利用实用生物信息学分析兔瘟基因组序列 - abc

RHDV: 兔 出 血 症 病 毒兔 病 毒 属EBHSV: 欧 洲 褐 色 兔 综 合征 病 毒杯 状病 毒科诺 瓦 克 病 毒 属扎 幌 样 病 毒 属水 疱 疹 病 毒 属

RHDV: 兔 出 血 症 病 毒本 课 程 试 验 利 用 实 验 室 提 交 的 基 因 组 序 列 进 行 :Locus:DQ205345 7464bp mRNA linear VRL 05-OCT-2005Definition:Rabbit hemorrhagic disease virusstrain JX/CHA/97 polyprotein (RHDV), majorcapsid protein VP60 (VP60), and structural proteinVP12 (VP12) mRNAs, complete cds.

利 用 plotorf 进 行 基 因 组 读 码 框 分 析 : 读 码 框 呈 现 连 续 状 态根 据 相 关 文 献 资 料 得 知 :RHDV 存 在 两 个 读 码 框 ,ORF1 和 ORF2, 它 们 在 7025-7378 存 在 重 叠 区 域

有 关 VP60病 毒 基 因 组 ORF1 编 码 一 个 257kDa 的 蛋 白 的多 聚 蛋 白 前 体 , 该 多 聚 蛋 白 在 蛋 白 酶 水 解 过程 中 可 以 产 生 七 种 非 结 构 蛋 白 和 一 种 重 要 的结 构 蛋 白 (VP60), 有 研 究 表 明 ,VP60 可以 自 我 装 配 成 病 毒 的 衣 壳 , 包 裹 核 酸 后 即 形成 具 有 感 染 性 的 病 毒 粒 子 , 但 是 ,VP60 其 在RHDV 致 病 机 制 中 的 作 用 以 及 它 的 病 毒 侵 染 力尚 不 清 楚 。 为 此 , 我 们 对 其 进 行 分 析 , 并 且将 病 毒 衣 壳 蛋 白 编 码 区 的 部 分 基 因 删 除 , 观察 其 功 能 变 化 。

二 、 VP60 的 结 构 预 测提 取 uniprot 中 的 审 核 过 的 RHDV 的 序 列 的 VP60 区 段 进 行 比 对 ,分 析 其 序 列 差 异 性 , 构 建 进 化 树 。序 列 :P27410: (strain Rabbit/Germany/FRG/1989)(Ra/LV/RHDV/GH/1989/GE) (RHDV-FRG)Q86119 :(strain AST89) (Ra/LV/RHDV/AST89/1989/SP)(RHDV-AST89)P27411 :(strain V-351) (Ra/LV/RHDV/V351/1991/CK)(RHDV-V351)Q89273 :(strain BS89) (Ra/LV/RHDV/BS89/1989/IT)(RHDV-BS89)Q86117 :(strain BS89) (Ra/LV/RHDV/BS89/1989/IT)(RHDV-BS89)其 中 Capsid protein VP60 为 577AA, 位 于 1768 – 2344 位

构 建 VP60 的 进 化 树

Uniprot 中 的 VP60

VP60 进 行 结 构 预 测>sp|Q85433|CAPSD_RHDVR Subgenomic capsid protein VP60OS=Rabbit calicivirus PE=2 SV=1MEGKARITPQGEAAGTATTASVPGTTTDGMDPGVVATTSVVTTENASTSVATAGIGGPPQQVDQQETWRTNFYYNDVFTWSVADAPGSILYTVQHSPQNNPFTAVLSQMYAGWAGGMQFRFIVAGSGVFGGRLVAAVIPPGIEIGPGLEVRQFPHVVIDARSLEPVTITMPDLRPNMYHPTGDPGLVPTLVLSVYNNLINPFGGSTSAIQVTVETRPSEDFEFVMIRAPSSKTVDSVTPAGLLTTPVLTGVGTDNRWNCQIVGLQPVPGGLSTCNRHWNLNGSTYGWSSPRFTDIDHRRGASQPGGNNVLQFWYANAGSAVDNPICQVAPDGFPDMSFVPLNGPNVPTAGWVGFGAIWNSNSGAPNVTTVQAYELGFATGAPNNLQPATNTSGSQIVAKSIYAVSTGANQNPAGLFVMASGVISTPTARAITYTPQPDRIVNAPGTPAAAPVGKNVPIMFASVVRRTGDVNAEAGSDNGTQYGTGSQPLPVTIGLSLNNYSSALTPGQFFVWQLNFASGFMEIGLNVDGYFYAGTGASTTLIDLTELIDIRPVGPRPSTSTLVFNLGGATSGFSYV

