Projeto Genoma do Câncer - Biotecnologia

R$ 5,00
ano II • número 12 • janeiro/fevereiro de 2000
ESPECIAL
Projeto Genoma do Câncer
Análise Diagnóstica de um Produto Transgênico
Terapia Gênica
Projeto Transcriptoma
Biomonitoramento de Mutagênese Ambiental
Proteínas Recombinantes
Construindo Flores
O controle molecular da arquitetura floral
www.biotecnologia.com.br

BIOTECNOLOGIA/KL3
REPETE FOTOLITO
2 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

BIOTECNOLOGIA/KL3
REPETE FOTOLITO
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 3

ENTREVISTA
Diagnóstico
Genético
Entrevista concedida a
Ana Lúcia Azevedo
José Bines
Mulheres do Estado do Rio de Janeiro contam agora com
um serviço que poderá ajudar a prevenir cânceres de
mama e ovário com ajuda de novas descobertas da
genética. O serviço pioneiro de aconselhamento genético
é fruto da iniciativa de profissionais do Instituto Nacional
do Câncer (INCa), no Centro do Rio, e atende a mulheres
com casos de câncer de mama ou ovário na família.
Coordenado pelo oncologista Dr. José Bines, o grupo dá
assistência a parentes de pacientes do próprio INCa. A
meta do grupo de aconselhamento genético é identificar
mulheres com alto risco de câncer de mama e ovário e ajudá-las a evitar a
doença com a combinação de métodos tão variados quanto o diagnóstico de
genes associados ao câncer e atendimento psicológico. Numa segunda etapa
do trabalho, a equipe também espera obter informações para produzir um
perfil dos cânceres de mama e ovário adequado às características da mulher
brasileira. Em entrevista à Revista Biotecnologia, Dr. José Bines conta que o
trabalho ainda está no início, mas tem um caminho promissor pela frente com
o avanço das técnicas de biologia molecular.
Dr. José Bines é médico, oncologista, responsável pelo Grupo de
Aconselhamento Genético do INCa. Ele é formado pela UFRJ e tem
Fellowship em Hematologia e Oncologia pela Northwestern University
(Chicago). Obteve certificado em Clínica Médica e Oncologia pelo American
Board of Internal Medicine.
4 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

BC&D - O que é aconselhamento genético?
José Bines - R: O objetivo do aconselhamento
genético é analisar e explicar, em
termos compreensíveis para os pacientes,
o risco de desenvolver determinadas
doenças. No nosso caso, de desenvolver
câncer. Sempre que possível, a meta é
oferecer propostas de prevenção e detecção
precoce.
BC&D - Como surgiu a idéia de oferecer
um serviço de aconselhamento
genético no INCa para cânceres de
mama e de ovário?
José Bines - Uma das linhas de pesquisa
que mais tem se desenvolvido no campo
do aconselhamento genético é justamente
o estudo dos cânceres de mama e
ovário. O INCa atende a um grande
número de pacientes com essas doenças.
Por isso, é importante que consigamos
avançar no que diz respeito ao diagnóstico
precoce e a prevenção.
BC&D - Quando o serviço de aconselhamento
genético do INCa começou
a funcionar?
José Bines - Começamos a formar o
grupo em maio de 1999. Desde então,
temos mantido reuniões semanais e em
agosto passado iniciamos a parte de
assistência propriamente dita.
BC&D - Quantos profissionais fazem
parte do grupo?
José Bines - Além de mim, que sou
oncologista, participam dois mastologistas,
um ginecologista, duas psicólogas,
uma enfermeira, uma assistente social e
quatro geneticistas.
BC&D - Quantas pessoas já foram atendidas?
José Bines - Vinte mulheres já foram
entrevistadas pelo grupo. Seis delas não
se encaixavam nos critérios de risco para
que precisassem ser testadas para identificação
de mutações nos genes BRCA1 e
BRCA2, os dois maiores envolvidos em
cânceres de mama e ovário de caráter
hereditário. Com isso, 14 realizaram o
teste de DNA para detecção do BRCA1 e
do BRCA2. Nos baseamos na história
familiar da mulher e na idade de aparecimento
dos tumores na família.
BC&D - Como é feita a seleção de
pacientes?
José Bines - Por enquanto, estamos atendendo
somente pacientes do INCa. Elas
são encaminhadas por outros médicos da
instituição, que indicam nosso serviço
para pacientes com história familiar e
idade precoce (menos de 50 anos) de
aparecimento de câncer de mama ou
ovário. A avaliação sempre começa com
"A avaliação sempre
começa com a pessoa que
tem a doença, caso o teste
seja positivo para mutação
do BRCA1/BRCA2,
passamos a avaliar os
familiares"
a pessoa que tem a doença, caso o teste
seja positivo para mutação do BRCA1/
BRCA2 , passamos a avaliar os familiares.
BC&D - Existem projetos de ampliar o
serviço para outros tipos de câncer? Quais?
"...há possibilidade de
prevenção e detecção
precoce, os principais
benefícios. O maior risco
é o estresse psicológico ao
qual a pessoa que tem
mutações identificadas e
não tem a doença estará
exposta durante o
restante da vida"
José Bines - Esse é apenas o início do
serviço. Ainda neste ano pretendemos
ampliar o serviço e atender a pacientes
com câncer de intestino (colo-retal) e
melanoma (câncer de pele). Há informações
relativas à transmissão hereditária
nesses tumores e estratégias que podem
ser utilizadas na sua prevenção e detecção
precoce.
BC&D - Qual é o papel da hereditariedade
no câncer da mama? Qual é o
percentual de casos associados à hereditariedade?
José Bines - Todo câncer é genético, isto
é, decorrente de mutações. Porém, a
maioria ocorre em células somáticas e
não germinativas. A maioria dos tumores
de mama são esporádicos, isto é, não são
hereditários. Somente entre 5 e 10% dos
tumores de mama são hereditários.
BC&D - Quando uma paciente é considerada
em risco?
José Bines - Os critérios variam um
pouco de acordo com cada serviço. Todavia,
de modo geral, é considerada em
risco a mulher que tiver história de mais
de um caso na familia com idade de
aparecimento da doença antes dos 50
anos, câncer bilateral (presença de câncer
de mama e ovário). Consideramos a
combinação de todos esses fatores para
calcular o risco de uma mulher. Quando
o risco (calculado com o uso de tabelas)
é maior do que 10%, há indicação para
exames de detecção de mutações nos
genes BRCA1 e BRCA2.
BC&D - Quantas mutações nos genes
BRCA1 e BRCA2 já foram associadas
ao câncer de mama e de ovário?
José Bines - Há várias mutações nos dois
genes: algumas de significado incerto,
outras sem relação com o aumento do
risco de câncer e outras diretamente
relacionadas a um risco aumentado. Há
três mutações principais associadas a um
risco aumentado de câncer de mama e
ovário, duas delas no BRCA1 e uma no
BRCA2.
BC&D - Quais são as mais importantes?
José Bines -No BRCA1, a 185 delAG e
5382 insC. No BRCA2, a 6174 delT. (185
é a posição no gene, del indica deleção,
ins é igual à inserção, AGCT são as bases
nitrogenadas do DNA).
BC&D - Como é feito o aconselhamento
genético?
José Bines - A paciente passa por uma
série de avaliações. Inicialmente ela conversa
com a assistente social. Depois é
entrevistada por uma psicóloga. Só depois
disso, passa para o exame médico.
Fazemos um heredograma e um exame
físico. Depois, estimamos o risco de uma
paciente apresentar mutações. A pacien-
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 5

te sai da consulta com um consentimento
informado, que é um documento no qual
expomos os riscos e benefícios para testagem.
A paciente deve retornar após três
semanas para nos trazer questões que
possam ter surgido nesse período e o
consentimento assinado (caso queira se
submeter à testagem). Nessa segunda
etapa, coletamos sangue para exame.
Fazemos uma outra consulta que começa
com uma avaliação psicológica e, finalmente,
damos os resultados do exame
genético. Caso a paciente tenha mutação
característica, o próximo passo é a avaliação
de familiares de primeiro grau (mãe,
irmãs e filhas com mais de 21 anos).
BC&D - Como tem sido a resposta das
pacientes ao serviço?
José Bines - A aceitação tem sido muito
boa. As pessoas têm se mostrado interessadas
e compreendem exatamente a função
da testagem. Há pouca alteração na
conduta no que diz respeito a mulheres
que já têm câncer. O principal objetivo é
o aconselhamento dos familiares.
BC&D - Os métodos de diagnóstico
genético existentes oferecem que margem
de acurácia?
"A maioria dos tumores
de mama são
esporádicos, isto é, não
são hereditários. Somente
entre 5 e 10% dos
tumores de mama são
hereditários"
José Bines - Fazemos o sequenciamento
de todo o DNA dos genes BRCA1 e
BRCA2, considerado o teste padrão (“goldstandard”).
Até o momento, encontramos
mutações clássicas. É importante ressaltar
que algumas mutações são de significado
incerto, isto é, não se sabe se estão
associadas a um risco aumentado de
câncer de mama ou ovário. Ainda pode
se tratar de um câncer hereditário, porém,
com uma mutação num gene ainda
não identificado.
BC&D - Os resultados ficam prontos
em quanto tempo?
José Bines - Entre dois e três meses.
BC&D - Nos últimos anos têm havido
um grande desenvolvimento na
área de testes genéticos. Que tipo de
benefício, e também de risco, essa
nova forma de diagnóstico traz para
pacientes com câncer e suas famílias?
José Bines - Não há evidência de
aumento de sobrevida, porém há possibilidade
de prevenção e detecção
precoce, os principais benefícios. O
maior risco é o estresse psicológico ao
qual a pessoa que tem mutações identificadas
e não tem a doença estará
exposta durante o restante da vida.
BC&D - Que tipo de aplicação médica
mais imediata o Projeto Genoma
Humano pode ter?
José Bines - O conhecimento do código
genético humano permitirá avaliar
as alterações existentes, sua associação
com doenças e a a busca de caminhos
para a prevenção e tratamento.
Etapas do aconselhamento genético para mulheres com mutações associadas aos genes BRCA1 e BRCA2 identificadas:
CÂNCER DE MAMA :
Detecção: Auto-exame da mama uma vez por mês
a partir dos 25 anos; realização de exame médico a
cada seis meses para mulheres com mais de 25
anos; mamografia uma vez por ano entre os 25 e
os 35 anos.
Quimioprevenção: Os médicos do INCa ainda
não recomendam remédios para prevenção porque
não existem estudos suficientes que indiquem sua
eficiência e segurança. No Estados Unidos, estudos
com a droga tamoxifeno revelaram que ela pode
diminuir em 50% o número de casos de câncer de
mama não relacionados à hereditariedade em mulheres
com mais de 60 anos. Porém, os médicos
não sabem se ela teria o mesmo êxito contra tumores
associados a genes específicos. Há pesquisas
com resultados semelhantes com o medicamento
raloxifeno.
Cirurgia: Segundo Dr. José Bines, a remoção dos
ovários pode diminuir em até 50% o risco de uma
mulher contrair tumor maligno na mama. Os médicos,
todavia, só recomendam a cirurgia de
ooforectomia para mulheres que já têm filhos e podem
suportar os problemas causados por uma menopausa
precoce. A outra opção é bem mais radical. A
mastectomia (extirpação da mama) pode diminuir o risco
da doença em 90% em mulheres sem mutações nos
genes. Todavia, não há resultados para mulheres com
risco associado ao câncer hereditário. Dr. José Bines diz
que por ser uma decisão drástica, precisa ser muito bem
avaliada por médico e paciente.
CÂNCER DE OVÁRIO :
Detecção: Os médicos recomendam um exame de sangue
para detectar uma substância chamada CA-125
(cujos níveis são alterados pelo câncer) a cada seis meses.
Eles também sugerem a realização de uma exame
de ultra-som transvaginal a cada seis meses.
Quimioprevenção: As pílulas anticoncepcionais comuns
são a melhor opção. Elas podem diminuir em 50%
o risco de câncer de ovário.
Cirurgia: Para algumas pacientes, os médicos recomendam
a ooforectomia.
6 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

MONSANTO NOVO
FOTOLITO EM
ANEXO
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 7

Carta ao Leitor
BIOTECNOLOGIA Ciência & Desenvolvimento
KL3 Comunicação
Fundador
Henrique da Silva Castro
Diretora de Pesquisa e Edição
Ana Lúcia de Almeida
Diretor Executivo
Márcio Brasil
Diretor de Arte
Henrique S. Castro Fº
Departamento Comercial,
Redação e Edição:
SRTV/Sul - Quadra 701
Ed. Palácio do Rádio II
Sala 215 - CEP 70340-902
Brasília - DF
Tel.: (061) 225-1512 (061) 225-0976
Fax: (061) 224-2830
E-mail
kl3@biotecnologia.com.br
Home-Page
www.biotecnologia.com.br
Com a conclusão do Projeto Genoma Xylella, podemos
dizer que o Brasil deu uma grande arrancada no progresso
científico do país. Não apenas pelo fato de ter
sido concluído em tempo record, um projeto de suma
importância para a erradicação do grande problema na
citricultura brasileira, mas principalmente por ter proporcionado
todo um desenvolvimento tecnológico em
torno do próprio projeto.
Afinal, foram muitos laboratórios de sequenciamento,
espalhados pelo Brasil inteiro, envolvendo vários especialistas,
num projeto completamente novo. Parabéns
aos cientistas envolvidos, aos técnicos, aos especialistas
das áreas de bioinformática, à Fapesp, e aos demais
envolvidos. Parabéns também, àqueles que dão
sequencia e aprimoramento às pesquisas. Com o desenvolvimento
da biologia molecular, todos os setores se
beneficiam. Da agricultura à saúde, novos projetos,
novas pesquisas e novas descobertas. Poderíamos até
dizer que, se o mundo não está melhor, ao menos
aponta para um futuro promissor. No encarte especial,
publicamos o artigo Projeto Genoma do Câncer Humano,
projeto da maior importância para a saúde mundial,
escrito por Emmanuel Dias Neto, do Instituto Ludwig,
de cujo grupo desenvolveu uma nova tecnologia, a
chamada Estratégia Orestes.
Dr. Henrique da Silva Castro
Projeto Gráfico
Agência de Comunicação IRIS
www.agenciairis.com.br
iris@agenciairis.com.br
Assinaturas
O pedido de assinatura é realizado através
da carta resposta-comercial encartada em
cada revista, por telefonema ou fax
diretamente à KL3 ou pela Internet
através dos nossos endereços eletrônicos.
A revista não tem vendedores autorizados.
ISSN 1414-4522
8 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

Conselho Científico
Dr. Aluízio Borém - Genética e Melhoramento Vegetal
Dr. Henrique da Silva Castro - Saúde;
Dra. Johanna Döbereiner - Microbiologia de Solos;
Dr. Maçao Tadano - Agricultura;
Dr. Naftale Katz - Saúde;
Dr. Pedro Juberg - Ciências;
Dr. Sérgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas;
Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Genética de Microorganismos;
Dr. William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental.
Conselho Brasileiro de Fitossanidade - Cobrafi
Dr. Ivan Rud de Moraes - Toxicologia;
Dr. Luís Carlos Bhering Nasser - Fitopatologia
Conselho Federal de Biologia
Dr. João de Deus Medeiros
Fundação Dalmo Catauli Giacometti
Dr. Eugen Silvano Gander - Engenharia Genética;
Dr. José Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biológico;
Dra. Marisa de Goes - Recursos Genéticos
Colaboraram nesta edição:
CARLOS FREDERICO MARTINS MENK,
CATHERINE NGUYEN E BERTRAND JORDAN,
CELIO LOPES SILVA,
EMMANUEL DIAS NETO,
FERNANDO ARARIPE GONÇALVES TORRES,
GERALDO A. S. PASSOS,
JOSE MACIEL RODRIGUES JÚNIOR,
KARLA DE MELO LIMA,
LIDIA MARIA PEPE DE MORAES,
MARCELO CARNIER DORNELAS,
MARCIO CASTRO SILVA-FILHO,
MARIA CRISTINA FALCO,
PEDRO CANISIO BINSFELD,
RENATA MARIA AUGUSTO DA COSTA,
SERGIO U. DANI.
Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN
Dr. José Roberto Rogero
Especial
O Projeto Genoma do Câncer Humano - Ludwig/Fapesp
- Encarte Especial
Novas Tecnologias
Microesferas Biodegradáveis - pág 10
Saúde
Terapia Gênica - pág 28
Entrevista
Diagnóstico Genético - José Bines - pág 04
Pesquisa
Análise Diagnóstica de um Produto Transgênico - pág 16
Proteínas Recombinantes Produzidas em Leveduras - pág 20
Biomonitoramento de Mutagênese Ambiental - pág 24
Projeto Transcriptoma - pág 34
Interação Planta-Inseto - pág 38
Construindo Flores - pág 44
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 9

Novas Tecnologias
Microesferas
Biodegradáveis
Uma nova alternativa para administração de vacinas de DNA
Karla de Melo Lima
Doutoranda do curso de Imunologia
Básica e Aplicada
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Universidade de São Paulo
klima@rpm.fmrp.usp.br
Célio Lopes Silva
Professor Titular de Imunologia da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Universidade de São Paulo
clsilva@fmrp.usp.br
José Maciel Rodrigues Júnior
Professor Adjunto da Faculdade de
Farmácia da Universidade
Federal de Minas Gerais
rodrigue@dedalus.lcc.ufmg.br
Fotos cedidas pelos autores
a última década, os avanços
no desenvolvimento
de vacinas permitiram a
introdução de novas estratégias
para a obtenção
e produção de antígenos,
assim como foram desenvolvidas vias alternativas
de administração e apresentação
desses antígenos para as células do
sistema imune. Estas estratégias abriram
caminho para inovações, particularmente
no contexto do desenvolvimento de vacinas
mais seguras, eficazes e polivalentes.
Dentro deste contexto, as vacinas de DNA
surgiram como uma alternativa
interessante para o desencadeamento
de proteção, especialmente
quando a resposta
imune celular é requerida.
A vacina gênica ou vacina
de DNA, pode tornar-se
um poderoso instrumento de
combate a doenças infecciosas
para as quais até hoje não
existe prevenção segura,
como herpes, AIDS, malária,
tuberculose, hepatite, esquistossomose
e dengue, dentre
outras. O processo de vacinação
envolve a inoculação intramuscular
do DNA que leva
a mensagem para a síntese do
antígeno apropriado no interior
das células do indivíduo
10 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento
vacinado. Este tipo de vacinação
apresenta uma grande
vantagem, pois fornece ao
organismo hospedeiro a informação
genética necessária
para que ele produza o
antígeno com todas as características
importantes para a
geração de uma resposta imune.
Isto, sem os efeitos colaterais
que podem ser gerados
pela introdução de patógenos
no organismo, ou problemas
proporcionados pela introdução das
vacinas de subunidades associadas a adjuvantes
que são frequentemente tóxicos. As
vacinas de DNA representam uma metodologia
que se aproxima da infecção natural,
alcançando altos níveis da proteção
desejada. Para a sua produção, uma porção
do DNA do agente causador da doença,
que pode ser um vírus, bactéria, fungo
ou um parasita, é retirada. Essa porção do
DNA, que normalmente representa um
gene que codifica um antígeno imunodominante
ou um fator de virulência, apresenta
a potencialidade de induzir o sistema
Figura 1 – Obtenção das vacinas de DNA. Uma porção do
DNA de um patógeno, correspondente a um gene que
codifica uma proteína antigênica apropriada, é retirada
(A) e clonada em um plasmídeos contendo um gene de
resistência a antibiótico (B). Os plasmídeos obtidos (C)
são introduzidos em células bacterianas (D). As bactérias
são semeadas em um meio contendo antibiótico (E) onde
apenas as células transformantes, isto é, que contêm o
plasmídeo, serão capazes de crescer (F). Estes clones são
então expandidos em meio líquido com antibiótico (G)
possibilitando a obtenção do plasmídeo em grande quantidade
após a lise das células (H). Uma vez purificados os
plasmídeos são utilizados como vacina de DNA
imunológico para a produção de anticorpos
ou estimular a imunidade mediada por
células, principalmente linfócitos T auxiliares
ou citotóxicos. O DNA é então clonado
em um plasmídeo e a transformação de
células bacterianas é utilizada para a sua
obtenção em grande quantidade. A figura
1 ilustra o processo de obtenção das vacinas
de DNA.
A vacinação com DNA pode ser feita
em várias espécies animais e no homem,
por diversas vias e esquemas. Embora a
injeção intramuscular seja um processo
simples e de baixo custo, sua utilização na
maioria das vezes requer uma
quantidade elevada de plasmídeo
para estimular uma resposta
imune adequada. O uso de solução
de glicose hipertônica para
edemaciar o tecido muscular, ou
de anestésicos locais como a
bupivacaína, que são capazes de
lesar o tecido e causar uma reação
inflamatória, têm sido empregados,
em modelos animais,
como alternativas para aumentar
a transfecção de células apresentadoras
de antígenos, como
macrófagos e células dendríticas,
após a injeção intramuscular
(Davis et al., 1993). Entretanto,
tais procedimentos não são aceitáveis
para utilização em clínica
humana devido aos seus efeitos
colaterais. Vários pesquisadores
mostraram que a injeção intramuscular
requer uma quantidade
de plasmídeo 100 vezes superior
para gerar uma expressão
equivalente àquela produzida
pelo bombardeamento de partículas
sob alta pressão com “gene
gun” (Barry & Johnston, 1997).
Esta diferença na eficácia de
transfecção pode ser atribuída
ao fato da injeção intramuscular
colocar o plasmídeo em um
ambiente extracelular onde quan-

