorfismo multiallelico.Il profilo del DNA (“DNA profiling”) serve per identificare gli individui e distinguere un individuodall’altro. Se due individui presentano caratteristiche simili, ad esempio hanno capelli dello stessocolore, occhi dello stesso colore, stessa altezza, stesso gruppo sanguigno ecc. non è possibiledistinguerli. Caso estremo di individui con le stesse caratteristiche e quindi non distinguibili tra loro, èrappresentato dai gemelli identici, monozigotici.Ne consegue che per poter distinguere due individui,bisogna riferirsi a caratteristiche che siano diverse neidue soggetti. Le caratteristiche in esame nel caso delDNA profiling sono i microsatelliti. Due individui sonodiversi tra loro, se posseggono alleli diversi dei singolimicrosatelliti in esame, e quindi posseggono due allelidiversi dello stesso microsatellite.E’ intuitivo che tanto maggiore è il numero di alleli cheesistono per un certo gene, tanto maggiore è laprobabilità che un individuo sia eterozigote e quindidiverso da un altro individuo.Dato il loro elevato polimorfismo (elevato numero dialleli), i microsatelliti sono pertanto degli ottimimarcatori genetici, in quanto consentono di“marcare”, vale a dire distinguere tra loro dueindividui.I microsatelliti possono essere studiati con la PCR e successiva elettroforesi del DNA e sono utilizzatiper effettuare il test del DNA (vedi §3.2).1.7 Genotipo e fenotipoIl genotipo è la costituzione genetica di una singola cellula o di un singolo organismo, mentre il fenotipo èl’insieme delle caratteristiche visibili o in qualche modo evidenziabili di una cellula o di un organismo. Adesempio, fenotipo è non solo il colore degli occhi, il colore della pelle o l’altezza (caratteristiche visibili), maanche il tipo di gruppo sanguigno (caratteristica non visibile, ma evidenziabile con saggi di laboratorio), cosìpure i polimorfismi del DNA non si vedono osservando un individuo, ma possono essere evidenziati con laPCR e successiva elettroforesi (vedi § 2.1 e 2.2). Il fenotipo non è determinato solo dai geni, ma dipendeanche dall’interazione del genotipo con l’ambiente. La statura di una persona, ad esempio, è influenzata daigeni, tuttavia la loro espressione può essere modificata dalle interazioni con l’ambiente esterno (ad esempio,alimentazione) o interno (ad esempio, ormoni).6

Section 500. Basis for Denial of License. The following shall be grounds for denying the issuance orrenewal of a license under this ordinance. If a license is mistakenly issued or renewed to a person, it shallbe revoked upon the discovery that the person was ineligible for the license under this section.A. The applicant is under the age of eighteen (18) years.B. The applicant has been convicted within the past five years of any violation of a Federal,State or local law, ordinance provision, or other regulation relating to tobacco, tobaccoproducts or tobacco-related devices.C. The applicant has had a license to sell tobacco, tobacco products or tobacco-related devicesrevoked within the preceding twelve months of the date of application.D. The applicant fails to provide information required on the application, or provides false ormisleading information.E. The applicant is prohibited by Federal, State or other local law, ordinance, or other regulationfrom holding such a license.F. The applicant is delinquent in the payment of Federal, State, or local taxes.G. The applicant or proposed business location is in violation of any local ordinances.Section 600. Prohibited Sales. It shall be a violation of this ordinance for any person to sell or offer tosell any tobacco, tobacco product or tobacco-related device:A. To any person under the age of eighteen (18) years.B. By means of any type of vending machine.C. By means of self-service methods whereby the customer does not need to make a verbal orwritten request to an employee of the licensed premise in order to receive the tobacco, tobaccoproduct or tobacco-related device and whereby there is not a physical exchange of the tobacco,tobacco product or tobacco-related device between the licensee or the licensee’s employee andthe customer.D. Containing opium, morphine, jimson weed, bella donna, strychnos, cocaine, marijuana, orother deleterious, hallucinogenic, toxic or controlled substances except nicotine and othersubstances found naturally in tobacco or added as part of an otherwise lawful manufacturingprocess.E. Including any product sold to minors containing or delivering nicotine or lobelia intended forhuman consumption, or any part of such a product, that is not tobacco as defined by MinnesotaStatutes 609.685, unless that product has been approved or otherwise certified for legal sale bythe United States Food and Drug Administration for tobacco use cessation, harm reduction, or forother medical purposes, and is being marketed and sold solely for that approved purpose.F. By any other means, to any other person, or in any other manner or form prohibited by Federal,State, or other local law, ordinance provision or other regulation.

L’allineamento e unione tra loro dei nucleotidicomplementari avviene per azione della DNApolimerasi che procede solo in direzione 5’→3’. LaDNA polimerasi per iniziare il processo ha anchebisogno di un innesco (detto anche primer), a cuiattaccarsi e procedere con la polimerizzazione. Durantela replicazione del DNA, il primer è costituito da unacorta sequenza polinucleotidica di RNA.La replicazione è semiconservativa: ogni emi-elica(singolo filamento) della molecola madre serve dastampo per la sintesi di un nuovo filamento, per cui ognidoppia elica figlia sarà costituita da un filamentovecchio e da un filamento nuovo. Le molecole risultantisono copie esatte dell’originale. Da una doppia elicamadre derivano due doppie eliche figlie uguali tra loro euguali alla molecola madre.Fig. 3. Rappresentazione grafica della replicazione del DNA,con la formazione dei due nuovi filamenti complementari aifilamenti “stampo” della molecola originaria.2. Le tecniche che utilizzeremo in laboratorio2.1 PCR (Polymerase Chain Reaction)Si tratta di una tecnica innovativa che consiste nell’amplificazione specifica di tratti di DNA mediantereazioni a catena della DNA polimerasi.Il principio è molto semplice. Datauna sequenza di DNA a doppiofilamento e due corte sequenzeoligonucleotidiche (primer), di cuiuna complementare ad un tratto difilamento ad una estremità del DNAda amplificare (forward primer) el’altra complementare ad un altroNumerodi cicliNumeromolecole dellasequenza diDNA bersaglio1 22 43 85 3210 1.02420 1.048.57630 1.073.741.824trattopostoall’altraestremità(reverFig. 6. Schema del processo di amplificazione di un frammento di DNA tramite PCR.se primer), in presenza di una DNA polimerasi termostabile e di una misceladi desossinucleotidi trifosfati in appropriate condizioni di reazione, è possibilefar copiare numerosissime volte il tratto compreso tra i due primer,semplicemente facendo variare ciclicamente la temperatura di reazione.Infatti, raggiunta la temperatura di denaturazione (circa 95°C), la doppia elicasi apre (fase di denaturazione), rendendo disponibile lo stampo per una eventuale sintesi delle catenecomplementari. Quando la temperatura si abbassa, in virtù delle loro minori dimensioni e della loroconcentrazione, i primer si legheranno (fase di appaiamento o annealing) al DNA stampo prima che si8

