Da un albero genealogico al DNA e ritorno - CusMiBio - UniversitÃ ...

More documents

Recommendations

Info

Fig 3.2 Costruzione di una molecola di DNAricombinante a partire da due molecole diDNA (una bianca e una nera) provenienti dafonti diverse ed entrambe tagliate con lostesso enzima di restrizione EcoRI.3.2 Polimorfismi del DNAIl termine polimorfismo significa “esistenza di forme diverse”. In genetica, il polimorfismo può essereanalizzato a livello di proteina (polimorfismo proteico) oppure di materiale genetico (polimorfismogenetico). In questo secondo caso, le forme diverse (ossia le varianti genetiche) possono riguardare ungene, vale a dire un tratto di DNA codificante una proteina (polimorfismo allelico), oppure un tratto diDNA non codificante (polimorfismo di sequenza).polimorfismo proteicoPolimorfismopolimorfismo geneticopolimorfismo allelicopolimorfismo di sequenza3.3 Polimorfismi di sequenza del DNAE’ stato osservato che il DNA di due individui differisce per circa un nucleotide ogni 500/1000. Questediversità di sequenza si definiscono polimorfismi e dato che >98% del DNA umano è DNA noncodificante, e che quindi la maggior parte di queste differenze è localizzata in sequenze non codificanti, ilfenotipo di un polimorfismo di sequenza del DNA non è riconoscibile dall’esterno (come nel caso, adesempio, dell’albinismo, o individuabile biochimicamente, come per i gruppi sanguigni). Dato l‘elevatonumero di loci polimorfici (1 coppia di basi ogni 500/1000), i polimorfismi di sequenza del DNA sonomolto più frequenti dei polimorfismi allelici tradizionali (albinismo, gruppi sanguigni, alleli delladeterminazione del colore degli occhi, etc, etc…) e conseguentemente più utili nella ricerca biologica emedica.3.4 I polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP)Quando un polimorfismo interessa una sequenza riconosciuta da un dato ER, la variazione, creando odistruggendo siti di restrizione, darà luogo a differenze nei siti di taglio di quel dato enzima all’internodella popolazione. Digerendo il DNA di individui diversi con quell’enzima, si osserva quindi unpolimorfismo di lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP, che per semplicità si usa leggere RIFLIP),e cioè dal DNA di individui diversi si generano frammenti di restrizione diversi.Come tutti i polimorfismi, i RFLP sono ereditabili come caratteri mendeliani semplici (Fig. 3.3) e sonotrasmessi come caratteri codominanti. Il fenotipo di un RFLP è evidenziabile in termini di differenze dinumero e/o dimensione dei frammenti di DNA ottenuti dalla digestione con un certo enzima direstrizione. I frammenti sono visibili dopo migrazione elettroforetica su un gel (Fig. 3.3 in basso).12
Fig. 3.3 Sono mostrati due frammenti di restrizione ottenuti con digestione con l’enzima EcoRI (E = sito direstrizione di EcoRI) di due alleli (1e 2) di un gene. L’allele 1 èinterrotto da un sito di taglio perl’enzima EcoRI (GAATTC), l’allele2, a causa di una mutazione di unasingola base, non presenta il sito ditaglio (GACTTC). Trattando questidue alleli con l’enzima direstrizione EcoRI, si otterrannosegmenti di lunghezza diversa: duesegmenti (350 e 150 bp) nel casodell’allele 1 e un solo segmentonon tagliato (500 bp, 350 + 150) nelcaso dell’allele 2. Negli individuieterozigoti sono presenti entrambigli alleli e quindi si evidenzierannotutti e tre i segmenti.Nella parte in basso della figura èmostrato un pedigree di unafamiglia e sotto il simbolo deisingoli individui è indicato ilgenotipo relativamente agli alleli 1e 2. Dal pedigree mostrato sicapisce come i RFLP abbiano ereditarietà mendeliana semplice e siano codominanti. Nel caso osservato, una coppiaeterozigote ha una figlia omozigote per l’allele 1 e un figlio omozigote per l’allele 2. Quando il DNA dei genitori edei figli è digerito con l’enzima di restrizione EcoRI e i frammenti di DNA vengono separati mediante corsaelettroforetica, il DNA dei genitori eterozigoti mostrano 3 bande corrispondenti a frammenti da 500, 350 e da 150bp; la figlia omozigote 1/1 mostra 2 bande corrispondenti a frammenti da 350 e 150 bp; il figlio omozigote 2/2mostra una sola banda da 500 bp.3.4.1 La tecnica della PCR per l’analisi degli RFLPL’introduzione della PCR, la tecnica che consente di amplificare selettivamente un tratto di DNA, harivoluzionato la genetica molecolare. (Per la descrizione della tecnica, vedere più avanti al § 5.1).Le applicazioni della PCR sono praticamente infinite. Uno degli ambiti di utilizzo è la diagnosi dimalattie genetiche mediante analisi dei RFLP. L’utilizzo della PCR semplifica molto le cose. Ad esempio,la PCR consente di analizzare uno specifico tratto di DNA, invece di dover lavorare su tutto il DNAnucleare di una cellula, ossia sul DNA genomico.Come è illustrato nella Fig. 3.4, i primer (inneschi) della PCR vengono disegnati a monte e a valle delsito di restrizione. Il segmento di DNA amplificato viene sottoposto a digestione con l’enzima direstrizione e i prodotti della digestione vengono analizzati dopo separazione elettroforetica.Fig.3.4 I primer della PCRvengono disegnati a monte e avalle del sito di restrizione (sito ditaglio dell’ER, cut site). Dopol’amplificazione, il DNA vienedigerito con l’enzima direstrizione e i frammenti di DNAvengono separati mediante corsaelettroforetica. Gli omozigoti e glieterozigoti sono distinguibili inbase alle diverse bande ottenutedalla digestione con l’ER. Gliomozigoti 1/1 e 2/2 darannorispettivamente due bande e 1banda; gli eterozigoti daranno 3bande.13
Page 4: 1.3. Alcuni concetti base e termino
Page 7: Ma tu ce l’haiil pedigree???!!2.
Page 14 and 15: 3.5 I polimorfismi di restrizione (

Da un albero genealogico al DNA e ritorno - CusMiBio - UniversitÃ ...

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?