Figura 2 – Avaliação in situ da
expressão da enzima β-galactosidade
em células J777 transfectadas in
vitro com o plasmídeo pSV-βgal
(Invitrogen®) utilizando o método
de bombardeamento com partículas
de ouro. As setas indicam as
partículas de ouro no citoplasma
da célula
tidades significativas do DNA são rapidamente
degradadas por nucleases. Em contraste,
com o bombardeamento de partículas
ocorre liberação do DNA dentro das
células, evitando a degradação dos plasmídeos
funcionais (Figura 2). Embora promova
uma transfecção eficiente, a imunização
pelo bombardeamento de partículas
apresenta inconvenientes como a necessidade
de aparelhos especiais para a sua
execução e a necessidade de doses de
reforço. Além disso, como muitos patógenos
penetram no organismo através de
superfícies mucosas como aquelas do trato
respiratório, gastrointestinal ou urogenital
entre outras, seria vantajoso que as vacinas
de DNA também estimulassem a imunidade
nestes tecidos. Embora demonstrado
que vacinas de DNA são capazes de estimular
uma resposta humoral em superfícies
mucosas sua administração por estas
vias requer o desenvolvimento de estratégias
que assegurem a sua estabilidade
principalmente no que concerne à administração
por via oral.
A busca por alternativas para administração
de vacinas, levou Preis e Langer
(1979) a aplicarem a tecnologia da liberação
controlada de fármacos no campo da
imunização. Eles demonstraram que a produção
de anticorpos em camundongos
imunizados com uma única dose de um
antígeno contido numa matriz polimérica
não degradável, mantinha-se por mais de
6 meses em níveis comparáveis aos dos
camundongos imunizados por duas vezes
com o mesmo antígeno incorporado em
adjuvante completo de Freund. Entretanto,
a aplicação desta estratégia suscitou a
preocupação sobre os possíveis efeitos
adversos que a presença deste material no
organismo poderia ocasionar criando-se,
desta forma, a necessidade de remoção
cirúrgica do implante após a liberação do
antígeno. Neste sentido, a síntese de polímeros
biodegradáveis contribuiu para a
melhoria do sistema visto que eles não
requerem remoção cirúrgica e efeitos colaterais
a longo prazo podem ser minimizados
uma vez que tais polímeros se
degradam em função do tempo. Dentre os
polímeros biodegradáveis comercialmente
disponíveis, os poliésteres derivados
dos ácidos lático e glicólico (PLGA) merecem
destaque por serem aprovados pelo
Figura 3 – Microscopia eletrônica de varredura mostrando microesferas de PLGA
após o preparo (A) e após a liberação do antígeno encapsulado (B) (Barra = 5
µm)
FDA para utilização na clínica humana e
terem uma longa história de segurança.
Além disso, quimicamente, estes polímeros
podem apresentar diferenças no tamanho
das cadeias e no número de monômeros
de ácido lático e glicólico presentes nas
mesmas. Tais diferenças estão diretamente
relacionadas com a degradação permitindo
assim, a obtenção de diferentes polímeros
cujo tempo de degradação pode variar
entre alguns dias e vários meses. No organismo,
estes polímeros são hidrolisados e
uma vez degradados, são gerados o ácido
lático e o glicólico que são compostos
inócuos ao organismo. O desenvolvimento
de sistemas de liberação controlada de
fármacos e antígenos visando a otimização
da resposta terapêutica e imunológica é
uma das principais linhas de pesquisa do
Laboratório de Tecnologia Farmacêutica
da Faculdade de Farmácia da UFMG.
As microesferas poliméricas surgiram
como alternativa de sistema de liberação
controlada que pudesse ser administrado
de maneira simples, sem a necessidade de
técnicas cirúrgicas, contando apenas com
o auxílio de seringa. Elas são partículas
poliméricas esféricas cujo diâmetro varia
entre 1 e 250 µm (figura 3) e constituem um
sistema matricial ou reservatório no qual o
antígeno está dissolvido, disperso ou encapsulado.
Microesferas constituídas de
poliésteres dos ácidos lático e glicólico
(PLGA) possuem a vantagem de serem
biodegradáveis sem manifestações ulcerativas
no sítio de administração se utilizadas
por via parenteral. Além disso, sua potencialidade
de utilização como adjuvante
reside também no fato delas formarem,
após administração subcutânea ou intramuscular,
um depósito onde o antígeno é
liberado lentamente, de maneira controlada,
de acordo com o polímero utilizado na
sua fabricação. A velocidade de hidrólise
de tais polímeros depende: de sua composição
química; da proporção dos monômeros;
do tamanho da cadeia e do tamanho
das partículas, podendo-se obter tempos
de degradação que variam entre algumas
semanas e vários meses. A combinação da
difusão através de poros e da erosão da
matriz polimérica permite controlar a taxa
de liberação do antígeno encapsulado nas
microesferas. Esta propriedade permitiu a
criação do conceito de vacina de dose
única onde uma formulação composta por
microesferas de tamanho, porosidade e
composição polimérica diferentes, liberaria
o antígeno encapsulado em intervalos
de tempo substituindo as doses de reforço
de uma vacina convencional (Figura 4).
Outra vantagem destes sistemas reside no
fato de poderem ser administrados por
diferentes vias. As potencialidades de microesferas
como adjuvantes de vacinas
foram recentemente revisadas por Lima &
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 11

Figura 4 – Modelo
esquemático da vacina
de dose única (“singleshot
vaccine”) baseada
no encapsulamento de
antígenos em
microesferas de PLGA
Rodrigues Júnior (1999).
Vários métodos têm sido descritos para
a obtenção de microesferas. Dentre eles, o
mais utilizado para o encapsulamento de
compostos hidrofílicos e também o método
de escolha para encapsulamento
de antígenos
protéicos e DNA,
é o método de emulsão
múltipla e evaporação
do solvente. Trata-se de
um método simples, de
fácil transposição para
escala industrial e cuja
realização em condições
assépticas garante
a esterilidade final do
produto. O esquema na
figura 5 ilustra o encapsulamento
de DNA em
microesferas de PLGA.
O processo consiste,
inicialmente, na formação
da emulsão primária
do tipo água/óleo.
O DNA é dissolvido na
fase aquosa e o polímero
na fase orgânica
cujo solvente consiste
normalmente de cloreto
de metileno ou acetato
de etila. A emulsão
primária é então vertida,
sob agitação, sobre uma segunda fase
aquosa contendo um agente tensoativo
(álcool poli vinílico) para formar uma
emulsão estável do tipo água/óleo/água.
Esta emulsão é mantida sob constante
agitação até que o solvente orgânico, volátil,
seja completamente eliminado da
formulação. A remoção do solvente orgânico
faz com que o polímero, insolúvel em
água, precipite em torno das gotículas de
água da fase aquosa interna resultando na
suspensão de microesferas. As partículas
são coletadas por centrifugação, lavadas
para remover o excesso de tensoativo e
liofilizadas. As microesferas poliméricas
oferecem ainda vantagens no que concerne
à sua estabilidade visto que elas são
armazenadas na forma de pó liofilizado a
ser reconstituído imediatamente antes da
sua utilização.
Outra característica fundamental para
a adjuvanticidade das microesferas reside
no fato de que, após administração parenteral,
as partículas menores que 10 µm são
fagocitadas pelas células fagocíticas do
sistema fagocitário mononuclear, apresentadoras
de antígenos. Já as partículas com
diâmetro superior a 10 µm seriam responsáveis
pela formação do depósito e liberação
do antígeno por um período prolongado.
Uma vez que o antígeno encontra-se
encapsulado no interior das partículas e
por isso protegido da ação de enzimas, as
microesferas têm sido utilizadas para a
estimulação da resposta imune em nível de
mucosas. Após administração por via oral,
as partículas menores que 5µm são captadas
nas placas de Peyer por células M e
Figura 5 – Obtenção de microesferas
poliméricas contendo DNA
pelo método de emulsão múltipla
e evaporação do solvente
transportadas para o tecido linfóide onde
elas encontram células apresentadoras de
antígenos. Esta possibilidade de imunização
tem como grande vantagem a produção
de IgA secretória que funcionaria como
uma barreira inicial contra patógenos que
invadem o organismo por superfícies mucosas.
Recentemente, Jones e colaboradores
(1997) demonstraram que o plasmídeo
contendo o gene que codifica a enzima
luciferase, encapsulado em microesferas
de PLGA foi capaz de estimular a resposta
imune humoral efetiva após administração
oral em camundongos. Pelo exposto, as
microesferas poliméricas têm surgido como
uma estratégia interessante a ser empregada
no processo de vacinação com DNA. A
figura 6 ilustra o esquema de ação das
vacinas de DNA encapsuladas em microesferas.
Desde 1991, o Laboratório de Vacinas
Gênicas da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto - USP, vem desenvolvendo
projeto de pesquisa, visando a descoberta
de uma nova vacina contra a tuberculose.
Os resultados mostraram que a vacina
gênica desenvolvida pelo grupo não só
tem atividade preventiva contra o estabelecimento
da tuberculose experimental
como também alta atividade terapêutica
contra a doença já estabelecida (Lowrie et
al., 1999 ). Em resumo, a vacina de DNA,
que codifica o antígeno
imunoestimulante hsp65
de Mycobacterium leprae,
tem a habilidade de: (I)
prevenir o estabelecimento
da infecção e da doença;
(II) eliminar a infecção
causada pelo bacilo da tuberculose
e curar casos
crônicos da doença disseminada;
(III) resolver casos
de tuberculose causada
por bactérias altamente
resistentes aos medicamentos
usados no combate
à doença; e (IV) impedir
a reativação da doença
quando os animais são
submetidos a uma imunodepressão
pelo tratamento
com drogas imunossupressoras.
Além disso,
durante o desenvolvimento
do projeto, foram determinados
os mecanismos
imune efetores responsáveis
pelo controle da infecção
e da doença assim
como iniciados estudos para saber qual a
melhor maneira de se administrar as preparações
vacinais para conferir maior proteção
nos camundongos. Entretanto, para
se alcançar tais resultados, foram necessárias
3 injeções, por via intramuscular, de
12 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

técnica de imunocitoquímica (Figura 7). Os dados
demonstram que o encapsulamento do DNA em
microesferas é capaz de promover a transfecção de
células fagocíticas in vitro. Então para avaliar o
funcionamento deste sistema in vivo, estão sendo
estudados parâmetros imunológicos, em camundongos
BALB/c, após a administração da vacina
encapsulada em microesferas, por vias e esquemas
diversos. Os dados obtidos permitirão o estabelecimento
de comparação da administração da vacina
empregando-se outras técnicas como injeção intramuscular
e bombardeamento de partículas.
Agradecimentos: FAPEMIG, FAPESP, CNPq,
PRPq/UFMG. Ao Centro de Microscopia Eletrônica
do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Minas Gerais pela análise de microscopia
eletrônica.
Figura 6– Modelo esquemático da ativação da resposta imune pela
vacina de DNA encapsulada em microesferas. A) Após administração,
as microesferas sâo fagocitadas por células apresentadoras de antígenos.
A erosão da matriz e difusão através de poros permite a liberação
do DNA encapsulado nas microesferas. B) O plasmídeo liberado
penetra então no núcleo da célula hospedeira e inicia a transcrição do
RNAm que originará a proteína antigênica. O antígeno presente no
citoplasma é então degradado em peptídeos que se ligam a moléculas
de MHC de classe I. Após a ligação, o complexo é transportado via
Golgi para a superfície celular onde podem ser reconhecidos por
linfócitos T citotóxicos. C) O antígeno pode também ser processado
por via exógena onde ele é fagocitado e degradado no fagolisossoma.
Os peptídeos gerados são então conjugados a moléculas de MHC de
Classe II e apresentados na superfície celular podendo ativar linfócitos
T auxiliares. Dependendo do tipo de linfócito T auxiliar estimulado,
células B podem ser ativadas e a produção de anticorpos específicos
induzida. Entretanto as células B podem também sofrer ativação
direta do antígeno secretado ou liberado no meio
grande quantidade de DNA (50 a 100µg
por amimal). Com o objetivo de otimizar
a utilização da vacina, possibilitando
a redução da quantidade e do
número de administrações do DNA,
microesferas de PLGA estão sendo
empregadas como carreadores do plasmídeo.
Para tal, o plasmídeo dissolvido
em salina tamponada foi encapsulado
em microesferas de PLGA 50:50
utilizando-se o método de emulsão
múltipla e evaporação do solvente. Os
resultados preliminares mostraram que
o plasmídeo mantém-se funcional após
o seu encapsulamento em microesferas
e que as partículas obtidas apresentam
distribuição de diâmetro variando
entre 1 e 10µm, essencial para a
captura por células fagocíticas. Quando
adicionadas a cultura de macrófagos
as microesferas são fagocitadas e
a expressão da hsp65 por estas células
pode ser detectada, 10 e 20 dias após
o início do tratamento, utilizando-se a
Figura 7– Avaliação da expressão de hsp65
por células J774 transfectadas com o DNA
encapsulado em microesferas. As setas indicam
as microesferas no interior das células
Referências Bibliográficas:
Barry M.A. & Johnston S.A. Biological features
of genetic immunization. Vaccine, 15(8):788-791,
1997.
Davis H.L., Whalen R.G., Demeneix B.A. Direct
gene transfer in skeletal muscle in vivo: factors
affecting efficiency of transfer and stability of expression.
Hum. Gene Ther., 4:151-156, 1993.
Jones D.H., Corris S., McDonald S., Clegg J.C.S.
and Farrar G.H. Poly(DL-lactide-co-glycolide)-encapsulated
plasmid DNA elicits systemic and mucosal
antibody responses to encoded protein after oral
administration. Vaccine, 15(8):814-817, 1997.
Lima K.M. & Rodrigues Júnior J.M. Poly-DLlactide-co-glycolide
microspheres as a controlled
delivery system. Braz. J. Med. Biol. Res., 32(2): 171-
180, 1999.
Lowrie DB, Tascon RE, Bonato VL, Lima VM,
Faccioli LH, Stavropolous E., Colston MJ, Hewinson
RG, Moelling K, Silva CL. (1999) Therapy tuberculosis
in mice by DNA vaccination. Nature 400:269-
271
Preis I, Langer RS (1979) A single-step immunization
by sustained antigen release. J Immunol
Methods. 28(1-2):193-7.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 13

WWW.BIOTECNOLOGIA.COM.BR
REPETE FOTOLITO
14 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

CARGILL
REPETE FOTOLITO
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 15

Análise Diagnóstica de um
PESQUISA
Produto Transgênico
Pedro C. Binsfeld
Institute of Agricultural Botany
Rheinische Friedrich-Wilhelms-University of Bonn
Physiology and Biotechnology of Plants
Ulp50b@uni-bonn.de
Foto cedida pelo autor
O CASO DO TOMATE FLAVR SAVR
biotecnologia rejuvenesceu
com a revolução
da engenharia genética.
Durante a última
década do século XX,
inúmeros produtos biotecnológicos
deixaram de ser uma promessa
para se tornar uma realidade do
Figura 1. Representação
esquemática
do vasto pool
gênico e métodos
de melhoramento
aplicados na transferência
de genes
entre espécies em
programas de melhoramento
de
plantas
nosso cotidiano. Entre esses, incluemse
inúmeros produtos usados na medicina,
no processamento industrial, na
produção de alimentos e na agricultura
(Tabela 1). Entre os produtos da engenharia
genética consolidados encontramse
quase que exclusivamente os controlados
por genes únicos, isto é, por monogenes.
Porém, o grande desafio da nova
era da engenharia genética para o início
do próximo milênio será o controle de
processos ou rotas metabólicas que envolvam
genes múltiplos,
abrindo-se, assim, uma
nova página na evolução
dessa tecnologia, bem
como a possibilidade de
gerar produtos inovadores.
O melhoramento de
plantas agrícolas é obtido
por meio do acúmulo de
genes que conferem maior
produtividade e qualidade
aos produtos agrícolas,
assim como conferem
maior tolerância a fatores
de estresses bióticos e abióticos.
Para alcançar esse
objetivo, os melhoristas
lançam mão de complexos
sistemas de cruzamentos
e retrocruzamentos
quando os genes de interesse
localizam-se na mesma
espécie. Porém, quando
os genes de interesse
encontram-se fora do pool
gênico primário da espécie,
a engenharia genética
oferece as ferramentas básicas
para identificar, selecionar,
isolar e transferir
genes específicos escolhidos
dentro de um vasto
pool gênico englobando um amplo espectro
de seres vivos como fonte de
genes (Figura 1).
Plantas transgênicas caracterizam-se
16 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

por possuir um ou mais genes provenientes
de um pool gênico mais distante. Pelo
uso dessa tecnologia espera-se produzir
novos produtos ecologicamente sustentáveis,
mais produtivos, com superior
qualidade e que sejam capazes de colaborar
na solução da falta nutricional dos
mais de 1,5 bilhão de pessoas no mundo,
que sofrem de subnutrição (Malik, 1999),
bem como, reduzir substancialmente a
agressão ao meio ambiente (Sachse, 1998).
Porém, antes que produtos de plantas
transgênicas cheguem ao mercado consumidor,
a legislação prevê que esses
sejam analisados sob diversos aspectos,
garantindo seguridade para o homem,
animais e meio ambiente. Tais análises
envolvem inúmeros testes bioquímicos,
fisiológicos, alimentares, testes de impacto
ambiental e, finalmente, testes de campo.
Desde 1986, após os primeiros testes
de campo com plantas transgênicas, já
foram realizados testes de campo com
mais de 40 espécies de culturas agrícolas
transformadas, em 31 países (Bilang. &
Potrikus, 1997). Desde que se iniciou o
uso comercial de plantas transgênicas
nos EUA, em meados da década de 90,
tem-se tido um crescimento médio de
20% ao ano na oferta de novos produtos
provenientes da engenharia genética
(Kleinmann, 1998).
Por meio da engenharia genética de
plantas, pode-se alterar importantes rotas
metabólicas e, com isso, promover a
alteração no tipo e composição de amido,
óleos, proteínas, vitaminas, etc. Com
essas modificações objetiva-se: 1) elevar
o valor nutricional dos alimentos, 2)
melhorar o processamento industrial e a
comercialização dos produtos, 3) desenvolver
plantas transgênicas que funcionem
como bioreatores, onde seja possível
produzir polipeptídios de valor farmacêutico,
como, por exemplo, vacinas
na forma de antígenos de vírus ou anticorpos,
e 4) produzir inúmeras enzimas
(proteínas) para fins industriais. A lista de
áreas de aplicação dessa tecnologia poderia
ser significativamente estendida.
Porém, para efeitos concretos, analisaremos
a seguir um produto de engenharia
genética (Tomate-FLAVR SAVR) sob o
aspecto da segurança alimentar.
O caso do tomate FLAVR SAVR
O tomate denominado de FLAVR
SAVR, modificado pela engenharia genética,
produzida pela empresa Calgene,
EUA, foi liberado pela USDA para ser
comercializado desde 1994 (Schlüter &
Potrikus, 1997). O objetivo da empresa
foi produzir um tomate que durante a
maturação amolecesse vagarosamente.
Assim, em vez de colher os frutos verdes,
Figura 2. Frutos de tomate convencional
em avançado processo de
maturação (esquerda), frutos do
tomate FLAVR SAVR, com desacelerado
processo de amolecimento
(direita)
esses poderiam permanecer na planta
para maturar até ficarem vermelhos. Isso
melhoraria a qualidade dos frutos sem
que implicasse perdas na colheita, no
transporte e no armazenamento, uma vez
que os frutos vermelhos e firmes, em sua
consistência, assemelham-se aos que são
colhidos verdes.
Variedades de tomate que produzam
frutos firmes podem ser obtidas também
pelos métodos tradicionais de melhoramento.
Porém, até o momento, não foi
possível transferir o gene de plantas silvestres
para a cultura sem que houvesse
também a transferência de inúmeros caracteres
indesejáveis. A engenharia genética
tem sido usada como ferramenta
auxiliar no melhoramento de espécies
vegetais, por oferecer elevada precisão
na transferência de um ou mais genes,
oriundos da própria ou de outra espécie,
sem que haja perda das características
desejáveis da espécie transformada, obtendo-se
assim o somatório de caracteres
desejáveis.
O amolecimento do fruto do tomate
na maturação é causado pela presença e
ação de uma enzima denominada poligalacturonase
(PG). Essa enzima degrada a
pectina, que é um importante componente
da parede celular de frutos imaturos.
Durante a maturação, o amolecimento
dos frutos é diretamente proporcional
à presença e ação dessa enzima, assim o
processo do amadurecimento pode ser
retardado se essa enzima for freada (Figura
2). Para essa finalidade, isolou-se uma
cópia da seqüência gênica do tomate que
codifica para a PG e esta foi transferida
novamente para a planta no sentido invertido
(Antisenso). O gene antisenso da
PG foi ligado a um promotor constitutivo,
isto é, um promotor que está ativo continuamente.
Por esse processo, supõe-se
que a mRNA antisenso do gene da PG seja
anelado ao mRNA do gene da PG normal
do tomate e, assim, freie a síntese da
enzima PG (isto é, o produto gênico). O
mecanismo preciso desse processo não
está completamente elucidado, porém,
tem-se indicativos de que o mRNA seja
afetado em diferentes níveis, como na
estabilidade, na transcrição, no transporte
e na tradução.
Além do gene antisenso da PG, transferiu-se
também um gene marcador, que
facilita a identificação e a seleção das
plantas transgênicas. Como gene marcador
usou-se o gene nptII associado a um
promotor constitutivo. O gene nptII codifica
para a enzima fosforiltransferase
[APH(3’)II], também conhecida como
neomicina fosfotransferase II (NPT II),
que, pela fosforilação, inativa os antibióticos
do grupo aminoglicosídios (Neomicina,
Canamicina e Gentamicina) (Schlüter
& Potrikus, 1997). A construção gênica
compreendida pelo gene antisenso da
PG e o gene marcador foi transferida
mediante o vetor Agrobacterium tumefaciens.
A caracterização das plantas transgênicas
foi realizada por de análises moleculares
e testes de segregação gênica. Os
resultados mostraram que o número de
cópias do gene antisenso da PG e nptII
variava entre 2 a 6 cópias por planta
transformada. Os genes distribuiam-se
em diferentes regiões do genoma. Foi
observado também que os genes eram
transferidos para a progenie e segregavam
de acordo com as leis de Mendel
(Bilang & Potrikus, 1997; Schlüter & Potrikus,
1997).
A segurança do tomate transgênico,
bem como sua eqüivalência com as variedades
produzidas por métodos de melhoramento
convencional, tem sido questionada.
Na prática, no tomate transgênico
tem-se somente o gene nptII e o seu
produto gênico, a enzima NPT II, como
novo componente, pois o gene PG foi
isolado do próprio tomate e, depois,
inserido novamente em sentido contrário.
Mesmo assim, a transformação e a
introdução de genes no genoma receptor
podem provocar alterações genotípicas e
fenotípicas inesperadas, pois podem ocorrer
mutações pela integração de novos
genes, já que a integração de genes pode
ocorrer em regiões codificadoras, podendo-se
esperar que genes da planta receptora
sejam desativados (silenciados) ou
outros ativados pela inativação de genes
supressores. Mutações e efeitos pleiotrópicos,
causados pela integração gênica,
podem ser esperados quando se usa o
vetor Agrobacterium. Mutações e efeitos
pleiotrópicos, no entanto, não são exclusivamente
causados pelo evento da transformação,
mas também são verificados
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 17