Per un certo intervallo di pesi molecolari, la velocità di migrazione è funzione del peso molecolare: tanto piùgrande è la molecola, tanto minore è la velocità di migrazione. E viceversa, tanto più piccola è la molecola diDNA, tanto più velocemente migra. Le molecole di DNA di diversa lunghezza vengono pertanto separate inbase alla diversa velocità di migrazione.Per poter determinare la lunghezza delle molecole di DNA in esame precedentemente separate medianteelettroforesi, viene “caricato” sul gel anche il cosiddetto marcatore di peso molecolare, ossia una miscela diframmenti di DNA di cui è noto il peso molecolare. Confrontando la posizione dei frammenti a pesomolecolare noto con quella dei frammenti di DNA in esame, è possibile calcolare il peso molecolare diquesti ultimi, ossia la loro lunghezza.La separazione elettroforetica dura circa 30 min - 1 ora. Al termine, i vari frammenti di DNA, essendoincolori, possono essere visualizzati, immergendo il gel in un colorante. Il DNA delle diverse classi di pesomolecolare è visibile sotto forma di bande distinte: sono le cosiddette bande di DNA.In genere in laboratorio le bande si visualizzanoesponendo il gel alla luce ultravioletta. Questo èdovuto al fatto che, durante la preparazione del gel,all’agarosio è stato aggiunto l’Eurosafe, una sostanzache ha la proprietà di legarsi al DNA e di emetterefluorescenza se esposta a luce UV.Fig. 9. Osservazione del gel alla luce ultravioletta.10

3. Chi è il colpevole?3.1 AntefattoGianni, un ragazzo di quindici anni, vince una gara dibicicletta e tornando a casa si imbatte in un gruppo diteppisti che vogliono rubargli il trofeo e la bici. Dopo unacolluttazione conclusasi con il furto del trofeo al vincitoree la fuga dei teppisti, arriva il vigile di quartiere chesoccorre il malcapitato e lo riaccompagna a casa.I genitori decidono di denunciare il fatto alla polizia edopo accurate ricerche vengono rintracciati alcuni ragazzi,presenti durante la gara e rientrati a casa con evidenti esospette ferite. Anche la bicicletta di Gianni è macchiata disangue, così come i suoi vestiti. La polizia scientificainizia l’analisi del materiale biologico e decide diidentificare il colpevole, facendo il profilo del DNA.3.2 DNA profiling (test del DNA)E’ una nuova tecnica di genetica molecolare, utilizzata in tutti quei casi in cui è necessario effettuarel’identificazione di un individuo. Oltre che nei laboratori di ricerca in genetica molecolare, questa tecnica èusata nei laboratori di medicina legale di tutto il mondo.Il DNA profiling può essere applicato all’identificazione di materiale per attribuirne l’appartenenza a vittimeo sospetti, come succede nei casi di incidenti aerei, delitti, stupri. Il test del DNA può essere applicato anchealla determinazione di relazioni familiari come paternità, nascite conseguenti a stupri o incesti.Un vantaggio di questa tecnica è che essa consente di analizzare il DNA di un individuo, partendo daquantità molto piccole di materiale biologico. E’ sufficiente una piccola quantità di cellule, come un capelloo le tracce di saliva su un bicchiere o su una sigaretta per poter effettuare il test del DNA con la PCR.Il test del DNA si basa sull’analisi dei microsatelliti (vedi § 1.6.2), dopo estrazione del DNA dal campione inesame, amplificazione delle sequenze di DNA relative ai microsatelliti (tramite PCR) ed elettroforesi.Se l’individuo è omozigote per il locus analizzato (sui due cromosomiomologhi è presente lo stesso numero di ripetizioni), sul gel si osserverà unasola banda, il cui peso molecolare corrisponde alla lunghezza della ripetizione.Se invece l’individuo è eterozigote (sui due cromosomi omologhi il numero diripetizioni è diverso), sul gel si osserveranno due bande di diverso pesomolecolare a seconda della lunghezza della ripetizione.Fig. Schema di elettroforesi sugel di due microsatelliti situati sucromosomi omologhi materni epaterni (omozigoti per il locusanalizzato) e del figlio (che saràeterozigote per lo stesso lucus).11

3.3 Schema dei microsatelliti utilizzatiSono stati analizzati i tre seguenti marcatori microsatelliti: i microsatelliti 1, 2 e 3, localizzati su trecromosomi diversi.12

3.3.1 EserciziPrima di andare avanti, svolgere i seguenti esercizi.Nota per l’insegnante: gli esercizi dal numero 2 al numero 8 cercano di familiarizzare lo studente conl’importanza che i marcatori microsatelliti siano altamente polimorfici, vale a dire esista per ogni marcatore unnumero elevato di alleli. Però attenzione: ricordare allo studente che, anche se per un dato marcatore esistonomolti alleli, un individuo ne porta sempre e solo due, perché è diploide!1. Si consideri un marcatore del DNA, di cui esistono due alleli (allele 1 e allele 2).Rispondere alle seguenti domande.a) Quanti sono i genotipi omozigoti e quali?Numero di genotipi omozigoti: _____Genotipo: _______b) Quanti sono i genotipi eterozigoti e quali?Numero di genotipi eterozigoti: ____Genotipo: _______Rispostadomanda a: i genotipi omozigoti sono 2 e precisamente: 1, 1 e 2, 2.domanda b: vi è 1 solo genotipo eterozigote e precisamente: 1, 2.Nota per l’insegnante: sottolineare allo studente che se il numero di alleli è piccolo, come in questo esempio, il numero di genotipi possibiliè piccolo.2. Relativamente ai marcatori microsatelliti 1, 2, 3, sulla base dello schema riportato nella sezione 3.3, scrivere ilpeso molecolare degli alleli di ciascuno dei tre microsatelliti.Microsatellite 1 Microsatellite 2 Microsatellite 3allele 1 _________ allele 13_________allele 2 _________ allele 14_________allele 3 _________ allele 15_________allele 4 _________ allele 16_________allele 5 _________ allele 17_________allele 6 _________ allele 18_________allele 7 _________ allele 19_________allele 8 _________ allele 20_________allele 9 _________ allele 21_________allele 10_________ allele 22_________allele 11_________ allele 23_________allele 12_________ allele 24_________allele 1 _________allele 2 _________allele 3 _________allele 4 _________allele 5 _________allele 6 _________allele 7 _________allele 8 _________allele 9 _________allele 10_________allele 11_________allele 12_________allele 13_________allele 14_________allele 15_________allele 16RispostaMicrosatellite 1 Microsatellite 2 Microsatellite 3allele 1: 414 allele 13: 450allele 2: 417 allele 14: 453allele 3: 420 allele 15: 456allele 4: 423 allele 16: 459allele 5: 426 allele 17: 462allele 6: 429 allele 18: 465allele 7: 432 allele 19: 468allele 8: 435 allele 20: 471allele 9: 438 allele 21: 474allele 10: 441 allele 22: 477allele 11: 444 allele 23: 480allele 12: 447 allele 24: 483allele 1: 224allele 2: 228allele 3: 232allele 4: 236allele 5: 240allele 6: 244allele 7: 248allele 8: 252allele 9: 256allele 10: 260allele 11: 264allele 12: 268allele 13: 272allele 14: 276allele 15: 280allele 16: 284allele 1 _________ allele 12_________allele 2 _________ allele 13_________allele 3 _________ allele 14_________allele 4 _________ allele 15_________allele 5 _________ allele 16_________allele 6 _________ allele 17_________allele 7 _________ allele 18_________allele 8 _________ allele 19_________allele 9 _________ allele 20_________allele 10_________ allele 21_________allele 11_________allele 1: 102 allele 12: 146allele 2: 106 allele 13: 150allele 3: 110 allele 14: 154allele 4: 114 allele 15: 158allele 5: 118 allele 16: 162allele 6: 122 allele 17: 166allele 7: 126 allele 18: 170allele 8: 130 allele 19: 174allele 9: 134 allele 20: 178allele 10: 138 allele 21: 182allele 11: 14213

