棉花线粒体ATP合酶beta亚基的生物信息学分析 - abc

Outline• 研 究 背 景• 序 列 分 析• 系 统 发 生 分 析• 三 级 结 构 预 测 与 分 析• 结 果 与 讨 论

研 究 背 景• 棉 花 (cotton)属 于 植 物 界 、 种 子 植 物门 、 被 子 植 物 亚 门 、双 子 叶 植 物 纲 、 五 桠果 亚 纲 、 锦 葵 目(Malvales)、 锦 葵 科(Malvaceae)、 棉 属(Gossypium)。 棉 花 是唯 一 由 种 子 生 产 纤 维的 农 作 物 。

棉 花 及 棉 纤 维 的 地 位• 作 为 世 界 上 最 重 要 的 经 济 作 物 之 一 , 棉 花是 当 今 世 界 首 要 的 纤 维 作 物 和 重 要 的 油 料作 物 , 是 纺 织 品 制 造 业 的 重 要 原 料 , 也 是我 国 出 口 创 汇 的 重 要 产 品 。• 我 国 是 目 前 世 界 上 最 大 的 棉 花 生 产 国 、 消费 国 和 纺 织 加 工 国 , 棉 花 种 植 业 和 棉 纺 业在 我 国 国 民 经 济 中 起 着 举 足 轻 重 的 作 用 。

我 国 棉 花 生 产 存 在 的 问 题• 首 先 , 我 国 棉 花 生 产 品 质 单 一 , 纤 维 强 度偏 低 , 纺 高 质 纱 的 优 质 棉 需 大 量 进 口 。• 其 次 , 棉 花 病 害 是 制 约 我 国 棉 花 生 产 的 重要 因 素 。

重 要 的 生 物 学 问 题• 棉 花 纤 维 的 伸 长 机 制• 棉 花 抗 病 虫 害 的 机 理

棉 花 纤 维 发 育 过 程A. 开 花 期 植 株 ;B. 开 花 的 棉 花 ;C. 吐 絮 及 未 吐 絮 的 棉 桃 。D. 成 熟 吐 絮 期 植 株 。图 片 引 自 中 国 作 物 种 质 资 源 信 息 网 http://icgr.caas.net.cn。

ATP 合 酶 研 究 背 景• ATP 合 酶 是 利 用 跨 膜 质 子 泵 催 化 ADP 和 磷酸 反 应 生 成 ATP 的 一 类 蛋 白 复 合 体 。• 在 线 粒 体 中 存 在 的 主 要 是 F1-F0 型 ATP 合 酶 ,它 由 膜 外 可 溶 性 的 球 形 结 构 域 F1 和 膜 内 结构 域 F0 两 个 复 合 体 组 成 , 而 每 个 复 合 体 又由 多 个 小 亚 基 组 成 。• 其 中 ,F1 结 构 域 由 α3β3γδε 五 种 肽 链 九 个 亚基 组 成 , F0 部 分 是 由 a ,b 和 c 亚 基 组 成 。

真 核 生 物 ATP 合 酶 结 构 图Boyer et al., 1997http://www.mrc-mbu.cam.ac.uk/

真 核 生 物 线 粒 体 ATP 合 酶 催 化 过 程“ 结 合 改 变 ”(combination change) 或“ 转 换 位 点 ”(conversion position point) 假 说(Boyer et al., 1993):

任 一 时 刻 , ATP 合 酶 上 的 三 个 催 化 部 位 (β 亚 基 )的 构 象 总 是 不 同 的 。openloosetighthttp://nobelprize.org

获 得 序 列• 构 建 开 花 后 5-10 天 的 棉 花 纤 维 cDNA 文 库 : 大 规 模EST 测 序 , 拼 接 得 到 了 1 万 多 条 独 立 的 陆 地 棉(upland cotton)cDNA, 点 制 成 cDNA 芯 片 后 通 过与 非 快 速 伸 长 期 的 胚 珠 及 无 毛 突 变 体 相 应 时 期 芯片 数 据 比 较 分 析 , 得 到 了 一 些 棉 花 纤 维 发 育 相 关基 因 (Ji et al., 2003; Shi et al., 2006)。• 在 这 些 基 因 中 , 我 们 发 现 1 个 在 纤 维 发 育 时 期 表 达上 调 的 ATP 合 酶 编 码 beta 亚 基 的 基 因 , 并 进 行 生 物信 息 学 的 分 析 。