em plantas criadas pelos métodos convencionais
de melhoramento (Kleinmann,
1998).
Um critério de avaliação de plantas
transgênicas é a identificação de caracteísticas
atípicas (mutações). Essas, podem
originar-se da técnica de cultura de tecidos
ou serem resultantes da transformação
genética. Plantas com anomalias são eliminadas,
mantendo-se somente plantas que
não exibem alterações fenotípicas, com
exceção da característica para a qual foi
feita a transformação da planta.
Avaliação
Em geral, tomates frescos são analisados
e testados para sabor, aroma, textura e
cor, enquanto que produtos do tomate
(sucos, molho, polpa concentrada, etc.)
são avaliados para quantidade de carotenóides
(Pró-vitamina A e Licopeno), vitamina
C, composição total de sólidos solúveis,
teor de açúcar, teor de ácidos (citrato
e malato), assim como a viscosidade e a
consistência. A viscosidade é, em grande
parte, função da concentração de moléculas
de pectina, enquanto que a consistência
depende da quantidade e estruturação
dos sólidos solúveis. No tomate transgênico,
adicionalmente foram analisados os
seguintes componentes: gordura, proteínas,
tiamina, riboflavina, vitamina B6, ácido
nicotínico, cálcio, magnésio e fósforo,
como também a presença de potenciais
toxinas, como os glicoalcalóides tomatina
e solanina. De acordo com a análise dos
componentes do FLAVR SAVR, não ocorreram
alterações na composição nutricional
(Tabela 2), exceto as já esperadas na
degradação da pectina. Devido a ação do
gene antisenso PG no tomate transgênico,
tanto o mRNA quanto a atividade enzimática
da PG foram freados em 90-95%. Com
essa redução da atividade da PG, obtevese
um processo desacelerado da degradação
da pectina no fruto. Isso implicou
numa maior conservabilidade (Figura 2),
aumento do rendimento, melhorou o processamento
industrial e aumentou a tolerância
a patógenos (Schlüter & Potrikus,
1997).
Comparando o sabor do tomate transgênico
com o do tomate convencional,
não foi constatada nunhuma alteração
quando estes foram colhidos no mesmo
estádio de maturação. Para os glicoalcalóides
(tomatina e solanina) não se constatou
diferenças em relação ao tomate convencional.
A variação constatada entre diferentes
frutos de uma mesma planta foi devido
a diferença no grau de maturação dos
frutos. Em frutos verdes, o teor desses
glicoalcalóides chega a miligramas, enquanto
que em frutos maduros, devido a
presença da enzima tomatinase, o teor
encontrado foi da ordem de microgramas
(Redenbaugh et al. 1994).
A toxicidade da enzima NPT II foi
testada para verificar se esta não poderia
representar um risco à saúde, mesmo que
ela não tenha parentesco com proteínas
tóxicas. No cotidiano, estima-se que cada
pessoa ingira juntamente com saladas e
verduras cruas, até 1,2x10 6 bactérias resistentes
à canamicina que possuem essa
enzima. A NPT II é liberada pela morte e
lise bacteriana no trato digestivo humano,
assim como acontece pela ingestão
de um tomate transgênico. Porém, para
verificar o que acontece com a enzima
NPT II, simulou-se uma digestão ácida
(estômago) e alcalina (intestino). Tomou-se
a enzima NPT II purificada e
submeteu-a ao suco estomacal. Neste, a
NPT II foi destruída após 2 minutos de
incubação, enquanto que, no suco intestinal,
a ação proteolítica foi um pouco
mais lenta e a proteólise da NPT II deuse
em 5 minutos (Schlüter & Potrikus,
1997).
Na seqüência, testou-se a enzima ativa
e purificada na alimentação de camundongos,
onde ministrou-se uma dose
única de 150 mg da enzima NPT II. Essa
dose representa o conteúdo enzimático
de mais de 1 milhão de tomates transgênicos.
Nos 7 dias subseqüentes ao tratamento,
não ocorreram mortes ou alterações
de comportamento dos camundongos.
Igualmente, não puderam ser verificadas
alterações de peso ou indícios
patológicos nos órgãos dos animais. Paralelamente
ao experimento anterior,
conduziu-se outro experimento, onde
tratou-se ratos com tomate transgênico
durante 28 dias. A dosagem de tomates
ingerida pelos ratos representaria para o
homem o consumo de, aproximadamente,
100 tomates por dia. Também nesse
caso, não foram constatados efeitos negativos
da enzima NPT II sobre os animais.
Essa enzima não possui homologia
com alergênicos conhecidos, além disso,
faltam à NPT II as típicas características
dos alergênicos, tais como, estabilidade
ao calor e estabilidade contra atividade
proteolítica das enzimas digestivas.
Freqüentemente, questiona-se se a
atividade antibiótica seria reduzida ou
inativada com o consumo de produtos
transgênicos que contenham NPT II, no
caso de um tratamento com canamicina e
neomicina. Mesmo que o consumo do
tomate fosse elevado, pela rápida atividade
proteolítica no trato digestivo, a presença
dessa enzima seria muito baixa, de
modo que o risco nesse caso, pode ser
descartado. Um eventual risco, porém
reduzido, poderia ocorrer se o antibiótico
fosse consumido juntamente com o
tomate transgênico. Porém, para isso seriam
necessárias condições ideais como: 1)
toda a enzima NPT II deveria estar livre no
suco gástrico, 2) deveria ter disponibilidade
suficiente de ATP no meio e 3) o suco
gástrico deveria estar tamponado em pH
7,0, o que na prática é irreal (Schlüter &
Potrikus, 1997).
Via de regra, administra-se, por via
oral, os antibióticos do grupo aminoglicosídios
a pacientes nos casos de encefalopatia
sistêmica e de cirurgia de intestino.
Neste último caso, é improvável que o
paciente ingira alimentos sólidos antes da
intervenção cirúrgica, portanto, não haveria
risco de inativação da canamicina. No
caso da encefalopatia sistêmica, a inativação
da neomicina, segundo cálculos, poderia
ser, no máximo, de 1,5% se o paciente
ingerisse tomate transgênico juntamente
com o antibiótico (Redenbaugh et al. 1994).
Outra preocupação freqüentemente
mencionada é se poderia haver a transferência
do gene nptII da planta transformada
para bactérias do trato digestivo ou
bactérias patogênicas. Cálculos de probabilidade
mostraram que tal evento, por
várias razões, é muito raro. Isso porque o
local da provável transformação seria na
parte posterior do intestino delgado (íleo)
e do intestino grosso (cólon), onde se
encontra uma quantidade enorme de bactérias.
Nesse ponto, os alimentos chegam
digeridos e o DNA fragmentado. Porém, a
concentração de DNA que estaria disponível
nesse local é mínima, uma vez que, 10
minutos no suco estomacal e mais 10
minutos no suco intestinal as extensas
moléculas de DNA são degradadas em
pequenos fragmentos, onde mais de 99,99%
destes são menores que 1 kb, tamanho
correspondente ao tamanho do gene nptII.
Fragmentos menores poderiam ser integrados
ao genoma, mas não resultariam em
uma seqüência capaz de produzir uma
enzima ativa. Isso mostra que a quase
totalidade do DNA do tomate transgênico é
destruído no trato digestivo, não havendo,
portanto, risco de transferência por essas
vias.
Especula-se também que o gene nptII
possa ser integrado ao genoma de células
humanas, como, por exemplo, em células
epiteliais do intestino. Para esse aspecto,
não há pesquisas acabadas. Porém, a probabilidade
de que isso ocorra é infinitamente
reduzida. Primeiro, porque, habitualmente,
células eucarióticas não tendem a
integrar genes estranhos e essas possuem
nucleases próprias que destroem DNA estranho
que venha a penetrá-las. Segundo,
a maior parte da alimentação que ingerimos
é composta por genes e não se tem
conhecimento de que, por isso, tenham-se
introgredido novos genes nas células epiteliais
do intestino. Terceiro, a vida média
18 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

de células epiteliais do intestino é relativamente
curta. Se ocorresse o caso de uma
eventual transferência, a probabilidade de
que esse gene se estabilizasse seria pouco
provável, porque a célula já estaria em
processo de morte. Porém, supondo que
houvesse transferência e expressão do
gene nptII na célula humana, isso não
levaria a uma nova característica, já que as
células humanas, naturalmente, já possuem
elevada resistência à canamicina e à
neomicina. Caso contrário, não poderíamos
tomar esses antibióticos (Redenbaugh
et al. 1994, Schlüter & Potrikus, 1997).
Conclusão
Conforme fica transparente para o produto
transgênico aqui analisado, o risco
pelo consumo humano ou animal não é
significante. Porém, essa não é uma afirmativa
que vale para todos os produtos da
engenharia genética. Assim, como se analisou
o tomate ’’FLAVR SAVR’’, é necessário
que todos os produtos transgênicos
sejam examinados, avaliados e julgados,
caso a caso, tendo em vista a sua finalidade
benéfica e que, em concordância com a
legislação e baseados nos preceitos éticos,
morais, sócio-econômicos e de segurança
ambiental, venham garantir vantagens ao
consumidor e ao processo produtivo, sem
que, no entanto, se ponha em risco a vida
e sua evolução como processo dinâmico e
multivariável.
Bibliografia
Bilang, R. & Potrikus, I. Pflanzenzüchtung.
In: Gassen, H.G. & Hammes,
W.P. Handbuch Gentechnologie Lebensmittell.
1ºAuflage. Hamburg - Behr Verlag,
1997.
Kleinmann, K. Gentechnik im Lebensmittelbereich.
In: Matissek & Reinhould
(ed.) Lebensmitttelchemische Gesellschaft.
1º Auflage - Hamburg - Behr Verlag, 1998.
Malik, V.D. Biotechnology: Multibilion
Dollar Industry. In: Chopra, V.L., Malik,
V.D. & Bhat S.R. Applied plant biotechnology.
Science Publishers, Inc. USA, 1-69,
1999.
Redenbaugh, K., Hiatt, W., Martineau,
B., Lindemann, J. & Emlay, D. Aminoglycoside
3’-prosphotransferase II
(APH(3’)II): review of ist safety and use in
the production of genetically engenered
plants. Food Biotechnology 8, 137-165,
1994.
Sachse, L. Gentechnik im Lebensmittelbereich.
In: Matissek & Reinhould (ed.)
Lebensmitttelchemische Gesellschaft. 1º
Auflage - Hamburg - Behr Verlag, 1998.
Schlüter K. & Potrikus I. Anwendungsbeispiele
für die Gentechnik bei Lebensmitteln,
transgene Nutzpflanzen. In: Gassen,
H.G. & Hammes, W.P. Handbuch
Gentechnologie Lebensmittell. 1º Auflage,
Hamburg - Behr Verlag, 1997.
Tabela 1. Alguns exemplos de produtos obtidos através da engenharia genética
que já são amplamente utilizados no cotidiano (Kleinmann, 1998; Sachse, 1998,
Malik, 1999)
Tipo de produto
Insulina humana
Vacina anti-Hepatite B
Alteplase
Interferon- α−2b
Fator anti-hemofílico
Hormônio do crescimento humano
Interferon-β
Culturas agrícolas
Tomate
Canola
Milho
Batata
Soja
Algodão
Aplicação industrial
Detergentes e sabão em pó
Produção de papel
Produção de sucos e vinhos
Produção de queijos
Produção de álcool
Indicação de uso
Diabetes
Prevenção da hepatite B
Prevenção de infarto do miocárdio
Tratamento da leucemia
Hemofilia A
Deficiência de crescimento
Tratamento de esclerose múltipla
Fenótipo verificado
Maturação retardada
Alteração da composição do óleo
Resistência a insetos
Resistência a viroses
Tolerância a herbicidas
Tolerância a herbicidas
Tipo de enzimas
Com protease, lipase, celulase, amilase
Lipases
Pectinase
Chimosina
Amilase e amiloglicosidase
Tabela 2. Comparação do tomate transgênico FLAVR SAVR e o tomate não
transgênico (Schlüter & Potrykus 1997)
Componentes Características Alteradas
Sabor
Coloração do fruto
Características de processamento
Viscosidade do suco
•
Características de produção
Resistência a doenças fúngicas
•
Amolecimento do fruto
•
Teor de toxina
Teor de proteínas
Teor de Vitamina A
Teor de Vitamina B 1
(Tiamina)
Teor de Vitamina B 2
(Riboflavina)
Teor de Vitamina C
Teor de ácido nicotínico
Teor de cálcio
Teor de magnésio
Teor de fosfato
Teor de sódio
Teor de ferro
Características Não Alteradas
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 19

PROTEÍNAS RECOMBINANTES
PRODUZIDAS EM LEVEDURAS
PESQUISA
Fernando Araripe Gonçalves Torres
PhD, Professor Adjunto do Departamento de Biologia
Celular da Universidade de Brasília.
ftorres@unb.br
Lídia Maria Pepe de Moraes
PhD, Professora Adjunto do
Departamento de Biologia Celular da
Universidade de Brasília
lmoraes@unb.br
Considerações sobre o uso de leveduras para a expressão de proteínas de interesse econômico
Fotos cedidas pelos autores
A levedura
Saccharomyces cerevisiae
As leveduras são fungos que têm sido
utilizados pelo homem há milhares de
anos e cuja manipulação causou um grande
impacto na produção de alimentos e,
por conseguinte, influenciando o próprio
processo de desenvolvimento sócio-econômico
da humanidade. O pão, a cerveja
e o vinho representam os produtos mais
expressivos do processo de manipulação
desses microrganismos ao longo do tempo.
Em todos esses processos, a levedura
Saccharomyces cerevisiae teve um papel
de destaque. Além de ser considerada um
dos microrganismos mais úteis ao homem,
essa levedura é um dos sistemas eucarióticos
mais bem conhecidos. Sua genética é
bem dominada e seu genoma foi totalmente
seqüenciado, fato este que representou
uma das maiores conquistas da Biologia
no século XX. Após o advento da tecnologia
do DNA recombinante, a levedura S.
cerevisiae pôde ser empregada em estudos
de genética molecular a partir do final dos
anos 70, quando ela foi geneticamente
transformada pela primeira vez. Desde
então, vários tipos de vetores moleculares
foram desenvolvidos, inclusive cromossomos
artificiais, mais conhecidos como YAC
(“Yeast Artificial Chromosomes”). Com a
obtenção de cepas de leveduras mutantes
foi possível o isolamento de genes de
outros organismos eucarióticos por complementação.
Nos últimos anos, foi desenvolvida
em S. cerevisiae uma das mais
sofisticadas abordagens para a identificação
de genes interativos. Trata-se de uma
técnica conhecida como sistema duplohíbrido
ou “two hybrid”, que propicionou
a identificação de vários genes envolvidos
em vias de transdução de sinal e no ciclo
celular.
No campo da pesquisa aplicada, a
levedura S. cerevisiae logo se destacou
como um interessante candidato para a
expressão de genes heterólogos de interesse
biotecnológico. Embora a bactéria
Escherichia coli represente uns dos mais
Figura 1: Mapa do plasmídio
pPIC9. Apenas os sítios de restrição
mais relevantes estão indicados.
5’AOX: região promotora do
gene AOX1; PS: peptídeo sinal do
fator α; T: região terminadora da
transcrição; HIS4: marca de seleção
para Pichia; 3’AOX: fragmento 3’
do gene AOX1; ColE1: origem de
replicação bacteriana; Amp: marca
de seleção para E. coli
poderosos sistemas de expressão heteróloga,
várias proteínas eucarióticas de interesse
comercial não puderam ser expressas
eficientemente nesse microrganismo.
Entre as razões para esses insucessos poderíamos
citar: conformação incorreta,
ausência de modificações pós-traducionais
e baixos níveis de expressão. Alguns
desses problemas puderam ser resolvidos
quando as mesmas proteínas foram expressas
em S. cerevisiae. O ambiente intracelular
da levedura é adequado para a
ocorrência de várias reações que normalmente
ocorrem em células de mamíferos.
Além do mais, S. cerevisiae goza do status
de microrganismo “GRAS” (Generally Recognized
As Safe”) o que é de suma
importância no que se refere à produção
de biofármacos por engenharia genética.
No entanto, várias proteínas humanas sofrem
hiperglicosilação quando secretadas
por S. cerevisiae o que será discutido mais
adiante.
A levedura metilotrófica
Pichia pastoris
Ao longo das últimas duas décadas,
outras leveduras têm sido apresentadas
como sistemas alternativos de expressão
por apresentarem vantagens sobre S. cerevisiae.
Entre esses novos sistemas, destacase
Pichia pastoris, uma levedura metilotrófica,
ou seja, que é capaz de crescer em
meio de cultura contendo metanol como
única fonte de carbono. O fato de crescer
até alta densidade celular em um meio
barato levou a empresa Phillips Petroleum
Company a propor o uso dessa levedura
como fonte de alimento (“single cell protein”
- SCP). Após constatar que o processo
de produção de SCP era inviável economicamente,
a empresa decidiu transformar P.
pastoris em um sistema de produção de
proteínas recombinantes.
A levedura P. pastoris apresenta duas
características que a tornam uma atraente
hospedeira para a produção de proteínas
heterólogas. A primeira, é o forte promotor
usado para transcrever genes heterólogos,
o qual é derivado do gene da álcool
oxidase (AOX1) de P. pastoris. Esse promotor
é regulado transcricionalmente por
metanol, um indutor relativamente barato.
Em células expostas a metanol como única
fonte de carbono, o início da transcrição
no promotor AOX1 é altamente eficiente e
comparável aos promotores derivados dos
genes altamente expressos da via glicolítica.
No entanto, ao contrário dos promoto-
20 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

es glicolíticos, o promotor AOX1 é firmemente
regulado e reprimido sob condições
de crescimento sem metanol. Uma
vez que a maioria das proteínas heterólogas
são de alguma forma deletérias para a
célula, quando expressas em altos níveis,
a habilidade de manter a cultura em um
estado reprimido ou desligado é altamente
desejável. Trata-se de uma importante precaução
para minimizar a seleção de mutantes
que não expressam o produto heterólogo
durante o crescimento da cultura.
Para ser ativado, o promotor AOX1 requer
a presença de metanol e, na ausência
desse indutor, ele se torna reprimido. Além
de metanol, o sistema AOX1 necessita da
ausência de glicose para ser plenamente
ativado. Uma vez que o promotor AOX1 é
controlado pela manipulação da fonte de
carbono adicionado ao meio de cultura, o
crescimento e a indução de cepas de P.
pastoris, que expressam proteínas heterólogas,
são facilmente obtidos em todas as
escalas, desde frascos até grandes fermentadores.
A segunda característica importante de
P. pastoris é que esta levedura não é
considerada uma forte fermentadora, como
S. cerevisiae. A fermentação realizada por
leveduras gera etanol, o qual, em culturas
de alta densidade, pode rapidamente atingir
níveis tóxicos (“efeito Crabtree”). Para
uma produção economicamente viável de
proteínas recombinantes a concentração
de proteínas no meio deve ser proporcional
à quantidade de células. É necessário,
pois, atingir níveis de alta densidade celular
os quais não são facilmente obtidos
com S. cerevisiae. Em contraste, as cepas
produtoras de P. pastoris são facilmente
cultivadas a densidades celulares de aproximadamente
100 g/L de peso seco, ou até
maiores.
Vários genes de diferentes procedências
(bactérias, fungos, invertebrados
, plantas e humanos) já foram expressos
em P. pastoris sob o controle do
promotor AOX1. A maioria dos genes
expressos tiveram seus produtos secretados
para o meio extracelular e alguns,
como o fator de necrose tumoral humano,
foi produzido no ambiente intracelular. Os
vetores de expressão em P. pastoris são
geralmente do tipo integrativo. Esses vetores
possuem um cassete de expressão
formado pelo promotor e pela região terminadora
de transcrição do gene AOX1
além de uma marca de seleção, sendo a
mais utilizada o gene histidinol desidrogenase
(HIS4) de P. pastoris. Essa marca
permite a seleção de transformantes prototróficos
His + a partir de uma linhagem
hospedeira his4. Um dos vetores mais
utilizados é o plasmídio pPIC9 (Figura 1)
desenvolvido e patenteado pela empresa
Invitrogen. O gene de interesse é clonado
Figura 2: Análise da expressão de
clones de P. pastoris (protease positiva)
transformada com o cassete de
expressão contendo a fusão α amilase-glucoamilase.
Os clones foram inoculados
em meio contendo amido
que foi, então, corado com vapor de
iodo após crescimento das colônias.
Notar os diversos tamanhos dos halos
de hidrólise que correspondem a clones
com diferentes números de cópias
do cassete de expressão
na região do cassete de expressão em um
dos sítios de clonagem que se localizam
logo após o sinal de secreção, nesse caso,
o peptídeo sinal do fator α de S. cerevisiae.
O cassete de expressão é liberado pela
digestão do plasmídio com a enzima de
restrição BglII, e uma cepa his4 de P.
pastoris é transformada por eletroporação.
Como em S. cerevisiae, o DNA linearizado
pode gerar transformantes estáveis quando
se integra no genoma por recombinação
homóloga. Esses transformantes podem
se originar pela integração do cassete
de expressão tanto no locus AOX1 quanto
no his4. No primeiro caso, pode haver uma
substituição completa do gene AOX1 pelo
cassete de expressão, o que resulta em um
fenótico denominado Mut s , caracterizado
por um crescimento lento na presença de
metanol. Ocasionalmente, o cassete de
expressão pode se integrar várias vezes no
locus AOX1, o que pode ser confirmado
por análise de “Southern blotting”. Outros
vetores, semelhantes ao pPIC9, não possuem
sinais de secreção e, portanto, são
empregados para a expressão intracelular.
Existem variantes do pPIC9 que não possuem
o sinal de secreção no cassete de
expressão sendo, portanto, ideais para
expressão intracelular.
Embora muito utilizados, os vetores
descritos anteriormente têm como desvantagens
o grande tamanho (cerca de 8 Kb)
e a presença de poucos sítios de restrição
para a clonagem do gene heterólogo. Há
uma família de vetores de P. pastoris que
contém o gene Sh ble, que confere resistência
à droga zeocina tanto em E. coli
quanto em P. pastoris. Embora esses vetores
sejam bem menores que o pPIC9, o
preço proibitivo da droga de seleção inibe
o uso desse sistema em escala industrial.
Recentemente, novos plasmídios com promotores
alternativos se tornaram disponíveis.
Esses vetores contêm o promotor
GAP, um forte promotor constitutivo derivado
do gene gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
(GAP). Em culturas crescidas
em glicose, os níveis de expressão obtidos
pelo promotor GAP são similares àqueles
obtidos com o promotor AOX1 em culturas
crescidas com metanol em frascos. Uma
das vantagens do promotor GAP com relação
ao promotor AOX1 é que, por ser
constitutivo, não é necessário mudar a
cultura de um meio para outro para induzir
expressão. No entanto, o uso do promotor
GAP é apropriado somente para genes
cujo produto não seja deletério para a
célula. Além do mais, os níveis de expressão
a partir do promotor AOX1 são geralmente
aumentados quando o metanol é
adicionado à culturas com taxas de crescimento
limitantes em fermentadores. O
mesmo fenômeno não é observado com o
promotor GAP.
Expressão heteróloga em
P. pastoris
Sendo P. pastoris um organismo eucariótico,
a produção de proteínas heterólogas
neste sistema é um processo mais
complexo do que em E. coli. Mesmo as
proteínas que são produzidas em P. pastoris
em concentrações acima de 1 g/L podem
apresentar, em frascos, níveis desapontadores
de produção inicial (menos de
1 mg/L). A geração de uma linhagem
produtiva requer um grande esforço de
investigação para se controlar os fatores
que possam limitar a produção da proteína
heteróloga, assim como desenvolver estratégias
para otimização da produção. Para a
detecção de baixos níveis de expressão,
um fator chave para a obtenção de um
linhagem de P. pastoris produtiva é a
disponibilidade de anticorpos específicos
para a proteína heteróloga de interesse. É
aconselhável que a seleção de clones
prototróficos que expressam a proteína de
interesse deva ser iniciada pela detecção
imunológica do mesmo. Essa etapa permite
selecionar clones expressando a proteína
heteróloga em diversos níveis, o que
poderia implicar a existência de clones
com diversos números de cópias integradas
do gene de interesse.
A maioria das proteínas secretadas
por P. pastoris são glicosiladas, o que
pode ou não afetar a atividade biológica da
proteína recombinante. A glicosilação é
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 21