3. Relativamente ai marcatori microsatelliti 1, 2, 3, sulla base dello schema riportato nella sezione 3.3, quantisono i genotipi omozigoti e quali?Microsatellite 1 Microsatellite 2 Microsatellite 3N. genotipi omozigoti: ________Genotipi:________________________________________________________________________________________________________________________N. genotipi omozigoti: ________Genotipi:____________________________________________________________________________________________________________________________N. genotipi omozigoti: ________Genotipi:____________________________________________________________RispostaMicrosatellite 1 Microsatellite 2 Microsatellite 3N. genotipi omozigoti: 24N. genotipi omozigoti: 16N. genotipi omozigoti: 21Genotipi: 414,414; 417,417; 420,420;Genotipi: 224,224; 228,228; 232,232; 236,236; Genotipi: 102,102; 106,106; 110,110;423,423; 426,426; 429,429; 432,432;240,240; 244,244; 248,248; 252,252; 256,256; 114,114; 118,118; 122,122; 126,126;435,435; 438,438; 441,441; 444,444;260,260; 264,264; 268,268; 272,272; 276,276; 130,130; 134,134; 138,138; 142,142;447,447; 450,450; 453,453; 456,456;280,280; 284,284146,146; 150,150; 154,154; 158,158;459,459; 462,462; 465,465; 471,471;162,162; 166,166; 170,170; 174,174;474,474; 477,477; 480,480; 483,483;178,178; 182,1824.Relativamente al marcatore microsatellite 1 sulla base dello schema riportato nella sezione 3.3, indicarealmeno 5 possibili genotipi eterozigoti. Identificare gli alleli in base al numero di ripetizioni (ad es, 5,9; vedi§1.8).Genotipo eterozigote 1 _______________Genotipo eterozigote 2 _______________Genotipo eterozigote 3 _______________Genotipo eterozigote 4 _______________Genotipo eterozigote 5 _______________Risposta:per scrivere un genotipo eterozigote, bisogna abbinare un allele con un determinato peso molecolare, ossia con un dato numero diripetizioni, con un altro allele di peso molecolare diverso dello stesso microsatellite, ad esempio 7,12 oppure 4,5.5. Scrivere un possibile genotipo di un individuo eterozigote per tutti e tre i marcatori microsatelliti analizzati.Identificare gli alleli in base al numero di ripetizioni (ad es. 5, 9; vedi §1.8).Risposta:marcatore microsatellite 1: due alleli diversi, ad esempio 2,9marcatore microsatellite 2: due alleli diversi, ad esempio 4,16marcatore microsatellite 3: due alleli diversi, ad esempio 8,156. Scrivere un possibile genotipo di un individuo omozigote per il marcatore microsatellite 1 ed eterozigote per imarcatori microsatelliti 2 e 3. Identificare gli alleli in base al numero di ripetizioni (ad es. 5, 9; vedi §1.8).______________________Risposta:marcatore microsatellite 1: due alleli uguali, ad esempio 3,3marcatore microsatellite 2: due alleli diversi, ad esempio 5,10marcatore microsatellite 3: due alleli diversi, ad esempio 1,97. Si consideri l’individuo il cui genotipo è stato scritto nel problema 6, ossia un individuo omozigote per ilmicrosatellite 1 ed eterozigote per i microsatelliti 2 e 3. Si supponga di aver prelevato un campione di cellule daquesto individuo, ad esempio un prelievo di sangue, di aver estratto il DNA, di aver tipizzato questo individuomediante PCR per i microsatelliti 1, 2 e 3 e di aver fatto migrare i prodotti di PCR su gel di agarosio.Disegnare che tipo di bande di DNA ci si aspetta di osservare sul gel e in che posizione, rispetto ad un marcatoredi peso molecolare.14

isposta8. Si considerino tre individui, A, B e C.Relativamente al marcatore 1, si supponga che l’individuo A sia omozigote per l’allele 6, l’individuo Beterozigote per gli alleli 10 e 15 e l’individuo C omozigote per l’allele 11.Relativamente al marcatore 2, si supponga che l’individuo A sia eterozigote per gli alleli 3, 8, l’individuo Beterozigote per gli alleli 1 e 12 e l’individuo C omozigote per l’allele 4.Relativamente al marcatore 3, si supponga che l’individuo A sia omozigote per l’allele 9, l’individuo Beterozigote per gli alleli 10 e 12 e l’individuo C eterozigote per gli alleli 16 e 21.Disegnare le bande di DNA che ci si aspetta di osservare sul gel e in che posizione, rispetto ad un marcatore dipeso molecolare.risposta15

3.4 Schema dell’esperimentoVSCS1; S2; S3I sospettiIl campione di materiale biologico di Gianni è indicato con V= vittimaIl campione prelevato sulla scena del crimine è il sangue ritrovato sulla bicicletta ed è indicato con lalettera SCI campioni prelevati dai sospettati sono indicati con: S1, S2, S3V SC S1 S2 S3Dai campioni viene estratto il DNA, viene poi applicata la tecnica della PCR, utilizzando coppie diprimer specifiche per i tre diversi microsatelliti; successivamente si effettua l’elettroforesi e sianalizzano i risultati.3.5 Protocollo sperimentale3.5.1 principali unità di misura usate in biologia cellulare e molecolarea) alcuni prefissi comuniPrefisso Simbolo Multiplo o Esempiosottomultiplochilo k 10 3 1 kg è 1.000 grammicenti c 10 -2 1 cm è 0.01 di un metromilli m 10 -3 1 mL è 10 -3 di un litromicro µ 10 -6 1 µm è 10 -6 di un metronano n 10 -9 1 ng è 10 -9 di un grammopico p 10 -12 1 pg è 10 -12 di un grammofemto f 10 -15 1 fg è 10 -15 di un grammoatto a 10 -18 1 ag è 10 -18 di un grammob) unità di volumeNell’esperimento che effettueremo, useremo per il DNA volumi molto piccoli, pari a circa 10 µl e per iltampone volumi maggiori, pari a circa 30-300 ml.Quantità Abbreviazione Equivalentelitrolmillilitro ml 10 -3 l (1 ml = 1 cm 3 = 1 cc)microlitro µl 10 -6 l (1 µl = 1 mm 3 )16

