Cellbind Screen: una nuova tecnologia di ... - Blood Transfusion

F Malferrari et al.permette la separazione dei globuli rossi dal siero/plasma;nella seconda, gli eritrociti sensibilizzati si legano alla matricedi affinità; nella terza, le emazie non sensibilizzate, osensibilizzate molto debolmente, sedimentano al fondo dellamicrocolonna.Nelle reazioni forti, i globuli rossi formano una bandanella parte superiore del gel; nelle reazioni di media forza odeboli, gli eritrociti si posizionano sia in cima, sia al fondodella colonna; nelle reazioni negative, tutte le emazieformano un bottone al fondo della colonna. La quantità diemazie sensibilizzate che si lega alla matrice di affinità ècorrelata alla densità antigenica eritrocitaria, al titolo eall'affinità anticorpale, ma dipende anche dalla durata dellaseconda fase della centrifugazione e dalla forza centrifugadella terza fase.Gli Autori hanno valutato la sensibilità e la specificitàdi Cellbind Screen rispetto a tre tecniche di riferimento:due di agglutinazione in colonna (Diamed-ID e OrthoBioVue) e una all'antiglobulina in provetta in soluzione abassa forza ionica (LISS-AGT). Il confronto ha riguardatola ricerca, l'identificazione e la titolazione degli anticorpiirregolari, le prove di compatibilità e il test all'antiglobulinadiretto.Materiali e metodiRicerca e identificazione di anticorpi irregolariCampioni di sangue prelevati in K 3EDTA a 620 pazientisono stati indagati, in parallelo con le quattro tecniche, perla presenza di anticorpi irregolari; i campioni positivi allaricerca sono stati successivamente identificati. Sono statiinoltre sottoposti a ricerca e identificazione 33 sieri conanticorpi irregolari, precedentemente studiati con varietecniche e conservati a -20 °C. Nella ricerca è stato utilizzatoun pannello a tre cellule (Screening cells 1-2-3 CLB-Menarini, Amsterdam, The Netherlands), nell'identificazioneuno a undici cellule (Makropanel 11 CLB-Menarini).Le cellule sono state sospese alle concentrazioni previste ,con i diluenti indicati nelle rispettive metodiche.Con Cellbind Screen (CLB-Menarini) sono statiintrodotti nelle microcolonne 40-50 µL di globuli rossisospesi allo 0,5% in una soluzione a bassa forza ionicamodificata (LISP) e 40-50 µL del siero/plasma in esame;dopo incubazione per 15' a 37 °C e successivacentrifugazione per 10' con strumentazione dedicata, si èproceduto alla lettura delle reazioni.Le tecniche Diamed-ID (Cressier sur Monat, Suisse -cards LISS-Coombs ) e Ortho BioVue (Raritan, New Jersey- cards anti-IgG, -C3d polispecifico) sono state eseguitesecondo le indicazioni dei rispettivi produttori 3,4 ; il LISS-AGT è stato effettuato secondo la metodica tradizionale 5 ,con soluzione a bassa forza ionica e siero antiglobulinepolispecifico di nostra preparazione.Nelle tre tecniche di riferimento, il tempo d'incubazione,per uniformità con Cellbind Screen, è stato di 15'. Tutte lereazioni sono state lette a occhio nudo, con l'aiuto di unbox illuminato.Titolazione di anticorpi irregolariSono stati titolati 30 anticorpi irregolari clinicamentesignificativi, alcuni evidenziati nei 620 pazienti, altri già noti.I campioni sono stati diluiti per raddoppio con le soluzioniconsigliate e testati contro un pool 6 di 2-3 cellule eterozigotiper l'antigene in causa, sospese come indicato inprecedenza.Prove di compatibilitàSu un campione randomizzato di pazienti da trasfondere,sono state eseguite 120 prove di compatibilità nel cui ambitosono stati inseriti 12 diversi controlli positivi, costituiti dasieri con anticorpi a basso titolo testati contro emazieeterozigoti per l'antigene in causa. Per sospendere le emaziedei donatori ed eseguire le indagini , si è fatto ricorso allestesse procedure impiegate nella ricerca degli anticorpiirregolari.Test all'antiglobulina direttoSono stati eseguiti 20 test: 10 su campioni sensibilizzatiin vivo e 10 in vitro da IgG di diverse sottoclassi e/o C3d.La determinazione delle sottoclassi IgG è stata effettuata ingel test secondo la metodica descritta dagli Autori 7 .Con Cellbind Screen , 40-50 µL di globuli rossi sospesiallo 0,5% in LISP sono stati introdotti in una microcolonnae centrifugati per 10'.Le altre tecniche sono state eseguite in conformità allemetodiche consigliate; per il LISS-AGT la lettura è stataeffettuata macroscopicamente e, in caso di dubbio, anchemicroscopicamente. In tutti i sistemi, la forza delle reazioniè stata graduata da 0 (reazione negativa) a 4+ (reazionepositiva molto forte).RisultatiRicerca e identificazione di anticorpi irregolariNei 620 campioni di pazienti, 581 (93,7%) sono risultati378