uma modificação pós-traducional que ocorre,
primeiramente, no retículo endoplasmático
e, posteriormente, no aparelho de
Golgi. Observou-se que o tamanho da
cadeia de carboidratos adicionados por P.
pastoris é bem menor que aquele adicionado
por S. cerevisiae. A estrutura destes
oligossacarídeos é muito similar à adicionada
em mamíferos e, por não ser capaz de
adicionar manoses terminais com ligações
α-1,3, como S. cerevisiae, as proteínas
produzidas em P. pastoris são menos imunogênicas.
Todavia, se a glicosilação não é
desejada, as proteínas de interesse devem
ser produzidas intracelularmente. Algumas
proteínas expressas em P. pastoris
apresentaram um núcleo de glicosilação
pequeno, como no caso da invertase de S.
cerevisiae. Outras, como a proteína gp120
do HIV, apresentaram um padrão de glicosilação
semelhante ao obtido em S. cerevisiae.
Ainda não está claro porque a algumas
proteínas são adicionadas cadeias
externas longas de carboidratos e a outras
apenas o núcleo central.
A levedura P. pastoris ganhou grande
aceitação com organismo hospedeiro para
a produção de proteínas heterólogas de
interesse farmacológico. Entre essas proteínas,
destacam-se: a albumina sérica humana
- que já esta em testes clínicos para
seu uso como produto de substituição de
plasma -, e o antígeno de superfície da
hepatite B - que foi aprovado para se fazer
uma vacina contra esse vírus. Em nosso
laboratório, temos empregado o sistema
de expressão em P. pastoris para a expressão
de várias proteínas de interesse biotecnológico.
Algumas proteínas recombinantes
serão utilizadas para fins farmacêuticos
e outras para processos de conversão de
biomassa. Dentre as proteínas já expressas
por nosso grupo, destacam-se: 1) α-amilase
de Bacillus subtilis (sozinha ou fusionada
a uma glicoamilase de Aspergillus awamori);
2) um fragmento de anticorpo (scFv)
anti-Z-DNA; 3) celobiohidrolase I.2 de
Humicola grisea var thermoidea.. No caso
da proteína de fusão formada pelo gene da
α-amilase de Bacillus subtilis e o cDNA da
glicoamilase de Aspergillus awamori, a
expressão foi realizada em duas linhagens
de P. pastoris: uma protease negativa e a
outra protease positiva. Os resultados preliminares
mostraram que a melhor condição
de expressão foi obtida quando a
linhagem protease positiva foi usada e
quando 3 cópias em sequência haviam
sido integradas (Figuras 2 e 3). Aparentemente,
o uso da linhagem protease negativa
não é o ideal quando a expressão
ocorre em altos níveis devido à necessidade
de processamento pós-traducional da
proteína de fusão. Por outro lado, no caso
da expressão do fragmento de anticorpo
scFv, o melhor resultado foi obtido com
uma linhagem protease negativa já que a
proteína recombinante mostrou ser suscetível
à ação das proteases produzidas
por P. pastoris. Como no caso da proteína
de fusão, a expressão da clobiohidrolase
I.1 de Humicola grisea var. thermoidea, o
melhor resultado foi obtido com uma linhagem
protease positiva. Experimentos
preliminares demonstraram baixos níveis
de expressão em frasco (cerca de 10 mg/
L para a fusão e 1 mg/L para o fragmento
scFv). No entanto, o rendimento poderá
ser sensivelmente maior quando as condições
de expressão em fermentador forem
ajustadas.
Figura 3: Expressão da fusão α amilase-glucoamilase
em cepas de P. pastoris
protease negativa (SMD) e protease
positiva (GS115) em meio contendo
amido. Após crescimento das células, a
placa foi corada com vapor de iodo.
GS115-C: cepa GS115 transformada com
cassete de expressão sem a fusão;
Fαg41 e Fαg38: cepa GS115 com 3
cópias da fusão; Fαg14: cepa GS115
com 1 cópia da fusão; SDM-C: cepa
SMD transformada com cassete de expressão
sem a fusão; SMD-Mut + e SMD-
Mut s : cepa SMD com 3 cópias da fusão
Perspectivas futuras
Com a finalidade de reduzir os custos
das etapas “downstream” de produção de
proteínas recombinantes a partir de P.
pastoris, estamos construindo novos vetores
que possibilitem a rápida purificação
da proteína de interesse. Estamos também
desenvolvendo novas estratégias que permitam
a co-expressão de duas subunidades
protéicas que formariam, então, uma
proteína heterodimérica funcional. Essa
estratégia seria útil para a expressão de
alguns hormônios proteicos. A longo prazo,
pretendemos isolar, a partir da biodiversidade
do cerrado, novas espécies de
levedura que possam ser empregadas como
hospedeiras alternativas para expressão
heteróloga. Esses novos sistemas poderão,
eventualmente, reduzir os custos de produção
com o pagamento de royalties ao
exterior quando são utilizados sistemas de
expressão já patenteados.
Referências bibliográficas
Barr, K. A., Hopkins, S. A. & Sreekrishna,
K. (1992). Protocol for efficient secretion
of HSA developed from Pichia pastoris.
Pharmaceutical Engineering 12: 48-51.
Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler,
ªY. & Madden, K. R. (1985). Pichia pastoris
as a host system for transformants. Molecular
Cell Biology 5: 3375-3385.
Cregg, J. M., Tschopp, J. F., Stillman,
C., Siegel, R., Akong, M., Craig, W. S.,
Buckholtz, R. G., Madden, K. R., Kellaris,
P.ª, Davis, G. R., Smiley, B. L., Cruze, J.,
Torregrossa, R., Velicelebi, G & Thill, G. P.
(1987). High-level expression and efficient
assembly of hepatites B surface antigen
in the methilotrophic yeast Pichia
pastoris. Bio/Technology 5: 479-485.
Cregg, J. M., Vedvick, T. S. & Raschke,
W. C. (1993). Recent advances in the
expression of foreign genes in Pichia
pastoris. Bio/Technology 11: 905-910.
Cregg, J. M. (1999). Expression in the
methylotrophic yeast Pichia pastoris. Em
“Gene Expression Systems”, ed. Joseph M.
Fernandez & James P. Hoeffler, Academic
Press, ISBN 012253840-4.
Higgins, D. R. & Cregg, J. M. (1998).
Pichia Protocols: Methods in Molecular
Biology, Human Press, Totawa, N. J.
Moraes, L.M.P., Astolfi-Filho, S. & Oliver,
S.G. (1995). Development of yeast
strains for the efficient utilization of starch:
evaluation of constructs that express α-
amylase and glucoamylase separately or
as bifunctional fusion proteins. Applied
Microbiology Biotechnology 43:1067-1076
Scorer, C. A., Buckholz, R. G., Clare,
J.J. & Romanos, M. A. (1993). The intracelular
production and secretion of HIV-1
envelope protein in the methylotrophic
yeast Pichia pastoris. Gene 136: 111-119.
Siegel, R. S. & Brierley, R. A. (1989).
Methylotrophic yeast Pichia pastoris produced
in high-cell-density fermentations
with high cell yields as vehicle for recombinant
protein production. Biotechnology
Bioengineering 34: 403-404.
Sreekrishna, K., Nelles, L., Potenz, R.
Cruze, J., Mazzaferro, P., Fish, W. Fuke,
M., Holden, K., Phelps, D., Wood, P. &
Parker, K. (1989). High-level expression
purification, and characterization, of recombinant
human tumor necrosis factor
synthesized in the methylotrophic yeast
Pichia pastoris. Biochemistry 28: 4117-
4125.
Waterham, H. R., Digan, M. E., Koutz,
P. J., Lair, S. L. & Cregg, J. M. (1997).
Isolation of the Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase gene
and regulation and use of its promoter.
Gene 186: 37-44.
22 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

NOVARTIS
REPETE FOTOLITO
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 23

BIOMONITORAMENTO DE
MUTAGÊNESE AMBIENTAL
PESQUISA
Renata Maria Augusto da Costa
Aluna do programa de doutorado do
Depto. de Biologia/Genética
Instituto de Biociências/USP
recosta@usp.br
Carlos Frederico Martins Menk
Professor titular do
Depto. de Microbiologia
Instituto de Ciências BiomédicasII/USP
cfmmenck@usp.br
Emprego de plantas transgênicas em mutagênese ambiental
Fotos cedidas pelos autores
s organismos vivos estão
freqüentemente
expostos a agentes
ambientais que podem
induzir modificações
químicas no
DNA, a molécula responsável pela informação
genética das células. As lesões
no DNA podem ser induzidas por
agentes químicos, provenientes do meio
ambiente ou resultantes de reações
químicas que ocorrem nas próprias
células; ou ainda por radiações, tais
como a luz ultravioleta (UV) e raios-X.
Estas modificações na estrutura do DNA
são prejudiciais às células, uma vez
que podem prejudicar processos vitais,
tais como a duplicação do DNA e a
transcrição gênica. Elas também podem
causar mutações e aberrações
cromossômicas, fenômenos estes que
podem levar ao desenvolvimento de
processos cancerosos e morte celular.
Pelo fato de causarem lesões no material
genético e potencialmente gerarem
tumores em seres humanos, esses agentes
são normalmente conhecidos como
genotóxicos ou carcinogênicos. A presença
de produtos químicos carcinógenos
no meio ambiente vem sofrendo
um crescente aumento, devido à atividade
humana, tanto rural e industrial,
quanto urbana . A detecção destes
produtos e seus prováveis efeitos nos
organismos é importante no estudo do
impacto que eles podem trazer às
populações animal, vegetal e humana.
Uma boa alternativa no emprego de
bioindicadores é a utilização de organismos
fenotipicamente mais sensíveis
às lesões no DNA. O objetivo do nosso
trabalho tem sido a obtenção de um
indicador vegetal sensível à uma grande
variedade de produtos lesivos ao
DNA.
Figura 1-
Arabidopsis thaliana
adulta
O organismo estudado foi Arabidopsis
thaliana (figura 1), que apesar de não
ser nativa da flora brasileira e não apresentar
interesse econômico, é ideal para
estudos em laboratório. O pequeno porte,
a alta produção de sementes (cerca
de 10.000 por indivíduo) e o rápido ciclo
de vida de cinco semanas facilitam a
análise genética e a identificação de
mutantes.
Para a obtenção de uma planta mais
sensível, optamos pelo emprego de
uma variedade que apresentasse alteração
em alguma via de reparo das
lesões no DNA. Todos os organismos
vivos apresentam mecanismos que reparam,
revertem, ou simplesmente toleram
a persistência da lesão. O reparo
por excisão de nucleotídeos (NER- nucleotide
excision repair) é uma via de
reparo geral, que reconhece e remove
lesões que distorcem a dupla hélice em
um processo multi-enzimático (para
revisão, Petit and Sancar, 1999). Após o
reconhecimento, o segmento de DNA
ao redor da lesão é removido (~30
nucleotídeos), formando uma lacuna
que é preenchida por meio da polimerização
de uma nova fita, usando como
molde a fita não danificada e sua posterior
ligação (veja figura 2). Devido à
esta atuação bastante abrangente, optamos
pela obtenção de uma planta
deficiente no reparo por excisão de
nucleotídeos.
A obtenção dessa planta não é uma
tarefa fácil, uma vez que o estudo do
reparo de DNA em plantas está apenas
começando a despertar interesse científico
recentemente Vornarx et al., 1998;
Britt, 1999). Desta forma, iniciamos a
clonagem de genes envolvidos nesta
via em Arabidopsis thaliana. Para isso,
escolhemos uma proteína de função
essencial na remoção de lesões no
DNA e bastante conservada entre diferentes
organismos. Essa proteína é uma
helicase, componente do fator de transcrição
da RNA polimerase II, denominada
XPB (veja figura 2). A proteína
vegetal deduzida a partir da seqüência
de DNA clonado por nós (atXPB1)
apresentou cerca de 50% de homologia
com as proteínas humana e de levedura
(Ribeiro et al., 1998). Entretanto,
24 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

diferindo de outros organismos,
a proteína vegetal
está representada em duas
cópias gênicas, expressas
em todos os tecidos e todas
as fases do desenvolvimento.
A ação da proteína vegetal
atXPB1 na remoção de
lesões no DNA foi inicialmente
verificada por meio
de ensaios de complementação
em leveduras mutantes
para o gene rad 25,
homólogo à XPB. Após exposição
à doses crescentes
de luz UV, as leveduras que
expressavam a proteína
vegetal apresentaram significativo
aumento no nível
de sobrevivência. Este resultado
sugere que atXPB1
atua na remoção das lesões
induzidas por UV.
Após a primeira indicação
de que a proteína clonada
estaria, de fato, envolvida
no reparo por excisão
de nucleotídeos, prosseguiu-se
o estudo através da
obtenção de uma planta
mutante transgênica para
esse gene, e portanto, mais
sensível aos compostos genotóxicos.
Para a obtenção de mutantes,
a metodologia mais
utilizada em organismos animais
e em leveduras é a
inserção de um fragmento
de DNA conhecido no gene
de interesse. Entretanto, essa
mutagênese dirigida ainda
não é possível em plantas, uma vez que
requer recombinação somática, a qual é
quase inexistente em células vegetais
(Leehan e Feldmann, 1997). Dessa forma,
a integração de um DNA de transferência
(T-DNA) é um sistema alternativo
para mutagênese em A.thaliana. O T-
DNA é o segmento de um plasmídeo
indutor de tumorogênese de Agrobacterium
tumefaciens, delimitado por seqüências
de repetições imperfeitas. Como
mostrado na figura 3, o T-DNA, incluindo
qualquer seqüência inserida entre as
bordas, pode ser transferido por meio de
Agrobacterium às células vegetais e ser
inserido aleatoriamente no genoma. Vale
lembrar que nesta metodologia a seqüência
de T-DNA foi modificada geneticamente
através da eliminação do promotor
de tumorogênese. No lugar desta
seqüência indutora de tumores, está
presente um marcador de resistência ao
Figura 2- Modelo para o reparo
por excisão de nucleotídeos (NER)
em eucariontes. Em amarelo são
representados os componentes
desta via de reparo já identificados
em plantas
antibiótico que permite a seleção de
plantas transformadas.
Nós empregamos uma biblioteca de
Arabidopsis thaliana com cerca de 30.000
plantas contendo, em média, 1,5 insertos
independentes por genoma (gentilmente
cedida por D. Bouchez). A identificação
da planta contendo o gene atXPB1
interrompido foi feita por meio de triagem
via PCR (polymerase chain reaction,
ou reação em cadeia por polimerase,
técnica que permite amplificação de
seqüências específicas de DNA). A escolha
dos iniciadores utilizados foi muito
importante para o sucesso da
seleção e está esquematizado
na figura 4. Foram desenhados
oligos para o gene atX-
PB1 distantes entre si cerca de
1 Kpb, o que permitiu uma
total cobertura do DNA genômico
durante a triagem. Nas
reações de PCR foram empregados
pares de iniciadores
correspondentes ao gene em
questão e às bordas do T-
DNA inserido. A identificação
da planta contendo o gene
interrompido foi realizada gradativamente,
partindo de “hiper
pools” com cerca de 750
plantas, reduzindo o número
de plantas na amostra testada
até a obtenção da planta positiva.
A confirmação da disrupção
do gene atXPB1 foi
obtida após o sequenciamento
de bases do fragmento gerado
na reação de PCR. Como
pode ser visualizado na figura
5, este está localizado na extremidade
do último domínio
de helicase da proteína, o que
provavelmente resulta em perda
da atividade enzimática.
Após a obtenção da planta
mutante para o gene de
reparo atXPB1 foram iniciados
os primeiros testes de
sensibilidade a agentes genotóxicos.
A sensibilidade da
planta mutada foi testada para
o agente químico metilante,
metil metano sulfonato (MMS),
que lesa o DNA por inserção
de um grupo metila nas bases
nitrogenadas dessa molécula. O tratamento
foi realizado em plântulas de
cinco dias e, após alguns dias, as plântulas
mutantes apresentaram sensível redução
no crescimento em doses baixas
do agente químico. Em doses superiores
de MMS, as plântulas mutantes apresentaram
porcentagem de sobrevivência
muito inferior às plântulas selvagens
(figura 6). Esse resultado sugere que a
planta mutante para atXPB1 apresenta
deficiência na remoção das lesões no
DNA, resultando em uma maior sensibilidade
aos agentes genotóxicos.
Os dados apresentados indicam que
dispomos de uma planta que pode servir
de modelo como bioindicadora na detecção
de mutagênese ambiental. O fato
desta planta estar adaptada a climas
temperados, limita o seu emprego no
Brasil a estudos no laboratório, isto é, na
detecção de agentes genotóxicos. Por
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 25

Figura 3- Esquema representativo da obtenção de plantas transgênicas mutadas através da inserção de seqüência de T-DNA.
Plantas adultas com flores são co-cultivadas com Agrobacterium contendo a construção do DNA de transferência (LB e RBseqüências
repetitivas nas bordas esquerda e direita, respectivamente, da inserção) mais o gene para resistência à antibiótico
(KAN). As sementes destas plantas são coletadas e crescidas em meio contendo o antibiótico. As plântulas resistentes,
portanto,portando a seqüência de interesse, são crescidas até o estágio maduro para obtenção de sementes. A progênie é
crescida a fim de que se possa extrair o DNA para reação de PCR e identificação da planta contendo o inserto de T-DNA no
gene de interesse
Figura 4- Esquema
representativo da
escolha e uso dos
iniciadores empregados
no PCR
Figura 5- Localização da inserção de T-DNA na
proteína vegetal at XPB1
exemplo, em amostras de solo potencialmente
contaminado, ou resíduos de
filtrados a partir de poluição atmosférica
urbana. Entretanto, como Arabidopsis
é uma planta bastante conhecida
geneticamente, sistemas que revelam
mutações já existem e podem ser incorporados
à este modelo por simples
cruzamentos com a planta at XPB1.
Como resultado, teremos uma linhagem
de plantas altamente sensível a
agentes genotóxicos, possibilitando a
detecção de níveis menores de produtos
mutagênicos. Dessa forma, esperamos
que em breve esta e outras plantas
que serão obtidas possibilitem o desenvolvimento
de sistemas vegetais úteis
no monitoramento ambiental para a
presença de produtos que sejam tóxicos
e nocivos à saúde humana.
Referência Bibliográfica
Britt A.B.- Molecular genetics of
DNA repair in higher plants- Trends in
plant science. 4: 20-25 (1999).
Leehan R.A., Feldmann K.A.-T-DNA
insertion mutagenesis in Arabidopsis:
going back and forth- Trends in Genetics
13: 152-156 (1997).
Petit C., Sancar A.- Nucleotide excision
repair: From E.coli to man. Biochemie
81: 15-25 (1999).
Ribeiro D.T., Machado C.R., Costa
R.M.A., Praekelt U.M., Van Sluys M.A.,
Menck, C.F.M.- Cloning of a cDNA from
Arabidopsis thaliana homologous to
the human XPB gene- Gene 208: 207-
213 (1998).
Vornax E.J., Mitchell H.L., Karthikeyrn
R., Chatterjee I., Kunz B.A.- DNA
repair in higher plants- Mutation Research
400: 187-200 (1998).
Figura 6- Sensibilidade das plantas araXPB1-/- ao MMS
26 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

EMBRAPA
REPETE FOTOLITO
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 27

SAÚDE
TERAPIA
GÊNICA
Sergio U. Dani
Médico pela Universidade
Federal de Minas Gerais;
Doutor em Medicina pela
Universidade de Hannover, Alemanha;
Livre-Docente em Genética pela Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto – USP;
Bolsista do Programa Jovem Pesquisador
em Centro Emergente, da FAPESP;
Diretor de Pesquisa & Desenvolvimento
da Genon ltda.
sudani@rgm.fmrp.usp.br
Vetores para terapia gênica
Fotos cedidas pelo autor
erapia gênica é o tratamento
de doenças baseado na transferência
de material genético.
Em sua forma mais simples,
a terapia gênica consiste
na inserção de genes funcionais
em células com genes defeituosos,
para substituir ou complementar esses
genes causadores de doenças. A maioria
das tentativas clínicas de terapia gênica
atualmente em curso são para o tratamento
de doenças adquiridas, como AIDS, neoplasias
malignas e doenças cardiovasculares,
mais do que para doenças
hereditárias. Em alguns protocolos,
a tecnologia da transferência
gênica vem sendo usada
para alterar fenotipicamente uma
célula de tal modo a torná-la
antigênica e assim desencadear
uma resposta imunitária. De
maneira análoga, um gen estranho
pode ser inserido em uma
célula para servir como um
marcador genotípico ou fenotípico,
que pode ser usado tanto
em protocolos de marcação gênica
quanto na própria terapia
gênica. O panorama atual indica
que a terapia gênica não se
limita às possibilidades de substituir
ou corrigir genes defeituosos,
ou eliminar seletivamente
células marcadas. Um espectro
terapêutico muito mais amplo
se apresenta à medida em que
novos sistemas são desenvolvidos
para permitir a liberação de
proteínas terapêuticas, tais como
hormônios, citocinas, anticorpos,
antígenos ou novas proteínas
recombinantes. A terapia gênica
é a esperança de tratamento
para um grande número de doenças
até hoje consideradas incuráveis
por métodos convencionais,
das hereditárias e degenerativas
às diversas formas de
câncer e doenças infecciosas.
28 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento
A tecnologia básica envolvida em qualquer
aplicação da terapia gênica é a transferência
gênica. Vários métodos atuais de
transferência gênica e suas vantagens e
desvantagens estão listados nas Tabelas 1
a 3. A maneira mais simples de transferir
genes para células e tecidos é por meio da
inoculação de DNA puro, com técnicas de
microinjeção; eletroporação e o método
biobalístico. Métodos mais elaborados e
mais eficientes incluem a administração de
DNA encapsulado (e.g., liposomos); ou
através de vetores virais, que podem ser
Tabela 1
Métodos Químicos para Introdução de Genes em Células de Mamíferos
fragmentos de DNA de vírus contendo o
DNA a ser transferido; ou mesmo a partícula
viral formada por proteínas virais
empacotando um DNA viral modificado
de maneira a tornar o vetor menos tóxico,
menos patogênico ou não-patogênico.
A palavra vetor, que deriva do Latim
vector (“aquele que carrega, entrega”) define
o agente que constitui ou contém os
genes a serem transferidos e expressos em
uma célula receptora. Os diversos tipos de
vetores são utilizados com o objetivo de
levar o DNA terapêutico ao núcleo das
Método Vantagens Desvantagens
DNA-fosfato de cálcio Morte celular durante Só ex vivo; transfecção é
o procedimento é mínima; baixa; baixo nível de
importante na produção de expressão do transgen;
vetores virais recombinantes;
simples e barato; expressão
pode ser transitória ou estável;
DNA-DEAE dextran Mais reprodutível que o méto- Só ex vivo; transfecção é
do anterior;
baixa e transitória; só
funciona em alguns
tipos celulares
DNA-lípide (liposomos) Não se integram ao genoma Baixa eficiência de transfechospedeiro;
uso in vitro e in ção em relação aos sistemas
vivo; carregam grandes peda- virais; expressão transitória
ços de DNA (tão grandes como do transgen; leve toxicidade
cromossomos inteiros); direcio- celular; podem ser inibidos
náveis; não-imunogênicos; por componentes séricos
preparações livres de contaminantes
(cf. vetores virais); alto
grau de pureza; padronização
DNA-proteína Maior direcionamento -
DNA-lípide-proteína
HACs (cromossomos Não se integram no genoma; Em desenvolvimento
artificiais)
inserções maiores são possíveis;
melhor controle transcricional