序 列 分 析• RACE 测 序 得 到 该 基 因 的 cDNA 序 列>cl3ct1411cn4173 COVERAGE:0.96; CRAWID: 2; TOTAL_ESTS:11; LENGTH:2241bp; ALT_CONSENSI:14AAACCCTAGCCTCTATCTGGGAGCCCTTTCCAATGGCTTCGCGTCGACTCCTCTCCTCTTTCCTCCGCTCCACTTCTCGCCGATCTCTCTCCAAATCTCCCAGCCCTACCCCTCGCCTCCCTTCACCTTCCCCCACGCGCCGCCCTTTTCCGTGCCCCTACTTTCTCTCACGCGATGCTGAGTACTCTACATCTGCGGCTGCTGCCGCTTCTGCTCCATCGCAGCCTCCTCCCGCTAAGAAGGGCGGAAAAGGTAAGATCACTGATGAGTTCACTGGTGCTGGAGCCATCGGTCAGGTTTGTCAAGTAATCGGTGCCGTCGTCGATGTTAGATTCGATGAAGGCTTGCCTCCGATTTTGACTGCGCTTGAAGTGATGGACCACTCGATCCGGCTTGTGTTGGAAGTGGCTCAGCACTTGGGTGAAAACATGGTTAGGACCATTGCTATGGATGGAACGGAGGGACTCGTCAGAGGGCAGCCGGTTCTCAACACCGGATCTCCTATCACTGTGCCTGTCGGTAGAGCTACTCTTGGTCGTATCATAAATGTCATTGGAGAGCCTATTGACGAGAAAGGCGAACTCAAAACCGACCATTTCTTGCCCATACACAGAGAAGCACCAGCCTTTGTCGATCAAGCTACTGAACAACAGATCCTTGTCACTGGTATTAAGGTTGTGGATCTCCTTGCACCATATCAAAGAGGAGGGAAGATTGGACTTTTTGGTGGTGCTGGTGTAGGGAAGACAGTGCTTATTATGGAACTTATCAACAATGTTGCTAAAGCCCACGGTGGTTTCTCAGTGTTTGCCGGTGTTGGAGAACGTACTAGAGAGGGTAATGACTTGTATAGGGAAATGATTGAGAGTGGTGTTATTAAGCTAGGTGAAAAGCAGGCTGATAGCAAGTGTGCTCTTGTTTATGGTCAAATGAATGAGCCCCCTGGTGCTCGTGCTCGTGTTGGCCTTACTGGTCTGACTGTGGCTGAACATTTCCGTGACGCTGAAGGGCAGGATGTGCTTCTCTTCATTGACAACATTTTCCGTTTTACTCAAGCAAACTCTGAAGTGTCTGCCTTGCTAGGCCGTATTCCATCTGCTGTCGGTTACCAACCAACCTTGGCTACTGATCTTGGAGGTCTTCAGGAACGTATTACCACCACCAAGAAAGGTTCTATCACTTCTGTTCAAGCCATATATGTGCCTGCTGATGACTTGACAGATCCAGCTCCTGCAACAACCTTTGCTCACTTGGATGCCACAACTGTGTTGTCCCGACAGATCTCTGAGCTTGGTATTTATCCTGCTGTGGATCCTTTGGATTCTACATCTCGTATGCTCTCTCCTCATATTTTGGGTGAGGAACACTACAACACTGCTCGTGGTGTTCAGAAGGTTCTCCAAAACTACAAGAACTTGCAAGATATTATTGCTATTTTGGGGATGGACGAGCTTAGTGAAGATGATAAATTAACTGTTGCACGTGCTCGTAAGATCCAAAGGTTCTTGAGCCAGCCTTTCCATGTGGCAGAAGTGTTCACTGGTGCTCCTGGCAAGTACGTGGAGTTGAAGGAGAGCATCACCAGCTTCCAGGGCGTGTTGGATGGAAAGTATGATGACCTGCCCGAGCAGTCGTTTTACATGGTTGGAGGAATCGAGGAAGTGATTGCCAAGGCAGATAAGATTGCCAAGGAATCTGCAGCCTAATCAAATCCACATACCTTAATTTCTGCTGAGTAATTTCGAAAATAATCTAGGTGGTGTTGGTAATGCCAGCAACAGAACTGTTCATTTATTTTGGGGGTTTGTTGTTTATGTTTAATGATGTTATTCAAGAGTGTAAAAGAGCACTTCGGCCCCGCTTTTTTCTTTGCTTAAATAAGGGAAATAGAAGGCGGATGTGTACATTTTTTTTGTTCGAAAACGCTGGCTGCTAAAGCCTTATCCTTTCTGACTGCCGTTTATTCGGAACTACTGATGTTTTGAAATGCATTCGAGACTAATGTTTCCTGAACCCATGGGGGTTTCAATTTTCTTTTTCTTAATGAAGAAATTGGCGAATTTTATCCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGGGGCCCCCCTATTTCCCCCCCGGGGGGGGGGCCAGGGAAAAGGGACCCCAATTTCCCCTATTAAGGGGGCTCTAATAAAAATTATACGGGGCGCGCCTTTTTACACAGGGCGGGAGGTGGGGGAAA