Soluzioni e reagenti• tampone TBE (Tris-Borato-EDTA) 1x. Questo tampone si prepara facendo una diluizione 1:10 dellasoluzione “madre” TBE 10x, la cui composizione è:Tris 108 gr (0,89 M)acido borico 55 gr (0,89 M)EDTA 9.3 gr (0,02 M) pH 8,3H 2 O a 1 litro. Il pH 8,3 viene raggiunto automaticamente.• DNA prodotti con la PCR, già pronti• marcatore di peso molecolare (DNA del plasmide pUC8 tagliato con l’enzima di restrizione HaeIII)• agarosio in polvere (0.6 gr)• soluzione EuroSafe (1 µg/ml)• loading dye 6x, già pronto in eppendorf e contenente:• alcool etilico denaturato e H 2 O distillataPreparazione del gel di agarosioNota di laboratorio: la concentrazione di agarosio del gel viene scelta dal ricercatore in base alle dimensionidei frammenti di DNA da separare. Nel nostro caso, dovendo separare frammenti lineari di DNA compresitra 100 e 2.000 bp (base pairs, coppie di basi), si utilizza un gel di agarosio al 2%.Operazioni preliminari per chi ha i capelli lunghi: legarsi i capelli con un elastico prima di cominciare a lavorare, lavarsi le mani pulire il banco di lavoro con alcol etilico denaturato prima di cominciare l’esperimento, lo studente verrà familiarizzato con la strumentazione che dovràutilizzare, in modo particolare con le micropipettePreparazione del gel preparare la vaschetta per elettroforesi con bordi di “nastro adesivo di carta” verificare che il piano su cui si appoggia la vaschetta per elettroforesi sia a bolla misurare 30 ml di tampone TBE 1x in un cilindro e versarli nella beuta di vetro pirex che contiene già 0,6gr di agarosio. Attenzione a non rovesciare la beuta. L’agarosio costa 600 euro al chilo! pesare la beuta contenente la soluzione di agarosio e segnare il peso sul protocollo: _______ leggere attentemente la “Nota di sicurezza sulla utilizzazione del forno a microonde” sciogliere l’agarosio nel forno a microonde impostato sulla potenza indicata da una figura con trefiammelle ( circa 500V) per 1 minuto. Aprire poi il forno a microonde, agitare delicatamente la soluzionecon una presina, facendo attenzione a non scottarsi. Richiudere il forno a microonde e sciogliere lasoluzione per un ulteriore minuto alla stessa potenza pesare la soluzione di agarosio (l’acqua del tampone, bollendo, è evaporata!) e riportare la soluzione diagarosio al peso originale, utilizzando una spruzzetta con H 2 O distillata. Attenzione: far cadere l’acquadelicatamente, facendola scivolare lungo i bordi della beuta, altrimenti si formano delle bolleAggiungere 1 µl di Eurosafe aspettare 3-5 minuti, coprendo la beuta contenente la soluzione di agarosio con un pezzetto di stagnola,per evitare l’evaporazione. L’agarosio deve raggiungere una temperatura intorno ai 60°C, altrimentirovina il supporto di plastica della vaschetta dell’elettroforesi. Quindi versare la soluzione di agarosio,evitando di formare bolle, nella vaschetta per elettroforesi dove è già stato inserito il pettine, nella qualeva inserito il pettine. I pozzetti si formano quando, una volta solidificato il gel, viene tolto il pettine lasciare solidificare a temperatura ambiente per circa 15 min. Quando è solidificato, il gel diventa opaco mentre si aspetta che il gel solidifica, fare delle prove di caricamento dei pozzetti del gel (12µl di loadingdye 1x) su altri gel già pronti togliere il nastro di carta dalla vaschetta e metterla nella cella versare il tampone TBE 1x nella camera di corsa (servono circa 250 ml), evitando che si formino bolle,fino a coprire completamente il gel. Se si formano bolle, toglierle con la punta di una pipetta Pasteur togliere lentamente il pettine, tenendosi perpendicolare rispetto al gel17blu di bromofenolo 0.25%xilene cianolo 0.25%glicerolo 30%

Corsa elettroforetica scrivere su ciascuna eppendorf con un pennarello waterproof il tipo di campione che vi verrà trasferito: V= vittima; SC = scena del crimine; S1 = sospettato 1; S2 = sospettato 2; S3= sospettato 3; PM = marcatoredi peso molecolare prelevare 10 µl di ciascun campione di DNA e trasferirli nella eppendorf corrispondente aggiungere 2 µl di loading dye 6x e risospendere con la micropipetta, evitando di formare bolle. Ilglicerolo presente nel loading dye serve per rendere più densa la soluzione di DNA da caricare nel pozzettoe quindi a facilitarne l’entrata nel pozzetto se si formano bolle, centrifugare brevemente (1 sec) in una microcentrifuga eppendorf (in gergo dilaboratorio, si dice “spinnare” da spin, centrifugare) leggere attentemente la “Nota di sicurezza sulla utilizzazione della centrifuga” posizionare la vaschetta per l’elettroforesi su un foglio nero, perchè sia più facile individuare i pozzetti caricare lentamente ciascun campione (12 µl) nei singoli pozzetti (ogni pozzetto ha un volume di circa 15µl), ponendosi con la punta della micropipetta in un angolo del pozzetto e perpendicolare rispetto al gel,facendo attenzione a non bucare il fondo del pozzetto stesso e a non far uscire il campione fuori dalpozzetto in un pozzetto laterale, caricare il marker di DNA a peso molecolare noto chiudere il coperchio della cella elettroforetica leggere attentemente la “Nota di sicurezza sulla utilizzazione dell’apparato per elettroforesi” collegare i morsetti alla camera di corsa e ai poli del generatore di corrente, detto anche power supply; ilDNA è carico negativamente e migra verso il polo positivo fissare il voltaggio al valore costante di 100 V e lasciare procedere la corsa elettroforetica per circa 50 min fare attenzione che la banda del blu di bromofenolo non esca dal gel (altrimenti alcune bande di DNApossono uscire dal gel) osservare la migrazione del loading dye per valutare la migrazione del DNA, che, essendo incolore, non sipuò vedere. Il blu di bromofenolo migra alla stessa velocità di un frammento di DNA a doppia elica dicirca 300 bp, mentre lo xilen cianolo migra alla stessa velocità di un frammento di circa 4.000 bp.Attenzione: fermare la corsa elettroforetica quando il blu di bromofenolo si trova a circa 1-2 cm dalla finedel gel, in modo da evitare che il DNA esca dal gel stesso. Se dovesse succedere, si perdono i campioni diDNA!Operazioni da svolgere alla fine della corsa elettroforetica. al termine della corsa, indossare i guanti monouso “disposable”, togliere delicatamente il gel dalla cellaelettroforetica fare un risciacquo del gel per togliere l’eccesso di colorante, trasferendo il gel in un’altra vaschettacontenente 300 ml d’acqua a temperatura ambiente (va bene l’acqua di rubinetto) osservare il gel al transilluminatore documentare il risultato del gel, facendo una foto al gel (ricordarsi di portare una macchina fotograficadigitale!) il tampone da elettroforesi TBE (Tris/Borato/EDTA) può essere riutilizzato diverse volte. Recuperate iltampone usato e versatelo in una bottiglia con un imbuto pulire le apparecchiature ed il banco di lavoro con acqua ed etanolo denaturato dopo aver finito di lavorare, lavarsi le mani18

