Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 1
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<strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong> 1
Colaboraram nesta edição:BIOTECNOLOGIACiência & <strong>Desenvolvimento</strong>KL3 PublicaçõesFundadorHenrique da Silva CastroDireção Geral e EdiçãoAna Lúcia de AlmeidaDiretor de ArteHenrique Castro FºProjeto GráficoAgência de Comunicação IRISE-mailbiotecnologia@biotecnologia.com.brPortalwww.biotecnologia.com.brDepartamento Comercial,Redação e Edição:SHIN CA 01 - Lote A - Bloco A - Sala 223Shopping Deck NorteLago NorteBrasília - DFCEP: 71503-502Os artigos assinados são deinteira responsabilidadede seus autores.ISSN 1414-6347Aline Oliboni de AzambujaBióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade eManejo de Vida Silvestre (UNISINOS).Andresa Patrícia Regert LuchoEngenheira Agrônoma (UFRGS) e Mestre em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS).Diouneia Lisiane BerlitzBióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade eManejo de Vida Silvestre (UNISINOS).Emerson Luís Nunes CostaEngenheiro Agrônomo (UFRGS) e Mestre e Doutor emFitotecnia – Fitossanidade (UFRGS)Gabriela Cristina AllesBióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutoranda em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS).Jaime Vargas de OliveiraEngenheiro Agrônomo (UFSM), Mestre em Fitotecnia –Fitossanidade/Entomologia (UFPEL),Laura Massochin Nunes PintoBióloga (PUCRS) e Mestre e Doutoranda em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS).Leila Lucia FritzBióloga (UNISINOS) e Mestranda em Biologia: Diversidade eManejo de Vida Silvestre (UNISINOS).Lidia Mariana FiúzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia –Fitossanidade (UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas(ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologia Vegetal(CIRAD-Montpellier).Marcus HübnerBiólogo (FURG) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejode Vida Silvestre (UNISINOS).Maria Helena Ribeiro RecheBióloga (UPF) e Mestre e Doutoranda em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS).Neiva KnaakBióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutoranda em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS).Raquel Castilhos-FortesBióloga (UNISINOS) e Mestre em Microbiologia Agrícola e doAmbiente (UFRGS)Rogério SchünemannBiólogo (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade eManejo de Vida Silvestre (UNISINOS).Vilmar MachadoBiólogo (UNISINOS) e Mestre e Doutor em Genética eBiologia Molecular (UFRGS)Nota: A Revista <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong>, éindexada na AGROBASE ( base de dados da Agricultura Brasileira)BINAGRI- Biblioteca Nacional de Agricultura- MAPA- Ministério daAgricultura, Pecuária e Abastecimento. no Agris ( InternationalInformation System for the Agricultural Sciences and Technology)da FAO e atende a obrigatoriedade do Depósito Legal na BibliotecaNacional do Rio de Janeiro - Fundação Biblioteca Nacional.2 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
Conselho CientíficoDr. Aluízio Borém - Genética e Melhoramento VegetalDr. Ivan Rud de Moraes - Saúde - Toxicologia;Dr. João de Deus Medeiros - Embriologia Vegetal;Dra. Lidia Mariana Fiuza - Microbiologia e Entomologia Agrícola;Dr. Maçao Tadano - Agricultura;Dr. Naftale Katz - Saúde;Dr. Pedro Jurberg - Ciências;Dr. Sérgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas;Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Genética de Microorganismos;Dr. William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental.Conselho Brasileiro de Fitossanidade - CobrafiDr. Luís Carlos Bhering Nasser - FitopatologiaFundação Dalmo Catauli GiacomettiDr. Eugen Silvano Gander - Engenharia Genética;Dr. José Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biológico;Dra. Marisa de Goes - Recursos GenéticosInstituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPENDr. José Roberto RogeroSociedade Brasileira de <strong>Biotecnologia</strong> - SBBiotecDr. Luiz Antonio Barreto de Castro - EMBRAPADr. Diógenes Santiago Santos - UFRGSDr. José Luiz Lima Filho - UFPEDra. Elba P. S. Bon - UFRJCarta ao LeitorEDIÇÃO <strong>38</strong> - 2009/2010bactéria Bacillus thuringiensis (Bt) tem o carismamundial dos microbiologistas e entomologistas.Esse entomopatógeno ubíquo é ímparno potencial biotecnológico aplicado nocontrole biológico nas áreas agrícolas, florestais, desaúde animal e humana. Nessas áreas, o microrganismopode ser utilizado como biopesticida formulado,registrado e comercializado ou seus genes podem seradaptados e incorporados no genoma das plantas pormeio da engenharia genética, atualmente denominadasplantas-Bt. Nos estudos dessa bactéria há cooperaçõesmultidisciplinares que permitem as análises dabiologia, toxicologia e ecologia microbiana, as