• 用 ExPasy 中 的 Transeq 工 具 将 核 酸 序 列 翻 译 成 蛋白 序 列 , 命 名 为 ATP beta1 。• > ATP beta1MASRRLLSSFLRSTSRRSLSKSPSPTPRLPSPSPTRRPFPCPYFLSRDAEYSTSAAAAASAPSQPPPAKKGGKGKITDEFTGAGAIGQVCQVIGAVVDVRFDEGLPPILTALEVMDHSIRLVLEVAQHLGENMVRTIAMDGTEGLVRGQPVLNTGSPITVPVGRATLGRIINVIGEPIDEKGELKTDHFLPIHREAPAFVDQATEQQILVTGIKVVDLLAPYQRGGKIGLFGGAGVGKTVLIMELINNVAKAHGGFSVFAGVGERTREGNDLYREMIESGVIKLGEKQADSKCALVYGQMNEPPGARARVGLTGLTVAEHFRDAEGQDVLLFIDNIFRFTQANSEVSALLGRIPSAVGYQPTLATDLGGLQERITTTKKGSITSVQAIYVPADDLTDPAPATTFAHLDATTVLSRQISELGIYPAVDPLDSTSRMLSPHILGEEHYNTARGVQKVLQNYKNLQDIIAILGMDELSEDDKLTVARARKIQRFLSQPFHVAEVFTGAPGKYVELKESITSFQGVLDGKYDDLPEQSFYMVGGIEEVIAKADKIAKESAA

利 用 SMART 网 站 对 目 的 蛋 白 进 行 结 构 域 分 析• 该 蛋 白 具 有 一 个 AAA 结 构 域 (ATPases associated with a varietyof cellular activities ), 以 及 ATP-synt_ab_N 结 构 域 , 因 此 具有 ATP 合 酶 活 性 。

利 用 MEME 对 目 的 蛋 白 进 行 Motif 分 析从 Expasy 获 得 序 列 ATP 合 酶 beta 亚 基 序 列 ( 共 24 条 )

三 个 保 守 Motif

Motif 1

Motif 2

Motif 3

利 用 WEBLAB PEPSTATS 进 行 氨 基 酸 组 成 分 析• WEBLAB PEPSTATS of ATP beta1 from 1 to 557• Molecular weight = 59853.16• Residues = 557• Average Residue Weight = 107.456• Charge = -2.0• Isoelectric Point = 6.2110• A280 Molar Extinction Coefficient = 16640• A280 Extinction Coefficient 1mg/ml = 0.28• Improbability of expression in inclusion bodies = 0.689