Nota di sicurezzaUtilizzazione del forno a microonde• non accendere il forno se è vuoto• non utilizzare il forno con materiali infiammabili• non utilizzare il forno con recipienti sigillati (potrebbero esplodere): svitare i tappi delle bottiglie, rimuovere icoperchi• non utilizzare il forno con oggetti metallici o metallizzati: (es. bottiglie coperte di stagnola) e con carta d’argento• non riempire eccessivamente i recipienti: il liquido bollendo, potrebbe traboccare• proporzionare la potenza e il tempo di riscaldamento al contenuto in acqua di quanto viene riscaldato. In particolare,nel caso di soluzioni acquose, il liquido potrebbe surriscaldarsi oltre il punto di ebollizione, senza che appaianobollicine. Ciò può portare al traboccamento improvviso di liquido bollente. Per prevenire questo pericolo, mescolare illiquido prima di scaldarlo e lasciarlo riposare per qualche minuto prima di togliere il recipiente dal forno• utilizzare i guanti imbottiti per togliere i recipienti dal forno• dopo l’uso pulire il forno con carta spruzzata con detersivo per vetri• in caso di incendio del contenuto del forno, tenere chiusa la porta, spegnere il forno, staccare la spina dalla presa dicorrente lasciando che il fuoco si estingua per soffocamentoNota di sicurezzaUtilizzazione dell’apparecchiatura per elettroforesi• assicurarsi che l’alimentatore sia spento, prima di collegare i morsetti• assicurarsi che il coperchio della vaschetta sia correttamente posizionato, prima di collegare i morsetti• prima di rimuovere il coperchio della cella elettroforetica, spegnere l’alimentatore e staccare i morsettiNota di sicurezzaUtilizzazione della centrifuga• chiudere accuratamente il tappo delle provette, per evitare la fuoriuscita di liquido e la formazione di aerosol• assicurarsi che il rotore sia bilanciato: provette di ugual peso devono essere inserite negli alloggiamentidiametralmente opposti• chiudere il coperchio della centrifuga prima di avviarla• non cercare di aprire il coperchio prima del completo arresto del rotore. In caso di fuoriuscita dei liquidi dalleprovette, avvertire il personale docenteNota di sicurezzaSmaltimento dei rifiuti• tutto il materiale monouso (puntali, provette, pipette ecc.) va messo in appositi contenitori per rifiuti• cercare di ridurre al minimo il materiale da eliminare, visto i costi elevati del loro smaltimento19

3.5.6 marcatore di peso molecolare di DNA utilizzatoCome marcatore di peso molecolare è stato utilizzato il plasmide pUC8. Si tratta di una molecola diDNA a doppia elica, con struttura circolare, formata da circa 2.700 bp. Questo plasmide deriva, persuccessive modificazioni in laboratorio, da molecole di DNA normalmente presenti nei batteri. Comein tutte le molecole di DNA, nella sequenza nucleotidica di questo plasmide sono presenti i cosiddettisiti di restrizione, ossia delle particolari sequenze di basi (come GAATTC oppure GGCC), incorrispondenza delle quali particolari enzimi, detti enzimi di restrizione, tagliano la molecola diDNA. E’ un pò come tagliare un cerchio di corda (il DNA plasmidico) con delle forbici (gli enzimi direstrizione) in punti specifici (i siti direstrizione).Se si conosce il peso molecolare delplasmide, ossia la sua lunghezza in coppie dibasi, e la posizione dei siti di restrizione diun dato enzina di restrizione, tagliando apezzetti una molecola circolare si formanoframmenti lineari di DNA a peso molecolarenoto. Questi costituiscono il marcatore diDNA a peso molecolare noto. Nel nostrocaso, il marcatore di peso molecolare ècostituito dal plasmide pUC8, tagliato conl’enzima di restrizione HaeIII.3.5 RisultatiIl risultato del gel di agarosio è riportato nello schema sottostante.20

3.7 InterpretazioneLa foto del gel va osservata attentamente per stabilire quale indiziato ha lo stesso profilo del DNA di quelloprelevato dalla scena del crimine. Per avere la certezza è necessario che le bande dell’indiziato coincidanotutte perfettamente con quelle del campione trovato, ossia presentino lo stesso profilo di DNA. Nel nostrocaso questo accade per l’indiziato 2.Attenzione: in genetica, una rondine non fa primavera, ma neanche due! In altri termini, per poter fare ilprofilo di un individuo ed ottenere risultati attendibili, bisogna analizzare secondo l’FBI almeno 13microsatelliti. Nel nostro esperimento, abbiamo analizzato 3 microsatelliti e non 13, per motivi di tempo, dispazio e di costi.3.7.1 domande di riepilogoAnalizzare attentamente il risultato e rispondere alle seguenti domande.1. Determinare il n° di ripetizioni degli alleli dei tre microsatelliti analizzati, tenendo presente lo schemadei microsatelliti riportato nella sezione 3.3.Microsatellite 1 Microsatellite 2 Microsatellite 3Allele(peso mol.)N° ripetizioni Allele(peso mol.)N°ripetizioniAllele(peso mol.)N° ripetizioniRispostaMicrosatellite 1 Microsatellite 2 Microsatellite 3Allele(peso mol.)N° ripetizioni Allele(peso mol.)N° ripetizioni Allele(peso mol.)N° ripetizioni483 24 284 16 182 21465 18 272 13 154 14432 7 244 6 126 7414 1 224 1 102 12. Determinare il genotipo degli individui relativo a ciascuno dei microsatelliti analizzati, compilando latabella sottostante. Identificare gli alleli in base al numero di ripetizioni (ad es. 5, 9; vedi §1.8).Microsatellite 1Microsatellite 2Microsatellite 3V SC S1 S2 S3RispostaV SC S1 S2 S3Microsatellite 1 1,18 7,24 1,24 7,24 1,18Microsatellite 2 1,16 16,16 16,16 16,16 6,13Microsatellite 3 1,14 1,21 7,14 1,21 7,213. Quale dei tre microsatelliti non è risultato utile per l’identificazione personale e perché?________________________________________________________________________________________________________________________________________________________RispostaIl microsatellite 2, perchè alcuni individui (S1 e S2) sono risultati omozigoti. Come pure omozigote è risultato anche ilDNA del campione SC. Se gli individui sono omozigoti, ossia presentano in omozigosi lo stesso allele, non è possibiledistinguerli.21

4. Norme generali di sicurezza in laboratorioQui di seguito sono elencate alcune norme elementari di sicurezza, che devono essere tassativamenterispettate.• Entrando in laboratorio, individuare le vie di fuga, indicate dalla segnaletica verde.• In laboratorio indossare sempre il camice. Il camice deve essere chiuso sul davanti, con maniche lunghe epolsini ad elastico. Al termine delle attività, prima di lasciare il laboratorio, togliersi il camice. In ogni caso,non uscire dal laboratorio, per recarsi in altre aree (biblioteca, uffici, bar, ecc.), senza aver prima tolto ilcamice.• Non introdurre in laboratorio borse, zaini o altro materiale non necessario.• Indossare guanti monouso durante la manipolazione di sangue o di materiale da esso derivato non fissato.I guanti devono essere rimossi con attenzione e sostituiti quando sono visibilmente contaminati. I guanti sisfilano rovesciandoli e vanno gettati negli appositi contenitori.• Gli studenti che presentano dermatiti o altre lesioni sulle mani, devono indossare guanti protettivi in tuttele fasi di lavoro.• I guanti vanno tolti, quando si usino strumenti di qualsiasi natura (telefono, tastiera, strumenti scientifici,maniglie, ecc.). I guanti usati non vanno riutilizzati.• Lavare le mani routinariamente, immediatamente dopo la manipolazione di materiali contaminati e, inogni caso, dopo la fine delle attività, anche quando sono stati indossati i guanti. Lavare sempre le maniprima di lasciare il laboratorio.• In laboratorio è vietato mangiare, bere, fumare, portare oggetti alla bocca ed applicare cosmetici.• Non pipettare mai con la bocca, ma utilizzare le apposite propipette.• Non appoggiare recipienti contenenti liquidi biologici vicino al bordo del banco di lavoro.• Tutto il materiale biologico d'origine umana (sangue, ecc.) deve essere considerato come potenzialmenteinfetto e pertanto trattato con le necessarie precauzioni.• Segnalare immediatamente al personale docente ogni spargimento di materiale biologico (ad es. schizzi disangue) sul piano di lavoro, affinché si provveda alla decontaminazione con un germicida chimicoappropriato (candeggina, ecc.).• Decontaminare e pulire sempre, al termine del loro utilizzo, le apparecchiature scientifiche e, al terminedella attività, i piani di lavoro.• Seguire scrupolosamente le indicazioni di sicurezza riportate nei protocolli di esperimento.• Raccogliere tutti i liquidi biologici (sangue, terreni di coltura venuti a contatto con le cellule, cellule, ecc.)in speciali contenitori per rifiuti, che verranno successivamente eliminati previo trattamento concandeggina al 15%.• Mettere il materiale disposable (pipette, fiasche ecc.) venuto a contatto con materiale biologico in unsacco apposito, che verrà smaltito mediante incenerimento.• Stante i costi elevati dello smaltimento, ridurre il più possibile l’uso del materiale disposable.• Segnalare immediatamente al personale docente qualsiasi incidente o la mancanza di materiale diprotezione22