células-alvo. Outra forma de transferência
da mensagem genética envolve a entrega
de RNA diretamente ao citoplasma das
células, mas o RNA é mais instável que o
DNA, o que limita a aplicação dessa modalidade
de transferência gênica. O uso de
mitocôndrias ou DNA mitocondrial (mtD-
NA) como vetores gênicos citoplasmáticos
tem aplicação potencial na reposição do
mtDNA a células com deficiência no metabolismo
energético da fosforilação oxidativa
causada por mutações no mtDNA.
Afora o núcleo, a mitocôndria é a única
organela que possui seu próprio DNA.
Uma questão-chave da terapia gênica
é a escolha do vetor adequado a cada
situação. Um vetor ideal seria aquele que
pudesse acomodar um tamanho ilimitado
de DNA inserido, fosse disponível em uma
forma concentrada, pudesse ser facilmente
produzido, pudesse ser direcionado
para tipos específicos de células, não permitisse
replicação autônoma do DNA, pudesse
garantir uma expressão gênica a
longo prazo e fosse não-tóxico e nãoimunogênico.
Tal vetor ainda não existe e
nenhum dos sistemas de entrega de DNA
atualmente disponíveis para transferência
gênica in vivo é perfeito com respeito a
qualquer um desses pontos. Até a presente
data, quatro sistemas de transferência gênica
(DNA plasmidial complexado, vetores
retrovirais, vetores adenovirais e vetores
baseados no virus adeno-associado)
foram os mais usados em tentativas de
terapia gênica em humanos, totalizando
uma experiência clínica de cerca de três
mil pacientes em todo o mundo.
DNA Plasmidial Complexado
Um vetor plasmidial é uma molécula
de DNA circular purificada, construída por
meio de técnicas do DNA recombinante
para conter, além do gen terapêutico de
interesse, sequências regulatórias tipo promotores
e intensificadores, para facilitar e
controlar a expressão do gen. Vetores de
DNA plasmidial podem ser introduzidos
nas células por uma variedade de métodos.
O mais óbvio deles, conceitualmente,
é a injeção direta, que exige técnicas
sofisticadas para injeção em escala microscópica.
Essa técnica, entretanto, é limitada
pelo fato de que somente um número
relativamente pequeno de células pode
ser injetado em um determinado momento.
Apesar das tentativas de automatizar as
técnicas de microinjeção, o pequeno número
de células que podem ser injetadas
por vez continua sendo uma grande limitação.
Esse método de transferência gênica
poderá ter interesse e de utilidade clínica
se um pequeno número de células purificadas
da medula óssea forem injetadas e
condições de cultivo celular forem encontradas
para expandi-las substancialmente.
Entretanto, ainda existirá o problema da
expressão transitória, pois a maioria das
células injetadas com o vetor não será
capaz de manter a expressão por longo
prazo. Isso exige outras melhorias na sequência
do vetor, de modo a aumentar, por
exemplo, a eficiência de sua integração.
Aumento da eficiência de transfecção
do DNA plasmidial purificado pode ser
obtido com a formação de algum tipo de
complexo: lipídico, protéico, ou misto.
Após a aplicação desse complexo nas
células em cultura ou in vivo, uma porção
substancial das células endocita o DNA e é
capaz de transportar pelo menos parte
dele para o núcleo, onde o DNA é expresso
transitoriamente por alguns dias (Figura
1). A não ser que o DNA plasmidial
tenha a capacidade de integração dirigida,
apenas uma fração muito pequena (geralmente
muito menos de 1 por cento) das
células retêm o DNA permanentemente,
incorporando-o em seus cromossomos e
continuam a expressar os genes introduzidos.
Vetores Virais
Vírus são vetores gênicos por excelência
e vêm evoluindo há milhões de anos na
natureza em associação com virtualmente
todos os organismos, de bactérias até plantas
e animais. Os sistemas biomoleculares
específicos de transferência, recombinação
e expressão gênica adotados pelos
virus constituem instrumentos poderosos
para a construção de vetores mais eficientes
e seguros, com indicações precisas de
uso. Bacteriófagos, baculovirus, retrovirus,
adenovirus e virus adeno-associados
são exemplos de virus que foram modificados
com sucesso pelas técnicas do DNA
recombinante e já possuem aplicações na
pesquisa, na agricultura e na medicina.
Conceitualmente, não é surpreendente que
virus de animais estejam sendo usados
como vetores para a transferência de genes
para células de mamíferos. Conforme
listado na Tabela 3, vários virus vêm
sendo explorados desta maneira.
Vetores Retrovirais
Um retrovirus murino, o virus da leucemia
murina de Moloney (MoMuLV), foi
o primeiro sistema vetorial desenvolvido
para aplicações clínicas da terapia gênica.
Os conceitos gerais da produção e uso
desse tipo de vetor estão ilustrados na
Figura 2: Por meio de técnicas de DNA
recombinante, os genes no genoma viral
necessários para a reprodução do Mo-
MuLV, genes gag, pol e env, são removidos
e substituídos por um gen de interesse. O
que sobra do retrovirus são seus elementos
regulatórios: as repetições terminais
longas (LTR), que funcionam como sinais
de integração do provirus e promotores da
transcrição e um sinal de empacotamento,
para permitir que o RNA transcrito seja
acomodado em uma partícula viral. Para a
produção dos vetores retrovirais contendo
o gen de interesse, é utilizada uma linhagem
celular de empacotamento contendo
os genes gag, pol e env incorporados ao
genoma destas células. Os vetores são
produzidos em altos títulos nas células de
empacotamento e a seguir purificados e
injetados no paciente (terapia gênica in
vivo) ou postos em contato com células
colhidas do paciente e mantidas em codições
de cultivo celular (terapia gênica ex
vivo). Os vetores têm a habilidade de
entrar nas células-alvo, transcrever seu
RNA na forma de DNA (graças à atividade
da enzima transcritase reversa), e se integrar
estavelmente em um cromosomo da
célula como resultado da presença das
sequências regulatórias retrovirais remanescentes.
Uma vez integrado, o gen inserido
pode ser expresso para produzir a
proteína terapêutica desejada. O vetor retroviral,
desprovido dos genes para a replicação
viral, não é competente para a
replicação (diz-se que o vetor é “defectivo”),
e por isso não é capaz de produzir
mais virus competentes dentro da célulaalvo.
Portanto, o vetor age como um agente
final de transferência gênica, deixando
uma cópia de sua sequência no genoma da
célula-alvo.
Vetores Adenovirais
Os adenovírus humanos são DNAvírus,
não envelopados, com um genoma
dupla-fita linear de, aproximadamente, 36
kb, encapsulado em um capsídeo icosaédrico
medindo 70-100 nm de diâmetro. O
capsídeo contém em seus vértices espículas
por onde se dá a interação com receptores
celulares. Na natureza, os adenovirus
são capazes de infectar células do trato
respiratório e gastrointestinal, causando
gripes, gastroenterites em crianças ou conjuntivites
epidêmicas. As glândulas adenóides
são um de seus alvos e de onde se
originou o nome adenovírus. Infecções
envolvendo o trato urinário, vias hepáticas
e o sistema nervoso central podem ocorrer
esporádicamente. A maioria, senão a totalidade
dos adultos já foi exposta ao adenovirus
e já possui anticorpos anti-adenovirus.
Ao contrário dos retrovirus, os adenovirus
se replicam independentemente da
divisão da célula hospedeira, e seu cromosomo
raramente se integra ao genoma da
célula, permanecendo episomal na maioria
das vezes. A integração parece ocorrer
somente na presença de altos níveis de
infecção em células em divisão, mas esse
evento não contribui significativamente
para a utilidade destes virus como vetores.
Os vetores adenovirais possuem um largo
espectro de infectividade celular que inclui
virtualmente todas as células pósmitóticas
e mitóticas (Figura 3), e também
podem ser produzidos em elevados títulos.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 29

Tabela 2
Métodos Físicos para Introdução de Genes em Células de Mamíferos
Método Vantagens Desvantagens
Microinjeção direta Alta taxa de transfecção; Só ex vivo; potencial para
evita a degradação cito- uso em terapia gênica da
plasmática e lisossomal linhagem germinativa
do material injetado; apresenta problemas
técnica muito trabalhosa; técnicos e éticos
requer células muito
bem isoladas
Eletroporação Alta taxa de transfecção Só ex vivo; muita morte
celular torna o procedimento
pouco eficiente
Injeção de plasmídeo
Simplicidade; 2-19 kb po- Baixa porcentagem de fibras
dem ser facilmente trans- expressam o transgen após a
feridos para músculo; uso injeção; uso restrito a pele,
em vacinação gênica timo e músculo estriado
Injeção balística de DNA Alta taxa de transfecção; Expressão transitória;
entrega de doses precisas; lesão celular considerável
uso em vacinação gênica no centro da região atingida
pelo disparo
A estrutura genômica dos adenovirus é
mais complexa que a dos retrovirus. O
genoma adenoviral codifica aproximadamente
15 proteínas. A expressão gênica
viral ocorre de uma maneira ordenada e é
dirigida, em grande parte, pelos genes E1A
e E1B, localizados na porção 5' do genoma
adenoviral. Esses genes possuem funções
de transativação para a transcrição de
vários genes virais e da célula hospedeira.
Como estes genes da região E1 estão
envolvidos na replicação do adenovirus,
sua remoção torna o virus incompetente
para replicação ou “defectivo”. A remoção
também cria espaço para a inserção de um
gen de interesse terapêutico. A região E3,
cujo produto está envolvido na habilidade
do virus de escapar do sistema imunológico
do organismo hospedeiro, também pode
ser substituída por um DNA exógeno.
Para a produção de vetores adenovirais,
é necessário utilizar, a exemplo do
que ocorre com vetores retrovirais defectivos,
uma linhagem de células empacotadoras
contendo genes virais que transcomplementam
o vetor defectivo a ser produzido.
As etapas principais de produção e
uso de um vetor adenoviral estão ilustradas
na Figura 4. Uma das modalidades
começa pela produção de um plasmídeo
ou cosmídeo contendo o genoma do adenovirus
com deleções em algumas regiões
especiais, como a região E1. A deleção de
E1 torna o virus defectivo. O gen de
interesse pode ser clonado nestas regiões
deletadas, e o plasmídeo ou cosmídeo
pode ser multiplicado em uma cultura de
bactéria. O plasmídeo ou cosmídeo purificado
é então transfectado para as células
empacotadoras onde ele é empacotado na
forma de partículas adenovirais defectivas.
Os vetores adenovirais assim produzidos
são isolados do meio de cultivo das células
empacotadoras, e purificados por ultracentrifugação
em gradiente de cloreto de
césio, que também concentra o vetor em
suspensões com elevada titulação (mais de
10 13 UFP ml -1 ), ou por cromatografia. O
virus purificado é estável em uma variedade
de tampões aquosos e pode ser congelado
por períodos prolongados sem perda
de atividade.
Uma estratégia alternativa de produção
de vetores adenovirais consiste em
preparar um plasmídeo no qual o gen de
interesse é flanqueado por seqüências de
DNA adenovirais. Estas sequências servem
como regiões controle e contêm sinais de
empacotamento e sítios para a recombinação
com DNA genômico adenoviral, que
será usado para reconstituir adenovirions
defectivos dentro da célula empacotadora.
A transfecção desse plasmídeo para células
empacotadoras, juntamente com o DNA
genômico de adenovirus com deleções
selecionadas (e.g., E1, E3) leva, por meio
de recombinação homóloga, à formação
de partículas adenovirais com o(s)
transgen(es) substituindo as regiões previamente
deletadas. Portanto, tanto a clonagem
direta, quanto a recombinação homóloga
podem ser usadas para produzir adenovirions
defectivos. Com o desenvolvimento
de novas linhagens de células de
empacotamento contendo um número cada
vez maior de genes adenovirais para a
transcomplementação, já é possível produzir
vetores adenovirais contendo um
número cada vez menor de sequências
adenovirais e um número cada vez maior
de sequências exógenas. Um vetor adenoviral
“all deleted” foi produzido recentemente.
Esse vetor possuía 28 kb de DNA
exógeno (gen da distrofina) e apenas 8 kb
de sequências adenovirais.
Vetores Adeno-Associados
Algumas características desfavoráveis
dos vetores adenovirais e retrovirais revistas
na Tabela 3 incluem a incapacidade de
integração do DNA dos vetores adenovirais
ao genoma da célula hospedeira, ocasionando
uma expressão instável e a integração
aleatória do DNA dos vetores retrovirais
ao genoma hospedeiro, podendo
acarretar mutagênese insercional ativadora
de proto-oncogenes celulares humanos
ou inativação de genes supressores de
tumor. Além disso, esses vetores podem
provocar resposta imunológica dos tipos
humoral e celular e podem ser patogênicos.
Vetores alternativamente indicados para
contornar esses problemas são baseados
no virus adeno-associado (AAV, adenoassociated
virus), um pequeno vírus de
DNA, não envelopado, não patogênico,
pertencente à família Parvoviridae. O AAV
possui uma única molécula de DNA fita
simples de 4681 bases, com repetições
terminais invertidas (ITRs, inverted terminal
repeats). Os ITRs são sequências palindrômicas
de 145 pares de bases envolvidas
na regulação do ciclo celular do AAV,
dispostas nas porções terminais 5' e 3' do
genoma viral, que servem como origem e
iniciadores para a replicação do DNA.
Flanqueadas pelas ITRs, duas amplas molduras
abertas de leitura codificam uma
proteína regulatória e outra estrutural denominadas
rep e cap, respectivamente. A
região de leitura situada na porção 5' (gen
rep) codifica quatro proteínas não-estruturais
envolvidas com a replicação genômica.
A porção 3' contém o gen cap, que
codifica três proteínas estruturais para a
formação do capsídeo viral.
O AAV é considerado um dependovirus
porque somente é capaz de se replicar
em uma célula na presença de um virus
auxiliar (adenovirus ou virus da herpes),
que lhe forneça, em transcomplementação,
os fatores auxiliares essenciais para
sua replicação. Na ausência do vírus auxiliar,
o genoma do AAV integra-se, preferencialmente,
em um sítio específico
(AAVS1) no braço curto do cromossomo
19, entre q13.3 e qter, utilizando para isso
os ITRs, com alta freqüência e estabilidade,
para estabelecer uma infecção latente tanto
em células mitóticas quanto em células
pós-mitóticas. Recentemente, formas episomais
do vírus também foram identifica-
30 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

das e a integração em sítios não
específicos foi documentada, porém
não há, até o momento, nenhuma
relação destas formas com oncogênese
insercional. O provírus latente pode
ser recuperado e replicado através de
uma superinfecção com o vírus auxiliar.
O vírus adeno-associado tem despertado
grande interesse como um
vetor potencial para transferência de
genes em tentativas de terapia gênica
humana. Entre as suas propriedades
mais favoráveis estão: (I) nenhuma
relação com doenças humanas; (II)
poder de infecção de uma ampla
gama de linhagens celulares derivadas
de diferentes tecidos; (III) a sua
habilidade de integrar dentro do genoma
hospedeiro e estabelecer uma
infecção latente. Este tipo de integração
pode ocorrer em células que não
estejam em processo de divisão, embora
aconteça com uma freqüência
menor que em células em divisão.
Soma-se a estas características favoráveis
o tipo de integração proporcionado
pelo AAV. A capacidade de
transdução com AAV recombinante
(rAAV) tem sido demonstrada em
uma ampla variedade de tipos celulares,
incluindo as diferenciadas, o que
sugere um grande potencial desse
sistema de vetor para transferência
gênica in vivo para órgãos como músculo,
fígado, sistema nervoso central
e pulmão.
Vetores rAAV são derivados de
plasmídeos que carregam os ITRs
flanqueando o gen exógeno de interesse.
Esses vetores podem ser empacotados
dentro do capsídeo do AAV
pela co-transfecção em células infectadas
com (I) adenovírus, e (II) um
segundo plasmídeo de empacotamento
contendo os genes rep e cap (Figura
5). O rAAV é recuperado em células
lisadas e o vírus auxiliar é removido.
Desta forma, quatro elementos são requeridos
para o empacotamento do vetor
AAV: (I) células eucarióticas em cultura,
(II) as proteínas responsáveis pela replicação
do genoma viral e síntese do capsídeo,
(III) o DNA do vetor e (IV) o vírus auxiliar.
As desvantagens de utilizar partículas
rAAV como vetores de transferência gênica
estão no tamanho do seu genoma
(acima de 5 kb ocorre interferência no
encapsulamento viral), o que limita a clonagem
de determinados genes, e a dificuldade
de produzir o vetor viral em grandes
quantidades. Entretanto, vários melhoramentos
têm sido obtidos na produção e
uso de vetores baseados em AAV. A dificuldade
de produzir estes vetores em larga
escala foi minimizada pela utilização de
Tabela 3
Métodos Biológicos para Introdução de Genes em Células de Mamíferos
Vetores Vantagens Desvantagens
Retrovirais Alta taxa de transdução; Imunogênico; requer células
amplo espectro de hospedeiro em divisão; risco de mutagênese
(somente células em divisão); insercional; risco de reversão para o
sistema muito bem estudado tipo selvagem; inativação pelo
e conhecido; integração no complemento; baixos títulos;
genoma hospedeiro; proteínas baixa taxa de entegra in vivo
do vetor não expressas no
hospedeiro
Adenovirais Amplo espectro de hospedeiro Imunogênico; reversão para o tipo
(células mitóticas e não
selvagem; período curto de expressão
mitóticas); altos títulos;
gênica em células em divisão (depuraalta
eficiência de transdução; ção do epissomo); “vazamento” de
genoma viral epissomal;
proteínas virais
virus selvagem causa doença
leve; não envelopado
Adeno- Amplo espectro de hospedeiro; Limite ao empacotamento de DNA;
associados nenhuma doença humana integração não é sempre sítio-dirigida;
associada; infecta células imunogênico (?)
em divisão ou paradas; integração
dirigida é preferencial
Híbridos Amplo espectro; altos títulos; Imunogênico
Adenovirus-AAV alta eficiência de transdução;
integração dirigida
Herpes simples Epissomal; pode induzir infec- Imunogênico; virus diferentes têm
ção latente por toda a vida (es- seletividade diferente; EBV é oncogêpecialmente
no CNS);
nico; ativação de virus latente; baixa
acomoda insertos grandes; eficiência de transdução; expressão
produção de altos títulos transitória nos vetores atuais; sistema
em desenvolvimento
HIV Infectam e transduzem células Sistema pouco conhecido;
mitóticas e pós-mitóticas, por eficiência baixa in vivo
longo prazo
Vaccinia Potencial para desenvolvimento Uso limitado aos individuos não
de uma grande variedade de previamente vacinados; uso não indivacinas
gênicas
cado em imunossuprimidos
plasmídeos contendo sequências de ITR e
sua multiplicação em linhagens recombinantes
de Escherichia coli. A restrição ao
tamanho do genoma viral também foi
minimizada, visto que esses plasmídeos
não precisam ser encapsulados em um
capsídeo viral, podendo ser introduzidos
em células eucarióticas utilizando a técnica
de transfecção com lipossomos, sem
prejuízo do amplo espectro de infectividade
celular característico do AAV.
Combinações de
Elementos Virais e Não-Virais
A combinação de elementos virais e
não-virais tem sido usada para aumentar a
eficiência da transferência gênica para células
em cultura. Um exemplo de combinação
de elementos virais e não virais é uma
alternativa ao uso de partículas de rAAV
mencionada anteriormente, e consiste na
construção de plasmídeos com sequências
de ITR delimitando genes de interesse para
promover a transformação gênica em células
eucarióticas e conferir maior persistência
do DNA transfectado, se comparada
àquela obtida com plasmídeos convencionais
sem os ITRs. Os vírus AAV podem ser
substituídos por esse tipo de construção
complexada em liposomos, pois os níveis
de expressão gênica e retenção do transgen
nas células transfectadas por esses
complexos são semelhantes aos níveis
obtidos com partículas virais encapsuladas.
Mitocôndrias e DNA Mitocondrial
A mitocôndria é a única organela que
possui seu próprio DNA (mtDNA). Em
princípio, as mitocôndrias se assemelham
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 31

Figura 1. Os complexos formados entre lípides ou fosfolípides e DNA constituem
liposomos. Liposomos catiônicos são geralmente preparados a partir de fosfolípides
bipolares e consistem de um núcleo hidrofílico, delimitado por uma camada
lipídica externa. Os lípides catiônicos formam interações eletrostáticas com a
molécula fortemente aniônica do DNA de maneira espontânea, promovendo o
encapsulamento do ácido nucleico. Os liposomos assim produzidos possuem um
amplo espectro de infectividade celular
Figura 2. Produção e uso de retrovirus
aos lipossomos utilizados em transferência
gênica, constituídos de membranas lipídicas
envolvendo moléculas de DNA. Uma
vez que mitocôndrias podem ser purificadas
por ultracentrifugação de homogenados
celulares, elas poderiam ser utilizadas
como vetores de transferência gênica. Mitocôndrias
isoladas do sangue de doadores
podem ser fundidas a células receptoras,
gerando híbridos de citoplasma (cíbridos)
viáveis. O uso de mitocôndrias ou do
DNA mitocondrial (mtDNA) como vetores
gênicos tem aplicação potencial na reposição
do mtDNA a células com deficiências
no metabolismo energético da fosforilação
oxidativa causadas por mutações. Mutações
no mtDNA estão ligadas a um grande
número de síndromes degenerativas neuromusculares
com padrão de herança materna.
Além disso, mutações no mtDNA
ocorrem em células da linhagem somática
e se acumulam durante o envelhecimento
e em condições de stress oxidativo, e
podem explicar boa parte dos fenótipos
característicos da idade avançada, como
fraqueza muscular, doença de Alzheimer e
doença de Parkinson.
Conclusão e Perspectivas
Várias doenças incuráveis pelos métodos
terapêuticos convencionais representam
perspectivas futuras para a aplicação
da terapia gênica. Contudo, ainda existem
limitações com relação à eficiência e direcionamento
dos vetores de transferência
gênica da geração atual. Os vetores virais
recombinantes são os veículos mais potentes
para a transferência gênica, mas a
resposta imunológica do hospedeiro e as
dificuldades de produção em larga escala
e padronização ainda são grandes barreiras
para seu uso clínico. A entrega de DNA
via lipossomos ou via direcionamento a
receptores celulares oferece alternativas
elegantes para a transferência mediada por
virus, mas os níveis de expressão gênica
obtidos com esses métodos precisam ser
melhorados significativamente antes que
eles possam ser utilizados para o tratamento
de doenças humanas. Além disso, nosso
conhecimento do controle transcricional é
incompleto. Estes campos estão sob intensa
investigação; os métodos de transferência
gênica ex vivo e in vivo estão em franco
desenvolvimento e esperam-se avanços
consideráveis na próxima década.
O desenvolvimento de sistemas altamente
eficientes de empacotamento viral
e o refinamento dos processos de purifica-
Figura 3. Amplo espectro de infectividade celular de um vetor adenoviral carregando o gen LacZ de E. coli, que codifica a enzima
beta-galactosidase. A expressão do gen é denotada pela cor azul do substrato X-gal, metabolizado pela enzima nas células
infectadas pelo vetor. No sentido horário, começando pelo canto superior direito: (I) córtex renal de coelho, após infusão
intracarotídea do vetor; (II) fibras de músculo estriado esquelético de rato, após injeção intramuscular do vetor; (III) células
endoteliais em capilar de cérebro de rato, após infusão intracarotídea do vetor; (IV) fibroblastos na pia mater de rato, após injeção
intraparenquimal do vetor; (V) astrócitos no córtex cerebral de rato, após injeção estereotáxica do vetor; (VI) neurônio piramidal
do córtex do giro do cíngulo, após injeção estereotáxica do vetor no hipocampo de rato
32 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