quaissão tratadas nessa edição. O objetivo dessa publicaçãoé apresentar o estado da arte sobre o entomopatógenoB. thuringiensis, com dados bibliográficos eresultados de pesquisa obtidos pelo grupo de pesquisaCNPq/UNISINOS: Manejo e Toxicologia em Agroecossistemas,onde atuam estudantes de Graduação ePós-Graduação da Biologia da UNISINOS, além de professorese pesquisadores colaboradores do IRGA, UFR-GS, UFPEL, UFSM, UCS, FIOCRUZ, EMBRAPA, CIRAD-Montpellier, Universidade de Otawa e Universidadede Nebraska.Dra. Lidia Mariana FiuzaEdição Especial - Ecotoxicologia de Bacillus thuringiensis, organizada e coordenada pela Dra. LídiaMariana Fiuza, Professora Titular e Coordenadora Executiva do Programa de Pós-Graduação emBiologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre da Universidade do Vale do Rio dos Sinos; Bolsista deProdutividade em Pesquisa do Conselho Nacional de <strong>Desenvolvimento</strong> Científico e Tecnológico,Consultora Técnica do Instituto Rio Grandense do Arroz.fiuza@unisinos.br lmfiuza@pesquisador.cnpq.brPESQUISAARTRÓPODES E BACTÉRIAS ENTOMOPATOGÊNICOS 04ECOLOGIA DE BACILLUS ENTOMOPATOGÊNICOS 14TOXINAS DE BACILLUS THURINGIENSIS 24MECANISMO DE AÇÃO DE BACILLUS THURINGIENSIS 32TOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSIS ÀS PRAGAS AGRÍCOLAS 36TOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSIS AOS INSETOS SOCIAIS 40TOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSIS ÀS PRAGAS URBANAS E VETORES 44INTERAÇÕES DE BACILLUS THURINGIENSIS E O CONTROLE DE FITOPATÓGENOS 48TOXICIDADE DE BACILLUS THURINGIENSIS EM ORGANISMOS NÃO-ALVO 54PRODUTOS DE BACILLUS THURINGIENSIS: REGISTRO E COMERCIALIZAÇÃO 58PLANTAS TRANSGÊNICAS QUE SINTETIZAM TOXINAS DE BACILLUS THURINGIENSIS E OUTRAS 62EVOLUÇÃO E MANEJO DA RESISTÊNCIA DE INSETOS 68<strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong> 3
PesquisaPesquisaARTRÓPODES E BACTÉRIASENTOMOPATOGÊNICOSEmerson Luís Nunes CostaEngenheiro Agrônomo (UFRGS) eMestre e Doutor em Fitotecnia –Fitossanidade (UFRGS)ntre os artrópodes, os insetos são a maioriadas espécies animais e têm importâncianas mais diversas áreas. Na agricultura,podem ser úteis ou nocivos, atuando namanutenção do equilíbrio das populaçõescomo inimigos naturais, na polinização, nadecomposição da matéria orgânica do solo e comopragas das culturas. Nesse trabalho são apresentadasalgumas informações sobre a classe Insecta,destacando-se os insetos de importância agrícola,com a caracterização de ordens e subordense exemplos de famílias e espécies de insetos-praga,vetores de fitopatógenos, predadores e parasitóides.Também constam dados sobre as bactériasque atuam como agentes microbianos aplicadosno controle biológico de insetos.1.1 A Classe Insecta4 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>Andresa Patrícia Regert LuchoEngenheira Agrônoma (UFRGS) eMestre em Biologia: Diversidade eManejo de Vida Silvestre(UNISINOS).A classe Insecta, com 29 ordens, pertence àsuperclasse Hexapoda e ao filo Arthropoda. Entreos aspectos que caracterizam a maioria dosrepresentantes da classe Insecta estão: corpo divididoem três porções (cabeça, tórax e abdome),cabeça com um par de antenas, olhos compostos,peças bucais expostas (ectognatos), tórax comtrês segmentos, três pares de pernas, nenhum,um ou dois pares de asas, e abdome com 6 a 11segmentos.Durante o desenvolvimento, os insetos sofremmetamorfose, por meio de muda do tegumento(ecdise). Insetos hemimetábolos são aquelesque sofrem metamorfose chamada incompleta,passando pelas fases de ovo, ninfa e adulto.Nesse caso os indivíduos jovens são muito semelhantesaos adultos, mas apresentam o sistemareprodutivo imaturo e, no caso de insetos alados,nota-se o desenvolvimento das asas, observandosea presença de tecas alares. Insetos holometábolostêm metamorfose completa, passando pelasfases de ovo, larva, pupa e adulto. Nesse caso,os indivíduos jovens são bem diferentes dos adultos,como ocorre com as borboletas e moscas,onde inclusive há mudança no aparelho bucal.Os besouros também têm metamorfose completa,com larvas morfologicamente diferentes dosadultos, mas normalmente o tipo de aparelhobucal se mantém.A classe Insecta representa 70% das espéciesanimais, e encontra-se distribuída nos mais diferentesambientes, onde os insetos, com aspectospositivos ou negativos, destacam-se como organismosde importância, como na indústria têxtil(o bicho da seda), na alimentação (o mel produzidopela abelha), na saúde humana (moscas, mosquitos,percevejos e outros insetos transmissoresde agentes patogênicos), na veterinária (insetostransmissores de moléstias em animais) e na agricultura.1.2 Importância dosinsetos na agriculturaLeila Lucia FritzBióloga (UNISINOS) eMestranda em Biologia:Diversidade e Manejo deVida Silvestre (UNISINOS).Na agricultura, a ocorrência de insetos tambémtem seus aspectos positivos e