laboratoriniai darbai - Biochemijos ir biofizikos katedra - Vilniaus ...

1. 4. Saugaus Audiniø ir darbo làsteliø biochemijos ardymas ir laboratorijoje frakcionavimas pagrindinës __________________________________________
taisyklës ________________________ 45
Darbo eiga:
1. Á baltymo tirpalo ápilti 1/10 tûrio 100% ÒCA.
2. Inkubuoti leduose 30 min. arba 15 min., esant –20 o C temperatûrai.
3. 5 min. centrifuguoti didþiausiu greièiu ependorfiniuose megintuvëliuose stalo
centrifuga
4. .Pipete paðalinti nuopylas (supernatant¹).
5. Gautas nuosëdas galima:
6. Iðtirpinti 50 – 100 µl 0,1 N NaOH.
7. Keletà kartø praplauti nuosëdas 1ml etanolis–eteris miðiniu (1:1 v/v) , norint
visiðkai paðalinti rûgðtá, truputá padþiovinti ir iðtirpinti norimame buferyje.
Trichloracto rûgðtis (TCA, CCl 3 COOH M r =163.39) laikoma tamsiame inde
traukos sàlygomis. Ruoðiant 100 ml 100% (w/w) tirpalo reikia 68,78 gramus
rûgðties iðtirpinti 31,22 ml distiliuoto vandens.
Remiantis Bollag, D.M., Edelstein, S.J. (1991). Protein Methods. Wiley-Liss, Inc.,
New York, p.72 -3.
4.6.2. Baltymø nusodinimas amonio sulfatu
Metodas taikomas daugiau kaip 130 metø. Anksèiau jis buvo vienas ið plaèiausiai
naudojamø baltymø frakcionavimo bûdø. Ðiuo metu metodas vertinamas kaip labai
pigus baltymø nusodinimo bûdas. Nusodinant baltymus gaunamas ir gryninimo poveikis,
t. y. nusodinant baltymus ið làsteliø ar audiniø ekstraktø amonio sulfatu galima tikëtis
gauti 2–10 kartø daugiau ásotintus tiksliniu baltymu ekstraktus.
Amonio sulfato koncentracija tirpale reiðkiama sotumo laipsniais arba sotumo
procentais. Pavyzdþiui, 0,4 ir 0,6 atitinkamai 40% ir 60% yra santykiniai dydþiai,
laikant kad 1,0 ir 100% atitinka visiðkà sotumà.
(NH 4 ) 2 SO 4 , M m =132,1 g/M, soèiojo tirpalo koncentracija 4,1M (707 g l –1 ).
(NH 4 ) 2 SO 4 tirpumas beveik nesikeièia, keièiant temperatûrà nuo 0 iki 30 0 C.
Nors literatûroje galima rasti duomenø apie amonio sulfato koncentracijas, kurioms
esant baltymai iðkrenta nuosëdomis, daþniausiai kiekvienu konkreèiu atveju „bandymø
ir klaidø“ metodu yra parenkamos sàlygos.
4.3 lentelëje parodyti amonio sulfato kiekiai, reikalingi pasiekti 0–100% sotumus.
Amonio sulfato kieká, reikalingà pasiekti atitinkamà sotumo laipsná, galima
apskaièiuoti ið formulës
0,515× V 1× (Pr1−Pr 2)
x=
,
1 − (0,272× Pr 2)
kur x –amonio sulfato kiekis (g), reikalingas norint pasiekti Pr2 sotumo laipsná, V1 –
pradinio tirpalo tûris, Pr1 – pradinio tirpalo sotumo amonio sulfatu laipsnis, Pr2 –
norimo tirpalo sotumo laipsnis.