Valutazione di un sistema automatizzato per l ... - Blood Transfusion

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D Zaccarelli et al.per eseguire prove di compatibilità pretrasfusionaliprogrammate (non urgenti) raccolte in batch. La dittaImmucor, da anni presente presso il nostro Servizio, hariconosciuto le sovraesposte caratteristiche nello strumentoABS Precis e ci ha offerto la possibilità di introdurlo nelnostro laboratorio, proponendoci il suo utilizzo per ladeterminazione dei gruppi sanguigni in micrometodo e perlo screening anticorpale ed il crossmatch con metodiche infase solida. Intravedendo la possibilità di riorganizzarel'evasione di unità assegnate con procedura non urgente,abbiamo dedicato particolare attività a quest'ultimametodica.Materiali e MetodiIl sistema ABS PrecisIl sistema ABS Precis è costituito da:- un preparatore-diluitore a quattro puntali (Rosys) dotatodi sistema di riconoscimento di bar-code per campioni,reattivi e piastre di reazione per la sicurezzadell'identificazione; la stazione di lavaggio per lemicropiastre di reazione e la stazione di incubazionesono incorporate;- un lettore di micropiastre ad analisi d'immagine (Zenyx)per la lettura di emoagglutinazione e fase solida;- una centrifuga per micropiastre (Heraeus, HeraeusInstruments GmbH, Hanau, Germany);- il software che gestisce il preparatore-diluitorenell'impostazione delle varie metodiche;- il software che gestisce le informazioni provenienti dallettore per l'interpretazione delle reazioni, la refertazionee l'archiviazione delle analisi.Le metodiche ABS PrecisI gruppi sanguigni vengono eseguiti in micropiastre da96 pozzetti, previo trattamento delle emazie con bromelina;gli antisieri Immucor sono pronti all'uso, mentre le emazietest sono di nostra preparazione (3% in Alsever). I profili direazione sono personalizzabili. Quelli di nostro utilizzo sono:- metodica Gruppi ABO ad 8 parametri (disposti in colonneverticali);- metodica ABO Fenotipo a 12 parametri (disposti in fileorizzontali).La ricerca di anticorpi irregolari utilizza metodiche infase solida: Capture-R Ready Screen con pannello a 2, a 4 ocon un pool di cellule.Per l'esecuzione delle prove di compatibilità, la metodicadisponibile al momento dell'installazione dello strumentoprevedeva alcuni passaggi manuali preliminari al fine diottenere la diluizione di lavoro delle unità:1- svuotamento del segmento della sacca del donatore inuna provetta da etichettare con bar-code;2- tre lavaggi preventivi di questa, da eseguire conapparecchio automatico in dotazione, allo scopo diridurre al minimo la quota residua di plasma, le cuiproteine ostacolano l'ottimale adesione dei globuli rossinella formazione del monostrato;3- diluizione delle emazie lavate con soluzione fisiologicatamponata;4- compilazione di una work-list informatica utilizzandouno scanner manuale per rilevare i bar-code, al fine diabbinare le unità ai rispettivi riceventi.Sistemate sullo strumento le diluizioni di lavoro, questiprocedeva alla creazione del monostrato con:5- distribuzione di 50 mL della diluizione delle unità nelpozzetto di reazione;6- centrifugazione a 1.000 gpm per 3' (intervento manuale);7- ricollocamento della piastra sullo strumento per illavaggio;8- dispensazione automatica di 100 µL di Liss + 50 µL disiero del ricevente nei relativi pozzetti;9- incubazione a 37 °C per 20';10- lavaggio automatico dei pozzetti di reazione;11- dispensazione di 50 µL di emazie indicatrici (veicolantil'antiglobulina anti-IgG);12- centrifugazione a 1.900 gpm per 2' (intervento manuale);13- lettura visiva e/o strumentale della piastra e relativaarchiviazione e refertazione.Questa metodica è stata considerata non adatta allanostra routine, in quanto la fase del lavaggio preventivo ela successiva diluizione manuale delle emazie, oltre adallungare i tempi (5-8' per il lavaggio di 12 campioni, più iltempo per la gestione manuale delle provette), complicaval'esecuzione del test, riportandoci ad una pratica pocostandardizzata, troppo laboriosa e problematica, giàbrillantemente superata dai test su colonna. Quindi, incollaborazione con Immucor, abbiamo cercato di mettere apunto una metodica alternativa che potesse evitare questipassaggi.Come abbiamo procedutoAbbiamo eseguito numerose serie di test in doppio conemazie delle unità preventivamente lavate e non lavate;come riceventi abbiamo utilizzato:- sieri di pazienti già testati in gel test contro le stesseunità;- sieri con anticorpi irregolari a titolo noto, testati controunità positive e negative per gli antigeni corrispondenti.È emerso, fin dall'inizio, che la fase critica del processoè la formazione del monostrato e che per migliorarne lecaratteristiche era necessario diluire molto di più le emazie190
