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3.5 I polimorfismi di restrizione (RFLP) nella diagnosi delle malattie genetiche3.5.1 Utilizzo di un RFLP nella diagnosi diretta. Diagnosi di anemia falciformeGli individui affetti da anemia falciforme sono omozigoti per la mutazione HbS, che consiste nellasostituzione di un singolo amminoacido dei 146 che formano la catena dell’emoglobina.Nell’emoglobina HbS, l’acido glutammico (Glu) nella sesta posizione della catena è sostituito dallavalina (Val). La sostituzione amminoacidica è dovuta alla mutazione A T nella posizione mediana delcodone 6 (Fig. 3.5).La sostituzione che converte il codone GAG (acido glutammico) nel codone GTG (valina) modifica lasequenza CCTGAGG (che interessa i codoni 5, 6 e 7) riconosciuta e tagliata dall’enzima direstrizione MstII. Gli individui omozigoti ed eterozigoti sono distinguibili in base al tipo dibande ottenute dal loro DNA dopo digestione con l’enzima MstII (Fig. 3.5, in basso).Fig. 3.5 La figura mostra l’enzima direstrizione Mst II che riconosce e tagliala sequenza CCTGAGG. Il DNAdell’allele A viene tagliato dall’enzimadi restrizione. Una mutazione di unasingola base fa perdere il sito di tagliodell’enzima MstII e il DNA dell’allele Snon viene tagliato dall’enzima. Nellaparte bassa della figura si vede ilrisultato della corsa elettroforeticarelativa ai DNA di un individuo normale,di un portatore sano e di un individuoaffetto amplificati con PCR (utilizzandoi primer indicati dalle frecce orizzontali)e successivamente digeriti con l’enzimaMstII. L’individuo normale ( A A )mostra 2 bande, il portatore sano ( A S )mostra 3 bande e l’individuo affetto ( S S ) mostra una sola banda di lunghezzacorrispondente al DNA non tagliato.In questo caso specifico, la stessa mutazione che causa la malattia altera anche un sito di restrizione. Lasemplice digestione con l’enzima di restrizione rilevante consente di fare diagnosi diretta di malattia e diriconoscere i portatori (Fig. 3.5 e 3.6).Fig.3.6. E’ mostrato il pedigree di unafamiglia in cui soltanto il figlio 1 èaffetto da anemia falciforme. Entrambii genitori sono eterozigoti e per questomotivo hanno avuto un figlio malato.Le bande elettroforetiche per ognimembro della famiglia (visibili al disotto di ognuno) consentono diidentificare il genotipo di ogniindividuo (vedere legenda Fig.3.3 e3.5).14
13.5.2 Utilizzo di un RFLP nella diagnosi indiretta. Ricerca di un RFLP associato a un allelemalattiaA differenza di quello che avviene nel caso dell’anemia falciforme, la maggior parte delle malattiegenetiche sono dovute a numerose mutazioni diverse dello stesso gene (eterogeneità genetica, vedere pag.10). In questo caso la mutazione responsabile della malattia non corrisponde a un unico polimorfismo disequenza (e quindi a un unico eventuale RFLP).In questi casi non è quindi possibile utilizzare un RFLP per la diagnosi diretta. E’ invece possibile trovareuno o più RFLP associati al gene-malattia (in quanto localizzati all’interno o nelle vicinanze del gene) chepossono essere utilizzati per la diagnosi: si tratta in questo caso di diagnosi indiretta per associazione enon di diagnosi diretta.Per poter utilizzare il RFLP come marcatore occorre che il gene responsabile della malattia sia collocatocosì vicino al RFLP che quest’ultimo possa rivelare la presenza stessa del gene malato.Un particolare RFLP può essere associato in alcuni individui con l’allele–malattia ed in altri con l’allelesano. Pertanto, per poter utilizzare un RFLP nella diagnosi indiretta, è necessario esaminare non soltantoil DNA del malato ma il maggior numero possibile di membri della famiglia per identificare il tipo diassociazione presente in quel pedigree (Fig. 3.7).L’importanza dei RFLP come marcatori genetici di associazione sta nel fatto che consentono la diagnosidi malattia anche in casi in cui non è noto il gene responsabile. I marcatori RFLP (nel genoma umanosono stati identificati migliaia di RFLP e diverse centinaia sono stati assegnati a ciascun cromosoma)hanno consentito la mappatura di alcuni importanti geni-malattia (ad esempio, è stato possibile assegnareil gene della fibrosi cistica in posizione distale del braccio lungo del cromosoma 7).A differenza della diagnosi diretta, l’accuratezza della diagnosi per associazione è del 100% solo quandoil locus malattia e il RFLP sono strettamente associati (vicini sul cromosoma). In questo caso, infatti lafrequenza di crossing-over che può modificare l’associazione è trascurabile. Tanto maggiore è la distanzatra il RFLP e il locus genico di interesse, tanto più bassa è la probabilità di una diagnosi accurata.Un secondo aspetto da prendere in considerazione è che non sempre un dato RFLP può essere utilizzato aifini della diagnosi indiretta. E’ necessario che nella famiglia siano presenti i due alleli (se tutti gliindividui della famiglia sono portatori dello stesso allele del RFLP studiare quel RFLP in quella famiglianon è significativo!).I12 3 4II12IIIMW1 2 3 4 5 6 7 81Fig.3.7 Il pedigree mostra l’ereditarietà di un marcatore RFLP attraverso tre generazioni di una famiglia in cuiè presente una malattia recessiva legata al cromosoma X. Nella famiglia sono presenti gli alleli (+) e (-). Tuttigli individui malati sono maschi che presentano l’allele (+). Tutti gli individui portatori dell’allele (-) sonosani; si può dedurre che l’allele malattia sia strettamente associato all’allele (+) di questo RFLP. Sia la madre(II 1) che la nonna I 1 sono eterozigoti portatrici sane in cui l’allele (+) è associato all’allele malattia. L’allele(-) del RFLP è associato all’allele sano del gene malattia come dimostrato da I 2, III 5, III 6 e III 7.L’accuratezza della diagnosi dipende dal grado di associazione dei due loci. Se il marcatore e il locus malattianon sono strettamente associati, il crossing-over durante la formazione dei gameti potrebbe modificarel’associazione e un individuo portatore dell’allele (+) del RFLP non sarebbe portatore dell’allele malattia.15
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