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(iv)(Lep., Sphingidae) uma aminopeptidaseN implicada na interaçãoda toxina Cry1Ac. Os modelosde receptores atualmentedescritos mostram que uminseto pode apresentar, emquantidade variável, diversasclasses de receptores que podemser reconhecidos por diferentestoxinas. Dados de pesquisarevelam que estes modelospodem explicar a especificidadedas toxinas de B. thuringiensis.Após o reconhecimento do receptor,a toxina induz a formaçãode poros na membrana celulardo epitélio intestinal. Aformação dos poros na membranacelular provoca o desequilíbrioiônico entre o citoplasmae a o meio externo àcélula. As análises histopatológicasrealizadas após a intoxicaçãodos insetos mostram adestruição das microvilosidades,hipertrofia das células epiteliais,vacuolização do citoplasmae lyse celular, levandoo inseto a paralisia e morte.Na seleção das proteínas inseticidas,sintetizadas por essa bactéria, asanálises in vitro dos receptores membranarespodem viabilizar uma rápidadeterminação do espectro de ação dasproteínas Cry contra as espécies alvo,sendo em seguida efetuada a avaliaçãoda toxicidade in vivo, apenas paraos isolados pré-selecionados como ativosin vitro. Sendo assim, o presentetrabalho trata de diferentes métodosde análise de receptores de proteínasde B. thuringiensis em formas imaturasde lepidópteros.1.2 Análise de receptores emcortes histológicos de insetos1.2.1 Tecidos dos insetosAs larvas de insetos podem serobtidas de coletas a campo, as quaisdevem passar por um período de quarentaem condições controladas, ouoriundas de criação massal de insetosmantida em laboratório, em condiçõescontroladas de temperatura, umidaderelativa e fotofase, as quais podemvariar de acordo com a espécie do inseto.Os tubos digestivos dos insetossão dissecados e fixados 24 h, em BouinHollande Sublimé a 10%, lavadospor 12 h em água destilada e desidratadosem séries crescentes de etanol,70 a 100% (Brandtzaeg, 1982). Em seguidaos tecidos são impregnados emFigura 1. Receptores de proteínas Cry biotiniladas, revelados nos tecidos delarvas de lepidópteros, com fosfatase alcalina e peroxidase (Fiuza, 1995)banhos mistos (etanol/tolueno/paraplasto)e incluídos em paraplasto100% a 58 o C. Os cortes longitudinaisou transversais, de 7 a 10 µmde espessura, preparados com micrótomoLKB, são montados em lâminasde vidro, tanadas com polyl-lysinaa 10%, e conservadas a 4 o Cpara posterior análise de receptoresem cortes histológicos.1.2.2 Proteínas CryAs cepas de B. thuringiensis podemser cultivadas em meio usualglicosado por aproximadamente 5dias, conforme o método de Mahillon& Delcour (1984). Após a lisebacteriana devem ser centrifugadase lavadas com tampão fosfato, pH6. Os cristais são separados dos esporose das células bacterianas emgradiente de renografina ou sacarosepor ultra centrifugação, conformemetodologia descrita porSharpe et al. (1975). As bandas, contendoos cristais puros, são lavadase diluídas em água milli-Q esterilizada,contendo phenylmethylsulfonyl(PMSF).As proteínas Cry são solubilizadasem tampão fosfato, pH 10. EssepH deve ser ajustado a 8,6 por diálisecontra o tampão 20 mM Tris eas proteínas Cry são ativadas porbovine pancreatic trypsin (Type I),sendo a reação inativada com trypsininhibitor (Type II). A pureza ea integridade das proteínas pode seravaliada por eletroforese em gel depoliacrilamida a 10%, SDS-PAGE(Laemmli, 1970). A concentraçãopode ser determinada pelo método Bradford(1976), usando a bovine serum albumin(BSA) como proteína padrão.1.2.3 Proteínas biotiniladasAs proteínas Cry podem ser biotiniladas,conforme o método descrito porBayer & Wilcheck (1990), onde a incorporaçãoda biotina na parte N-terminalda proteína é feita usando o BNHS (biotinyl-N-hydroxysuccinimide)em tampãode bicarbonato de sódio, pH 9. Oproduto da reação deve ser purificadoem sephadex G-25 (Sigma) e as fraçõesbiotiniladas identificadas por dot-blot,onde se utiliza membrana de nitrocelulose,o conjugado de estreptavidina-fosfatase-alcalinadiluída no tampão TST(Tris-Saline-Triton, pH 7;6) e o substratode revelação (BCIP e NBT em tampãoTris; pH 9,5). A concentração dasproteínas Cry biotiniladas pode ser determinadapelo método Bradford (1976),usando a BSA como proteína padrão. Apureza e a integridade das proteínasmarcadas pode ser avaliada em westernblot,usando membrana de nitrocelulose(Sigma) e o tampão Towbin, pH 8,3com 10% etanol. As membranas podemser reveladas usando a mesma técnicadescrita no dot-blot.1.2.4 AnticorposAs proteínas Cry são preparadas,conforme descrito anteriormente napurificação, e depois são utilizadas naobtenção de anticorpos em pequenosanimais como: coelhos, ratos e camundongos,entre outros. O soro coletadodos animais é utilizado na obtenção dasimunoglobulinas (IgGs), as quais podemBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 33