ecombinase funcional com a construção
de expressão gênica em complexos lipossomais
direcionados a uma célula específica
com anticorpos ou proteínas ligantes de
receptores. A longo prazo, novos métodos
de entrega poderão ser desenvolvidos para
a transferência intranuclear de cromossomos
artificiais humanos (HACs) carregando
grupos inteiros de genes com seus elementos
naturais de controle. No futuro, a pesquisa
básica deverá tentar definir os elementos
genômicos que tornam possível o
controle temporal e espacial da expressão
gênica durante a vida de um indivíduo.
Avanços nessas áreas irão requerer desenvolvimentos
paralelos no desenho de vetores,
antes que os conhecimentos possam
ser utilizados na prática clínica.
Da grande quantidade e criatividade
dos sistemas de vetores e métodos de
transfecção gênica que estão sendo desenvolvidos,
parece claro que, no futuro, haverá
uma grande escolha de métodos diferentes
para as diferentes aplicações clínicas.
Isso certamente ampliará as oportunidades
para o uso da transferência gênica no
contexto clínico. A terapia gênica promete
ser uma área fértil de pesquisa científica e
clínica por muitos anos, e não há dúvida
que se tornará uma prática clínica importante
neste novo século. A terapia gênica
poderá representar uma mudança de paradigma
da medicina, com importantes repercussões
para a sociedade.
Leituras recomendadas
Figura 4. Etapas da produção e uso de vetores adenovirais
Figura 5. Etapas da produção e uso de partículas de vetores adeno-associados
recombinantes (rAAV)
ção e concentração poderão melhorar os
títulos dos vetores virais para valores que
poderão permitir a transferência gênica pela
administração sistêmica. O direcionamento
da entrega poderá ser possível pela incorporação
de anticorpos de cadeia única contra
antígenos de superfície ou ligantes para
receptores transmembrânicos incorporados
ao envelope de retrovírus ou proteínas penton
de adenovírus, e há sinais encorajadores
de que essa estratégia possa alcançar sucesso.
A médio prazo, espera-se a chegada de
“vetores de desenho” incorporando os elementos
mais úteis dos sistemas virais e sintéticos
disponíveis atualmente, com variações
dependendo da aplicação. Por exemplo, as
repetições terminais invertidas (ITR) dos virus
adeno-associados, que promovem integração
cromossomal estável, podem ser combinadas
com seqüências de outros vetores
com maior capacidade de acomodação de
insertos. A integração pode ser aumentada
através do empacotamento de uma enzima
Balagué C, Kalla M, Zhang W-W. 1997.
Adeno-associated virus rep78 protein and
terminal repeats enhance integration of
DNA sequences into the cellular genome. J.
Virology 71:3299-3306.
Dani, S.U. 1998. Terapia Gênica. Capítulo
90, in Dani, R. Gastroenterologia Essencial.
Rio de Janeiro, Guanabara Koogan.
Dani SU. 1999. Terapia Gênica: O Objetivo
Final. Cap. 14 in Rossi, BM, Pinho, M.
Genética e Biologia Molecular para o Cirurgião.
São Paulo, Editora Lemar, pp. 261-
289.
Dani SU. 1999. The challenge of vector
development in gene therapy. Braz. J. Med.
Biol. Res. 32:133-145.
Dani SU, Uetsuki T, Nishimura I, Saito I,
Yoshikawa K. 1998. Improved adenovirusmediated
gene transfer to neurons in the
brain: Effect of intraparenchymal injection
of hypertonic mannitol and concentration
of the vector particles in the infusate. Virus
Reviews and Research 3(1-2):41-49.
Darquet A-M, et al. 1997. A new DNA
vehicle for nonviral gene delivery: supercoiled
minicircle. Gene Therapy 4:1341-
1349.
Hartikka, J., et al. 1996. An improved
plasmid DNA expression vector for direct
injection into skeletal muscle. Hum Gene
Ther 7:1205-1217
Lebkowski JS, et al. 1988. Adeno-associated
virus: a vector system for efficient
introduction and integration of DNA into a
variety of mammalian cell types. Mol Cell
Biol 8(10):3988-96
Lebkowski JS, Okarma TB, Philip R.
1996. The challenges of recombinant adeno-associated
virus manufacturing: alternative
use of adeno-associated virus plasmid/
liposome complexes for gene therapy applications.
Curr Top Microbiol Immunol
218:51-9
Philip, R., et al. 1994. Efficient and
sustained gene expression in primary T
lymphocytes and primary and cultured tumor
cells mediated by adeno-associated
virus plasmids DNA complexed to cationic
liposomes. Mol. Cell. Biol. 14, 2411-2418.
Zhu, N., Liggitt, D., Liu, Y., Debs, R.
1993. Systemic gene expression after intravenous
DNA delivery into adult mice. Science
261, 209-211.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 33

PROJETO
PESQUISA
TRANSCRIPTOMA
Análise da Expressão Gênica em Larga Escala Usando DNA - Arrays
Geraldo A. S. Passos
Professor Associado (Genética),
Faculdade de Odontologia de
Ribeirão Preto e
Grupo de Imunogenética Molecular,
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP
passos@rgm.fmrp.usp.br
Catherine Nguyen
Bertrand Jordan
Pesquisadores do Centre d’Immunologie
Marseille-Luminy, Equipe TAGC,
INSERM-CNRS de Marseille, França
nguyen@ciml.univ-mrs.fr
jordan@ciml.univ-mrs.fr
Fotos cedidas pelos autores
34 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento
s projetos genoma estão
revolucionando a maneira
como a biologia e a
medicina serão exploradas
no próximo século e
além (Collins et al., 1998). Com o seqüenciamento
total dos genomas humano
e de outras espécies e a disponibilidade
das bibliotecas de cDNA, abriu-se
a possibilidade de uma nova estratégia
para a genética, que está sendo chamada
de genômica funcional, a interpretação
da função das seqüências de DNA
numa escala genômica.
No curso do seqüenciamento de
diversos genomas, demonstrou-se que
muitos genes são descobertos somente
quando suas seqüências totais tornamse
conhecidas. Assim, a descoberta de
novos genes fica dependente do trabalho
de seqüenciamento do DNA.
Entretanto, o conhecimento da estrutura
de um gene ou de outro elemento
funcional é somente parte da resposta
que precisamos.
A necessidade vai mais além; está na
elucidação da função dos genes e isso
resultará da comparação de dados, como
interação de genomas com o ambiente
ou níveis de expressão gênica com o
desenvolvimento normal e patológico.
Isto será um desafio para toda a
biologia do futuro.
Os recursos rotineiros atuais para
abordarmos a função dos genes numa
escala genômica são por comparação e
análise de padrões de seqüência com
expressão gênica (RNAs mensageiros).
Mas são necessárias novas estratégias
para podermos relacionar a expressão
dos genes diretamente com os fenômenos
biológicos. Isso nos aproximará
mais da função desses genes.
A caracterização em larga escala de
transcritos (RNAs) e suas proteínas resultantes
está bem dentro da análise
funcional do genoma.
É bastante razoável pensarmos que o
seqüenciamento e a análise dos níveis
de expressão de todos os genes de um
organismo devem ser tomados como
alta prioridade.
Por analogia com o termo genoma,
que representa o conjunto completo dos
genes (DNA) de um organismo, criou-se
o termo transcriptoma, que representa o
conjunto completo dos transcritos (RNAs).
Seguindo a idéia, temos também o proteoma,
que representa todas as proteínas.
O novo desafio para a biologia está,
então, na análise global desses sistemas:
genoma, transcriptoma e proteoma.
Recursos metodológicos para enfrentar
esses desafios estão sendo padronizados
com sucesso.
Dentro da análise dos transcriptomas,
o primeiro recurso disponível foram
as bibliotecas de DNAs complementares
(cDNA), ou seja, um conjunto de
clones (de fagos ou plasmídeos) que
abrigam cópias , se possível, de todos os
RNAs mensageiros de uma linhagem
celular ou órgão na forma de cDNA.
Seqüências de cDNA e conjuntos
validados de clones com marcadores
únicos são muito úteis na análise da
expressão gênica.
Atualmente, uma das “últimas palavras”
em tecnologia para o estudo dos
transcriptomas são os DNA-arrays.
Aliando-se a disponibilidade das bibliotecas
de cDNA com a robótica de alta
precisão na deposição de pequenas
amostras em superfícies sólidas, tornouse
possível a preparação dos arrays
(arranjos) de clones de cDNA ou até de
produtos de PCRs (reação de polimerização
em cadeia) em membranas de
nylon ou em lâminas de vidro (figura 1).

Vejamos o princípio
do método dos DNA-arrays
e das sondas complexas
de cDNA (Jordan,
1998).
Essencialmente, os
métodos das assinaturas
de hibridação usam sondas
complexas preparadas
a partir de RNAs mensageiros
de uma dada linhagem
celular, tecido ou
amostra cirúrgica por
transcrição reversa e marcação
radioativa. A sonda
contém muitas espécies
de RNAs mensageiros que
podem variar muito em
quantidade; por exemplo,
no cérebro, podemos encontrar
espécies variando
de 1.000 a 30.000 moléculas
de RNA mensageiro por célula.
Sugere-se que uma célula de mamífero
típica contenha, aproximadamente,
300.000 moléculas individuais de RNAs
mensageiros. Algumas delas estão presentes
em abundância que variam de um
a vários por cento.
Uma parcela razoável de RNAs mensageiros
são de espécies raras, representados
a uma molécula por célula ou
mesmo menos (uma espécie de RNA
mensageiro presente somente uma vez a
cada dez células poderá, mesmo assim,
ter significado biológico).
O seqüenciamento sistemático de
cDNAs poderá proporcionar os dados
de caracterização do transcriptoma, especialmente
se feito em bibliotecas de
cDNA (Okubo et al., 1992).
Entretanto, a quantificação de baixos
níveis de expressão envolve uma quantidade
não usual de seqüenciamentos:
para seqüenciarmos um dado RNA mensageiro
abundante de 1:10.000 faz-se
necessário o seqüenciamento de 50 a
100.000 clones. Para cada biblioteca !
Os métodos que envolvem os tags
(etiquetas moleculares de cDNAs) diminuem
o seqüenciamento pela redução
de cada cDNA, mas o trabalho para
padronizar esses métodos é enorme e as
limitações estatísticas ainda persistem.
Por outro lado, os métodos de hibridação
molecular, usando sondas complexas
e um grande arranjo de alvos de
DNA (DNA-arrays) têm seu poder derivado
do fato de que cada experimento
individual proporciona uma grande quantidade
de informação; ainda não há
método rival para as medidas de expressão
gênica em grande escala.
É claro que o seqüenciamento do
Figura 1.
Utilização de bibliotecas de cDNA,
produtos de PCR ou oligonucleotídeos
na confecção dos DNA-arrays
e suas alternativas de análise
DNA é e será o “método final” para a
caracterização da estrutura gênica. Com
ele podemos deduzir a seqüência dos
resíduos de aminoácidos da proteína
mesmo sem a termos isolado.
Mas fica claro que o caminho mais
rápido e lógico para identificarmos os
genes implicados nos fenômenos biológicos
normais e patológicos está sendo
o uso dos DNA-arrays.
O poder dos métodos que também
estão sendo chamados de assinaturas
de hibridação se deve ao fato de que
milhares de níveis de expressão podem
ser mensurados num único experimento.
Brevemente, uma sonda complexa é
hibridada com um array consistindo de
muitos “alvos de DNA”, cada um representando
um gene em particular. Seguiremos
a definição adotada por Jordan
(1998), onde o DNA imobilizado é considerado
como alvo.
Os DNA alvos podem ser tanto colônias
de bactérias fixadas em membranas,
produtos PCR de clones de cDNA ou
oligonucleotídeos sintéticos desenhados
para ensaiar um gene em particular.
O ponto importante é que a combinação
de uma sonda complexa contendo
muitas espécies de RNAs mensageiros
com um grande arranjo (array) de
alvos, o que permite a coleção de um
grande volume de informações
em paralelo.
Nesse ponto, temos
que salientar que as diferenças
entre esse tipo
de hibridação com as
clássicas hibridações
Southern- e northernblot.
Nestas últimas, trabalhamos
com um excesso
de sonda, o DNA
alvo é hibridado até a
saturação, no final da
incubação.
Nos experimentos de
medidas de expressão
gênica, entretanto, cada
seqüência individual na
sonda complexa está
presente em pequenas
quantidades em relação
ao(s) seu(s) alvo(s) no
array.
Determinações realizadas pelo grupo
de um dos autores (B. Jordan, ver
Nguyen et al., 1995) para esses arrays
indicaram uma proporção de 30 ng de
inserto de cDNA de uma colônia de E.
coli crescida sobre a membrana de
nylon para menos de 0,1 ng de RNA
mensageiro (cDNA).
Nessas condições, a cinética de hibridação
é linear e a quantidade da
sonda hibridada a um dado alvo será
proporcional à abundância da seqüência
correspondente na sonda complexa
e, portanto, ao nível de expressão do
gene na célula ou tecido do qual a sonda
foi preparada.
Embora o princípio do uso de DNAarrays
tenha sido discutido tão cedo
como, em 1991 (Lennon & Lehrach,
1991), somente quatro anos após é que
apareceram os primeiros trabalhos mostrando
a possibilidade de quantificação
em DNA-arrays (Nguyen et al., 1995;
Zhao et al., 1995; Pietu et al., 1996).
A aquisição dos dados usando sondas
radioativas ou fluorescentes envolve
outras necessidades como algoritmos
para detecção dos pontos (spots de hibridação),
subtração do background, atribuição
dos sinais às entidades corretas
(Granjeaud et al., 1996) e, geralmente,
procedimentos corretos para o manuseio
de milhares de dados gerados em
cada experimento individual.
Os requerimentos para um sistema
ideal são, principalmente, a habilidade
de quantificar níveis de expressão abaixo
do nível de uma molécula por célula
(1/300.000); dar uma resposta linear
dentro da faixa de abundância (1/300.000
a 1/100); capacidade de mensuração de
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 35

muitos alvos ao mesmo tempo,
idealmente o complemento total
dos 100.000 genes humanos
e o uso de pequenas quantidades
de material de partida para
a sonda, já que os interesses
envolvem o estudo de populações
de células difíceis de coletar
e também de biópsias
clínicas.
Tudo isso deve ser conseguido
com uma reprodutibilidade
aceitável, pois uma diferença
de um fator de 2 entre
duas assinaturas de hibridação
pode ser altamente significativo.
É claro que a aparelhagem
deve ser compacta, com alta
performance e fácil de usar.
Nessas aplicações, clones
de cDNA (ou produtos PCR)
são arranjados em filtros de
nylon com auxílio de um robô
(figura 2); as sondas complexas
são marcadas com fósforo
radioativo ( 32 P ou 33 P) e, então,
hibridadas com os filtros.
Os resultados são adquiridos
com auxílio de sistemas de
placas de imagens (phosphor
imagers).
O uso de sondas fluorescentes,
que permitem a miniaturização
devido à sua muito boa resolução,
iniciou-se em 1995 (Schena, 1995)
e foi posteriormente desenvolvidas a
ponto de padronizarem os micro-arrays
contendo vários milhares de amostras de
DNA em superfícies de um centímetro
quadrado, os quais têm sido produzidos
por laboratórios acadêmicos e firmas
(figura 3).
Também desenvolveram os oligonucleotide-chips,
sendo o setor privado
norte americano o principal produtor.
Tais chips contém 64.000 diferentes
oligonucleotídeos sintetizados
numa superfície de dois
centímetros quadrados (Chee
et al., 1996).
O DNA-chip resultante é
então usado para aplicações
tipo “quase-seqüenciamento”,
como, por exemplo, a detecção
de mutações ao longo do gene
p53.
Embora originariamente
projetado para esse fim, os DNAchips
podem também ser aplicados
aos estudos de medidas de expressão
gênica (Lockhart et al., 1996).
Devido ao enorme potencial de miniaturização,
o DNA-chip poderá, a longo
prazo, representar a principal via para
Figura 2.
Utilização dos macro-arrays e sondas
complexas de cDNA radioativas
na identificação de genes exclusivamente
expressos numa dada linhagem
tumoral
medidas sistemáticas de expressão gênica.
Entretanto, as membranas de nylon
de alta densidade (membranas HD) são
Sites na Internet sobre DNA-arrays e expressão
gênica:
http://tagc.univ-mrs.fr/
www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.html
www-bio.llnl.gov/bbrp/image/image.html
www.clontech.com/clontech/Catalog/Hybridization/Atlas.html
www.genome-systems.com/GDA/
www.synteni.com
http://cmgm.Stanford.EDU/pbrown/
a opção mais razoável atualmente para
os estudos de expressão gênica. As
colônias de E.coli são crescidas sobre as
membranas que são então lisadas e
fixadas por métodos usuais.
Alternativamente, DNA
obtido por PCR a partir desses
clones também pode ser fixado
nas membranas; isso pode
contornar o problema de crescimento
desigual das colônias
de bactérias. Os produtos
PCR podem ser aplicados às
membranas como são, só necessitando
de ser dosados e
diluídos de maneira uniforme
antes de ser aplicados. Mas
realizar milhares de PCRs e
depois dosar cada uma das
reações não é tarefa fácil é
muito demorada.
Por isso é que o crescimento
de colônias bacterianas
sobre as membranas ainda
é a melhor opção.
Quanto às sondas complexas
de cDNA, estas são
preparadas a partir dos RNAs
mensageiros (RNA poli A+)
ou a partir de RNA total por
transcrição reversa e marcação
radioativa simultânea dos
cDNAs resultantes (Bernard
et al., 1996). A marcação radioativa
é feita com 32 P ou,
preferencialmente, com 33 P,
que permite maior resolução
quando se trabalha com membranas
HD.
A aquisição dos dados quantitativos
das hibridações é obtida com as imaging
plates de aparelhos leitores de fósforo
(phosphor imagers). As imaging plates
associadas com scanners a laser proporcionam
um formato conveniente, já que
muitas membranas podem ser simultaneamente
expostas e um scanning demora
em média cinco minutos.
A imagem da hibridação, uma vez
adquirida, é salva como arquivo de
computador e pode ser quantificada,
isto é, os spots de
hibridação são definidos assim
como o background e
valores numéricos são atribuídos
a cada spot. Agora cada
valor é associado ao clone
correspondente para análises
posteriores.
A sensibilidade atual das
membranas HD está na faixa
de 1/10.000, isto é, os níveis
de expressão podem ser quantificados
ao que corresponde
a espécies de RNA presentes nessa proporção
em relação à população total de
RNAs mensageiros.
As sondas são preparadas geralmente
a partir de um a alguns microgramas
36 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

de RNA poli A+, ou a partir
de 25 microgramas de RNA
total para uso em macroarrays
(membranas HD de 8
x 12 cm) ou 5 microgramas
de RNA total para uso em
micro-arrays (1 cm 2 ).
Esse “screening diferencial
quantitativo” tem sido
aplicado na procura de “novos”
genes diferencialmente
expressos em células cancerosas
e em tecidos normais
(Zhao et al., 1995) para estudar
genes especificamente
expressos no músculo (Pietu
et al., 1996) e para estudos
sobre a maturação do timo
do camundongo (Rocha et
al., 1997).
Nosso Grupo de Imunogenética
Molecular situado
no Departamento de Genética
da Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto, USP, trabalha
em colaboração com a
Equipe TAGC (Technologies
Avancées pour le Génome et
la Clinique) no Centre d’Immunologie
de Marseille-Luminy (Marseille, França),
por intermédio do Acordo INSERM-
FAPESP. Esse acordo prevê a ida de
pesquisadores brasileiros para a Equipe
TAGC e a vinda dos pesquisadores franceses
para o nosso laboratório.
Estamos trabalhando com análise da
expressão gênica em larga escala durante
o desenvolvimento do timo do camundongo,
com o intuito de descobrirmos
“novos” genes implicados na maturação
dos linfócitos T e na recombinação
V(D)J dos genes de receptores de antígenos
(TCR) (Passos et al., 1999).
Essa tecnologia tenderá a tornar o
processo muito mais prático quando
dispusermos de toda a expressão de
genomas (o transcriptoma) numa só
membrana, provavelmente isso acontecerá
com os micro-arrays e DNA-chips e
detecção por fluorescência.
O que, há dois anos, ainda era um
ponto de “estrangulamento” nessa tecnologia,
hoje, é realidade, ou seja, já
encontramos no mercado todo um conjunto
de aparelhos, que vão desde o
robô para repicar os clones nas placas de
microtitulação até a preparação dos micro-arrays
acoplados a um sistema para
hibridação e a um scanning que identifica
e quantifica os níveis de hibridação
com softwares dedicados.
Em resumo, os micro-arrays são definitivamente
a etapa lógica nos estudos
de expressão gênica em larga escala,
Figura 3.
Utilização dos DNA-chips na identificação
de genes preferencialmente
expressos pela levedura crescida em
meios de cultura de diferentes composições
embora estejam rapidamente sendo alcançados
pelos DNA-chips que foram
originariamente desenvolvidos para um
propósito diferente.
As realizações que apresentamos revelam
o imenso potencial dos DNAarrays
e o futuro promete a essa tecnologia
uma revolução comparável àquela
que ocorreu com o advento da reação de
polimerização em cadeia (PCR).
Enfim, a padronização de DNA-chips
para explorar n genes em n situações
abre um futuro de combinações muito
mais sofisticadas, do tipo lab on a chip.
No momento em que as necessidades
do seqüenciamento massivo de genomas
orientou a biologia em direção
aos grandes equipamentos, no modelo
da física de partículas, vemos o nascimento
de uma solução metodológica
proporcionada por uma ferramenta que
cabe na palma de nossa mão!
Referências Bibliográficas:
Bernard, K., Auphan, N., Granjeaud,
S., Victorero, G., Schmitt-Verhulst, A.M.,
Jordan, B.R. e Nguyen, C. (1996) Nucleic
Acids Res. 24: 1435-1443.
Collins, F.S., Patrinos, A.,
Jordan, E., Chakravarti, A.,
Gesteland, R., Walters, L. et
al. (1998) Science 282: 682-
689.
Chee, M., Yang, R., Hubbell,
E., Berno, A., Huang,
X.C., Stern, D., Winkler, J.,
Lockhart, D.J., Morris, M.S. e
Fodor, S.P. (1996) Science
274: 610-614.
Granjeaud, S., Nguyen C.,
Rocha, D., Luton, R. e Jordan,
B. (1996) Genetic Anal. Biomol.
Eng. 12: 151-162.
Jordan, B.R. (1998) J. Biochem.
(Tokyo) 124: 251-258.
Lennon, G.G. e Lehrach,
H. (1991) Trends Genet. 7:
314-317.
Lockhart, D.J., Dong, H.,
Byrne, M.C., Follettie, M.T.,
Gallo, M.V., Chee, M.S., Mittmann,
M., Wang, C., Kobayashi,
M., Horton, H. e
Brown, E.L. (1996) Nature
Biotechnol. 14: 1675-1680.
Nguuen, C., Rocha, D., Granjeaud,
S., Baldit, M., Bernard, K., Naquet, P. e
Jordan, B. (1995) Genomics 29: 207-
215.
Okubo, K., Hori, N., Matoba, R.,
Niiyama, T., Fukushima, A., Kojima, Y.
e Matsubara, K. (1992) Nature Genet. 2:
173-179.
Passos, G.A.S., Junta, C.M., Espanhol,
A.R., Macedo, C., Jordan, B.,
Nguyen, C., Victorero., G., Loriod, B.,
Granjeaud, S. (1999) Genetics Mol. Biol.
22, supp.: 312.
Pietu, G., Alibert, O., Guichard, V.,
Lamy, B., Bois, F., Leroy, E., Mariage-
Samson, R., Houlgate, R., Soularue, P. e
Auffray, C. (1996) Genome Res. 6: 492-
503.
Rocha, D., Carrier, A., Naspetti, M.,
Victorero, G., Anderson, E., Botcherby,
M., Nguyen, C., Naquet, P. e Jordan, B.
(1997) Immunogenetics 46: 142-151.
Schena, M., Shalon, D., Davis, R.W.
e Brown, P.O. (1995) Science 270: 467-
470.
Zhao, N., Hashida, H., Takahashi,
N., Misumi, Y. e Sakaki, Y. (1995) Gene
156: 207-213.
Agradecimentos:
À Fundação de Amparo à Pesquisa
do Estado de São Paulo (FAPESP) e ao
Institut National de la Santé et de la
Recherche Médicale (INSERM, França)
por possibilitar o trabalho em colaboração
entre nossas equipes (Proc. No. 98/
09789-4).
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 37