negativos.Sob o aspecto negativo estão os insetos quese alimentam de plantas e causam danos econômicosa diversas culturas agrícolas. Os insetospraga,pelo hábito de alimentarem-se de vegetais,são chamados de fitófagos. Dependendo daestrutura vegetal da qual se alimentam, tambémrecebem denominações específicas. Assim, os quese alimentam de frutos são os carpófagos; de raízes,rizófagos; de folhas, filófagos; de madeira,xilófagos; sugadores de seiva são fitossucsívoros.Além dos danos causados de forma direta,pela alimentação, alguns insetos causam danosindiretos às culturas, atuando como vetores defitopatógenos (Tabela 1). Também há insetos queestão associados à ocorrência de moléstias, devidoa injúrias que causam nos tecidos vegetais peloshábitos alimentares ou de postura, favorecendo apenetração de patógenos. Como exemplos podemser citados o minador-dos-citros (Phyllocnistiscitrela), que favorece a ocorrência do cancrocítrico, causado pela bactéria Xanthomonasaxonopodis pv. citri, o tripes Thrips tabaci associadoà ocorrência do fungo Alternaria porri, causadorda mancha púrpura em alho e cebola, e asmoscas-das-frutas, cujos hábitos de postura, alimentaçãoe desenvolvimento facilitam a ocorrênciade patógenos causadores de podridões emfrutos, como o fungo Monilinia fructicola, causadorda podridão parda em frutos de pêssego. Insetossugadores que excretam substâncias açucaradasestão associados à ocorrência de fumagina,caracterizada pelas estruturas fuliginosas do fungoCapnodium sp.Sob o aspecto positivo estão os insetos polinizadores,muitos deles essenciais para a formaçãode frutos e conseqüentemente de sementes;os insetos subterrâneos que atuam na decomposiçãoda matéria orgânica e em outras característicasdesejáveis nos solos destinados à produçãoagrícola e, ainda, os inimigos naturais, que se alimentamde outros insetos, muitas vezes mantendoas populações de pragas em níveis que nãocausam dano econômico e sem necessidade deadoção de outros métodos de controle.Entre os inimigos naturais, na classe Insecta,Lidia Mariana FiuzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestre emFitotecnia – Fitossanidade (UFRGS),Doutora em Ciências Agronômicas(ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora embiotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).espécies predadoras ocorrem em 22 ordens, enquantocinco ordens têm representantes parasíticos(Berti Filho & Ciociola, 2002).Os predadores, durante seu ciclo evolutivo,podem consumir diversas presas. Normalmentesão mais generalistas, pois atacam diferentes espécies,que podem pertencer a diferentes famíliasou ordens, incluindo insetos-praga ou não.Na Tabela 2 são apresentados alguns insetos predadorese suas presas.Os parasitóides são em geral mais específicos,ou seja, especializados a determinados hospedeiros.Assim, normalmente são mais restritosà espécie, família ou ordem. Tais inimigos naturaisdependem de apenas um hospedeiro paracompletar seu ciclo de desenvolvimento, e diferenciam-sedos parasitas porque causam a mortedo hospedeiro e os adultos têm vida livre.Atacam em geral as formas jovens dos insetospraga,inclusive ovos. Quando ocorrem em posturas,controlam a praga antes dessa causar danosàs culturas. Na Tabela 3 são apresentadosalguns insetos parasitóides e seus hospedeiros.De acordo com Berti Filho & Ciociola (2002),o impacto de predadores é mais difícil de avaliardo que o de parasitóides, pois estes podem serobservados em seus hospedeiros, enquanto ospredadores dificilmente deixam sinais de ataque,principalmente quando consomem toda a presa.Ao contrário dos predadores, os parasitóidestêm alta capacidade de encontrar seus hospedeiros,inclusive quando a densidade populacionalde fitófagos é baixa (Shepard et al., 1987 e1995).1.3 Ordens, subordens e famíliasde insetos de importância agrícolaDentre as 29 ordens da classe Insecta, novedestacam-se pela importância agrícola de seusrepresentantes: Coleoptera, Diptera, Hemiptera,Hymenoptera, Isoptera, Lepidoptera, Neuroptera,Orthoptera e Thysanoptera. O Quadro 1 apresentainformações sobre características gerais,famílias e espécies das principais ordens e subordensde insetos de importância agrícola.Nesse contexto, as plantas de arroz (Orysasativa L.) são hospedeiros para um grande númerode insetos-praga e a ação desses artrópodesé um dos principais fatores que afetam aorizicultura, pois as perdas variam entre 10 e35% da produção. No entanto, são poucos osinsetos que podem ser considerados pragas, poismuitos deles são inimigos naturais que estãoassociados ao controle biológico dos insetos-pra-
