Da un albero genealogico al DNA e ritorno - CusMiBio - Università ...

3. I polimorfismi di restrizione (RFLP) e il loro utilizzo nella diagnostica dellemalattie genetiche3.1 Gli enzimi di restrizioneGli enzimi di restrizione (ER) riconoscono una sequenza di nucleotidi nella doppia elica del DNA etagliano il DNA in frammenti di lunghezza definita (Tab.3.1). Sono enzimi prodotti dai batteri che liutilizzano per difendersi dagli attacchi di un DNA estraneo, per esempio di un virus (Fig.3.1). Sono statifino ad ora purificati più di 1000 enzimi di restrizione prodotti da altrettanti tipi di batteri diversi.coesiveTab 3.1 Gli enzimi direstrizione si indicano con unsistema di lettere e numeri chesi riferisce al ceppo batterico dacui sono stati isolati. Sonomostrati alcuni esempi dienzimi di restrizione, lesequenze di DNA che questitagliano e i prodotti discissione. Alcuni enzimitagliano le sequenze in modo dadare origine ad estremitàcoesive, altri effettuano untaglio che determina laformazione di estremità piatte.Il DNA endogeno viene protetto dall’aggiunta di gruppi metile (-CH 3 ) ai residui di adenina e citosina(Fig.3.1). Dal punto di vista biochimico gli ER sono delle endo-desossi-ribonucleasi che scindono unlegame fosfodiesterico. Gli ER si possonosuddividere in varie classi a seconda della specificitàe della modalità di taglio; ER diversi riconoscono etagliano, in linea di massima, sequenze diverse; unostesso enzima taglia qualsiasi tipo di DNA dovunquetrovi la propria sequenza di riconoscimento, dettasito di restrizione. I siti di restrizione sono sequenzepalindromiche (cioè che possono essere lete inentrambe le direzioni, come le parole ANNA, ETNAGIGANTE …) di poche (in genere 4, 5 o 6) coppiedi nucleotidi.Gli ER sono uno strumento fondamentale perl’analisi del DNA.Fig. 3.1 I batteri producono enzimi di restrizione perdifendersi dagli attacchi di DNA esogeno, peresempio DNA fagico. Altri enzimi (metilasi)proteggono il DNA batterico dall’azione delleproprie endonucleasi di restrizione.A causa del tipo di sequenze riconosciute (sequenzepalindromiche) e della loro modalità di taglio (lamaggior parte degli ER fa un taglio asimmetrico),tagliando due DNA diversi con uno stesso enzimasi mettono allo scoperto le stesse sequenzenucleotidiche, si generano cioè le stesse estremità(estremità adesive o coesive) nei due tipi dimolecole. Questo permette di costruire molecole diDNA ricombinante (Fig.3.2)11