5. Quiz di autovalutazione1. Completa il brano, scegliendo tra i seguenti termini:somatiche, diploidi, aploidi, poliploidi, germinali, embrione, spora, sessuali, mitosi, meiosi, gameti, cellulauovo, spermatozoo, zigote, aneuploidi, fecondazione.Nella maggior parte degli esseri viventi, uomo compreso, le cellule del corpo, ossia le cellule…………,hanno un corredo cromosomico doppio e perciò sono dette cellule………….. Mediante il processodi………………, alcune cellule cellule, dette………….danno origine a cellule riproduttive o ………………Queste cellule si chiamano……………. e …………………, rispettivamente nel maschio e nella femmina.Queste cellule si fondono durante il processo della ………….. e danno origine alla prima cellula del nuovoorganismo, detta………….2. Il DNA dell’uomo è diverso da individuo a individuo, eccetto che nel caso di:A. marito e moglieB. fratello e sorellaC. genitori e figliD. gemelli dizigoticiE. gemelli monozigotici3. Questo disegno rappresenta un nucleotide.Definisci le parti A, B e C:A…………………………….B ……………………………C …………………………….4. Le due emieliche di una molecola di DNA sono antiparallele. Questa affermazione significa che:A. una emielica ha la direzione 5’P 3’OH e l’altra 3’OH 5’PB. i legami chimici che tengono uniti i nucleotidi in ciascuna emielica sono diversiC. le due emieliche sono complementariD. una sola delle due emieliche viene trascrittaE. la replicazione del DNA è semiconservativa5. Indicare il corretto ordine decrescente di dimensioni:A. gene, cromosoma, nucleotide, codoneB. cromosoma, gene, codone, nucleotideC. nucleotide, cromosoma, gene, codoneD. cromosoma, nucleotide, gene, codoneE. gene, cromosoma, codone, nucleotide6. Gli istoni sono:A. tratti di DNA specifici per l’attacco della polimerasiB. proteine basiche utilizzate come marcatori nell’elettroforesiC. proteine basiche coinvolte nella spiralizzazione del DNA nei cromosomiD. sequenze di DNA codificante particolari proteineE. sequenze ripetute di DNA, che determinano polimorfismo allelico7. La denaturazione del DNA consiste nella distruzione:A. dei legami tra nucleotidi adiacentiB. dei legami tra zuccheroo e base azotata dei nucleotidiC. della struttura a doppia elicaD. della sequenza nucleotidica della doppia elicaE. nessuna delle precedenti23

8. In un organismo che produce gameti contenenti 32 cromosomi, il numero dei cromosomi contenutiin una cellula somatica è:A. 16B. 32C. 4D. 64E. 89. Al microscopio ottico è possibile osservare:A. virusB. ribosomiC. proteineD. batteriE. molecole inorganiche10. Definite i seguenti termini:gene ……………………………………………………………………………………locus ……………………………………………………………………………………11. In questo diagramma del processo di replicazione del DNA, i quadratini neri contrassegnati da D edE sono:A. RNA iniziatore (primer)B. DNA filamento stampo (template strand)C. frammenti di OkazakiD. DNA polimerasiE. filamento di DNA di nuova sintesi12. La replicazione del DNA: (Identificare l’affermazione sbagliata)A. è catalizzata dall’enzima DNA polimerasiB. avviene in modo simile in tutte le cellule di tutti gli organismiC. richiede l’intervento di numerosi enzimiD. necessita della presenza di un innesco a RNAE. avviene mediante aggiunta di nucleotidi in direzione 3'→5'13. La replicazione semiconservativa del DNA assicura che siano prodotte:A. due molecole identiche di DNA, ognuna formata da una emielica già esistente e da unaemielica neo-formataB. molte molecole di RNA, delle quali solo alcune maturano a RNA messaggeriC. quattro molecole di DNA, delle quali solo due vengono conservateD. due emieliche identiche di DNA, ognuna complementare al DNA stampoE. una sola emielica di DNA, copiando uno solo dei due filamenti stampo di DNA24

14. Una molecola di DNA è formata da un filamento che in un certo tratto è costituito dallaseguente sequenza nucleotidica:5’ ATCCATTGTGTCAATT 3’.Scrivi quella del filamento complementare, indicandone la polarità.15. La Taq polimerasi è:A. un enzima che interviene nella replicazione del DNAB. un enzima estratto da un batterio termofilo, usato nelle reazioni della PCRC. il colorante che permette di visualizzare le bande di DNA nell’elettroforesiD. l’enzima che favorisce l’annealing dei primer nei termociclatoriE. un marcatore di peso molecolare usato nell’elettroforesi16. Gli enzimi di restrizione:A. separano la doppia elica di DNA nei due singoli filamentiB. copiano una porzione ristretta di DNAC. introducono geni estranei nel DNAD. tagliano il DNA a livello di sequenze nucleotidiche specificheE. eliminano tratti di DNA17. Quale delle seguenti affermazioni riguardo all’elettroforesi del DNA su gel di agarosio ècorretta?A. l’elettroforesi su gel separa le singole basi azotate del DNAB. nel corso dell’elettroforesi su gel i frammenti di DNA migrano verso l’elettrodo positivoa causa della loro carica negativaC. i frammenti più grandi di DNA copriranno, nello stesso tempo, distanze maggiori nel gelrispetto ai frammenti più piccoliD. questa tecnica è usata per amplificare il DNAE. é una tecnica che permette di tagliare il DNA in frammenti18. Effettuando l’elettroforesi del DNA spiegate:a - quale carica assume il DNA e a cosa è dovutab - il verso di migrazione19. L’acronimo PCR sta per:……………………………………20. La tecnica della PCR consiste di vari cicli di amplificazione della sequenza “bersaglio” diDNA. Ogni ciclo di amplificazione, a sua volta, è costituito da tre fasi. Indicare quali.fase 1: _______________________fase 2: ________________________fase 3: _________________________21. I primer utilizzati nella PCR:A. sono sequenze ripetute di DNAB. sono oligonucleotidi ritagliati dagli enzimi di restrizioneC. per essere utilizzabili devono essere presenti molte volte nel filamento di DNAD. sono corte sequenze nucleotodiche artificiali complementari al DNA da amplificareE. costituiscono i marcatori di peso molecolare usati come riferimento nell’elettroforesi22. I markers di peso molecolare usati nell’elettroforesi per individuare la lunghezza deiframmenti di DNA sono miscele di:A. molecole proteiche, a peso molecolare noto, che vengono fatte migrare nella cellaelettroforetica insieme ai campioni da analizzareB. molecole di DNA, a peso molecolare noto, che vengono fatte migrare nella cellaelettroforetica insieme ai campioni da analizzare25

