Il test Chiron-TMA: un approccio molecolare allo ... - Blood Transfusion

M. Testi et al.Figura 3: protocollo di validazione - limite di sensibilitàOrganizzazione del lavoroIl laboratorio è stato organizzato in due locali attigui,ciascuno dotato dei materiali e dei reagenti necessari, talida permettere la separazione tra aree di pre-amplificazionee di post-amplificazione e strutturati in modo tale daconsentire un flusso di lavoro unidirezionale 11 .- Nell'area di pre-amplificazione sono state eseguite lapreparazione del campione e l'amplificazione mediatadalla trascrizione; per la distribuzione del plasma e delReagente di Cattura del Target è stato impiegato unpreparatore automatico Tecan Genesis RSP 150/8 (TecanItalia Srl, Cologno Monzese - MI), con relativo softwarein grado di identificare i campioni primari, creare unalista di lavoro e collegare i codici a barre relativi aicampioni a quelli dei tubi di reazione.- Nell'area di post-amplificazione sono state eseguitel'ibridazione e la rilevazione mediante HPA. La lista dilavoro creata dal Tecan viene inserita nel software dielaborazione dati del luminometro, il quale provvedeall'elaborazione finale dei risultati.Protocollo di validazione per HCV-RNALa procedura analitica, definita come l'intero processodall'estrazione dell'acido nucleico alla rilevazione deiprodotti dell'amplificazione, è stata validata, valutando trecaratteristiche principali:- la specificità,- il limite di sensibilità,- la robustezza.SpecificitàViene intesa come la capacità di rilevareinequivocabilmente l'acido nucleico in presenza di altricomponenti, ed è strettamente collegata con la scelta deiprimers e delle sonde, nonché con la stringenza deiparametri di amplificazione e rilevazione. Generalmente,quando si usa un kit commerciale, viene accettata lavalutazione fornita dal produttore. Tuttavia, è stato ritenutoopportuno confermare la capacità del metodo di nonprodurre risultati falsamente positivi, testando 100 campionidi plasma precedentemente risultati negativi alla ricerca diHCV-RNA con il kit Amplicor HCV Roche v.2.0 (RocheDiagnostics SpA, Monza - MI) modificato conl'introduzione di uno step di ultracentrifugazione.Limite di sensibilità (cut-off)Viene definito come il numero minimo di sequenze targetper volume di campione rilevabile nel 95% dei test eseguiti.Per determinare questo cut-off, sono state saggiate 4diluizioni seriali semi-logaritmiche del Working Reagent ISSHCV 0498 12 , preparazione di riferimento calibrata contro loStandard Internazionale WHO 96/790 13 a 1.698 UI/mL. Laconcentrazione delle diluizioni era di 31,7 UI/mL, 10 UI/mL,3,17 UI/mL e 1 UI/mL (Figura 3). Per ottenere 24 replicati di204

Test Chiron-TMA per lo screening HCV-RNATabella I: limite di sensibilità - risultaticiascuna delle diluizioni dello Standard impiegate, sonostate effettuate 4 prove, in ognuna delle quali ogni diluizioneè stata ripetuta 6 volte. Per diluire il Working Reagent èstato utilizzato un campione di plasma risultato negativo altest di screening per anticorpi anti HCV (MEIA Abbott) eal test per la rilevazione di HCV-RNA (Amplicor HCV Rochev.2.0). Lo stesso diluente è stato comunque testato inciascuna prova in 6 replicati. Il cut-off è stato calcolatomediante analisi dei probit.RobustezzaIn merito alla robustezza, ossia alla capacità dellametodica di rimanere invariata nonostante piccolicambiamenti nei parametri di reazione, non essendo presentistep di ultracentrifugazione, ci si è basati sulle valutazionidel produttore del kit. È tuttavia stato eseguito un controllodella cross-contaminazione testando, in un'unica seduta,20 campioni di plasma negativo, di cui 10 infettati con uncampione HCV-RNA positivo alla concentrazione di220.000 UI/mL, come valutato mediante test HCV MonitorRoche, con diluizione finale di 1:10. I 20 campioni sonostati processati alternando un campione positivo ed uncampione negativo.Screening HCV-RNA e HIV1-RNANel periodo compreso tra settembre ed ottobre 1999,sono stati esaminate 3.300 donazioni. I campioni