• Residue Number Mole% DayhoffStat• A = Ala 52 9.336 1.086• B = Asx 0 0.000 0.000• C = Cys 3 0.539 0.186• D = Asp 30 5.386 0.979• E = Glu 35 6.284 1.047• F = Phe 20 3.591 0.997• G = Gly 52 9.336 1.111• H = His 10 1.795 0.898• I = Ile 36 6.463 1.436• J = --- 0 0.000 0.000• K = Lys 26 4.668 0.707• L = Leu 51 9.156 1.237• M = Met 10 1.795 1.056• N = Asn 12 2.154 0.501• O = --- 0 0.000 0.000• P = Pro 35 6.284 1.208• Q = Gln 24 4.309 1.105• R = Arg 32 5.745 1.172• S = Ser 37 6.643 0.949• T = Thr 36 6.463 1.060• U = --- 0 0.000 0.000• V = Val 43 7.720 1.170• W = Trp 0 0.000 0.000• X = Xaa 0 0.000 0.000• Y = Tyr 13 2.334 0.686• Z = Glx 0 0.000 0.000

• Property Residues Number Mole%• Tiny (A+C+G+S+T) 180 32.316• Small (A+B+C+D+G+N+P+S+T+V) 300 53.860• Aliphatic (A+I+L+V) 182 32.675• Aromatic (F+H+W+Y) 43 7.720• Non-polar (A+C+F+G+I+L+M+P+V+W+Y) 315 56.553• Polar (D+E+H+K+N+Q+R+S+T+Z) 242 43.447• Charged (B+D+E+H+K+R+Z) 133 23.878• Basic (H+K+R) 68 12.208• Acidic (B+D+E+Z) 65 11.670

利 用 Protscale 对 目 的 蛋 白 的 理 化 性 质 分 析• 极 性该 蛋 白 有 六 个高 极 性 区

系 统 发 生 分 析特 征 序 列 的 选 择• 在 Expasy 中 得 到 的 38 条 相 关 序 列 ,23 条 为 ATP合 酶 beta 亚 基 序 列• 另 外 找 到 一 条 ATPB_ECOK1 ATP synthasesubunit beta 序 列 , 作 为 外 类 群• 用 这 24 条 序 列 和 我 们 的 目 的 序 列 进 行 比 对 , 在MEGA 中 用 bootstrap NJ 构 建 系 统 发 生 树

多 序 列 比 对

• 从 以 上 结 果 可 以 看 出 ,ATP 合 酶 beta 亚 基从 细 菌 到 高 等 动 物 中 的 序 列 相 似 性 很 高 。

95Zea mays (Maize)5197Oryza sativa subsp. japonica (Rice)Nicotiana plumbaginifolia (Leadwort-l...6180100Hevea brasiliensis (Para rubber tree)Gossypium hirsutum (Upland cotton) (Gossypium mexicanum)cotton ATP synthase beta ubunitmitoch...100Daucus carota (Carrot)89100Arabidopsis thalian(Mouse-ear cress) (3)Arabidopsis thalian(Mouse-ear cress) (1)Arabidopsis thalian(Mouse-ear cress) (2)31Chlamydomonas reinhardtii85Caenorhabditis elegans1006899Hemicentrotus pulcherrimus (Sea urchin)Drosophila melanogaster (Fruit fly)Cyprinus carpio (Common carp)Gallus gallus (Chicken)Bos taurus (Bovine)95Homo sapiens (Human)91Rattus norvegicus (Rat)9081 Mus musculus (Mouse)Dictyostelium discoideum (Slime mold)54100Saccharomyces cerevisiae (Bakers yeast)Kluyveromyces lactis (Yeast) (Candida sphaerica)8942Neurospora crassaSchizosaccharomyces pombe (Fission yeastE.coli0.05

• 从 上 面 看 出 , 我 们 的 序 列 和 Gossypium hirsutum (Uplandcotton) (Gossypium mexicanum) 在 同 一 分 支 上 , 且 它 们之 间 的 的 bootstrap 值 为 100。 将 这 两 个 序 列 进 行 needle 全局 比 对 , 得 到 :