INTERAÇÃO
PESQUISA
PLANTA-INSETO
Adaptação dos insetos aos inibidores de proteinases produzidos pelas plantas
Fotos cedidas pelos autores
Marcio Castro Silva-Filho
Prof. Dr. da Escola Superior de Agricultura “Luiz de
Queiroz” (ESALQ/USP)
Departamento de Genética
Laboratório de Biologia Molecular de Plantas
mdcsilva@carpa.ciagri.usp.br
A
B
C
D
Maria Cristina Falco
Pós-Doc. do Departamento de Genética
da ESALQ/USP
mcfalco@carpa.ciagri.usp.br
Figura 1. Pragas de importância econômica. A) Lagarta da maçã do algodoeiro
(Heliothis virescens). B) Broca da cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis). C)
Lagarta da soja (Anticarsia gemmatalis). D) Lagarta do algodoeiro (Alabama
argillacea). Fotografias cedidas por Heraldo Negri de Oliveira (Depto de
Entomologia ESALQ/USP)
co-evolução de inibidores
de proteinases (IPs) de
plantas e proteinases de
insetos fornece um interessante
e novo paradigma
para pesquisas ecológicas, fisiológicas
e bioquímicas. As plantas parecem
ter desenvolvido IPs com extraordinárias
propriedades contra proteinases
de insetos. Eles são extremamente resistentes
à proteólise e permanecem
ativos sob diversos pHs intestinais
(Christeller et al., 1994), além de ser
identificados como inibidores contra
quase todas as classes de proteinases.
Os IPs tendem a ser sensivelmente
amplos em seus campos de ação, e há
indicações que eles têm propriedades
parecidas com a dos anticorpos para
precipitar proteinases intestinais, retirando-as
da solução. Por outro lado, as
pragas conhecidas apresentam diversas
formas de evitar os efeitos negativos
dessas proteínas de defesa presentes
nas plantas hospedeiras. Estas incluem
o uso de proteinases para as
quais as plantas hospedeiras não tenham
inibidores, a degradação proteolítica
de inibidores, e mutações adquiridas
que resultam em proteinases
menos sensíveis aos IPs sem a perda da
atividade proteolítica. Além disso, o
monitoramento de mecanismos de atividade
proteolítica, aparentemente leva
para uma rápida resposta aos altos
níveis de IPs na dieta. A expressão de
proteinases insensíveis aos IPs parece
ser flexivelmente regulada para compensar
as proteinases inibidas.
Controle de Insetos
Estima-se que as perdas provocadas
por pragas e doenças na agricultura
mundial atinjam 37% da produção, dos
quais cerca de 13% devido a insetos
(Fig. 1). Atualmente os métodos de
controle concentram-se basicamente
38 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

Tabela 1. Propriedades cinéticas e peso molecular de diferentes atividades
trípticas presentes em lagartas alimentadas com dieta artificial e à base de folhas
Enzima
T1
T2
T3
T4
Dieta à base de folhas a
Km (mM)
0,27
0,35
2,4
15
Peso Molecular (kDa)
70
67
29
17
Km (mM)
-
-
2,9
*
Dieta artificial
Peso Molecular (kDa)
-
-
29
17
a
Folhas de fumo transgênico e não transgênico apresentaram os mesmos resultados
* Atividade não detectada
na utilização de agroquímicos dentro
de um manejo integrado de pragas.
Entretanto, há uma grande demanda
por parte da sociedade pelo desenvolvimento
de uma agricultura limpa, que
diminua o uso de energia e produtos
químicos, que não deixe resíduos indesejáveis
no meio ambiente e nos alimentos,
além de reduzir as contaminações
aos agricultores. Entre as alternativas
para contornar estes problemas estão
o controle biológico e o uso de
variedades resistentes.
Com o desenvolvimento
das técnicas de
biologia molecular que
permitem a manipulação
de genes de interesse,
aliadas às metodologias
de transformação
genética de
plantas, uma nova e
interessante abordagem
no controle de
insetos vem atraindo a
atenção de pesquisadores
em todo o mundo.
Genes que codificam
para proteínas
com atividade inseticida
tornaram-se uma
arma bastante poderosa
e com um amplo
potencial de utilização.
Por outro lado, estudos
envolvendo a interação
entre as plantas
hospedeiras com seus insetos, notadamente
as pragas, não se desenvolveram
com a mesma intensidade. Um dos
sistemas mais fascinantes envolvendo
esse tipo de interação é baseado nos
estudos com inibidores de proteinases
produzidos pelas plantas e insetos herbívoros.
Inibidores de Proteinases de
Plantas Contra Insetos Herbívoros
Sabe-se há mais de 60 anos que as
plantas contêm peptídeos que atuam
como inibidores de proteinases (IPs).
Este grupo de proteínas está amplamente
distribuído no reino vegetal e faz
parte de um mecanismo de defesa das
plantas contra o ataque de pragas e
patógenos (Richardson, 1991). As proteínas
de defesa podem ser produzidas
constitutivamente em tecidos que são
particularmente vulneráveis ao ataque
de insetos, como as sementes, ou podem
ser induzidos por danos mecânicos,
como ocorre quando um inseto se
alimenta de uma folha (Jouanin et al.,
Figura 2-
Esquema representativo da ligação
de uma serino-proteinase (tripsina)
ao inibidor correspondente
(Adaptado de Bode & Huber, 1992)
1998). Entretanto, muitas delas são tóxicas
também a mamíferos, o que indica
que devam ser cautelosamente estudadas
para uso como mecanismo de proteção
de plantas a insetos.
De acordo com sua especificidade,
as proteinases podem ser divididas em
quatro classes: as serino-, cisteíno-, metalo-
e aspartil-proteinases. Os IPs mais
abundantes e estudados são aqueles
capazes de inibir as serino-proteinases,
grupo das tripsinas e quimotripsinas,
enzimas encontradas majoritariamente
em insetos da ordem Lepidoptera (Terra
& Ferreira, 1994). Os inibidores de
serino- e cisteíno-proteinases são amplamente
distribuídos em sementes e
tecidos de reserva de plantas. Portanto,
além de protegerem as plantas contra o
ataque de insetos, os IPs são utilizados
como proteínas de reserva em algumas
sementes.
O mecanismo de ação de um IP
baseia-se na inibição competitiva de
uma proteinase, via bloqueio de sua
atividade proteolítica (Fig. 2). A ingestão
de IPs pelos insetos herbívoros
interfere no processo de degradação de
proteínas no intestino médio. Assim
sendo, os inibidores são considerados
agentes anti metabólicos, pois
levam a uma deficiência protéica
dos insetos. A atividade
antibiótica dos IPs é atribuída
à sua interferência na digestão
protéica que diminui a
disponibilidade de aminoácidos,
prejudicando a síntese
de proteínas necessárias ao
crescimento, desenvolvimento
e reprodução. Uma outra
hipótese é que os inibidores
afetem o desenvolvimento de
forma indireta, via um mecanismo
de “feedback”, que
levaria a um aumento da produção
de proteinases digestivas
para compensar os baixos
níveis de aminoácidos
disponíveis. Os aminoácidos
seriam deslocados para a síntese
de proteinases em detrimento
de outras proteínas
essenciais. Entretanto, investigações
mais recentes mostraram que a
deficiência de aminoácidos essenciais
resultantes da hiperprodução de proteinases
em lagartas de Spodoptera exigua
e Heliothis zea deveu-se à redução da
atividade proteolítica intestinal (Broadway,
1995).
Uma vez estabelecido que os IPs são
produzidos pelas plantas em resposta
ao ataque de pragas, suas propriedades
antimetabólicas foram testadas contra
diversos insetos. Resultados in vitro ba-
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 39

Figura 3.
Separação das tripsinas (n)e quimotripsinas
(♦) presentes em extrato
intestinal de Spodoptera frugiperda
alimentadas com dieta artificial
(A) e com dieta artificial suplementada
com 0,5 % (p/v) de IPs extraídos
de sementes de soja (B)
seados na combinação de extratos
intestinais com diferentes inibidores,
mostraram que os IPs
foram efetivos na inibição das
proteinases digestivas. Além disso,
a incorporação de IPs em
dietas artificiais mostrou-se eficiente
em vários estudos. Desta
forma, foram obtidas plantas
transgênicas resistentes a pragas
via expressão de genes de IPs
(Hilder et al., 1987; Duan et al.,
1996; Gatehouse et al., 1997).
Paralelamente aos resultados
positivos com as plantas transgênicas,
um número crescente
de trabalhos mostrou que os
insetos eram capazes de adaptar-se
à presença dos inibidores
produzidos pelas plantas (para
uma revisão, veja Jongsma &
Bolter, 1997).
Mecanismos de Adaptação
dos Insetos aos Inibidores
de Proteinase
Em um trabalho pioneiro,
Jongsma e colaboradores (1995a)
observaram que lagartas de Spodoptera
exigua adaptaram-se à presença de
IPs expressos em plantas transgênicas
via indução de proteinases insensíveis
ao inibidor. A partir de então, estas
observações foram extendidas à uma
ampla gama de insetos-praga. No entanto,
um outro mecanismo adaptativo
baseado na síntese de proteinases capazes
de inativar, via degradação proteolítica,
os IPs produzidos pelas plantas
foi descrito por outros grupos (Giri
et al., 1998; Girard et al., 1998).
O Laboratório de Biologia Molecular
de Plantas do Departamento de
Genética da ESALQ/USP iniciou, recentemente,
estudos envolvendo o uso
de IPs visando a obtenção de resistência
a pragas de importância econômica.
Os trabalhos também tiveram como
objetivo o estudo a nível molecular da
interação entre plantas de interesse
econômico e insetos herbívoros. O
primeiro trabalho avaliou os efeitos da
presença do inibidor de proteinase do
tipo 2 de batata (PIN-2) em plantas
transgênicas de tabaco, sobre o desenvolvimento,
metabolismo e proteinases
intestinais da lagarta da maçã do
algodoeiro, Heliothis virescens (Brito et
al., submetido). Os ensaios biológicos,
realizados com apoio do Departamento
de Entomologia da ESALQ/USP mostraram
não haver diferenças significativas
quando comparados com o tratamento
à base de plantas não transformadas.
Estas observações levaram à
hipótese de uma adaptação deste inseto
ao inibidor. A fim de estudar o
possível mecanismo adaptativo das
lagartas, foram caracterizadas as proteinases
digestivas dos insetos, com
apoio do Laboratório de Bioquímica
de Insetos do Departamento de Bioquímica
do IQ/USP. Assim, as lagartas
foram submetidas a três dietas distintas:
1) à base de folhas de plantas
transgênicas de fumo, 2) folhas de
plantas de fumo não transformado e,
3) dieta artificial sem a presença de IPs.
A combinação de técnicas de separação
de proteínas e estudos cinéticos,
revelaram a presença de duas tripsinas
e uma quimotripsina no tratamentos à
base de dieta sem inibidor. No entanto,
em lagartas alimentadas à base de
folhas transgênicas ou não, foram detectadas
quatro atividades trípticas,
sendo que duas eram totalmente novas
(Tab. 1). Uma única atividade
de quimotripsina foi observada.
Uma observação interessante foi
que as novas tripsinas apresentavam
pesos moleculares bem superiores
aos demais e maior afinidade
pelo substrato. A filtração
em gel na presença ou ausência
de SDS, revelou que as tripsinas
de alto peso molecular seriam
originadas a partir das tripsinas de
menor peso recém sintetizadas,
via um processo de oligomerização.
Portanto, trata-se de mais um
novo mecanismo de adaptação
dos insetos aos IPs produzidos
pelas plantas.
Novas evidências de adaptação
dos insetos à presença de
inibidores de proteinases foram
verificadas em um estudo envolvendo
um outro inseto polífago
(múltiplos hospedeiros), a lagarta
do cartucho do milho, Spodoptera
frugiperda, e inibidores de serinoproteinases
extraídos de soja.
Os inibidores de proteinase de
soja “Bowman-Birk” e “Kunitz” foram
incorporados em dietas artificiais que
foram utilizadas na alimentação das
lagartas desde as primeiras fases do
desenvolvimento. Embora os ensaios
de inibição in vitro tenham mostrado
uma alta eficiência contra as proteinases
da lagarta, os ensaios biológicos
mostraram que não houve alterações
significativas no desenvolvimento e
metabolismo de lagartas alimentadas
com dieta artificial contendo inibidores
extraídos da soja. Esse fato levou à
investigação do mecanismo responsável
pela adaptação dos insetos à presença
dos inibidores. Para isso, foram
analisados extratos intestinais das lagartas
alimentadas com dietas contendo
os inibidores. O mecanismo adaptativo
desenvolvido pelas lagartas de S.
frugiperda estava relacionado à alteração
na expressão das serino-proteinases.
Os resultados mostraram o aparecimento
de uma nova atividade tríptica
e um aumento significativo na atividade
quimotríptica do inseto (Fig. 3). A
polifagia do inseto pode ter facilitado
o desenvolvimento de proteinases que
tenham reduzida afinidade aos IPs da
soja. Como a eficiência de um inibidor
específico é dependente da compatibilidade
estrutural do seu sítio reativo
com o sítio ativo da proteinase, é
provável que as enzimas digestivas
tenham sofrido alterações nos amino-
40 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

ácidos que circundam o sítio de ligação,
resultando em uma fraca interação com
os inibidores (Paulillo et al., no prelo).
Perspectivas na Utilização de
Inibidores de Proteinases no
Controle de Insetos
Ao se considerar a possibilidade de
produzir plantas transgênicas expressando
IPs, algumas considerações se
fazem necessárias a fim de aumentar as
chances de sucesso. Entre estas, incluem-se
os níveis de expressão do IP, sua
constante de inibição, a estabilidade do
IP no intestino do inseto e a habilidade
de adaptação do inseto aos inibidores
via alteração da expressão gênica. Fatores
ambientais secundários também podem
interferir na severidade dos sintomas.
Como os IPs agem causando uma
deficiência na disponibilidade de aminoácidos,
a digestibilidade do alimento,
a concentração e a qualidade protéica
da dieta serão determinantes
para maximizar os efeitos dos IPs
sobre os insetos. Além disso, inúmeros
compostos fitoquímicos
presentes ou induzidos pelas plantas
também apresentam potencial
de alterar a toxicidade dos IPs
sobre os insetos hospedeiros (Broadway
& Duffey, 1988).
A pressão de seleção sobre os
insetos para desenvolver proteinases
que são insensíveis aos IPs
de plantas hospedeiras são consideráveis
e a evolução de insetos
em muitas gerações por ano oferece
uma vantagem significativa sobre
as plantas. Mas, além das altas
concentrações de inibidores, as
plantas podem encontrar alternativas
de melhorar a eficácia de
seus inibidores envolvendo multidomínios
ou variantes multiméricos.
Isso é antes regra que exceção
entre os IPs vegetais, e uma ampla
gama de combinações é observada.
Além de serem encontrados
inibidores com sítios ativos repetidos,
é comum encontrar inibidores
de serino-proteinases em combinações
com inibidores de cisteíno-,
aspartil-proteinases e amilases
(Richardson, 1991). Isto, por
um lado, parece uma elegante
forma de economizar proteínas,
mas o significado desses múltiplos
sítios pode ser muito mais complexo.
Ferreira et al. (1994) têm demonstrado
que as enzimas digestivas de insetos
ocorrem muitas vezes em formas multiméricas.
Jongsma & Bolter (1997) propõem
que os efeitos da combinação de
inibidores multiméricos com enzimas
multiméricas em quantidades equimolares
devem ser muito similar aos anticorpos
policlonais e antígenos com múltiplos
epitopos.
Os insetos polífagos são um caso
interessante. Ao longo da evolução,
estes insetos desenvolveram a capacidade
de atacar uma grande variedade
de espécies vegetais, incluindo mono e
dicotiledôneas. Consequentemente, eles
foram capazes de responder a uma
gama de diferentes inibidores vegetais.
Isso vai de encontro aos resultados
obtidos pelo nosso grupo e descritos
acima. Recentes experimentos com plantas
transgênicas utilizando genes de IPs
de monocotiledôneas expressos em dicotiledôneas
e vice-versa, sugeriram que
aqueles insetos que normalmente se
Figura 4.
A metodologia do “Phage Display”
(Adaptado de Webster, 1996)
alimentam de mono ou dicotiledôneas
são capazes de se adaptar a IPs de
diversos tipos de plantas (Leplé et al.,
1995). Para contornar estes problemas
de adaptação, seria interessante utilizar
IPs de espécies vegetais bastante separadas
evolutivamente daquelas cujos
insetos são predadores. Duan et al.,
(1996) demonstraram que isso é possível
a partir da obtenção de plantas
transgênicas de arroz expressando o
inibidor de proteinase do tipo 2 de
batata. Os autores mostraram que as
plantas transgênicas foram protegidas
contra o ataque da praga Sesamia inferens.
Esta possibilidade está sendo
testada no nosso laboratório com a
broca da cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis)
e os inibidores de proteinases
de soja (Kunitz e Bowman-Birk). Os
resultados da caracterização das
proteinases das lagartas, seguido
da realização de ensaios biológicos
com a incorporação dos IPs
de soja em dieta artificial, mostraram-se
muito promissores (Patrícia
Pompermayer, comunicação
pessoal). Assim, os genes
que codificam para os IPs da soja
foram clonados e utilizados na
transformação genética da canade-açúcar
(Maria Cristina Falco,
comunicação pessoal).
Uma outra alternativa seria a
geração de novas moléculas de
inibidores de proteinases específicos
contra enzimas de pragas
de importância econômica. Esta
estratégia pode ser testada utilizando-se
IPs engenheirados, com
suas afinidades otimizadas por
modelos computacionais, como
descrito por Urwin et al. (1995),
ou por “phage display”, como
proposto por Jongsma et al.
(1995b). Na metodologia do
“phage display”, múltiplas sequências
de genes inibidores, que
diferem apenas no sítio da proteína
que interage com a proteinase
do inseto são geradas, utilizando-se
a técnica da Reação da
Polimerase em Cadeia -“PCR” e
oligonucleotídeos degenerados.
A biblioteca é clonada em um
fagomídeo ou um vetor M13
fusionado ao gene da capa protéica
- g3 - do fago, que expõe as
proteínas em sua superfície. Esses fagos
são selecionados contra uma proteína
de interesse (proteinase digestiva de D.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 41

saccharalis, por exemplo), imobilizada
em suporte sólido (uma placa Elisa, p.
ex.). Subseqüentes lavagens eliminam
os fagos sem ou com pouca afinidade.
As partículas do fago com alta afinidade
são selecionadas para transformação de
E. coli, fornecendo novos genes e codificando
inibidores de proteinase mais
específicos (Fig. 4). Essa metodologia
foi utilizada para a família de inibidores
do tipo Kunitz, gerando inibidores potentes
e específicos contra várias proteinases
do tipo serina (Roberts et al.,
1992; Dennis & Lazarus, 1994). Esta
estratégia vem sendo explorada em
nosso laboratório com o IP “Bowman-
Birk” de soja, dirigido contra as proteinases
digestivas da broca da cana-deaçúcar,
D. saccharalis (Marcia O. de
Mello, comunicação pessoal).
Provavelmente algum mecanismo
adaptativo ocorrerá, apesar da
utilização desta tecnologia. O que se
procura, na verdade, é que esta adaptação
seja mais lenta, de forma a permitir
um maior tempo de cultivo sem que a
presença dos insetos cause danos econômicos
significativos à cultura. A utilização
de vários métodos de controle
dentro do manejo integrado de pragas,
a diversificação do material cultivado,
de forma a diminuir a pressão de seleção
sobre a praga, rotação de culturas e
práticas culturais, retardariam o aparecimento
de insetos resistentes.
A maioria das pesquisas atuais estão
focadas na expressão de inibidores de
proteinases únicos em plantas transgênicas.
O sucesso deve ser mais significativo
quando combinações de IPs cobrirem
o espectro de proteinases intestinais.
Isto tornará mais difícil para o
inseto superar os efeitos dos IPs simplesmente
aumentando a expressão de
genes de proteinases insensíveis aos
IPs. Alguns desses genes podem ser
encontrados na natureza, mas a engenharia
genética tem permitido alterá-los
de forma a torná-los mais eficientes.
Na verdade, é necessário compreender
melhor o modo de ação dos IPs
sobre os insetos e as formas pelas quais
eles se adaptam. Esta promete ser uma
linha de pesquisa com muito espaço
para crescer nos próximos anos.
Agradecimentos
Agradecemos a colaboração dos professores
Walter R. Terra (Depto. de
Bioquímica, IQ/USP) e José Roberto P.
Parra (Depto. de Entomologia, ESALQ/
USP), à FAPESP pelo suporte financeiro,
ao Biólogo Heraldo Negri de Oliveira
42 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento
(Depto. de Entomologia, ESALQ/USP),
pelas fotografias.
Referências Bibliográficas
Bode W & Huber R (1992) Natural
protein proteinase inhibitors and their
interation with proteinases. Europ Biochem
204: 433-451.
Broadway RM & Duffey SS (1986)
Plant proteinase inhibitor: mechanism
of action and effect on the growth and
digestive physiology of larval Heliothis
zea and Spodoptera exiqua. J Insect
Physiol 32: 827-833.
Broadway RM & Duffey SS (1988)
The effect of plant protein quality on
insect digestive physiology and the
toxicity of plant proteinase inhibitors. J
Insect Physiol 34: 1111-1117.
Broadway RM (1995) Are insects
resistant to plant proteinase inhibitors?
J Insect Physiol 41: 107-116.
Christeller JT, Laing WA, Markwick
NP, Burgess EPJ (1992) Midgut protease
activities in 12 phytophagous lepidopteran
larvae: dietary and protease
inhibitor interactions. Insect Biochem
Mol Biol 22: 735-746,.
Dennis MS & Lazarus RA (1994)
Kunitz domain inhibitor of tissue factor-Factor
VIIa. I. Potent inhibitor selected
from libraries by phage-display.
J Biol Chem 269: 22129-22136.
Duan X, Li X, Xue Q, Abo-El-Saad
M, Xu D, Wu R. (1996) Transgenic rice
plants harboring an introduced potato
proteinase inhibitor II gene are insect
resistant. Nature Biotech 14: 494-498.
Ferreira C, Capella AN, Sitnik R,
Terra WR (1994) Properties of the digestive
enzymes and the permeability
of the periotrophic membrane of Spodoptera
frugiperda (Lepidoptera) larvae.
Comp Biochem Physiol 107: 631-
640.
Gatehouse AMR, Davison GM,
Newell CA, Merryweather A, Hamilton
WDO, Burgess EPJ, Gilbert RJC, Gatehouse
JA (1997) Transgenic potato
plants with enhanced resistance to the
tomato moth, Lacanobia oleracea: growth
room trials. Mol Breed 31: 49-63.
Girard C, Le Métayer M, Bonadé-
Bottino M, Pham-Delègue M-H, Jouanin
L (1998) High level of resistance to
proteinase inhibitors may be conferred
by proteolytic cleavage in beetle larvae.
Insect Biochem Mol Biol 28: 229-237.
Giri AP, Harsulkar AM, Deshpande
VV, Sainani MN, Gupta VS, Ranjekar PK
(1998) Chickpea defensive proteinase
inhibitors can be inactivated by podborer
gut proteinases. Plant Physiol 116:
393-401.
Hilder VA, Gatehouse AMR, Sheerman
SE, Barker RF, Boulter D (1987) A
novel mechanism of insect resistance
engineered into tobacco. Nature 330:
160-163.
Jongsma MA, Bakker PL, Peters J,
Bosch D, Stiekema WJ (1995a) Adaptation
of Spodoptera exigua larvae to
plant proteinase inhibitors by induction
of gut proteinase activity insensitive
to inhibition. Proc Natl Acad Sci
USA 92: 8041-8045.
Jongsma MA, Bakker PL, Stiekema
WJ, Bosch D (1995b) Phage display of
a double-headed proteinase inhibitor
analysis of the binding domains of
potato proteinase inhibitor II. Mol Breed
1: 181-191.
Jongsma MA & Bolter C (1997) The
adaptation of insects to plant protease
inhibitors. J Insect Physiol 43: 885-895.
Jouanin L, Bonadé-Bottino M, Girard
C, Morrot G, Giband M. (1998)
Transgenic plants for insect resistance.
Plant Sci 131: 1-11.
Leplé JC, Bonadé-Bottino M, Augustin
S (1995) Toxicity to Chrysomela
tremulae (Coleoptera: Chrysomelidae)
of transgenic poplars expressing a
cysteine proteinase inhibitor. Mol Breed
1: 319-328.
Michaud D (1997) Avoiding protease-mediated
resistance in herbivorous
pests. Trends Biotechnol 15: 4-6.
Paulillo LCMS, Lopes AR, Cristofoleti
P, Parra JRP, Terra WR, Silva-Filho
MC (2000) Changes in midgut endopeptidase
activity of Spodoptera frugiperda
(J.E. Smith, 1797) is responsible
for adaptation to soybean proteinase
inhibitors. J Econ Entomol (No Prelo).
Richardson MJ (1991) Seed Storage
Protein: the Enzyme inhibitors. In:
Roger L.J. ed. Methods in Plant Biochemistry,
Academic Press, New York,
v.5, p. 259-305 .
Roberts BL, Markland W, Siranosian
K, Saxena MJ, Guterman SK, Ladner
RC (1992) Protease inhibitor display
M13 phage: selection of high affinity
neutrophil elastase inhibitors. Gene
121: 9-15.
Terra WR, Ferreira C (1994) Insect
digestive enzymes: properties, compartmentalization
and function. Comp
Biochem Physiol 109B: 1-62.
Webster RE (1996) Biology of the
filamentous bacteriophage. In: Kay BK,
Winter J, McCafferty J. Phage Display
of Peptides and Proteins: A Laboratory
Manual. Academic Press, Inc. 344p.

