Il test Chiron-TMA: un approccio molecolare allo ... - Blood Transfusion

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M. Testi et al.Figura 3: protocollo di validazione - limite di sensibilitàOrganizzazione del lavoroIl laboratorio è stato organizzato in due locali attigui,ciascuno dotato dei materiali e dei reagenti necessari, talida permettere la separazione tra aree di pre-amplificazionee di post-amplificazione e strutturati in modo tale daconsentire un flusso di lavoro unidirezionale 11 .- Nell'area di pre-amplificazione sono state eseguite lapreparazione del campione e l'amplificazione mediatadalla trascrizione; per la distribuzione del plasma e delReagente di Cattura del Target è stato impiegato unpreparatore automatico Tecan Genesis RSP 150/8 (TecanItalia Srl, Cologno Monzese - MI), con relativo softwarein grado di identificare i campioni primari, creare unalista di lavoro e collegare i codici a barre relativi aicampioni a quelli dei tubi di reazione.- Nell'area di post-amplificazione sono state eseguitel'ibridazione e la rilevazione mediante HPA. La lista dilavoro creata dal Tecan viene inserita nel software dielaborazione dati del luminometro, il quale provvedeall'elaborazione finale dei risultati.Protocollo di validazione per HCV-RNALa procedura analitica, definita come l'intero processodall'estrazione dell'acido nucleico alla rilevazione deiprodotti dell'amplificazione, è stata validata, valutando trecaratteristiche principali:- la specificità,- il limite di sensibilità,- la robustezza.SpecificitàViene intesa come la capacità di rilevareinequivocabilmente l'acido nucleico in presenza di altricomponenti, ed è strettamente collegata con la scelta deiprimers e delle sonde, nonché con la stringenza deiparametri di amplificazione e rilevazione. Generalmente,quando si usa un kit commerciale, viene accettata lavalutazione fornita dal produttore. Tuttavia, è stato ritenutoopportuno confermare la capacità del metodo di nonprodurre risultati falsamente positivi, testando 100 campionidi plasma precedentemente risultati negativi alla ricerca diHCV-RNA con il kit Amplicor HCV Roche v.2.0 (RocheDiagnostics SpA, Monza - MI) modificato conl'introduzione di uno step di ultracentrifugazione.Limite di sensibilità (cut-off)Viene definito come il numero minimo di sequenze targetper volume di campione rilevabile nel 95% dei test eseguiti.Per determinare questo cut-off, sono state saggiate 4diluizioni seriali semi-logaritmiche del Working Reagent ISSHCV 0498 12 , preparazione di riferimento calibrata contro loStandard Internazionale WHO 96/790 13 a 1.698 UI/mL. Laconcentrazione delle diluizioni era di 31,7 UI/mL, 10 UI/mL,3,17 UI/mL e 1 UI/mL (Figura 3). Per ottenere 24 replicati di204
Test Chiron-TMA per lo screening HCV-RNATabella I: limite di sensibilità - risultaticiascuna delle diluizioni dello Standard impiegate, sonostate effettuate 4 prove, in ognuna delle quali ogni diluizioneè stata ripetuta 6 volte. Per diluire il Working Reagent èstato utilizzato un campione di plasma risultato negativo altest di screening per anticorpi anti HCV (MEIA Abbott) eal test per la rilevazione di HCV-RNA (Amplicor HCV Rochev.2.0). Lo stesso diluente è stato comunque testato inciascuna prova in 6 replicati. Il cut-off è stato calcolatomediante analisi dei probit.RobustezzaIn merito alla robustezza, ossia alla capacità dellametodica di rimanere invariata nonostante piccolicambiamenti nei parametri di reazione, non essendo presentistep di ultracentrifugazione, ci si è basati sulle valutazionidel produttore del kit. È tuttavia stato eseguito un controllodella cross-contaminazione testando, in un'unica seduta,20 campioni di plasma negativo, di cui 10 infettati con uncampione HCV-RNA positivo alla concentrazione di220.000 UI/mL, come valutato mediante test HCV MonitorRoche, con diluizione finale di 1:10. I 20 campioni sonostati processati alternando un campione positivo ed uncampione negativo.Screening HCV-RNA e HIV1-RNANel periodo compreso tra settembre ed ottobre 1999,sono stati esaminate 3.300 donazioni. I campioni di plasmaprovenienti da singolo donatore sono stati raccolti inprovette K 3EDTA ed analizzati entro 24 ore dal prelievo.Di tutti i campioni è stata contemporaneamente eseguitala ricerca di HCV Ab e HIV1-Ab mediante dosaggioimmunoenzimatico a cattura di microparticelle. In ogniseduta analitica sono stati testati 3 calibratori negativi, 3calibratori HCV RNA positivi e 3 calibratori HIV-1 RNApositivi necessari per determinare due limiti di cut-off perciascun test: uno per il segnale analitico ed uno per il segnaledel controllo interno. Il software di elaborazione dati delluminometro, tramite questi valori, ha calcolato, perciascuna esecuzione, i criteri di validità di ogni singolaseduta e dei singoli campioni. In tutte le sedute è statoinoltre inserito come run control, lo standard HCV ISS 0498ad una concentrazione pari a tre volte il cut-off determinatodalla validazione. La seduta analitica era validata se, oltre asoddisfare i criteri di validità indicati dal software dielaborazione dati, il run control in essa analizzato dava unrisultato positivo ed il numero totale di calibratori e/ocampioni invalidi era inferiore al 10%.RisultatiValidazione per HCV-RNASpecificità100 campioni precedentemente risultati negativi per laricerca di HCV-RNA con la metodica Amplicor HCV Rochev.2.0 si sono confermati non reattivi con il metodo ChironTMA, dimostrando una buona capacità della metodica dinon produrre risultati falsamente positivi.Limite di sensibilitàI risultati ottenuti testando 24 replicati di ciascuna205
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