• 可 以 看 出 , 这 两 个 序 列 是 完 全 相 同 的 , 所以 将 其 合 并 , 重 新 作 树 如 下 :

5296Zea mays (Maize)Oryza sativa subsp. japonica (Rice)单 子 叶 植 物97Nicotiana plumbaginifolia (Leadwort- leaved tobacco)1005782Hevea brasiliensis (Para rubber tree)Gossypium hirsutum (Upland cotton) (Gossypium mexicanum)Daucus carota (Carrot)双 子 叶 植 物Arabidopsis thalian(Mouse-ear cress) (2)89100Arabidopsis thalian(Mouse-ear cress))(1)Arabidopsis thalian(Mouse-ear cress) (3)30Chlamydomonas reinhardtii83Caenorhabditis elegans1006799Hemicentrotus pulcherrimus (Sea urchin)Drosophila melanogaster (Fruit fly)Cyprinus carpio (Common carp)Gallus gallus (Chicken)Bos taurus (Bovine)95Homo sapiens (Human)9392Rattus norvegicus (Rat)82 Mus musculus (Mouse)哺 乳 动 物Dictyostelium discoideum (Slime mold)55100Saccharomyces cerevisiae (Bakers yeast)Kluyveromyces lactis (Yeast) (Candida sphaerica)真 菌90Neurospora crassa43Schizosaccharomyces pombe (Fission yeast).E.coli

目 的 蛋 白 三 级 结 构 分 析• 寻 找 结 构 已 知 的 同 源 蛋 白• 预 测 目 的 蛋 白 的 三 维 结 构• 保 守 序 列 和 突 变 位 点 分 析

寻 找 结 构 已 知 的 同 源 蛋 白• 用 翻 译 出 的 蛋 白 序 列 进 行 blastp 的 结 果 , 与其 氨 基 酸 一 致 性 超 过 60 的 序 列 多 于 500 个 。、

选 择 分 值 最 高 的 ATP 合 酶 beta 亚 基Nicotiana plumbaginifolia 皱 叶 烟 草

2QE7 为 皱 叶 烟 草 (Nicotiana plumbaginifolia) 的 同 源 蛋 白

ATPbeta1 与 2QE7 序 列 比 对• 将 ATPbeta1 的 蛋 白 序 列 与 2QE7 的 D 链(beta 亚 基 ) 进 行 比 对 :2QE7 的 D 链 与 ATPbeta1 的 相 似 性 很 高 , 而 且 同 为 ATP 合 酶 的beta 亚 基 , 功 能 相 同 , 所 以 两 者 为 同 源 基 因 。

预 测 目 的 蛋 白 的 三 维 结 构• 用 SPDBV 软 件 来 构 建 目 的 蛋 白 的 模 型1. 从 PDB 网 站 下 载 2QE7 的 蛋 白 三 维 结 构 模 型 , 保 留 D 链

2. 利 用 SPDBV 中 的 SwissModel 工 具 进 行 结 构 模 拟

Magic fit 结 果 :

ATP beta 12QE7_D chain

保 守 序 列 和 突 变 位 点 分 析保 守 结 构 域 ( 球 状 )

Motif1Y359-D408,富 含 Thr,Ser和 极 性 氨 基 酸 ,且 形 态 上 为 口袋 状 , 可 能 为催 化 中 心 。

Motif3K292-D323, 富 含 Thr,Ser 和极 性 氨 基 酸 , 且 形 态 上 为 钳状 , 可 能 为 催 化 中 心 。

结 构 叠 合

猜 测• 最 为 保 守 的 Motif1 和 Motif3 组 合 成 双 臂 结 构分 别 结 合 磷 酸 分 子 和 ADP 分 子 , 并 催 化 其结 合 为 ATP。

“DELSEED” motif位 于 蛋 白 C 端 的 “DELSEED” 模 体是 与 γ 亚 基 结 合 的 结 构 域 。 提 供了 头 部 F1 转 动 的 动 力 。在 高 等 植 物 中 这 一 模 体 为“DELSEDD”。