di plasmaprovenienti da singolo donatore sono stati raccolti inprovette K 3EDTA ed analizzati entro 24 ore dal prelievo.Di tutti i campioni è stata contemporaneamente eseguitala ricerca di HCV Ab e HIV1-Ab mediante dosaggioimmunoenzimatico a cattura di microparticelle. In ogniseduta analitica sono stati testati 3 calibratori negativi, 3calibratori HCV RNA positivi e 3 calibratori HIV-1 RNApositivi necessari per determinare due limiti di cut-off perciascun test: uno per il segnale analitico ed uno per il segnaledel controllo interno. Il software di elaborazione dati delluminometro, tramite questi valori, ha calcolato, perciascuna esecuzione, i criteri di validità di ogni singolaseduta e dei singoli campioni. In tutte le sedute è statoinoltre inserito come run control, lo standard HCV ISS 0498ad una concentrazione pari a tre volte il cut-off determinatodalla validazione. La seduta analitica era validata se, oltre asoddisfare i criteri di validità indicati dal software dielaborazione dati, il run control in essa analizzato dava unrisultato positivo ed il numero totale di calibratori e/ocampioni invalidi era inferiore al 10%.RisultatiValidazione per HCV-RNASpecificità100 campioni precedentemente risultati negativi per laricerca di HCV-RNA con la metodica Amplicor HCV Rochev.2.0 si sono confermati non reattivi con il metodo ChironTMA, dimostrando una buona capacità della metodica dinon produrre risultati falsamente positivi.Limite di sensibilitàI risultati ottenuti testando 24 replicati di ciascuna205

M. Testi et al.Figura 4: analisi dei Probit - il grafico mostra la retta della regressione lineare Probit = a + b log dose determinata coni dati della tabella I. I punti corrispondenti a 10 e 31,7 UI/mL sono stati omessi, dato che per il 100% diprobabilità il Probit assume un valore infinito.diluizione dello standard HCV ISS 0498 sono mostrati nellatabella I. Per ogni diluizione testata, è stata calcolata lapercentuale di positività ed il rispettivo valore del probitutilizzando il programma di analisi statistica "Sigma Plot".Dalla regressione lineare: Probit = a + b log dose, illimite di rilevabilità può essere facilmente calcolato secondola formuladose 95%= (Probit 95%- intercetta)/ pendenza.Il limite di sensibilità è risultato pari a 13 UI/mL (Figura 4).RobustezzaAnalizzando alternativamente campioni di plasmanegativi e campioni contaminati con HCV-RNA ad elevataconcentrazione, non è stata osservata crosscontaminazione.Screening di HCV-RNA e HIV1-RNA su campionida singolo donatoreNel periodo settembre-ottobre 1999, sono stati analizzati3.300 campioni in 38 sedute (Tabella II). Un totale di 8campioni sono risultati inizialmente reattivi e di questi 7 sisono confermati alla ripetizione del test. I 7 campioni reattivisono stati identificati come HCV-RNA positivi mediantel'esecuzione del test di discriminazione per HCV-RNA eHIV1-RNA; inoltre i campioni erano positivi alla ricerca dianticorpi anti HCV e confermati HCV-RNA positivi anchecon metodica Amplicor Roche v.2.0 modificata. Il campioneinizialmente reattivo e non confermato risultava negativoper HCV Ab e negativo per HCV-RNA anche con metodoAmplicor HCV Roche v.2.0 modificato. È stato, quindi,classificato come "falso positivo". Nessun campione HCV-RNA positivo era negativo allo screening anticorpale.Viceversa, come indicato dalla tabella III , il confronto trasierologia e NAT ha evidenziato 5 campioni positivi perHCV Ab e negativi per HCV-RNA: di questi, 3 RIBA positivie 2 indeterminati, con una percentuale complessiva dicampioni positivi per HCV-RNA, rispetto ai positivi perHCV Ab, del 58,33%. I donatori risultati HCV Ab positivi e/o HCV-RNA positivi erano tutti occasionali. Nessuncampione, infine, è risultato HIV1-RNA positivo. Riguardoalla metodica, nessuna seduta è risultata non valida, mentrei campioni con controllo interno negativo, e quindi nonvalidi, sono stati 6 (0,18%). In questa evenienza, il campioneveniva ripetuto nella seduta successiva.DiscussioneLe Linee Guida del Consiglio d'Europa, relative allavalidazione dei metodi basati sull'amplificazione degli acidinucleici per la ricerca di HCV-RNA nei pool di plasma,stabiliscono un protocollo con il quale valutare lemetodologie presenti sul mercato al fine di una loroapplicazione ad una routine trasfusionale. La metodica206