DEKALB
Atenção:
Anúncio Novo em Anexo!
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 43

CONSTRUINDO
PESQUISA
FLORES
Marcelo Carnier Dornelas
phD pela Université de Paris XI (France)
Pesquisador do Departamento de Ciências
Florestais da Escola Superior de
Agricultura Luiz de Queiroz - USP
mcdornel@carpa.ciagri.usp.br
O controle molecular da arquitetura floral
Fotos cedidas pelo autor
A uniformidade estrutural
das plantas
Uma idéia unificadora em biologia
vegetal é que a variedade de formas dos
vegetais reflete simplesmente variações
de um plano de desenvolvimento comum.
Diferentes permutações de umas
poucas características-chave do desenvolvimento
vegetal podem gerar um universo
de formas distintas. Provavelmente
não há ilustração melhor deste princípio
do que a comparação entre uma flor e um
ramo. A noção de que estas duas estruturas
poderiam ser fundamentalmente
equivalentes foi exemplificada
pela primeira vez pelo
famoso naturalista e poeta Goethe
(o mesmo que escreveu
«Fausto»), em um tratado sobre
a metamorfose, há mais de 300
anos. Goethe concluiu que «As
flores que se desenvolvem das
gemas devem ser vistas como
ramos ou plantas inteiras, inseridas
na planta-mãe, como esta
está inserida na terra» (Goethe,
1790). Comparando-se flores e
ramos, quatro detalhes precisam
ser esclarecidos. Primeiro,
as diferentes partes de uma flor
(sépalas, pétalas, estames e carpelos)
são os equivalentes de
folhas em um ramo. Segundo, os órgãos
de ramos e flores são separados por
entrenós, mas no caso das flores, estes
são tão curtos que raramente são visíveis.
Terceiro, os órgãos dos ramos e das flores
podem ter uma filotaxia distinta, ou seja,
são diferencialmente arranjados ao redor
de um eixo. Finalmente, o crescimento
indeterminado que caracteriza um ramo
é suprimido, no caso de uma flor, tanto
apicalmente, porque uma flor, em geral,
pára de produzir órgãos ao redor do eixo
central, quanto lateralmente, pois novos
brotos não surgem nas axilas dos órgãos
florais, como pode acontecer nas axilas
das folhas dos ramos.
Portanto, a comparação entre flores e
ramos aponta quatro variáveis importantes:
a identidade dos órgãos produzidos,
o tamanho do entrenó, a filotaxia e a
determinação do crescimento. Desse
modo, as inúmeras formas e hábitos
visíveis das plantas simplesmente refletem
variações e permutações desses quatro
aspectos fundamentais do desenvolvimento.
Quais os princípios criadores e
reguladores desses parâmetros? Eles poderiam
ser manipulados pelo Homem?
Figura 1: A flor de arabidópsis
(Arabidopsis thaliana) do tipo
selvagem possui 4 sépalas (não
visíveis nesta foto), 4 pétalas brancas,
6 estames e um gineceu composto
por 2 carpelos unidos
O desenvolvimento de ramos e flores
depende do comportamento das regiões
de proliferação celular na planta, os meristemas
apicais. Na periferia dos meristemas,
grupos de células são arregimentados
para formar meristemas secundários
ou primórdios de órgãos. A filotaxia
depende do padrão preciso em que ocorre
essa repartição. A determinação também
é reflexo desta partição, principalmente
se ela favorece a continuidade do
meristema ou a formação de primórdios.
A identidade dos órgãos formados depende
das caractísticas do desenvolvimento
dos primórdios (principalmente
de seu padrão de divisões celulares).
Finalmente, o crescimento da região entre
os mesmos determina o tamanho dos
entrenós.
Dessa forma, a grande questão é:
como as células ainda indiferenciadas
«aprendem» suas posições
relativas de tal forma a se diferenciarem
de maneira correta?
Esta pergunta tem preocupado,
há muito tempo, pesquisadores
que estudam a formação de padrões
de desenvolvimento em
diferentes organismos, na tentativa
de compreender como o
comportamento de um grupo
de células é coordenado. A formação
de padrões durante o
desenvolvimento tem sido mais
intensamente estudada em animais,
particularmente a moscadas-frutas,
do gênero Drosophila.
Recentemente, entretanto,
vários grupos trabalhando com
plantas modelo como a boca-de-leão
(Antirrhinum majus) e arabidópsis (Arabidopsis
thaliana, Figura 1) usaram dados
genéticos e moleculares para formular
um modelo de um processo formador
de padrão de desenvolvimento único de
plantas: a especificação dos órgãos florais.
O modelo ABC do
desenvolvimento floral
Embora uma vasta gama de mutações
genéticas possa alterar o processo de
44 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

formação de uma flor, relativamente poucos
genes foram encontrados que estejam
envolvidos com a especificação dos
órgãos florais per se. Mutações em tais
genes causam transformações homeóticas
em dois verticilos adjacentes da flor.
Os dois verticilos mais externos de mutantes
apetala2 (ap2) de arabidópsis, por
exemplo, contêm carpelos e estames no
lugar de sépalas e pétalas, respectivamente.
Mutações nos genes APETALA3
(AP3) ou PISTILLATA (PI) de arabidópsis
causam a substituição de pétalas por
sépalas e de estames por carpelos. Finalmente,
no mutante agamous (ag; Figura
2) de arabidópsis, os dois verticilos mais
internos são alterados: estames são transformados
em pétalas e carpelos em sépalas.
(Coen & Meyerowitz, 1991; Meyerowitz
et al., 1991; Ma, 1998). Em adição ao
controle da identidade dos órgãos florais,
o gene AG deve suprimir o crescimento
do meristema floral uma vez que os
carpelos estão formados, pois a mutação
ag tem o efeito adicional de causar a
proliferação indeterminada do meristema.
Desta forma, o quarto verticilo de
uma flor ag constitui o primeiro verticilo
de uma nova «flor» mutante, que contém
outras em seu interior. Portanto, o gene
AG também é responsável pelo hábito
determinado do meristema floral.
As modificações das características
dos órgãos florais dos mutantes descritos
acima sugerem um modelo combinatorial
simples para a determinação da identidade
destes órgãos (Coen & Meyerwitz,
1991; Figura 3). Segundo este modelo, os
genes responsáveis pela identidade estão
ativos em três regiões sobrepostas, cada
uma compreendendo dois verticilos adjacentes.
Devido à sobreposição das regiões
de expressão de cada gene, uma
combinação única de genes especifica a
identidade de cada verticilo (Figura 3a).
Se a região de atividade B (que requer a
expressão dos genes AP3 e PI em arabidópsis)
está ausente, ambos os verticilos
1 e 2 serão especificados apenas pela
região de atividade A (AP2 em arabidópsis)
e conterão sépalas (Figura 3b). De
maneira similar, nesse caso, os verticilos
3 e 4 serão ambos especificados pela
região de atividade C (AG em arabidópsis)
e conterão carpelos. Para explicar os
fenótipos dos mutantes ap2 e ag, é necessário
adicionar ao modelo a previsão de
que as atividades A e C são mutuamente
antagonistas. Ou seja, em um mutante
para genes do tipo A, a ação de C se
expande para os quatro verticilos e em
um mutante do tipo C, dessa vez, é a
atividade de A que é expressa nos quatro
verticilos (Figuras 3c, d).
Esse modelo, criado para explicar os
fenótipos de mutantes simples,
passa por uma prova final: ele
fielmente prevê o fenótipo de
mutantes duplos. Por exemplo, o
modelo prevê que, se as funções B
e C fossem removidas, C deveria
definir a identidade dos quatro
verticilos, que se desenvolveriam
em carpelos. De fato, todos os
verticilos do mutante duplo ap2ap3
contêm carpelos (Meyerowitz et
al., 1991). Similarmente, se as atividades
B e C estivessem ausentes,
A deveria definir a identidade de
todos os órgãos da flor. Como
previsto pelo modelo, sépalas se
desenvolvem em todos os verticilos de
mutantes duplos agpi. O fenótipo deste
duplo mutante apresenta ainda vários
verticilos concêntricos adicionais (todos
compostos de sépalas), devido ao efeito
da mutação ag de suprimir a determinação
do meristema floral.
O que aconteceria se ambas as funções
A e C fossem removidas? A atividade
B sozinha definiria a identidade dos verticilos
2 e 3, porém nenhuma das atividades
identificadas estaria presente nos
verticilos 1 e 4. O modelo não faz nenhuma
previsão óbvia sobre o fenótipo resultante,
pois nenhum destes estados ocorre
em nenhum verticilo da flor do tipo
selvagem. A função B é associada à
formação de pétalas e estames; assim,
espera-se que, na ausência de A e C, B
cause a produção de órgãos intermediários
entre pétalas e estames. De fato, os
verticilos 2 e 3 das flores do mutante
duplo ap2ag são ocupados por pétalas
estaminoidais. Os verticilos 1 e 4 deste
duplo mutante contêm folhas. Igualmente,
no triplo mutante ap2ap3ag, no qual
as funções A, B e C foram desativadas, as
«flores» são formadas por folhas organizadas
em vários verticilos concêntricos.
Estas observações indicam que a folha
seria o «estado basal» a partir do qual a
identidade de cada órgão floral seria
determinada.
Por meio destes resultados, a equivalência
de flores e ramos (e portanto de
órgãos florais e folhas), clamada por
Goethe há mais de 300 anos, foi finalmente
demonstrada.
O ABC não é suficiente
Figura 2: A flor do mutante
agamous de arabidópsis é
composta por uma série de
verticilos contendo apenas
sépalas e pétalas
Durante a década passada, todos os
genes descritos acima foram clonados e
seqüenciados. A localização dos respectivos
RNA mensageiros foi determinada
por hibridização in situ e corresponde,
de fato, às regiões descritas pelo modelo
ABC (veja a revisão de Ma, 1998). Todos
os genes do modelo ABC codificam fatores
de transcrição, sugerindo que seus
respectivos produtos ativam ou reprimem
a transcrição de outros genes requeridos
para a diferenciação de tipos celulares
órgão-específicos. Embora o modelo
ABC explique com sucesso como a
combinação de genes homeóticos pode
especificar a identidade dos primórdios
dos órgãos florais, ele não explica como
os domínios de expressão de cada gene
homeótico são definidos. Outros mutantes
homeóticos do desenvolvimento floral
de arabidópsis, como superman (sup;
Figura 4) e leafy (lfy), foram caracterizados
e os genes correspondentes, clonados.
O estudo do fenótipo destes mutantes
e dos mutantes duplos entre esses e os
do modelo ABC, permitiu o aprimoramento
do modelo (Ma, 1998). Assim,
SUP, cujo mutante apresenta o desenvolvimento
de anteras no lugar de carpelos,
embora possua os verticilos 1, 2 e 3
normais (Figura 4), estaria envolvido na
retenção da expressão dos genes de
função B. O gene LFY faria o papel
contrário, ativando os genes de função B.
Tanto LFY quanto SUP também codificam
reguladores de transcrição. Outros fatores
de transcrição, como o codificado
pelo gene PERIANTHIA (PAN, Figura 5),
controlam o número de órgãos florais
sem alterar suas identidades (veja a revisão
de Baum, 1998). Assim, as flores do
mutante pan possuem mais sépalas e
pétalas que as do tipo selvagem (Figura
5).
Em animais, a atividade e a extensão
do domínio de expressão de fatores de
transcrição envolvidos no desenvolvimento
são geralmente controladas por
cascatas de sinalização. O exemplo de
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 45

estudo mais detalhado deste mecanismo
é o da cascata iniciada pelo gene WIN-
GLESS (WG) de Drosophila. O produto do
gene WG é utilizado como um sinal na
comunicação entre as células. Como resultado
desta comunicação, decisões relativas
ao destino celular são tomadas,
tais como a expressão de genes homeóticos.
Um elemento chave da cascata de
sinalização de WG é o gene SHAGGY
(SGG) que codifica uma proteína-kinase.
Homólogos de SGG foram recentemente
clonados em arabidópsis e denominados
ASK (Dornelas et al., 1998; 1999). Os
genes ASK formam uma família multigênica,
cujos produtos parecem fazer parte
de uma cascata de sinalização semelhante
àquela em que SGG está envolvido. Os
produtos dos genes ASK controlam o
domínio de expressão de AG e AP3 e,
portanto, a arquitetura floral (Dornelas et
al., in press). Assim, aparentemente, mecanismos
controladores de alguns aspectos
do desenvolvimento podem ter sido
conservados entre animais e plantas.
Evolução e biotecnologia
Figura 3: Modelo ABC para a especificação
da identidade dos órgãos
florais. O modelo prevê os casos em
que todos os fatores estão presentes,
como no tipo selvagem (a); quando
o fator B está ausente, como no
mutante apetala3, de arabidópsis;
quando o fator A está ausente, como
no mutante apetala2 e quando o
fator C está ausente, como no mutante
agamous. Se: sépala; Pe: pétala;
Es: estame; Ca: carpelo
Como tanto os genes homeóticos do
modelo ABC quanto os genes reguladores
ASK são conservados durante a evolução,
espera-se que os mecanismos de
desenvolvimento dos órgãos florais sejam
semelhantes entre as diferentes espécies
de plantas. De fato, vários homólogos
dos genes envolvidos na diferenciação
floral foram clonados em vários gêneros
e famílias, tanto de mono- como de
dicotiledôneas, e o princípio de funcionamento
dos mesmos parece conservado
pela evolução (Baum, 1998).
A obtenção de plantas transgênicas,
onde se modifica a expressão dos genes
envolvidos no florescimento, tem demonstrado
que é possível a manipulação
da arquitetura floral pelo Homem (Ma,
1998; Dornelas et al. in press). As conseqüências
biotecnológicas são óbvias. A
capacidade de modelar a arquitetura floral
artificialmente, eliminando ou adicionando
verticilos e/ou modificando a identidade
e a posição de cada órgão floral,
abre um invejável universo de possibilidades
agronômicas.
Assim, com a possibilidade atual
de «construir» flores por meio da manipulação
genética molecular, a expressão
«engenharia genética» ganhou um aspecto
arquitetônico renovado.
Referências
Baum, D. (1998) The evolution of
plant development. Curr. Opin. Plant
Biol. 1:79-86.
Coen, E.S.; Meyerowitz, E.M. (1991)
The war of the worls: genetic interactions
controlling flower development. Nature
353:31-37.
Dornelas, M.C.; Lejeune, B.; Dron, M.;
Kreis, M. (1998). The Arabidopsis SHA-
GGY-related protein kinase (ASK) gene
family: structure, organization and evolution.
Gene 212:249-257.
Dornelas, M.C.; Wittich, P.E.; von
Recklinghausen, I.R.; van Lammeren,
A.A.M.; Kreis, M. (1999). Characterization
of three novel members of the Arabidopsis
SHAGGY-related protein kinase (ASK)
multigene family. Plant Mol. Biol. 39:137-
147.
Goehte, J.W. (1790). Versuch die metamorphose
der Plantzen zu erklaren. In:
A. Arber (1946) Goethe´s Botany. Chron.
Bot. 10:63-126.
Ma, H. (1998). To be, or not to be, a
flower - control of floral meristem identity.
Trends in Genetics 14:26-32.
Meyerowitz, E.M.; Bowman, J.L.; Brockman,
L.L.; Drews, G.L.; Jack, T.; Sieburth,
L.E.; Weigel, D. (1991). A genetic and
molecular model for flower development
in Arabidopsis thaliana. Development
112 (Suppl.): 157-169.
Figura 4: A flor do mutante superman de arabidopsis
possui estames (órgãos masculinos) no lugar dos carpelos
(órgãos femininos) no verticilo central
Figura 5: As flores do mutante perianthia de arabidopsis
apresentam um número superior de sépalas e pétalas (5 ou
mais) que as do tipo selvagem (sempre 4)
46 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

BAYER
Atenção:
REPETE FOTOLITO ANTIGO
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 47

SEÇÃO DE CARTAS
CARTAS
Para entrar em contato com Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento você pode
enviar sua correspondência via Internet, fax ou carta para esta seção. A critério do editor,
as mensagens poderão ser publicadas resumidamente. Nossos endereços são:
Redação de Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento: SRTV/Sul – Quadra 701 – Ed.
Palácio do Rádio II, sala 215 – Cep 70340-902 – Brasília –DF Tel: (061) 225-1512 Fax:
(061)224-2830
Home-page: http://www.biotecnologia.com.br Email: kl3@biotecnologia.com.br
Parabenizo a equipe responsável pela
revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento
pois há muito estávamos
precisando de uma revista tão
bem elaborada tanto em nível editorial
quanto em nível de conteúdo,
sempre abordando temas atuais de
forma simples e bem ilustrada.
A revista constitui-se de fato um
material excelente para a elaboração
de discussões em sala de aula com
alunos de graduação que geralmente
não tem acesso à revistas estrangeiras,
ou não dominam o inglês. Certamente
utilizarei no próximo período
letivo os artigos sobre OGM’S com
meus alunos dos cursos de Engenharia
Florestal e Agronomia na Universidade
Federal de Mato Grosso, e
dessa forma abordar o tema de uma
forma diferente desta que sempre
ouvimos em simpósios e palestras:
muitas perguntas, poucas respostas.
O artigo de Escape Gênico do
Prof.Dr.ALuísio Borém(UFV) vem
mostrar algo completo com relação
ao risco ao meio ambiente. Chega de
achismo!
Parabéns!
Profa.Rute Magalhães Brito Ribon
Departamento de Biologia e Zoologia
– IB/UFMT (MSc em Genética
e Melhoramento - UFV).
llll
Sou assinante desta revista e aluno
do curso de Engenharia Agrícola da
Universidade Estadual de Campinas,
e gostaria de parabenizá-los pela
ótima revista produzida. Estou fazendo
uma pesquisa para meu orientador,
a respeito da utilização de agroquímicos,
e gostaria de saber: qual a
quantidade de herbicidas necessários
para manter uma lavoura de Soja
de um hectare “limpa”, considerando
que foram utilizadas as doses
corretas, desde o plantio até a colheita.
Em relação as várias formulações
existentes atualmente, qual o custo
para o produtor?
Sem mais, obrigado.
Daniel Albiero
Dalbiero@agr.unicamp.br
As informações acima poderão ser
obtidas junto à Associação Nacional
de Defesa Vegetal, ANDEF. Pelo tel.
0XX11- 8815033.
llll
Gostaria de parabenizar a iniciativa
de vocês de iniciarem uma revista tão
boa. Assinei a revista e estou ansiosa
para receber os outros números.
Estou interessada em reportagens sobre
biotecnologia em plantas do Cerrado,
portanto sugiro este tema para
reportagem.
Daniela Orem
Zazae487@zaz.com.br
Informamos que sua sugestão foi encaminhada.
llll
Informamos a inauguração do laboratório
de Fitopatologia Molecular e
Engenharia Genética em 01/10/99 da
UFSCAR- Lafimeg – Laboratório de
Fitopatologia Molecular e Engenharia
Genética.
Centro de Ciências Agrárias – Dep. de
Biotecnologia Vegetal – CCA
Lafimeg@dbv.cca.ufscar.br
www.dbv.cca.ufscar.br
llll
Agradeço a divulgação do site do
nosso laboratório (Cultura de Tecidos
da UFPEL), na página eletronica
desta revista. Nosso contador de visitas
aumentou consideravelmente. Gostaria
que divulgassem outras páginas da nossa
Universidade, relacionadas a programas
de pós-graduação, tais como:
Programa de Pós –Graduação em Fitossanidade
(FAEM-UFPel), áreas de concentração
em: Solos, Fitomelhoramento,
Fruticultura de Clima Temperado e
Produção Vegetal.
www.ufpel.tche.br/faem/ppga
Programa de Pós- Graduação em Fitossanidade
(FAEM-Ufpel), áreas de concentração
em: Fitopatologia e Entomologia.
www.ufpel.tche.br/faem/ppgfs
Programa de Pós-Graduação em Fisiologia
Vegetal (IB-UFPel)
Mestrado
www.ufpel.tche.br/ib/botanica/fisiologia
delponte@ufpel.tche.br
llll
A Faculdade de Engenharia Agrícola-
FEAGRI – da UNICAMP promoveu o
evento Engenharia Agrícola aberta ao
Público nos dias 17 e 18 de Setembro
de 1999. O evento teve como objetivo
apresentar a sociedade em geral e aos
vestibulandos, as atividades desenvolvidas
na faculdade, bem como possibilitar
a esse público a oportunidade de
nos visitar e conhecer as nossas modernas
instalações e laboratórios, assim
como conhecer um pouco sobre a profissão
em Engenharia Agrícola, seu
mercado de trabalho e perspectivas
futuras. Mais informações na página da
Faculdade de Engenharia agrícola.
www.agr.unicamp.br
48 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento