马铃薯抗晚疫病基因的分离及功能分析 - abc

马 铃 薯 抗 晚 疫 病 基 因 的分 离 及 功 能 分 析第 一 组 : 李 鑫 鑫 孙 宁 曲 东 杨 召 军2008.6.22

• 研 究 背 景• 技 术 路 线• 研 究 过 程• 结 果 分 析• 参 考 文 献• 致 谢

研 究 背 景• 马 铃 薯 作 为 世 界 上 最 重 要 的 粮 食 和 经 济 作物 , 在 世 界 农 业 生 产 中 有 举 足 轻 重 的 作 用 。晚 疫 病 是 危 害 马 铃 薯 生 产 最 主 要 的 病 害 ,加 强 晚 疫 病 的 防 治 工 作 是 马 铃 薯 生 产 须 优先 考 虑 的 重 要 环 节 。19 世 纪 中 叶 爱 尔 兰 空前 的 “ 大 饥 荒 ” 就 是 由 晚 疫 病 引 起 。

• 利 用 基 因 工 程 技 术 将 高 效 的 晚 疫 病 抗 病 基 因导 入 到 马 铃 薯 主 栽 品 种 , 是 培 育 抗 病 品 种 快捷 有 效 的 途 径 之 一 。• 目 前 已 从 马 铃 薯 抗 性 野 生 种 S.demisssum 中鉴 定 出 了 十 几 个 晚 疫 病 抗 病 基 因 , 其 中 4 个 抗病 基 因 已 经 被 克 隆 出 来 ,S.demisssum 中 尚有 大 量 的 抗 病 基 因 资 源 有 待 开 发 。• 我 们 的 工 作 就 是 要 从 此 野 生 种 中 继 续 分 离 晚疫 病 抗 病 基 因

R 基 因 的 序 列 保 守 性• 在 已 克 隆 并 加 以 分 析 的 70 多 个 已 知 功 能 的R 基 因 中 它 们 似 乎 都 编 码 植 物 防 卫 反 应 信号 转 导 系 统 中 的 组 分 , 并 存 在 有 特 征 性 的 保守 结 构 域 NBS( 核 酸 结 合 位 点 )-LRR( 亮氨 酸 重 复 区 )N B S 区LRRP-LoopKinase-2Kinase-3a

P-loop 作 用 是 结 合 ATP/GTP 的 磷酸

Kinase-2,4 个 疏 水 氨 基 酸 残 基后 紧 跟 一 个 恒 定 的 带 负 电 荷 的 天冬 氨 酸 , 其 共 有 序 列 为K(K/R)XaaaaDDV(W/D)

Kinase-3a 与 嘌 呤 核 苷 酸 的 嘌呤 或 核 糖 结 合 有 关 , 通 常 含 有 一个 精 氨 酸 残 基

• 这 三 个 单 元 共 同 组 成 R 蛋 白 NBS 区 的 ATP/GTP 的 结合 位 点 , 它 在 结 构 上 与 动 物 细 胞 凋 亡 的 调 节 因 子相 似 ; 被 认 为 是 在 蛋 白 质 与 蛋 白 质 相 互 作 用 中 作为 一 个 功 能 组 件 发 挥 作 用 。 比 如 嘌 呤 核 苷 酸 的 结合 被 认 为 是 改 变 了 R 蛋 白 和 防 御 信 号 途 径 中 其 他 成员 间 的 相 互 作 用 。

LRR• LRR 是 蛋 白 质 与 蛋 白 质 相 互 作 用 的 一 种 典 型 类 型 , 具有 LRR 的 蛋 白 质 可 以 组 成 一 个 超 家 庭 , 生 物 中 许 多 膜受 体 便 属 于 这 一 家 庭 。• 一 般 认 为 ,LRR 域 是 由 大 约 每 24 个 氨 基 酸 残 基 作 为一 个 重 复 单 元 而 构 成 的 一 系 列 重 复 基 序 , 在 每 一 个重 复 单 元 中 , 亮 氨 酸 与 其 他 疏 水 氨 基 酸 以 有 规 则 的间 隔 交 错 排 布 , 进 而 形 成 近 似 卷 曲 弹 簧 的 三 维 结 构 。在 这 一 结 构 中 , 保 守 的 亮 氨 酸 残 基 形 成 疏 水 的 核 心 ,而 其 它 非 保 守 的 氨 基 酸 残 基 则 暴 露 于 卷 曲 弹 簧 外 周形 成 了 亲 水 的 配 体 结 合 表 面 。

LRR 的三级结构A 用 球 棍 表 示 的 1 个 LRRB 用 α 螺 旋 和 β 折 叠 表 示 的 2 个 LRRC 连 续 多 个 LRR 形 成 的 马 蹄 形

• 植 物 细 胞 对 不 同 病 原 体 的 识 别 是 植 物 抗病 的 基 础 , 抗 性 基 因 编 码 蛋 白 的 LRR 区域 的 多 样 性 较 高 则 有 利 于 植 物 细 胞 识 别不 同 病 原 体 无 毒 基 因 (Avr gene) 编 码的 蛋 白 。• 共 有 序 列 可 概 括 为“XLXXLXLXXNXLXGXIPXXLXXLX”

技术路线马 铃 薯 RGAs 的 分 离马 铃 薯 RGAs 同 源 性 分 析马 铃 薯 RGAs 的 系 统 进 化 分 析 和聚 类 分 析cDNA 水 平 马 铃 薯 RGAs 的鉴 定↓↓基 因 组 水 平 马 铃 薯 RGAs的 鉴 定确 定 与 马 铃 薯 抗 晚 疫 病 相关 的 候 选 基 因↓获 得 候 选 基 因 全 长↓抗 病 基 因 的 编 码 蛋 白 分 析

研 究 过 程

材 料• 高 抗 晚 疫 病 的 马 铃 薯 野 生 近 缘 种 S.demissum 作 为试 验 材 料 , 六 个 马 铃 薯 栽 培 品 种 垄 3、 尼 勒 克 , 大西 洋 、 紫 花 白 、MC-4、Favorita 作 为 对 照 材 料

植 物 中 已 知 抗 病 基 因 的 序 列 分 析• 以 马 铃 薯 抗 晚 疫 病 野 生 品 种 Solanum dimissum为 试 材 , 根 据 GenBank 中 已 登 录 的 植 物 抗 病 基 因(R1、R3a 、Rpi-blb2 、 蕃 茄 中 的 抗 镰 刀 霉 枯萎 病 基 因 I2、I2C-5、I2-C、I2GA-SH23-1、I2GA-SH23-3、I2GA-SH194-2 等 ) 的 NBS 区 的 保 守序 列 kinase-2(DDVW) 和 GLPL 区 设 计 简 并 引 物 。

利 用 NCBI 的 GeneBank 上 依 次 找 到 以 上 序 列名 称 序 列 号 序 列 信 息R1EU5990374392 bp Solanum demissumR3a AY849382 3849 bp Solanum tuberosumRpi-blb2 DQ122125 3804 bp Solanum bulbocastanumI2GA-SH23-1 AY849383 3798 bp Solanum tuberosumI2GA-SH23-3 AY849384 3984 bp Solanum tuberosumI2GA-SH194-2 AY849385 3861 bp Solanum tuberosumI2C-5 AF408704A 4491 BP Lycopersicon pimpinellifolium

利 用 DNAMAN 多 序 列 比 对 设 计 简 并 引 物

• 以 S.demissum 的 cDNA 作 模 板 进 行 RT-PCR 扩 增 ,产 物 经 克 隆 测 序 , 得 到 47 条 序 列• 共 获 得 31 条 具 有 开 放 阅 读 框 的 含 NBS 区 保 守 结构 域 的 序 列 。

利 用 DNAMAN 和 ClustalX 进 行 蛋 白 相 似 性 比对 , 利 用 Mega 对 所 有 的 NBS 区 序 列 构 建 系 统进 化 树 , 并 根 据 进 化 树 结 果 对 所 有 序 列 进行 聚 类 分 析 。

对 所 有 测 序 所 得 的 NBS 区 序 列 取 核 酸 相 似 性 在 97% 的 进 行 进 一 步 分 析(Neighbour-joining method, Bootstrap Reps = 1000).

共 有 27 条 序 列 参 与 了 分 析 , 以 核 酸 相 似 性90% 分 为 九 大 类

这 27 条 序 列 以 核 酸 相 似 性 90% 为 界分 为 九 类类 别 序 列 名 称Ⅰ PB1-6/PB3-4/PB5-9/PB6-29/PB6-18/PB3-6/PB4-17Ⅱ PB6-23Ⅲ: PN4-2/PB1-8/PB4-8Ⅳ PB6-22Ⅴ PB6-A6Ⅵ PB1-1Ⅶ PB5-12/PB6-A4/PB5-11/PB1-7/PB4-6Ⅷ PB1-9Ⅸ PB6-25/PB6-31/PB6-21/PB4-13/PB-8/PB6-14/PB6-24

检 测• 九 类 特 异 引 物 分 别 在 S.demissum 和 六 个 栽 培 品种 基 因 组 中 的 进 行 PCR 检 测• 结 果 : 第 Ⅳ 类 只 在 S.demissum 中 有 扩 增 条 带 ,而 在 其 他 的 六 个 对 照 品 种 中 没 有 扩 增确 定 PB6-22 为 马 铃 薯 抗 晚 疫 病相 关 的 候 选 基 因

获 得 基 因 全 长 序 列• 产 物 用 RACE 方 法 找 出 目 的 基 因 PB6-22 的 核 酸全 长 序 列• 得 到 编 码 蛋 白 序 列

获 得 基 因 PB6-22 的 编 码 蛋 白MDICTVALLKNQEYYSLLGLKVEGQHQILAETSNQQVSDAFFRNIKDKLEDTIETLEDLEEHFLDLKKHFGPTNQETRTPSTSFVDESDIFGRQSETEDLIDRLLSEDASGKNLTVVPIVGMGGLGKTTFAKAVYNDERVKNHFDLKAWFCVPENYDAFRLTRGLLQEFGSFDLKDDNNMNQLQLKLKESLKGKKFLVVLDDVWNDDYNEWDYLRNIFVQGDMGSKIIVTTRKESVALMMGSRPINVGTLSDEASWDLFKRHSLENRDPKEHPELVEIGKQIADKCKGLPLALKALAGVLRCKSEVDEWRDILRSEIWELPSCSNGILPALMLSYNDLPAHLKQCFAYCAIYPKDYQFCKDQVIHLWIANGLVQQFHSGNQYFLELRSRLLFEMVSESSEWNSEKFLMHDLVNDLAQIAPSNLCIRLEENKGLHMLEQCRHISYSIGQDGDFDKLKSLFKSKQLRTLLAINVHPHYYDIKLSKRVLHNVLPRLTSLRALSLSRYEIVELPNDLFIELKLLRFLDISRTKIKRVPDSICVLYNLETLLLSSCDYLEELPLQMEKLINLRHLDISNSFRLKMPLHLSKLKSLQVLVGAKFLLSGWRMEDLGEAQNLYGSVSVVELENVVDRREAVKAKMREKNHVDKLSLKWSERSSADNSQTERDILDELRPHTNIKEVEITGYRGTTFPNWLADPLFLKLVKLSLSNCKDCYSLPALGELPCLKILSIKGMHGITEVMEESYGSLSSKKPYCLEELRFEDMAEWKQWHVLGSGEFPTVEKLFIINCPELGLETPIQLSSLKRFQVSGCPKVGVVFDDTELFRSQLEGMKQIEELCIRYCNSVTSLPFSILPTTLKRITISGCLKLKLEAPVGEMSMCLEELSLEECDCVSPELLPTARYLSVRRCDNLTRFLIPTATETLNIWGSENVEKLSVACGEAQMTLLSISDCSKLKCLPELLPSLKTLQLYECPEIESFPEGGLPFNLQLLQINNCTKLVNGRKEWCLQRLPCLNWLEISHDGSDEEIVGGENWELPSSIQTLIIQNLKTLSSQHLKNLTSLQSLYYGYLPQIQSMLEQVRLTSSLFDLILYGHHELHSLDLWHLTSLQSLQIMNCPNLQSLSESALPSSLSHLIISDCPNLQSLPVKGMPSSLSKLSISNCPLLGPLLEFNKGEYWPNIAHISTIKINGECL—