C. varie molecole di DNA e proteine, a peso molecolare noto, che vengono fatte migrarenella cella elettroforetica insieme ai campioni da analizzareD. isotopi radioattivi usati per marcare i frammenti di DNA da analizzareE. coloranti a peso molecolare noto che vengono fatte migrare nella cella elettroforeticainsieme ai campioni da analizzare23. La tecnica della PCR: (Identificare l’affermazione sbagliata)A. necessita di elevate quantità di DNA per poterne effettuare l’amplificazioneB. consente di amplificare una regione specifica del genomaC. si basa sull’utilizzo di due primerD. è costituita da vari cicli di amplificazioneE. utilizza una DNA polimerasi termostabile24. I cromosomi omologhiA. sono presenti nelle femmine, ma non nei maschiB. sono diversi per forma e dimensioni, ma portano geni identiciC. sono simili nella struttura e nella posizione occupata dai geni corrispondentiD. sono diversi a seconda che si trovino nei maschi o nelle femmineE. sono i cromosomi sessuali, contrapposti agli eterocromosomi25. Osservando i risultati dell’elettroforesi su gel, quali conclusioni possiamo trarre se:A. notiamo una sola banda per un locus analizzatoB. notiamo due bande di diverso peso molecolare per lo stesso locus26. I microsatelliti:A. sono corte sequenze nucleotidiche ripetute in numero variabile nei diversi individui, chegenerano polimorfismoB. sono i punti di innesco della DNA polimerasi durante la replicazione del DNAC. sono polimorfismi del DNA, facilmente identificabili dalle differenze nel fenotipoD. non sono utilizzabili come marcatori genetici perché presenti diffusamente in tutti gliindividuiE. rappresentano differenti proteine codificate da alleli polimorfici27. Quali sono le differenze tra polimorfismo allelico e polimorfismo del DNA?……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………28. Quanti diversi alleli di un singolo microsatellite è possibile identificare con il DNA profiling inun individuo eterozigote?A. 1B. 2C. 4D. 8E. 629. I microsatelliti sono ottimi marcatori genetici perché:A. sono frequenti in corrispondenza di loci cromosomici notiB. sono molto rari nella popolazione e quindi facilmente riconoscibiliC. le sequenze ripetute determinano un elevato polimorfismo riconoscibile nel fenotipoD. la variabilità connessa al numero di sequenze ripetute garantisce un elevatopolimorfismo, in particolare negli eterozigotiE. sono facilmente identificabili dai primer forward e reverse30. In un caso di attribuzione di paternità, il DNA del bambino viene confrontato con quello didue uomini indicati dalla madre quali presunti padri. Il DNA profiling della madre rivela perun singolo microsatellite una singola banda di circa 220 bp. Il DNA del bambino rivela due26

ande di 220 e 232 bp. Il DNA del presunto padre 1 mostra due bande di 180 e 202 bp,mentre il DNA del presunto padre 2 rivela due bande di 202 e 232 bp. Quale uomo potrebbeessere il padre?A. presunto padre 1B. presunto padre 2C. entrambiD. nessuno dei dueE. non si può determinare31. La figura riporta i DNA profiling relativi a numerosi microsatelliti effettuati su 4 coppie digemelli (indicate con le lettere da A a D). Indicare quali coppie sono costituite da gemellidizigotici.A. coppie A e BB. coppie A e CC. coppie A e DD. coppia B e CE. coppie C e D32. Da una madre con gruppo sanguigno A e un padre B può nascere un figlio con grupposanguigno 0? In caso di risposta affermativa, indica la percentuale di figli con grupposanguigno 0 e il genotipo dei genitori.33. Individua il peso molecolare totale in bp di due marcatori costituiti rispettivamente da:- primo marcatore: un primer forward da 90 bp, un primer reverse da 50 bp, con 15 unità diripetizione da 2 bp- secondo marcatore : un primer forward da 100 bp, un primer reverse da 120 bp, con 8 unitàdi ripetizione da 3 bpRISPOSTE1.Nella maggior parte degli esseri viventi, uomo compreso, le cellule del corpo, ossia le cellulesomatiche, hanno un corredo cromosomico doppio e perciò sono dette cellule diploidi. Mediante ilprocesso di meiosi, alcune cellule cellule, dette germinali danno origine a cellule riproduttive o gameti.Queste cellule si chiamano spermatozoo e cellula uovo, rispettivamente nel maschio e nella femmina.Queste cellule si fondono durante il processo della fecondazione e danno origine alla prima cellula delnuovo organismo, detta zigote.2. E3. A. (base azotata); B. (ribosio o desossiribosio); C. (gruppo fosfato)27

4. A5. B6. C7. C8. D9. D10. gene: unità funzionale di eredità che corrisponde a un segmento di DNA che codifica per unaproteinalocus: posizione fissa su un cromosoma occupata da un dato gene o da un suo allele11. A12. E13. A14. 3’ TAGGTAACACAGTTAA 5’15. B16. D17. B18. A- Il DNA assume carica negativa per la presenza di gruppi fosfatoB - dal polo negativo al polo positivo19. Polymerase Chain Reaction20. Fase 1: denaturazione del DNA; fase 2:appaiamento (annealing) dei primer; fase 3: sintesi(extension) di DNA21. D22. B23. A24. C25. A – il soggetto è omozigote per quel carattere; B- il soggetto è eterozigote26. A27. polimorfismo allelico: si riferisce a sequenze di DNA codificantepolimorfismo del DNA: sequenze di DNA in genere non codificante28. B29. D30. B31. C32. sì, 25%, A0, B033. 170 e 244 bp28