DELSEEDDELSEDD

猜 测• 在 微 生 物 及 动 物 中 , DELSEED 模 体 第 六位 的 Glu 使 其 分 子 间 多 形 成 一 个 氢 建 , 可 能有 助 于 与 γ 亚 基 的 结 合 , 产 生 更 强 的 动 力 ,催 化 ATP 的 合 成 。

结 论• ATP 合 酶 beta 亚 基 是 极 度 保 守 的 蛋 白 , 从 细 菌 到 高等 动 物 中 的 序 列 相 似 性 很 高 。• ATP 合 酶 beta 亚 基 通 过 “DELSE(ED)D” 模 体 与gumma 亚 基 相 结 合 , 通 过 质 子 运 动 产 生 动 力 催 化 合成 或 分 解 ATP。• 在 微 生 物 及 动 物 中 , 因 为 在 保 守 位 点 的 氨 基 酸 改变 , ATP 合 酶 可 能 具 有 更 强 活 性 。• ATP 合 酶 最 为 保 守 的 Motif1 和 Motif3 组 合 成 双 臂 结构 , 可 能 是 催 化 ATP 合 成 的 部 位• ATP 合 酶 在 棉 花 纤 维 发 育 时 期 表 达 上 调 , 可 能 是 为了 产 生 更 多 能 量 , 促 进 纤 维 细 胞 的 伸 长 , 及 细 胞内 物 质 的 合 成 。

实 验 设 计• 针 对 “DELSEDD” 模 体 设 计 点 突 变 ( 如 D E),分 析 纤 维 发 育 过 程 中 ATP/ADP 的 比 率 变 化 及 纤 维细 胞 的 长 短 变 化 。• 针 对 Motif1 双 臂 结 构 中 的 关 键 氨 基 酸 ( 如 Asp366,Gln386,Thr313) 设 计 点 突 变 , 分 析 纤 维 发 育 过程 中 ATP/ADP 的 比 率 变 化 及 纤 维 细 胞 的 长 短 变 化 。• 在 酵 母 中 表 达 点 突 变 的 蛋 白 , 分 析 酵 母 细 胞 形 态变 化 。• 根 据 以 上 保 守 结 构 底 物 类 似 物 , 处 理 材 料 竞 争 性抑 制 底 物 结 合 , 分 析 同 上 。

参 考 文 献• K. Y. Hara, Y. Kato-Yamada, Y. Kikuchi, T. Hisabori, and M. YoshidaThe Role of the beta DELSEED Motif of F1-ATPase.J. Biol. Chem., June 22, 2001; 276(26): 23969 - 23973.• H Omote, MY Park, M Maeda and M FutaiThe alpha/beta subunit interaction in H(+)-ATPase (ATP synthase). AnEscherichia coli alpha subunit mutation (Arg-alpha 296-->Cys)restores coupling efficiency to the deleterious beta subunit mutant(Ser-beta 174-->Phe)J. Biol. Chem., Vol. 269, Issue 14, 10265-10269, 1994• M. K. Al-Shawi, C. J. Ketchum, and R. K. NakamotoEnergy Coupling, Turnover, and Stability of the F0F1 ATP SynthaseAre Dependent on the Energy of Interaction between gamma and betaSubunitsJ. Biol. Chem., January 24, 1997; 272(4): 2300 - 2306.• M. Nakanishi-Matsui, S. Kashiwagi, T. Ubukata, A. Iwamoto-Kihara, Y.Wada, and M. FutaiRotational Catalysis of Escherichia coli ATP Synthase F1 Sector:STOCHASTIC FLUCTUATION AND A KEY DOMAIN OF THE betaSUBUNITJ. Biol. Chem., July 13, 2007; 282(28): 20698 - 20704.• 逄 宇 (2008) 博 士 研 究 生 学 位 论 文

致 谢• 罗 静 初 教 授• 王 珺 逄 宇• Pku09s2 班 的 全 体 同 学

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