通 过 网 站 预 测 得 到 目 的 基 因 的 蛋 白 结 构• (http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/)

• 此 编 码 蛋 白 在 预 测 其 结 构 时 是 以 1Z6T 蛋 白 A链 为 模 型• 1Z6T 是 一 种 结 合 ADP 的 细 胞 凋 亡 蛋 白 激 活 因子• entry: 1Z6T chain: A score: 99 E: 2e-20• E 值 表 示 依 此 蛋 白 为 模 型 预 测 目 的 蛋 白 结 构 的错 误 概 率 , 证 明 此 结 果 很 可 信

1Z6T 和 PB6-22 蛋 白 序 列 比 对• 利 用 WebLab 中 的 water 程 序 进 行 局 部 序列 比 对

亮 氨 酸 重 复 区

Cn3D

3D Jigsaw

aswin

结 果 分 析据 文 献 报 道 , 植 物 抗 病 基 因 的 NBS 区 域 被 认 为与 传 递 信 号 有 关 ,NBS 中 的 基 序 如 磷 酸 结 合 环 (Ploop)为 ATP/GTP 结 合 位 点 ,NBS 能 激 活 激 酶 或 G蛋 白 , 使 细 胞 产 生 防 御 反 应 。NBS-LRR 蛋 白 并 不是 仅 仅 由 一 些 单 独 的 功 能 单 元 构 成 , 可 能 是 由 不同 的 共 同 进 化 的 区 域 构 成 的 , 而 且 信 号 感 应 和 传导 需 要 分 子 间 的 相 互 作 用 。 对 抗 性 基 因 的 克 隆 发现 它 们 更 象 膜 受 体 和 信 号 转 换 分 子 。

• 利 用 RACE 技 术 克 隆 出 了 第 Ⅳ 类 (PB6-22) 的 基 因 , 基 因 全 长 为 3570bp, 编码 1189 氨 基 酸 , 该 基 因 含 有 抗 病 基 因 的NBS 保 守 结 构 域 (P-loop、Kinase2、Kinase-3a、GLPL 等 ), 并 在 此 基 因 中鉴 定 出 了 至 少 8 个 LRR 结 构 域 。

• PB6-22 编 码 蛋 白 与 Solanum demissum中 的 抗 病 蛋 白 I2C-5(AAU90287.1) 相似 性 最 高 , 达 77%。

I2C-5 与 PB6-22:• Length: 1198• Identity: 923/1198 (77.0%)• Similarity: 1001/1198 (83.6%)• Gaps: 46/1198 ( 3.8%)• Score: 4565.0

存 在 的 问 题虽 然 PB6-22 基 因 编 码 的 蛋 白 四 个 保 守 区与 其 它 抗 病 基 因 的 存 在 很 高 的 序 列 相 似性 , 但 这 些 保 守 区 的 具 体 功 能 以 及 该 基因 与 晚 疫 病 抗 性 是 否 具 有 直 接 的 相 关 关系 还 有 待 进 一 步 的 实 验 研 究 确 定 。 基 因表 达 及 抗 病 性 功 能 鉴 定 工 作 有 待 于 进 一步 研 究 。

References• 周 军 会 马 铃 薯 抗 病 同 源 序 列 系 统 进 化 分 析 及 晚 疫 病 抗 病 基 因 的 克 隆• http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/CN3D/cn3d.shtml• http://bmm.cancerresearchuk.org/~3djigsaw/• swiss-Pdb viewer• DNAMAN• clustalX• MEGA

致 谢感 谢 第 一 组 全 体 成 员 的 共 同 努 力 !感 谢 周 军 会 师 兄 的 大 力 协 助 与 指 导 !感 谢 罗 静 初 老 师 !