6. GlossarioAgarosioAlleleAnnealing (appaiamento)AploideBasi azotateCellulaCellula germinale o gameteCellula somaticaCromosomaCromosomi omologhiDenaturazioneDiploideDNADNA polimerasiElettroforesiEnzimaEnzima di restrizioneEterozigoteFenotiposostanza organica estratta da alcune alghe rosse e usata come gelificanteUna delle possibili forme alternative che un gene, localizzato in unospecifico sito cromosomico, può assumere.formazione di molecole ibride di acidi nucleici basata sullacomplementarietà delle basicellula o individuo con una sola copia (n) di ciascun cromosomamolecole contenenti azoto, costituenti il filamento del DNA insieme allozucchero deossiribosio e al gruppo fosfato. Sono quattro e si classificanoin basi puriniche (A e G) e pirimidiniche (T e C)Unità elementare di un organismo pluricellulare ed essa stessa, comeunità singola, un organismo elementareCellula aploide (n) deputata alla riproduzione (cellula uovo espermatozoo)Cellula diploide (2n) destinata alla formazione del corpo (in greco“soma”) di un organismo e contrapposta a quella della linea germinale,deputata alla riproduzioneStruttura generalmente allungata, costituita da cromatina, visibile almicroscopio ottico durante la divisione cellulare e contenente i geni insuccessione lineareCoppie di cromosomi di forma generalmente simile, che contengonoinformazioni per gli stessi caratteri. Portano gli stessi geni, nonnecessariamente gli stessi alleli. Si appaiano alla meiosiperdita della configurazione originale di una macromolecola, dovuta ades. all’aumento di temperatura, a cambiamenti estremi di pH, atrattamenti chimici o altro; generalmente è accompagnata a perditadell’attività biologica. Nel caso del DNA, la denaturazione consiste nellaseparazione dei due filamenti della doppia elica per rottura dei legami aidrogeno tra le basi azotateCellula o organismo avente due copie di ciascun cromosoma dell’assetto(2n)abbreviazione di acido deossiribonucleico. Il DNA constituisce ilmateriale genetico di tutti gli organismi ( ad eccezione di alcuni virus). E’costituito da due catene polinucleotidiche avvolte a doppia elicaenzima che sintetizza DNA unendo insieme nucleotidi e usando unsingolo filamento di DNA come stampotecnica che consente di separare molecole caricate elettricamente,mediante la migrazione in un campo elettricoProteina che catalizza (accelera) una specifica reazione chimica di unavia metabolica in un sistema vivente. Ha azione specifica, in quantoriconosce il substrato su cui agiredetto anche endonucleasi di restrizione o forbice molecolare; enzima chetaglia il DNA a doppia elica (e non quello a singolo filamento!), incorrispondenza di sequenze specifiche dette siti di restrizioneOrganismo o cellula diploide, in cui sono presenti due alleli diversi diuno stesso gene (Aa)Insieme delle caratteristiche visibili di un organismo, che risultanodall’interazione tra genotipo e ambiente29

Gemelli monozigoticiGemelli dizigoticiGeneGenomaGenotipoIstoniLocus ( plurale loci)Microsatelliti (STR)MutazioneNucleotideOligonucleotideOmozigotePCR(polymerase chain reaction)PlasmidePolimorfismoPolinucleotidePrimerProfilo del DNA(DNA profiling)STR (Short Tandem Repeat, cortaripetizione in tandem)gemelli derivati dalla fecondazione di una singola cellula uovo esuccessiva separazione delle cellule dopo le primisisme divisionimitotiche dello zigote. I gemelli monozigotici sono identicigeneticamentegemelli derivati dalla fecondazione indipendente di due cellule uovo condue diversi spermatozoi. I gemelli dizigotici sono geneticamente similiquanto due fratelli. Possono essere dello stesso sesso oppure di sessodiversounità funzionale di eredità che corrisponde di solito al segmento di DNAche codifica per una proteinaquantità totale di materiale genetico di una cellula; negli eucarioti indicaanche l’assetto aploide dei cromosomi di una speciecostituzione genetica di un organismoproteine basiche ricche in arginina e lisina che partecipano allaformazione del nucleosoma nei cromosomi eucarioticiposizione fissa su un cromosoma occupata da un dato gene. Nel liguaggiocomune il termine viene spesso usato come sinonimo di geneShort Tandem Repeat. Polimorfismo del DNA corrispondente a unaregione del genoma in cui segmenti identici di DNA di 2, 3 o 4 paia dibasi sono ripetuti e disposti uno di seguito all’altro in posizione testacoda(arrangiamento in tandem)Cambiamento del patrimonio genetico ereditabile, raro, improvviso ecasuale; può verificarsi spontaneamente oppure essere indotto da agentichimici o fisiciunità base ( monomero) del DNA e dell'RNA, formata da gruppo fosfato,zucchero e base azotatacorta molecola di DNA (o RNA) a singolo filamento di poche decine dipaia di basi, ottenuta artificialmente e utilizzata in esperimenti diibridazione molecolare e nella PCRorganismo o cellula diploide che porta alleli identici di uno steso gene(AA o aa)tecnica di biologia molecolare utilizzata per amplificare in breve tempotratti specifici di DNA, purché se ne conosca almeno in parte la sequenzanucleotidicapiccola molecola di DNA extracromosomico dei procarioti che ha lapossibilità di trasferirsi da una cellula all’altra previa duplicazione.Esistenza di forme diverse. Può essere riferito a: alleli (polimorfismoallelico), proteine (polimorfismo proteico), DNA (polimorfismo delDNA)Lunga molecola costituita da più nucleotidi uniti da legami fosfodiestericicorta catena polinucleotidica, a DNA o RNA, alla quale vengono aggiuntinuovi nucleotidi nel corso della sintesi di DNA. Noto anche con iltermine di innesco. Nella PCR si utilizza una coppia di primertecnica di genetica molecolare per identificare gli individui e distinguereun individuo dall’altro. Si basa sull’analisi dei microsatellitivedi microsatellite30

7. Siti web utiliAspetti forensihttp://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/elsi/forensics.shtmlhttp://whyfiles.org/014forensic/genetic_foren2.htmlhttp://www.laboratoriogenoma.it/indagini_paternita_come.aspEsercizi interattivi e laboratorio virtualehttp://www.dnai.org/d/index.htmlhttp://www.molecularlab.it/interactive/index.asphttp://www.dnalc.org/shockwave/pcranwhole.htmlApprofondimentihttp://www.geneticorigins.org/geneticorigins/pv92/aluframeset.htmhttp://www.racine.ra.it/curba/biotecnologie/index.html (in italiano)8. Concorso “Una settimana da ricercatore”Al termine delle attività di laboratorio, verrà distribuito agli insegnanti un quizzario con 30 domande da farsvolgere in classe e che potrà servire sia come verifica del lavoro svolto che per selezionare lo studentemigliore nella classe che avrà la possibilità di partecipare al concorso: “Una settimana da ricercatore”. Ilconcorso si svolgerà in un pomeriggio del mese di maggio presso l’Università degli Studi di Milano (ilpomeriggio della prova verrà comunicato successivamente), attraverso una prova al computer, basata su testinterattivi a risposta multipla.Per i primi classificati, il premio consisterà in uno stage presso un laboratorio di ricerca dell’Universitàdegli Studi di Milano nel campo della Genetica molecolare.Lo stage si svolgerà al termine dell’anno scolastico, nei mesi di giugno o luglio.31

Supervisione di: Prof.ssa Maria Luisa Tenchini, Dipartimento di Biologia e Genetica per le Scienze Mediche,Università degli Studi di Milano.A cura di:• Prof.ssa Silvana Dolfini Faccio, Dipartimento di Biologia e Genetica per le Scienze Mediche,Università degli Studi di Milano;• Prof.ssa Cinzia Grazioli, insegnante di Scienze delle scuole secondarie di secondo grado, distaccatapresso il Cus-Mi-Bio• Prof.ssa Anna Cartisano, Liceo Vico, Corsico• Prof.ssa Anna Cimino, IIS Leonardo da Vinci Cologno Monzese• Prof.ssa G. De Falco, Liceo Scientifico Cremona , Milano• Prof.ssa R. Quarta, Itc Schiapparelli, Milano• Prof.ssa G. Tabita, IIS Leonardo da Vinci Cologno MonzeseSi ringrazia la Eppendorf Italia32