Automazione test immunoematologiciTabella I: prove crociate eseguite in parallelo in fase solida(FS) e gel testn° Concordanti Discordanticross matches448 390 (87 %) 58 (13 %) 3 gel pos, FS neg55 gel neg, FS posTabella II: prove crociate eseguite con sieri contenentianticorpi, in parallelo in fase solida (FS) e gel testSpecificità Totale Positività PositivitàAbs test in gel test in FSJk a + K 7 6 6Jk a 11 3 3S 5 5 5Fy a 2 2 1E 2 2 1D 1 1 1CQ 4 4 0al fine di trasferire la minore quantità possibile di proteineplasmatiche nel pozzetto.Abbiamo, quindi, cercato di ottimizzare la diluizione delleemazie, i tempi e la velocità di centrifugazione, sia per laformazione del monostrato (punto 5) che nella fase finale(punto 11).Per individuare la diluizione ottimale abbiamo operatomanualmente su micropiastre con pozzetti a fondo piattoda 350 µL, e, gradualmente, siamo arrivati a discreti risultaticon una diluizione pari allo 0,8-1% in fisiologica tamponata,che abbiamo ritenuto ottimale.Per fare riprodurre questa diluizione dallo strumento, laprovetta da 5 mL adottata si è rivelata di capacitàinsufficiente, per cui abbiamo proposto ad Immucor diapportare una modifica al software che prevedesse l'uso diuna piastra per la prediluizione come per le prove manuali.In una prima versione, si è tentato di raggiungere loscopo con una unica diluizione in un unico pozzetto, maquesta si è dimostrata ancora insufficiente. Con unaseconda versione, si è finalmente raggiunto la diluizionedello 0,8 % attraverso diluizioni successive in due pozzetti.Per quanto riguarda la centrifugazione per la formazionedel monostrato, siamo passati da 3 minuti a 5 minuti,ottenendo un monostrato più stabile.La centrifugazione finale è stata modificata nella velocitàe nel tempo: siamo passati da 1.900 gpm per 2 minuti a 2.300gpm per 3 minuti al fine di ottenere un fondello il piùpossibile chiuso e con margini definiti nei test negativi eche allo stesso tempo si mantenesse aperto nei test attesicome positivi deboli.Questa nuova metodica è stata utilizzata per eseguireuna serie di crossmatches in parallelo con il nostro metododi riferimento, il gel test.RisultatiLe prove dedicate al gruppaggio e allo screeninganticorpale sono state relativamente poco numerose, inquanto le metodiche e lo strumento si sono immediatamentedimostrati conformi alle attese; la metodica dello screeninganticorpale è stata messa subito in routine (10.923 test insette mesi) con netto miglioramento in ripetibilità especificità rispetto ai risultati ottenuti con il precedentepreparatore (siamo passati dal 2% allo 0,5% di falsi positivi,non confermati cioè ad un secondo controllo).Maggiore è stato l'impegno per valutare l'attendibilitàdelle prove di compatibilità pretrasfusionali.Dei 448 crossmatches eseguiti in doppio, 390, pariall'87%, hanno dato esito concordante con il test in gel,mentre per 58 (il 13 %) il risultato discordava.La grande maggioranza delle discordanze, 55, dava unrisultato positivo in fase solida (FS), negativo in gel (TabellaI); questi sieri sono stati quindi testati per la ricerca dianticorpi irregolari in fase solida, risultando tutti negativi,tranne due casi in cui si è avuta panagglutinazione. In unodi questi, si è rilevato un test diretto all'antiglobulina (TAD)positivo mentre l'altro non ha avuto alcun riscontro con lemetodiche di riferimento.In un caso la fase solida non ha rivelato incompatibilitàdi gruppo ABO.Nella tabella II sono rappresentate le prove fatte, semprein doppio, con sieri contenenti anticorpi irregolari testaticontro unità tipizzate per gli antigeni corrispondenti e conil siero utilizzato come controllo di qualità (CQ) per il geltest (anti-D commerciale IgG + IgM diluito 1: 1.500).DiscussioneUna possibile spiegazione per il 20 % dei 58 casidiscordanti è da individuare nelle differenti modalità discomposizione delle unità in emocomponenti. Il nostroServizio, sede di CRCC, ha a disposizione unità di diversaprovenienza: in tutti i casi in cui non sono state utilizzateunità di tipo top and bottom, non si è riusciti ad ottenereun monostrato efficace, poiché in questi casi le emazie neisegmenti risultano sospese in plasma e non in soluzioneconservante.Dai dati riportati nella seconda tabella si evince che lasuperiore sensibilità dei test in fase solida descritta da altriAutori per lo screening anticorpale 1-3 non si manifesta, nella191
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