Cellbind Screen: una nuova tecnologia di ... - Blood Transfusion

Cellbind Screen: una nuova tecnologia di affinità inmicrocolonna per ricerche di immunoematologiaeritrocitaria. Confronto fra quattro tecnicheFranco Malferrari, Patrizia Bernardoni, Roberto ConteServizio di Medicina Trasfusionale, Policlinico S.Orsola-Malpighi, Bologna(Responsabile: Dott. Roberto Conte)Cellbind Screen is a new microcolumn affinitytechnology suitable for the detection or identificationof red blood cells (RBCs) antibodies, and for crossmatchingand direct antiglobulin test.During the test procedure, sensitized RBC from asuspension are bound to an active gel matrix containingimmobilized protein G, anti-IgM and anti-C3d; protein Gspecifically binds the Fc portion of IgG subclasses.Unlike the traditional column systems, where cellsloaded with antibodies or complement react withantihuman globulin and become enmeshed within thefiltering bed, in the microcolumn affinity technology noagglutination occurs, but the RBCs are bound in the gelmatrix.The purpose of this study was to estimate thesensitivity and specificity of Cellbind Screen vs threereference techniques: two microcolumn agglutinationsystems (Diamed-ID, Ortho BioVue) and the standardtube low ionic strength solution antiglobulin test ( LISS-AGT).The comparative study has considered thedetection, identification and titration of RBC antibodies,as well as the cross-matching and the direct antiglobulintest.In 620 patients and in 33 samples with antibodiespreviously studied, tested for the detection andidentification of RBC antibodies, the overall sensitivityand specificity of Cellbind Screen was respectively93.5 and 98.5%, of Diamed-ID, 95.1 and 98.7%, of OrthoBioVue, 91.9 and 98.3%, of the LISS-AGT 85.4 and 98.8%.Regarding the titration of 30 clinically significantantibodies, the highest titer was obtained 9 times byCellbind Screen, 6 by Diamed-ID, 2 by Ortho Biovue, 0by LISS-AGT, 13 times by two or more techniques.120 cross-matching tests and 12 positive controlsyielded equal results by all systems.In the direct antiglobulin test 20 samples, sensitizedRicevuto: 1 ottobre 2001 - Accettato: 5 novembre 2001Corrispondenza: Dott. Franco MalferrariServizio di Medicina Trasfusionale, Policlinico S. Orsola-MalpighiVia Massarenti, 940138 Bolognain vivo and in vitro by IgG and/or C3d, were detected byall techniques, even if with different strength of reaction.Cellbind Screen was the most sensitive system indetecting C3d, whereas weak positive reactions by IgGwere better shown by the other column techniques.The obtained results demonstrate that thesensitivity of Cellbind Screen is comparable to that ofcolumn agglutination techniques , superior to that ofthe tube LISS-AGT, and the specificity of four systemsis very similar.Parole chiave: tecnologia di affinità in microcolonna,proteina G, sensibilità e specificità di reazione.Key word: microcolumn affinity technology, protein G,sensitivity and specificity of reaction.IntroduzioneCellbind Screen è una nuova tecnologia di affinità 1 inmicrocolonna per la ricerca e l'identificazione degli anticorpiirregolari, le prove di compatibilità e il test all' antiglobulinadiretto. Con questa tecnica, i globuli rossi sensibilizzati silegano a una matrice attiva di gel contenente proteina G 2immobilizzata, anti-IgM e anti-C3d ; la proteina G è in gradodi legare in modo specifico il frammento Fc di tutte lesottoclassi IgG. A differenza delle tecniche in colonnatradizionali, dove gli eritrociti ricoperti da anticorpi e/ocomplemento vengono agglutinati dal siero antiglobulinee rimangono intrappolati nel letto filtrante, con CellbindScreen non si ha agglutinazione, bensì legame dei globulirossi sensibilizzati alla matrice di affinità.La sospensione eritrocitaria e il siero/plasma in esamevengono introdotti nella camera di incubazione di unamicrocolonna, separata dalla matrice attiva da un gradientead alta densità. Terminata l'incubazione, la successivacentrifugazione comprende tre fasi: nella prima, il gradienteLA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol. 46 - num. 6 novembre-dicembre 2001 (377-383)377