提 交 至 swiss-model:Model information:Modelled residue range:18 to 567Based on template: [2gh8A] (3.20 Å)Parent PDB: 2gh8 Chain: A , 从 18-567 位Sequence Identity [%]:24.87Evalue:0.00e-1Quality information:[details]QMEAN Z-Score: -6.15Warning: Low QMEAN Z-scores! Only membraneproteins or models of poor quality are expected toreach such low scores.

对 其 进 行 分 析 :存 在 6 个 螺 旋 , 位 于 28-30,44-55,101-108,1489-150,391-394,490-497 处, 仅 仅 存 在 5 个 His( 位 于 95,155,179,277,297 位 ), 有 研 究 表 明 组 氨 酸 是 结合 、 包 裹 核 酸 的 位 点 。

2gh8_ARHDV_VP60

三 、 VP60 的 功 能 预 测在 RHDV 基 因 的 N2 端 (5325nt 处 ) 和 C2 端 (6945nt 处 )分 别 进 行 突 变 , 制 造 NarⅠ 酶 切 位 点 。设 计 四 条 突 变 引 物 :F5325:5’-GGGCAAAACCCGCACGGCGCCGCAAGGCGAAGC-3’R5325:5’-GCTTCGCCTTGCGGCGCCGTGCGGGTTTTGCCC-3’F6949:5’-GGAGCCTCAACGGCGCCCATTGACTTGACTG-3’R6949:5’-CAGTCAAGTCAATGGGCGCCGTTGAGGCTCC-3’

RHDV 突 变 体 的 构 建体 外 转 录 物 RNA 转 染 RK-13 细 胞NarⅠ 酶 消 化 上 述 重 组 突 变体 , 将 编 码 衣 壳 蛋 白 的 基因 从 pBlHDV 中 删 除 , 再 用T4DNA 连 接 酶 , 将 缺 口 链接 起 来 , 转 化 JM109 细 胞 ,涂 布 含 有 氨 苄 青 霉 素 的 琼脂 糖 平 板 , 于 37℃ 孵 化16h, 最 后 , 挑 取 阳 性 克 隆 ,提 取 质 粒 并 进 行 鉴 定转 染 产 物 接 种 于 RK-13 细 胞RT-PCR 法 检 测 病 毒 基 因 组间 接 免 疫 荧 光 法 检 测病 毒 突 变 体 蛋 白 的 表 达荧 光 定 量 RT-PCR 检 测 病毒 突 变 体 的 复 制

结 论 :5325-6931nt 区 域 缺 失 以 后 , 病 毒 的 侵染 性 没 有 明 显 改 变 , 但 是 病 毒 的 复 制能 力 有 所 下 降 , 可 见 该 区 域 可 能 含 有与 病 毒 复 制 有 关 的 调 控 序 列 和 元 件 。

四 、 讨 论一 、 基 于 2gh8_A 链 建 立 的 RHDV_VP60 蛋 白结 构 , 存 在 很 大 程 度 的 相 似 性 , 但 比 分 较低 。 如 果 基 于 3ZUE 的 基 础 上 , 其 可 信 度可 能 会 高 很 多 。二 、577vs576可 能 是 某 个 AA 在 翻 译 过 程 中 裂 解 掉 了 一个 氨 基 酸三 、 可 以 考 虑 将 组 氨 酸 突 变 后 观 察 其 是 否能 够 包 裹 核 酸 , 然 后 看 是 否 具 有 感 染 性 。

参 考 文 献 :1.Rabbit haemorrhagic disease (RHD) and rabbithaemorrhagic disease virus (RHDV): a review2. 谢 玉 柱 等 兔 出 血 症 病 毒 缺 失 突 变 体 的 构 建和 鉴 定3. 相 关 网 站