Test Chiron-TMA per lo screening HCV-RNATabella II: risultati dello screening HCV RNATabella III: confronto tra sierologia e NATNATHCV RIBAPOS IND NEGPOS 7 0 0NEG 3 2 0n° campioni anti-HCV pos = 12Chiron TMA HIV-1/HCV, validata secondo tali criteri, hamostrato una buona rispondenza, in termini di specificità,di robustezza e di sensibilità, ai requisiti richiesti. Perquest'ultimo parametro, è importante sottolineare chegeneralmente nei pannelli di sieroconversione si rilevanoda 5x10 4 a 5x10 8 UI/mL di HCV-RNA e che campioni conuna concentrazione inferiore a 5x10 4 UI/mL sono daaspettarsi esclusivamente all'inizio della replicazionevirale 14 . Pertanto, una sensibilità minima di 5x10 3 UI/mL perla singola donazione è da ritenersi sufficiente per rilevarecampioni HCV-RNA positivi in fase precedente allasieroconversione e tale è stata la soglia di sensibilitàproposta dal Paul Ehrlich Institute (Federal Gazette n°6304/04/97). Il Consiglio d'Europa, tramite l'EMEA (TheEuropean Agency for the Evaluation of MedicinalProducts) nella sua raccomandazione 390/97 non stabiliscedirettamente un limite di sensibilità, ma richiede che il metodosia in grado di rilevare un run control che abbia unaconcentrazione di HCV-RNA di 100 UI/mL, considerandoevidentemente l'ipotetica diluizione di un campione positivoin un pool. Il test Chiron TMA ha mostrato, nelle nostremani, un limite di sensibilità di 13 UI/mL, soddisfacendoentrambi i requisiti proposti. La metodica è strutturata inmaniera tale da ridurre al minimo il pericolo dicontaminazione, in quanto la reazione avviene, senzatrasferimenti, in un unico tubo; l'RNA trascritto, inoltre,essendo più labile nell'ambiente esterno rispetto al DNAprodotto da altri sistemi di amplificazione e non contenendosequenze riconosciute dal reagente di cattura del target,non può contaminare una nuova reazione.La rintracciabilità dei campioni esaminati è garantita dauna lista di lavoro creata dal Tecan che collega i codici abarre dei campioni e quelli dei tubi di reazione; il softwaredi elaborazione dati del luminometro, tramite essa, provvedeall'elaborazione finale dei risultati.Lo screening virologico delle unità di sangue basatosull'amplificazione degli acidi nucleici rappresentasicuramente un grosso contributo alla sicurezzatrasfusionale, ma allo stesso tempo è fonte di numerosiproblemi relativi alla necessità di un'organizzazione di unacerta complessità, al superamento di limiti tecnici emetodologici, nonché alla valutazione del rapporto costobeneficiodell'introduzione di tale tecnologia.La strategia che attualmente la maggior parte deilaboratori sta valutando è quella, in analogia a quantoavviene nelle industrie produttrici di emoderivati, di testarecampioni di plasma riuniti in pool 15,16 ; questa scelta è dettatasia da motivi economici che dalla difficoltà di analizzarecontemporaneamente e in tempo reale un elevato numerodi campioni. Viceversa, un'impostazione basata sulloscreening delle singole unità è conforme all'organizzazionegià in uso nei servizi trasfusionali per i test sierologici enon necessita della validazione di un algoritmo dipreparazione dei pool. Ulteriori vantaggi di questoapproccio possono essere rappresentati da una sensibilitàmaggiore, non essendoci diluizione dei campioni in un pool,e da un rilascio immediato delle unità non reattive, venendoa mancare la necessità, come nel caso dei pool di plasma, dirisalire per tappe successive, al campione positivo.Il test Chiron TMA HIV-1/HCV presenta delle207

