Il test Chiron-TMA: un approccio molecolare allo ... - Blood Transfusion

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M. Testi et al.Figura 4: analisi dei Probit - il grafico mostra la retta della regressione lineare Probit = a + b log dose determinata coni dati della tabella I. I punti corrispondenti a 10 e 31,7 UI/mL sono stati omessi, dato che per il 100% diprobabilità il Probit assume un valore infinito.diluizione dello standard HCV ISS 0498 sono mostrati nellatabella I. Per ogni diluizione testata, è stata calcolata lapercentuale di positività ed il rispettivo valore del probitutilizzando il programma di analisi statistica "Sigma Plot".Dalla regressione lineare: Probit = a + b log dose, illimite di rilevabilità può essere facilmente calcolato secondola formuladose 95%= (Probit 95%- intercetta)/ pendenza.Il limite di sensibilità è risultato pari a 13 UI/mL (Figura 4).RobustezzaAnalizzando alternativamente campioni di plasmanegativi e campioni contaminati con HCV-RNA ad elevataconcentrazione, non è stata osservata crosscontaminazione.Screening di HCV-RNA e HIV1-RNA su campionida singolo donatoreNel periodo settembre-ottobre 1999, sono stati analizzati3.300 campioni in 38 sedute (Tabella II). Un totale di 8campioni sono risultati inizialmente reattivi e di questi 7 sisono confermati alla ripetizione del test. I 7 campioni reattivisono stati identificati come HCV-RNA positivi mediantel'esecuzione del test di discriminazione per HCV-RNA eHIV1-RNA; inoltre i campioni erano positivi alla ricerca dianticorpi anti HCV e confermati HCV-RNA positivi anchecon metodica Amplicor Roche v.2.0 modificata. Il campioneinizialmente reattivo e non confermato risultava negativoper HCV Ab e negativo per HCV-RNA anche con metodoAmplicor HCV Roche v.2.0 modificato. È stato, quindi,classificato come "falso positivo". Nessun campione HCV-RNA positivo era negativo allo screening anticorpale.Viceversa, come indicato dalla tabella III , il confronto trasierologia e NAT ha evidenziato 5 campioni positivi perHCV Ab e negativi per HCV-RNA: di questi, 3 RIBA positivie 2 indeterminati, con una percentuale complessiva dicampioni positivi per HCV-RNA, rispetto ai positivi perHCV Ab, del 58,33%. I donatori risultati HCV Ab positivi e/o HCV-RNA positivi erano tutti occasionali. Nessuncampione, infine, è risultato HIV1-RNA positivo. Riguardoalla metodica, nessuna seduta è risultata non valida, mentrei campioni con controllo interno negativo, e quindi nonvalidi, sono stati 6 (0,18%). In questa evenienza, il campioneveniva ripetuto nella seduta successiva.DiscussioneLe Linee Guida del Consiglio d'Europa, relative allavalidazione dei metodi basati sull'amplificazione degli acidinucleici per la ricerca di HCV-RNA nei pool di plasma,stabiliscono un protocollo con il quale valutare lemetodologie presenti sul mercato al fine di una loroapplicazione ad una routine trasfusionale. La metodica206
Test Chiron-TMA per lo screening HCV-RNATabella II: risultati dello screening HCV RNATabella III: confronto tra sierologia e NATNATHCV RIBAPOS IND NEGPOS 7 0 0NEG 3 2 0n° campioni anti-HCV pos = 12Chiron TMA HIV-1/HCV, validata secondo tali criteri, hamostrato una buona rispondenza, in termini di specificità,di robustezza e di sensibilità, ai requisiti richiesti. Perquest'ultimo parametro, è importante sottolineare chegeneralmente nei pannelli di sieroconversione si rilevanoda 5x10 4 a 5x10 8 UI/mL di HCV-RNA e che campioni conuna concentrazione inferiore a 5x10 4 UI/mL sono daaspettarsi esclusivamente all'inizio della replicazionevirale 14 . Pertanto, una sensibilità minima di 5x10 3 UI/mL perla singola donazione è da ritenersi sufficiente per rilevarecampioni HCV-RNA positivi in fase precedente allasieroconversione e tale è stata la soglia di sensibilitàproposta dal Paul Ehrlich Institute (Federal Gazette n°6304/04/97). Il Consiglio d'Europa, tramite l'EMEA (TheEuropean Agency for the Evaluation of MedicinalProducts) nella sua raccomandazione 390/97 non stabiliscedirettamente un limite di sensibilità, ma richiede che il metodosia in grado di rilevare un run control che abbia unaconcentrazione di HCV-RNA di 100 UI/mL, considerandoevidentemente l'ipotetica diluizione di un campione positivoin un pool. Il test Chiron TMA ha mostrato, nelle nostremani, un limite di sensibilità di 13 UI/mL, soddisfacendoentrambi i requisiti proposti. La metodica è strutturata inmaniera tale da ridurre al minimo il pericolo dicontaminazione, in quanto la reazione avviene, senzatrasferimenti, in un unico tubo; l'RNA trascritto, inoltre,essendo più labile nell'ambiente esterno rispetto al DNAprodotto da altri sistemi di amplificazione e non contenendosequenze riconosciute dal reagente di cattura del target,non può contaminare una nuova reazione.La rintracciabilità dei campioni esaminati è garantita dauna lista di lavoro creata dal Tecan che collega i codici abarre dei campioni e quelli dei tubi di reazione; il softwaredi elaborazione dati del luminometro, tramite essa, provvedeall'elaborazione finale dei risultati.Lo screening virologico delle unità di sangue basatosull'amplificazione degli acidi nucleici rappresentasicuramente un grosso contributo alla sicurezzatrasfusionale, ma allo stesso tempo è fonte di numerosiproblemi relativi alla necessità di un'organizzazione di unacerta complessità, al superamento di limiti tecnici emetodologici, nonché alla valutazione del rapporto costobeneficiodell'introduzione di tale tecnologia.La strategia che attualmente la maggior parte deilaboratori sta valutando è quella, in analogia a quantoavviene nelle industrie produttrici di emoderivati, di testarecampioni di plasma riuniti in pool 15,16 ; questa scelta è dettatasia da motivi economici che dalla difficoltà di analizzarecontemporaneamente e in tempo reale un elevato numerodi campioni. Viceversa, un'impostazione basata sulloscreening delle singole unità è conforme all'organizzazionegià in uso nei servizi trasfusionali per i test sierologici enon necessita della validazione di un algoritmo dipreparazione dei pool. Ulteriori vantaggi di questoapproccio possono essere rappresentati da una sensibilitàmaggiore, non essendoci diluizione dei campioni in un pool,e da un rilascio immediato delle unità non reattive, venendoa mancare la necessità, come nel caso dei pool di plasma, dirisalire per tappe successive, al campione positivo.Il test Chiron TMA HIV-1/HCV presenta delle207
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