F Malferrari et al.permette la separazione dei globuli rossi dal siero/plasma;nella seconda, gli eritrociti sensibilizzati si legano alla matricedi affinità; nella terza, le emazie non sensibilizzate, osensibilizzate molto debolmente, sedimentano al fondo dellamicrocolonna.Nelle reazioni forti, i globuli rossi formano una bandanella parte superiore del gel; nelle reazioni di media forza odeboli, gli eritrociti si posizionano sia in cima, sia al fondodella colonna; nelle reazioni negative, tutte le emazieformano un bottone al fondo della colonna. La quantità diemazie sensibilizzate che si lega alla matrice di affinità ècorrelata alla densità antigenica eritrocitaria, al titolo eall'affinità anticorpale, ma dipende anche dalla durata dellaseconda fase della centrifugazione e dalla forza centrifugadella terza fase.Gli Autori hanno valutato la sensibilità e la specificitàdi Cellbind Screen rispetto a tre tecniche di riferimento:due di agglutinazione in colonna (Diamed-ID e OrthoBioVue) e una all'antiglobulina in provetta in soluzione abassa forza ionica (LISS-AGT). Il confronto ha riguardatola ricerca, l'identificazione e la titolazione degli anticorpiirregolari, le prove di compatibilità e il test all'antiglobulinadiretto.Materiali e metodiRicerca e identificazione di anticorpi irregolariCampioni di sangue prelevati in K 3EDTA a 620 pazientisono stati indagati, in parallelo con le quattro tecniche, perla presenza di anticorpi irregolari; i campioni positivi allaricerca sono stati successivamente identificati. Sono statiinoltre sottoposti a ricerca e identificazione 33 sieri conanticorpi irregolari, precedentemente studiati con varietecniche e conservati a -20 °C. Nella ricerca è stato utilizzatoun pannello a tre cellule (Screening cells 1-2-3 CLB-Menarini, Amsterdam, The Netherlands), nell'identificazioneuno a undici cellule (Makropanel 11 CLB-Menarini).Le cellule sono state sospese alle concentrazioni previste ,con i diluenti indicati nelle rispettive metodiche.Con Cellbind Screen (CLB-Menarini) sono statiintrodotti nelle microcolonne 40-50 µL di globuli rossisospesi allo 0,5% in una soluzione a bassa forza ionicamodificata (LISP) e 40-50 µL del siero/plasma in esame;dopo incubazione per 15' a 37 °C e successivacentrifugazione per 10' con strumentazione dedicata, si èproceduto alla lettura delle reazioni.Le tecniche Diamed-ID (Cressier sur Monat, Suisse -cards LISS-Coombs ) e Ortho BioVue (Raritan, New Jersey- cards anti-IgG, -C3d polispecifico) sono state eseguitesecondo le indicazioni dei rispettivi produttori 3,4 ; il LISS-AGT è stato effettuato secondo la metodica tradizionale 5 ,con soluzione a bassa forza ionica e siero antiglobulinepolispecifico di nostra preparazione.Nelle tre tecniche di riferimento, il tempo d'incubazione,per uniformità con Cellbind Screen, è stato di 15'. Tutte lereazioni sono state lette a occhio nudo, con l'aiuto di unbox illuminato.Titolazione di anticorpi irregolariSono stati titolati 30 anticorpi irregolari clinicamentesignificativi, alcuni evidenziati nei 620 pazienti, altri già noti.I campioni sono stati diluiti per raddoppio con le soluzioniconsigliate e testati contro un pool 6 di 2-3 cellule eterozigotiper l'antigene in causa, sospese come indicato inprecedenza.Prove di compatibilitàSu un campione randomizzato di pazienti da trasfondere,sono state eseguite 120 prove di compatibilità nel cui ambitosono stati inseriti 12 diversi controlli positivi, costituiti dasieri con anticorpi a basso titolo testati contro emazieeterozigoti per l'antigene in causa. Per sospendere le emaziedei donatori ed eseguire le indagini , si è fatto ricorso allestesse procedure impiegate