Figura 1. Abundância de insetos e inimigos naturais em lavouras de arrozirrigado, RSga. Fritz et al. (2008) analisaram a abundância de insetos-pragae inimigos naturais presentes em áreasde arroz irrigado em Cachoeirinha (RS). Foram quantificados1015 indivíduos subdivididos em 10 ordensde insetos e 2 ordens de aracnídeos (Figura 1). Osdípteros apresentaram maior abundância dentre osinsetos (51,92%), seguido de Hemiptera (14%), Hymenoptera(8,87%), Collembola (8,18%), Coleoptera(3,05%), Orthoptera (2,56%), Odonata (1,28%), Psocoptera(0,98%), Lepidoptera (0,69%) e Dermaptera(0,1%). Acredita-se que as larvas de mosquitos vêmdesenvolvendo resistência aos inseticidas que são utilizadosfrequentemente em lavouras orizícolas, tornando-seconseqüentemente abundantes nesses agroecossistemas(Victor & Reuben, 2000).Entre os insetos, Coleoptera é a ordem dos besourosou cascudos. Há inúmeras espécies de coleópterosfitófagos, sendo que em muitos casos, tantoas larvas quanto os adultos alimentam-se de plantas.Nessa ordem, há insetos-praga de diferentes hábitos:filófagos, rizófagos, xilófagos, carpófagos, entre outros.Há também várias espécies que atacam produtosarmazenados. Entre as famílias, destaca-se Curculionidae,dos gorgulhos ou bicudos, que é a maiorfamília do mundo, com cerca de 50.000 espécies descritas,sendo a maioria das espécies fitófagas, e aslarvas geralmente desenvolvem-se no interior de partesvegetais, como brocas.Na ordem Coleoptera também há insetos que sãoinimigos naturais, pois atuam no controle biológicocomo predadores de outros insetos. Nesse caso destacam-seas famílias Carabidae e Coccinellidae (joaninhas),onde a maioria das espécies, tanto na fase delarva como de adulto, são predadoras de insetos-praga.Em Diptera, a ordem das moscas e mosquitos,também há insetos-praga e inimigos naturais. Entreos insetos fitófagos destaca-se a família Tephritidae,das moscas-das-frutas. Entre os inimigos naturais destacam-seas famílias Syrphidae, com espécies cujaslarvas são predadoras, e Tachinidae, com espéciesque desenvolvem-se como parasitóides.A ordem Hemiptera é composta por insetos dehábito sugador. Anteriormente, Hemiptera era a ordemapenas dos percevejos. Atualmente, inclui tambémcigarras, cigarrinhas, pulgões, cochonilhas, psilídeose moscas-brancas, que pertenciam à ordem Homoptera,atualmente não mais considerada como ordemem Insecta.Além dos danos diretos causados pelos insetosfitófagos da ordem Hemiptera, que sugam líquidosde diferentes partes vegetais, também há os danosindiretos, principalmente relacionados à transmissãode fitopatógenos.Em Hemiptera, inimigos naturais ocorrem apenasna subordem dos percevejos (Heteroptera), ondeem algumas famílias há espécies predadoras de insetos(sugam hemolinfa). No entanto, tais famílias nãosão exclusivas de espécies entomófagas. Em Reduviidaehá também espécies hematófagas (os barbeiros)e em outras, como Pentatomidae, há um grande númerode espécies fitófagas. Em Hymenoptera estãoas abelhas, vespas, vespinhas e formigas. Nessa ordemhá diversas espécies que atuam como polinizadores.Entre os fitófagos destaca-se a família Formicidae,que inclui as formigas-cortadeiras. Mas é no controlebiológico que a ordem Hymenoptera destacase,pela grande quantidade de famílias e espécies deparasitóides. Entre os predadores, destaca-se a famíliaVespidae.Na ordem Isoptera estão os cupins, com espéciesconsideradas pragas de diversas culturas, como pastagens,cana-de-açúcar e florestais.Em Lepidoptera, a ordem das mariposas e borboletas,estão espécies de insetos-praga com diferenteshábitos alimentares, como filófagos, xilófagos, carpófagos,rizófagos, minadores de folhas, espéciesque atacam produtos armazenados, entre outras.No entanto, os danos dos lepidópteros às culturassão causados quase que exclusivamente pelasformas jovens, conhecidas como lagartas.Entre as famílias de Lepidoptera destaca-seNoctuidae, que inclui diversas espécies que causamdanos a culturas de grande importância econômica.Em Noctuidae estão a lagarta-da-soja (Anticarsiagemmatalis) e Spodoptera frugiperda, umapraga polífaga conhecida como lagarta-militar, lagarta-do-cartucho-do-milhoou lagarta-da-folhado-arroz.A ordem Neuroptera é composta por insetospredadores, com destaque para a família Chrysopidae,cujas larvas são conhecidas como bicholixeiro,pois carregam os restos mortais das presasaderidos ao corpo.Em Orthoptera, ordem dos gafanhotos, grilos,esperanças e grilotalpas, as espécies de insetos-pragasão normalmente polífagas, com destaquepara as famílias Acrididae, do gafanhoto-criouloe Gryllotalpidae, dos grilotalpas ou cachorrinhos-da-terra.Na ordem Thysanoptera estão os insetos conhecidoscomo tripes ou trips, sendo a maioriadas espécies fitófagas e algumas associadas à transmissãode viroses de plantas.A ordem Araneae conta com mais de <strong>38</strong>.834 espécies,incluídas em 3.694 gêneros e 109 famíliasno mundo (Platnick, 2008). Elas estão distribuídasem agroecossistemas terrestres e são consideradasum dos mais abundantes grupos de invertebradospredadores, além de possuírem a vantagemde não danificar as plantas e controlaremeventuais explosões