M. Testi et al.caratteristiche che lo rendono adatto ad una ipotesi diquesto tipo, essendo in grado di analizzarecontemporaneamente numerosi campioni e di rilasciare irisultati in circa 5 ore. La possibilità, infine, di rilevarecontemporaneamente HCV e HIV-1 rappresenta un primopasso verso quella che sembra essere la strategia del futuro,ossia uno screening molecolare dei diversi agenti viralicon lo stesso test, con il massimo grado di automazione.RiassuntoI test di amplificazione degli acidi nucleici (NAT) perla ricerca di HCV-RNA possono consentire, rispetto agliattuali test basati sulla rilevazione di anticorpi, una identificazioneprecoce dell'infezione da HCV: la loro applicazionenello screening di routine delle unità di sangue,su singolo campione o su pool di plasma, potrebbe quindiaumentare la sicurezza della terapia trasfusionale.Il test Chiron TMA HIV-1/HCV è un'indaginemolecolare per la rilevazione qualitativa dell'RNA delvirus dell'epatite C e /o di quello dell'HIV-1 che, per lesue caratteristiche, può essere utilizzato per la rilevazionedi HCV-RNA nelle singole unità di sangue. Nell'ipotesidi introdurre tale tecnologia molecolare nello screeningdelle unità destinate a trasfusione, è stato seguito un protocollosperimentale comprendente la validazione delmetodo secondo le Linee Guida emanate dal Consigliod'Europa PA/PH/OMCL (98) 22 e lo screening di campioniprovenienti da singolo donatore, ossia senza ricorrerealla formazione di plasma pool.RingraziamentiGli AA ringraziano il Dott. G. Gentili, il Dott. G. Pisani eil Dott. G.M. Bisso del Laboratorio di Immunologia dell'IstitutoSuperiore di Sanità per la disponibilità e la fattiva collaborazione.Bibliografia1) Widell A, Elmud H, Persson MH et al.: Transmission of hepatitisC via both erythrocyte and platelet transfusions from a singledonor in serological window-phase of hepatitis C. Vox Sang,71, 55, 1996.2) Schreiber GB, Busch MP, Kleinman SH et al.: The risk oftransfusion-transmitted viral infections. N Engl J Med, 334,1685, 1996.3) Koerner K, Cardoso M, Dengler T et al.: Estimated risk oftransmission of hepatitis C virus by blood transfusion. VoxSang, 74, 213, 1998.4) Muller-Breitkreutz K, Baylis SA, Allain JP: Nucleic AcidAmplification tests for the detection of blood-borne viruses.Vox Sang, 76, 194, 1999.5) Stramer SL, Porter RA, Brodsky JP et al.: Sensitivity oh HIVand HCV RNA detection by pooled genome amplificationtesting. Transfusion, 38, 705, 1998.6) Busch MP, Rawal MD, Ferberg EW et al.: Dynamics of HCVviremia and seroconversion in transfusion acquired HCVinfections. Transfusion, 38, 725, 1998.7) Roth WK, Weber M, Seifried E: Feasibility and efficacy ofroutine PCR screening of blood donations for hepatitis Cvirus, hepatitis B virus and HIV-1 in a blood-bank setting.Lancet, 353, 359, 1999.8) Flanagan P, Snape T: Nucleic Acid Technology (NAT) testingand the Transfusion Service: a rationale for the implementationof minipool testing. Transf Med, 8, 9, 1998.9) Mc Donough SH, Giachetti C, Yang Y et al.: High throughputassay for the simultaneous or separate detection ofHuman Immunodeficiency Virus (HIV) and Hepatitis TypeC Virus (HCV). Infusionsther Transfusionsmed, 25, 164,1998.10) Arnold LJ, Hammond PW, Wiese WA: Assay formats involvingAcridium-ester labelled DNA probes. Clin Chem, 35, 1588,1989.11) Knok S, Higuchi R: Avoiding false positives with PCR. Nature,339, 237, 1989.12) Pisani G, Mele C, Bisso G et al. : Nucleic Acid AmplificationTechnology (NAT) for the detection of Hepatitis C Virus(HCV) in plasma pools. Validation Report 2000, 11. RapportiISTISAN 00/613) Saldhana J, Leslie N, Heath A: Establishment of the firstInternational Standard for nucleic acid amplificationtechnology (NAT) assays for HCV RNA. WHO CollaborativeStudy Group. Vox Sang, 76, 149, 1999.14) Flanagan P, Barbara J: PCR testing of plasma pools: fromconcept to reality Trans Med Rev, 13, 164, 1999.15) Mortimer J: Intersecting pools and their potential applicationin testing donated blood for viral genomes. Vox Sang, 73, 93,1997.16) Lefrere JJ, Coste J, Defer C et al.: Screening blooddonations for viral genomes: multicenter study of realtimesimulation using pooled samples on the model ofhepatitis C virus RNA detection. Transfusion, 38, 915,1998.208