nella ricerca degli anticorpiirregolari.Test all'antiglobulina direttoSono stati eseguiti 20 test: 10 su campioni sensibilizzatiin vivo e 10 in vitro da IgG di diverse sottoclassi e/o C3d.La determinazione delle sottoclassi IgG è stata effettuata ingel test secondo la metodica descritta dagli Autori 7 .Con Cellbind Screen , 40-50 µL di globuli rossi sospesiallo 0,5% in LISP sono stati introdotti in una microcolonnae centrifugati per 10'.Le altre tecniche sono state eseguite in conformità allemetodiche consigliate; per il LISS-AGT la lettura è stataeffettuata macroscopicamente e, in caso di dubbio, anchemicroscopicamente. In tutti i sistemi, la forza delle reazioniè stata graduata da 0 (reazione negativa) a 4+ (reazionepositiva molto forte).RisultatiRicerca e identificazione di anticorpi irregolariNei 620 campioni di pazienti, 581 (93,7%) sono risultati378

Una nuova tecnologia di affinità in microcolonnaTabella I: ricerca e identificazione di anticorpi irregolari in pazientiCampioni Negativi Positivi concordanti Positivi non concordantiesaminati concordanti Anti- n o Anti- n oD 5 D 2D+C 2C 2c 1E 2 E 1E+K 1E+ Fy a 1K 3 K 1Fy a 2Jk a 1 Jk a 1S 1M 1 M 1Le a 123 6Panagglutinanti 5Aspecifici 2 Aspecifici 37 3620 581 Totale 30 9(93,7%) (4,8%) (1,5%)Tabella II: performance delle 4 tecniche con i 9 campioni positivi non concordantiSpecificità Cellbind Screen Diamed-ID Ortho BioVue LISS-AGT1- Anti-D + + + -2- Anti-D 0 + 0 -3- Anti-E + 0 0 -4- Anti-K + + 0 +5-Anti-Jk a + 0 + -6- Anti-M 0 + + +7-Aspecifico 0 - 0 -8-Aspecifico 0 0 0 -9-Aspecifico - - 0 -Ab sidentificati 4 4 3 2+ = Ab completamente identificato; 0 = Ab non completamente identificato; - = Ab non reattivonegativi, 30 (4,8%) positivi con tutte le tecniche; 23 di questicontenevano anticorpi clinicamente significativi, 7 anticorpinon significativi. Nove campioni sono risultati positivi, manon con tutti i sistemi; in 6 campioni erano presenti anticorpiclinicamente significativi, in 3 anticorpi non significativi.Nell'ambito dei 9 positivi discordanti, Cellbind Screenha identificato 4 anticorpi, Diamed-ID 4, Ortho BioVue 3, ilLISS-AGT 2. I risultati sono riportati nelle tabelle I e II.Riguardo ai 33 anticorpi precedentemente studiati, 26sono stati identificati con tutte le tecniche, 7 solo conqualcuna: Cellbind Screen ne ha identificati 5, Diamed-ID6, Ortho BioVue 5, il LISS-AGT 2. I risultati figurano nelletabelle III e IV. Il calcolo della sensibilità e della specificitàcomplessiva ha dato questi valori: per Cellbind Screenrispettivamente 93,5 e 98,5%, per Diamed-ID 95,1 e 98,7%,per Ortho BioVue 91,9 e 98,3%, per il LISS-AGT 85,4 e98,8%. Questi dati compaiono in tabella V.Tabella III: ricerca e identificazione di anticorpi irregolariin campioni già studiatiAnti- n o Positivi concordanti Positivi nonconcordantiD 4 3 1D+C 2 2 -C 2 2 -C w 1 1 -c 1 1 -E 3 2 1e 2 2 -K 4 3 1Kp a 1 1 -Fy a 3 2 1Fy b 1 1 -Jk a 2 1 1Jk b 1 1 -S 3 2 1s 1 1 -Lu a 2 1 1Totale 33 26 7379

F Malferrari et al.Tabella IV: performance delle 4 tecniche con i 7 campioni positivi non concordantiSpecificità Cellbind Screen Diamed-ID Ortho BioVue Liss-AGTAnti-D + + + -Anti-E 0 + 0 0Anti-K + 0 + +Anti-Fy a + + + 0Anti-Jk a + + + 0Anti-S + + 0 +Anti-Lu a 0 + + -Ab identificati 5 6 5 2+ = Ab completamente identificato; 0 = Ab non completamente identificato; -= Ab non reattivoTabella V: sensibilità e specificità delle 4 tecnicheVPSensibilità = x 100(VP + FN)VP = veri positiviFN = falsi negativiTecnica Sensibilità %Cellbind Screen 58/58 + 4 = 93,5Diamed-ID 59/59 + 3 = 95,1Ortho BioVue 57/57 + 5 = 91,9Liss-AGT 53/53 + 9 = 85,4VPSensibilità = x 100(VP + FN)TecnicaSpecificità%Cellbind Screen 591/591 + 9 = 98,5Diamed-ID 591/591 + 8 = 98,7Ortho BioVue 591/591 + 10 = 98,3Liss-AGT 591/591 + 7 = 98,8Titolazione di anticorpi irregolariLa tabella VI riporta i titoli dei 30 anticorpi: il titolo piùalto è stato ottenuto 9 volte con Cellbind Screen, 6 conDiamed-ID, 2 con Ortho BioVue, nessuna volta con il LISS-AGT, 13 volte con due o più tecniche.Prove di compatibilitàLe 117 prove di compatibilità negative, le 3 positive,causate dalla presenza nel siero dei pazienti di autoanticorpi,e i 12 controlli positivi hanno dato risultati concordanticon tutti i sistemi. I dati sono riportati in tabella VII.Test all'antiglobulina direttoI 20 campioni sensibilizzati in vivo e in vitro da IgG e/oC3d sono stati messi in evidenza da tutte le tecniche, anchese con diversa forza di reazione. Cellbind Screen è risultatoil sistema più sensibile nel rilevare la presenza di C3d, mentrele positività da IgG, specie se deboli, sono state meglioevidenziate dalle altre due tecniche in colonna. I risultatisono riportati in tabella VIII.DiscussioneNella ricerca e identificazione degli anticorpi irregolari,Cellbind Screen si è posizionato, per sensibilità (93,5%), traDiamed-ID (95,1%) e Ortho BioVue (91,9 %) e ha superatosignificativamente il LISS-AGT (85,4%).Questo riscontro, se da un lato ha confermato lamaggiore sensibilità delle tecnologie in colonna rispettoalla provetta 8,9 , dall'altro ha ribadito ulteriormente che anchei sistemi più sensibili non sono in grado di mettere inevidenza l'intera gamma degli anticorpi clinicamentesignificativi 10 .Va sottolineato che Cellbind Screen, sebbene contenganella matrice di affinità anche anti-IgM, ha evidenziato unnumero di anticorpi di scarsa rilevanza clinica non superiorea quello delle altre tecniche in colonna. In effetti, lacomponente anti-IgM di Cellbind Screen ha la funzione dimettere in evidenza solo le eventuali IgM non agglutinanti;quelle agglutinanti, largamente prevalenti negli anticorpiclinicamente non significativi, vengono comunque rilevateda tutti i sistemi.L' elevata sensibilità di Cellbind Screen ha trovatoun'ulteriore conferma nei titoli dei 30 anticorpi irregolari: èinfatti con questa tecnica che si è ottenuto con maggiorfrequenza (9 volte) il titolo più elevato.Circa la specificità, i valori per i vari sistemi sono risultatimolto simili, intorno al 98%: la tecnica leggermente piùspecifica si è dimostrata il LISS-AGT (98,8%), a confermadel fatto che abbastanza spesso il metodo meno sensibile èil più specifico.Nel test all'antiglobulina diretto, Cellbind Screen èrisultato più sensibile degli altri sistemi nel rilevare il C3d,380

Una nuova tecnologia di affinità in microcolonnaTabella VI: titoli di anticorpi irregolarin o Anti- Cellbind Screen Diamed-ID Ortho BioVue Liss-AGT1 D 16 16 8 42 D 8.192 4.096 1.024 5123 D 256 256 128 644 D 16 8 4 25 D 64 128 32 166 D 128 128 128 327 C 128 256 128 328 C 32 16 16 89 C w 4 4 4 nt10 c 32 16 16 411 c 64 128 64 3212 E 256 64 64 1613 E 32 32 16 814 E 16 4 4 215 e 16 16 32 416 K 64 128 128 3217 K 4 2 4 nt18 K 512 1.024 2.048 25619 K 128 128 64 3220 Kp a 32 32 16 821 Fy a 64 32 16 1622 Fy a 128 256 256 6423 Fy b 32 32 16 824 Jk a 32 32 16 825 Jk a 32 64 32 826 Jk b 16 16 8 227 S 32 16 16 828 S 4 8 4 229 s 64 32 16 1630 Lu a 2 4 2 ntI valori in grassetto indicano i titoli più alti ottenuti con una sola tecnica.Il titolo più alto è stato ottenuto 9 volte con CELLBIND SCREEN, 6 volte con DIAMED-ID, 2 volte con ORTHO BIOVUE, nessunavolta con LISS-AGT, 13 volte con due o più tecniche.Tabella VII: prove di compatibilitàProve eseguite Negative concordanti Positive concordanti Controlli positivi Positivi concordantisieroemazieAnti-I 1 Anti-D 2 CcDeAuto Ab scaldi 2 Anti-C 2 CcDeAnti-E 2 CcDEeAnti-K 2 KkAnti-Fy a 1 Fy(a+b+)Anti-Jk a 1 Jk a (a+b+)Anti-S 1 SsAnti-s 1 Ss120 117 3 12 12meno nel mettere in evidenza le positività da IgG, specie sedeboli. La sensibilità di Cellbind Screen per le IgG è risultatasimile a quella della tecnica in provetta.Nella nostra esperienza tutti i campioni sensibilizzati invivo e in vitro sono stati evidenziati, pur con diversa forzadi reazione, dalle quattro tecniche; è