populacionais de insetos, limitandoo canibalismo e territoriedade. No entanto,os pesticidas não seletivos têm sido consideradosum risco para as espécies de aranhasbenéficas. Fritz et al. (2008) analisaram as populaçõesde aranhas em lavouras orízicolas orgânicase convencionais (com aplicação de inseticida),coletadas de 3 regiões produtoras de arroz irrigadodo RS. Nesses agroecossistemas foram coletadas1148 aranhas, entre jovens e adultos, havendomaior abundância em lavouras orgânicas (765)que diferiram significativamente das lavouras comaplicações de inseticidas (<strong>38</strong>3). Das 12 famíliasregistradas predominaram Araneidae e Tetragnathidaeque foram fortemente afetadas pelos inseticidas,reduzindo em até 80% da população (Figura2).1.4 Bactérias EntomopatogênicasAs toxinas bacterianas com atividade inseticidapotencialmente aplicadas no controle de insetos-pragadas plantas cultivadas e vetores de doençasanimais e humanas foram casualmente descobertasno final do século XIX, através das investigaçõesdas doenças que ocorriam nas criaçõesde abelhas melíferas (Apis mellifera) e do bichoda-seda(Bombyx mori).A documentação da taxonomia geral bacterianaefetuada por Breed et al. (1957) e o levantamentode espécies de bactérias relacionadas cominsetos hospedeiros descrito por Steinhaus (1947),podem ser considerados trabalhos pioneiros e fundamentaisà taxonomia de bactérias que causamdoenças em insetos. A taxonomia bacteriana modernabaseia-se em critérios morfológicos, fisiológicos,sorológicos e genéticos.Atualmente são conhecidas inúmeras espéciesde bactérias associadas a insetos, porém poucasapresentam as características desejáveis à aplicaçãono controle biológico de pragas, sendo naclassificação das bactérias entomopatogênicas, oscritérios de Falcon (1971) os mais viáveis por agruparemas bactérias em apenas duas categorias: esporulantese não-esporulantes. Entre essas categoriasdestacam-se com maior importância à patologiade insetos as espécies das famílias Bacillaceaee Enterobacteriaceae.As bactérias esporulantes apresentam uma característicade persistência, as quais podem se manterem condições ambientais adversas através deestruturas de resistência denominadas endósporos.Esta característica dessa categoria de bactériasvem sendo considerada um pré-requisito à produçãode agentes microbianos em escala comercial.Como característica de bactérias entomopatogênicaspotencialmente aplicadas no controle microbianode insetos, destacam-se as espécies queapresentam alta virulência, elevada capacidade invasorae produção de toxinas, causando toxemiasnos insetos alvo. Com essas características, na categoriade bactérias esporulantes destacam-se comogêneros de maior importância: Bacillus e Clostridium.1.4.1. Gênero BacillusBacillus spp., em geral aeróbicas ou facultativamenteanaeróbicas, encontram-se em substratosvariáveis devido ao complexo enzimático produzidopelas células em forma de bastonetes, podendoessas se apresentarem individuais ou emcadeias. Esse gênero apresenta uma grande variaçãoentre as espécies, porém as características entomopatogênicasassociadas à formação de endós-<strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong> 5
poros e a produção de toxinas e enzimas determinamas seguintes espécies como promissorasao controle de insetos prejudiciais:A. Bacillus thuringiensisEste microrganismo foi descoberto em 1902por Ishiwata no Japão, através da criação massalde Bombix mori. Em 1911, B. thuringiensis foinovamente isolado por Berliner a partir de larvasde Ephestia kuehniella, na cidade de Thüringe,na Alemanha, de onde é originário seu atualnome. Os primeiros ensaios utilizando B. thuringiensisforam realizados na Europa entre os anosde 1920 e 1930, no controle de Ostrinia nubilalis,lepidóptero da família Pyralidae. Nos EstadosUnidos e na Europa, entre os anos de 1930 e1940, numerosos testes foram realizados contraoutras espécies de lepidópteros. Atualmente, nocaso do controle biológico, B. thuringiensis é omicrorganismo mais utilizado em nível mundial .Para os microbiologistas, B. thuringiensis (Figura3) é uma bactéria gram-positiva, esporulante,aeróbica ou facultativamente anaeróbica, naturalmenteencontrado no solo. As espécies thuringiensis,cereus e anthracis do gênero Bacillusapresentam um grau de parentesco tão elevado,que muitas vezes dificulta, se não impossibilita,diferenciá-las através de provas bioquímicas e bacteriológicasmais simples. Durante muito tempo,as duas primeiras espécies foram consideradascomo sendo uma única. O principal critério utilizadopara a distinção entre essas bactérias é aprodução de corpos de inclusões paraesporaisdurante o processo de esporulação do B. thuringiensis.No controle microbiano dos insetos, o entomopatógenoBacillus thuringiensis (Bt) ofereceas melhores alternativas como bioinseticida, mostrando-setambém um bom candidato à obtençãode formulações comerciais, bem como à engenhariagenética de plantas.B. Bacillus cereusB. cereus pode ser considerado como patógenofacultativo, devido ao seu hábito saprofíticoe à adaptação à vida parasítica das linhagensentomopatogênicas, sendo atualmente ainda utilizadocomo opcional no controle de alguns lepidópteros,coleópteros e himenópteros quandoo B. thuringiensis mostra-se ineficaz.O ingrediente ativo responsável pela virulênciadessa bactéria corresponde a ação enzimáticada lecitinase, descrita por Heimpel (1954,1955). Em 1989, Rahmet-Alla & Rowley descreveramque a fosfolipase C de B. cereus estariarelacionada a sua atividade entomopatogênica.Essa bactéria caracteriza-se por apresentar célulasem forma de bastonetes com esporos centrais,não-cristalíferas e ausência de esporângioestendido. Alguns autores mencionam que alémda lecitinase que levou certas linhagens a vidaparasítica, o endósporo dessa bactéria contémproteína tóxica de baixa atividade específica, estruturalmentesemelhante ao cristal de B. thuringiensis.Diversos estudos do modo de ação B. cereusmencionam que essa espécie não tolera meio alcalinoe a enzima para ser ativa exige um pHentre 6,6 e 7,4, tornando essa bactéria específicaa insetos cujo conteúdo intestinal encontra-se nafaixa neutra, quando então são provocadas alteraçõesno epitélio do intestino médio das larvassensíveis, sendo os sintomas patológicos variáveisem função do modo de infecção por essepatógeno.C. Bacillus larvaeFigura 2. Araneofauna em sistema de cultivo orgânico e convencional dearroz irrigado, RSEssa bactéria apresenta esporos centrais outerminais que variam de elípticos a cilíndricos numesporângio distinto, sem corpo de inclusão paraesporal(cristal). Quando os esporos de B. larvaesão ingeridos pelas larvas e pupas das abelhas,causam a doença americana das abelhas ou pútridados berçários.D. Bacillus alveiEssa espécie caracteriza-se por apresentar esporoscentrais ou sub-terminais que variam deelípticos a cilíndricos. Essa espécie causa doençaeuropéia das crias das abelhas.E. Bacillus popilliae e Bacillus lentimorbusEssas espécies são patógenos obrigatórios,crescem pouco em meio de cultura, e têm comocaracterísticas esporos elípticos a cilíndricos, emesporângio nítido num bastonete. B. popilliae causaa doença leitosa do tipo A e B. lentimorbuscausa a doença leitosa tipo B, ambas em larvasde escarabeídeos. As características de resistênciados esporos ao calor, à dessecação e à radiação,além da sua longevidade em larvas mortas e partículasde solo, tornam essas bactérias agentespromissores no controle de larvas de Popillia japonicae Amphimallon mojalis (na Europa e Austrália),além de Eutheola humilis, Stenocrates spp.e Migdolus morretesi (no Brasil).O mecanismo de ação é semelhante em ambasàs espécies, cujas bactérias atuam por ingestão,passando do trato digestivo à hemolinfa, multiplicando-se,esporulando, causando a septicemiae morte dos insetos.F. Bacillus sphaericusTrata-se de uma espécie que apresenta esporosesféricos em posição terminal num esporângiodistendido. Certas cepas dessa espécie produzeminclusões cristalinas (ou cristais), compostaspor dois peptídeos de 42 e 51 kDa que representama toxina binária, com ação inseticida. Hácepas que sintetizam proteínas inseticidas de100kDa.Essa bactéria é cosmopolita, tendo sido isoladade solo, água e do seu hospedeiro natural(pernilongos mortos). As cepas foram classificadaspor sorotipos conforme o antígeno flagelar,totalizando atualmente cerca de 50 sorotipos, entreos quais 7 contêm cepas ativas contra larvasde dípteros e as cepas mais tóxicas apresentamcomo particularidade inclusões paraesporais cristalinas.Existem mais de 300 cepas de B. sphaericuscatalogadas pelo Instituto Pasteur (Paris, França),sendo 50% dessas tóxicas às larvas de dípteros.1.4.2 Gênero ClostridiumO gênero Clostridium compreende cerca de 100espécies distribuídas em 19 grupos de acordo coma homologia de ARN16s. As células são em formade bastonetes, geralmente Gram-positivas, com endósporosovais ou esféricos que as deformam. Asespécies desse gênero são estritamente anaeróbias,havendo algumas que toleram a presença de oxigêniolivre, porém não formam esporos. Essas bactériassão encontradas naturalmente no solo, sedimentosmarinhos, restos animais e vegetais, assimcomo na flora intestinal de vertebrados e invertebrados,como os insetos.Os efeitos entomopatogênicos de C. brevifasciense C. malacosomae foram observados em larvasde Malacosoma pluviale, havendo a germinaçãodos esporos na luz intestinal e o rápido crescimentovegetativo, o qual causa a morte em poucosdias, sem haver invasão na cavidade do corpo doinseto. Alguns autores citam que C. bifermentansmalaysia sintetiza uma proteína tóxica às larvas deAedes aegypti, Culex pipiens e Anopheles stephensi,a qual apresenta elevada similaridade as delta-endotoxinassintetizadas pelo entomopatógeno B. thuringiensis.Figura 3. Bacillus thuringiensisem microscopia eletrônica detransmissão6 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