peraltro verosimileche, in presenza di positività da IgG e/o C3d molto deboli,Cellbind Screen possa dare risultati diversi dai tradizionalisistemi di agglutinazione in colonna. A questi ultimi,abbastanza spesso, viene imputata un'eccessiva sensibilitànel rilevare deboli sensibilizzazioni da IgG, attribuibili allegame non specifico di immunoglobuline presenti nel sieroa concentrazioni elevate 11-13 . In effetti, questo tipo dipositività non ha un reale significato clinico e puòrappresentare uno svantaggio, specie nelle indaginiroutinarie, comportando, oltretutto, carichi di lavoroaddizionali quali la preparazione degli eluati 14,15 .Per converso, la sensibilità non particolarmente elevatadelle tecniche di agglutinazione in colonna nel rilevare lapresenza di C3d, inferiore per qualche Autore alla sensibilità381

Una nuova tecnologia di affinità in microcolonnapositività da IgG, specie se deboli, sono state meglioevidenziate dalle altre tecniche in colonna.I risultati ottenuti dimostrano che Cellbind Screenha una sensibilità simile a quella degli altri sistemi incolonna, superiore a quella del LISS-AGT in provetta, euna specificità sovrapponibile a quella delle altretecniche.Bibliografia1) Axén R, Parath J, Eznback S: Chemical coupling of peptidesand proteins to polysaccharides by means of cyanogenhalides. Nature, 214, 1302, 1967.2) Björck L, Kronvall G: Purification and some properties ofstreptococcal Protein G. A novel IgG-binding agent. JImmunol, 133, 969, 1984.3) Lapierre Y, Rigal D, Adam J et al.: The gel test: a new way todetect red cell antigen-antibody reactions. Transfusion, 30,109, 1990.4) Reis KJ, Chachowski R, Cupido A et al.: Columnagglutination technology. The antiglobulin test. Transfusion,33, 639, 1993.5) Moore HC, Mollison PL: Use of a low-ionic-strength medium inmanual tests for antibody detection. Transfusion, 16, 291, 1976.6) Voak D: Validation of new technology for antibody detectionby antiglobulin tests. Transf Med, 2, 177, 1992.7) Malferrari F, Bernardoni P, Chiari E, Conte R: Una nuovaapplicazione del gel test: determinazione delle sottoclassiIgG negli anticorpi antieritrocitari. Atti del ConvegnoInterregionale per Operatori Sanitari del Servizio Trasfusionale"Simposio di Immunoematologia eritrocitaria". Genova, 13-15 novembre 1997.8) Eichler H, Böhler A, Hastka J: Micro-column affinity test andgel test: comparative study of two techniques for red cellantibody screening. Vox Sang, 77, 154,1999.9) Weisbach V, Ziener A, Zimmerman R et al.: Comparison ofthe performance of four microtube column agglutinationsystems in the detection of red cell alloantibodies. Transfusion,39, 1045, 1999.10) What is the best technique for the detection of red cellalloantibodies? International Forum, Vox Sang, 69, 292 ,1995.11) De Figueiredo M, Lima M, Morais S et al.: The gel test: someproblems and solutions. Transfus Med, 2, 115, 199212) Eichler H: The gel test: investigation on the cause and thesignificance of a positive autocontrol; in five years ofexperience with the original gel system. Diamed SatelliteSymposium, ISBT Meeting. Amsterdam, pag. 14, 1994.13) Fabijanska-Mitek J, Zupanska B, Poglod R et al.: Evaluationof the microcolumn technology for pretransfusion testing inmultiple myeloma patients. Vox Sang, 74, 31, 1988.14) Boulton FE: Increase of blood donations found positive in thedirect antiglobulin test detected by column methods: do weneed to know? Br J Biomed Sci, 53, 172, 1996.15) Moulds JM, Diekman L, Wells TD et al.: Evaluation of columntecnology for direct antiglobulin testing. Transfusion, 37(Suppl30S), S117, 1997.16) Tissot ID, Kiener C, Burnand B et al.: The direct antiglobulintest: still a place for the tube technique? Vox Sang, 77, 223,1999.17) Sokol RJ, Hewitt S, Stamps BK: Autoimmune haemolysis:an 18-years study of 865 cases referred to a regionaltransfusion centre. Br med J (Clin Res Ed), 282, 2023, 1981.383