Quadro 1. Caracterização das principais ordens e subordens de insetos de importância agrícola, comexemplos de famílias e espéciesORDEM COLEOPTERA – besourosCaracterísticas gerais• Asas anteriores do tipo élitros (consistência coriácea ou córnea) e posteriores membranosas;• Aparelho bucal mastigador;• Metamorfose completa : Holometábolos (ovo, larva, pupa, adulto);• Mais de 300.000 espécies descritas.Subordem AdephagaCaracterísticas gerais• Porção ventral do segmento abdominal (urosternito) basal divido pelas cavidades coxais do terceiro par depernas;• Em geral, predadores.Principal família de importância agrícola• Carabidae: adultos e larvas predadores (Ver Tabela 2)Subordem PolyphagaCaracterísticas gerais• Porção ventral do segmento abdominal (urosternito) basal não divido pelas cavidades coxais do terceiropar de pernas;• Maioria das famílias de Coleoptera.Principais famílias de importância agrícola• Anobiidae: Lasioderma serricorne – besouro-do-fumo• Bostrichidae: Rhyzopertha dominica - besourinho-do-trigo• Buprestidae: Colobogaster cyanitarsis – broca-da-figueira• Bruchidae: Acanthoscelides obtectus – caruncho-do-feijão• Cerambycidae: Oncideres impluviata - serrador-da-acácia-negra• Chrysomelidae: Diabrotica speciosa – vaquinha ou brasileirinho• Coccinellidae: joaninhas – larvas e adultos predadores (Ver Tabela 2)Epilachna cacica – joaninha-das-cucurbitáceas (fitófaga)• Curculionidae: Anthonomus grandis – bicudo-do-algodoeiroOryzophagus oryzae – gorgulho-aquático (adulto), bicheira-da-raiz-do-arroz (larva)Sitophilus zeamais – gorgulho-do-milho• Elateridae: Conoderus scalaris - larva-arame• Meloidae: Epicauta atomaria – burrinho• Scarabaeidae: Euetheola humilis – cascudo-preto-do-arroz• Scolytidae: Hypothenemus hampei – broca-do-café• Tenebrionidae: Tribolium castaneum - besouro-do-milhoObservação: As outras duas subordens (Archostemata e Myxophaga) têm pouco mais de 50 espécies descritas.ORDEM DIPTERA – moscas e mosquitosCaracterísticas gerais• Asas anteriores membranosas;• Asas posteriores modificadas em halteres ou balancins;• Aparelho bucal sugador labial;• Metamorfose completa: Holometábolos (ovo, larva, pupa, adulto).Subordem Nematocera – mosquitos, pernilongos e borrachudosCaracterística geral• Antenas mais longas que o tórax.Principal família de importância agrícola• Cecidomyiidae: Jatrophobia brasiliensis – mosca-das-galhas-da-folha-da-mandiocaStenodiplosis sorghicola – mosca-do-sorgoSubordem Brachycera – moscasCaracterística geral• Antenas curtas, com arista ou estilo no último segmento.Principais famílias de importância agrícola• Agromyzidae: Liriomyza trifolii - mosca-minadora• Syrphidae: larvas predadoras (Ver Tabela 2)<strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong> 7
• Tachinidae: parasitóides (Ver Tabela 3)• Tephritidae: moscas-das-frutas - Ceratitis capitata – mosca-do-mediterrâneoAnastrepha fraterculus – mosca-sul-americanaAnastrepha grandis - mosca-das-cucurbitáceasORDEM HEMIPTERA - percevejos, cigarras, cigarrinhas, pulgões, cochonilhas, psilídeos e moscas-brancasCaracterísticas gerais• aparelho bucal sugador labial (rostro);• ápteros ou com dois pares de asas, membranosas ou com o anterior total ou parcialmente mais resistente queo posterior;• metamorfose incompleta: Hemimetábolos (ovo, ninfa, adulto ou ovo, ninfa, “pupário”, adulto)Subordem Sternorrhyncha - cochonilhas, pulgões, moscas brancas e psilídeosCaracterísticas gerais• rostro emergindo entre as pernas anteriores;• antenas longas ou curtas;• ápteros ou alados (membranosas ou anteriores tégminas);• ninfas e/ou adultos podem viver aderidos às plantas.Principais famílias de importância agrícola• Aleyrodidae: moscas-brancas - Aleurothrixus floccosusBemisia tabaci• Aphididae: Aphis gossypii – pulgão-do-algodoeiroMyzus persicae - pulgão-verdeToxoptera citricida - pulgão-preto-dos-citros• Phylloxeridae: Daktulosphaira vitifoliae - filoxera-da-videira• Psyllidae: Diaphorina citri - psilídeo-dos-citros• Coccidae: Coccus viridis - cochonilha-verdeSaissetia coffeae - cochonilha-parda• Diaspididae: Chrysomphalus ficus – cabeça-de-pregoLepidosaphis beckii - escama-vírgulaPinnaspis aspidistrae - escama-farinha• Margarodidae: Eurhizococcus brasiliensis – pérola-da-terraIcerya purchasi – cochonilha-australiana• Pseudococcidae: Planococcus citri – cochonilha-brancaPseudococcus maritimus - cochonilha-brancaSubordem Auchenorrhyncha – cigarras e cigarrinhasCaracterísticas gerais• rostro emergindo da parte inferior da cabeça;• antenas setáceas curtas;• asas membranosas ou anteriores tégminas;• ninfas e adultos de vida livre.Principais famílias de importância agrícola• Cicadidae: Quesada gigas – cigarra-do-cafeeiro• Cercopidae: Deois flavopicta - cigarrinha-das-pastagensMahanarva fimbriolata – cigarrinha-da-raiz-da-cana-de-açúcarMahanarva posticata – cigarrinha-da-folha-da-cana-de-açúcarNotozulia entreriana - cigarrinha-das-pastagens• Cicadellidae: Dalbulus maidis – cigarrinha-do-milhoEmpoasca kraemeri - cigarrinha-verde-do-feijoeiroSubordem Heteroptera – percevejosCaracterísticas gerais• rostro articulado;• asas anteriores do tipo hemiélitro.Principais famílias de importância agrícola• Cydnidae: Scaptocoris castanea - percevejo-castanho• Coreidae: Diactor bilineatus - percevejo-do-maracujáPhthia picta – percevejo-do-tomate• Pentatomidae: Nezara viridula – percevejo-verde-da-sojaOebalus poecilus - percevejo-do-grão-do-arrozTibraca limbativentris – percevejo-do-colmo-do-arroz• Reduviidae : predadores (Ver Tabela 2)8 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
ORDEM HYMENOPTERA – abelhas, formigas, vespas, vespinhasCaracterísticas gerais• Asas membranosas;• Metamorfose completa: Holometábolos (ovo, larva, pupa, adulto)Subordem Apocrita – abelhas, formigas, marimbondos, vespinhasCaracterística geral• Abdome livre ou pedunculadoPrincipais famílias de importância agrícola• Apidae: abelhas - Trigona spinipes - abelha-irapuá (fitófaga)• Formicidae: Atta spp. - saúvasAcromyrmex spp. - quenquéns• Vespidae: predadores (ver Tabela 2)Observação: Famílias de hymenópteros parasitóides (ver Tabela 3)Subordem Symphita Característica geral• Abdome séssilFamília de importância agrícola• Siricidae: Sirex noctilio - vespa-da-madeiraORDEM ISOPTERA – cupinsCaracterísticas gerais• Aparelho bucal mastigador;• Antenas moniliformes;• Asas presentes nas formas reprodutivas, membranosas, ambos os pares iguais;• Asas com sutura basal, que se rompe após a revoada, destacando as asas do corpo;• Metamorfose completa: holometábolos (ovo, larva, pupa, adulto);• Espécies sociais, formando castas: sexuados alados (formam novos cupinzeiros), sexuados ápteros (rei erainha) e estéreis (operários e soldados);• Fontanela: onde localiza-se glândula com função de defesa dos cupins superiores.Principal família de importância agrícola• Termitidae: Cornitermes cumulansNasutitermes globicepsORDEM LEPIDOPTERA – borboletas e mariposasCaracterísticas gerais• Asas membranosas cobertas por escamas• Aparelho bucal sugador maxilar (espiritromba ou probóscida)• Metamorfose completa: Holometábolos (ovo, larva (=lagarta), pupa (=crisálida), adulto)Subordem GlossataCaracterística geral• Espiritromba formada pelas gáleas maxilaresPrincipais famílias de importância agrícola• Crambidae: Azochis gripusalis – broca-da-figueiraDiatraea saccharalis - broca-da-cana-de-açúcar• Gelechiidae: Phthorimaea operculella – traça-da-batataSitotroga cerealella - traça-dos-cereais• Noctuidae: Agrotis ipsilon – lagarta-roscaAlabama argillacea - curuquerê-do-algodoeiroAnticarsia gemmatalis – lagarta-da-sojaHelicoverpa zea - lagarta-da-espiga-do-milhoMocis latipes – lagarta-dos-capinzaisSpodoptera frugiperda – lagarta-do-cartucho-do-milho, lagarta-da-folha-do-arrozPseudaletia sequax – lagarta-do-trigo• Pieridae: Ascia monuste orseis - curuquerê-da-couve• Pyralidae: Elasmopalpus lignosellus – lagarta-elasmoPlodia interpunctella – traça-indiana• Sphingidae: Erinnyis ello – mandarová-da-mandiocaManduca sexta - mandarová-do-fumo• Tortricidae: Cydia pomonella – traça-da-maçãGrapholita molesta – mariposa-orientalObservação: Cada uma das outras três subordens (Aglossata, Heterobathmiina e Zeugloptera) tem apenas umafamília. Como característica geral dessas subordens, as gáleas maxilares não formam espiritromba (probóscida).<strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong> 9
Tabela 1: Alguns insetos vetores de fitopatógenosINSETOS VETORESPATÓGENOSDOENÇASCULTURASAcrogonia citrina (Hem.:Cicadellidae)Aphis gossypii (Hem.:Aphididae)Bactéria - Xylella fastidiosaCucumber mosaic virus (CMV)Papaya ringspot virus – type P (PRSV-P)Passion fruit woodiness virus (PWV)Clorose variegada dos citros (CVC)Mosaico da bananeiraMosaico do mamoeiroEndurecimento dos frutosCitrosBananeiraMamoeiroMaracujazeiroBemisia tabaci (Hem.:Aleyrodidae)Cerotoma arcuata(Col.:Chrysomelidae)Dalbulus maidis(Hem.:Cicadellidae)Diabrotica speciosa (Col.:Chrysomelidae)Diaphorina citri (Hem.:Psyllidae)Dilobopterus costalimai(Hem.:Cicadellidae)Frankliniellaoccidentalis(Thy.: Thripidae)Frankliniella schultzei(Thy.:Thripidae)Hypocryphalus mangiferae(Col.: Scolytidae)Myzus persicae (Hem.:Aphididae)Myndus crudus(Hem.:Cixiidae)Oncometopia facialis (Hem.:Cicadellidae)Planococcus ficus (Hem.:Pseudococcidae)Pseudococcuslongispinus(Hem.:Pseudococcidae)Rhopalosiphum maidis(Hem.:Aphididae)Bean golden mosaic virus (BGMV)Bean rugose mosaic virus (BRMV)FitoplasmaMaize rayado fino virus (MRFV)Spiroplasma kunkeliiBean rugose mosaic virus (BRMV)Bactéria - Candidatus liberibacter spp.Bactéria - Xylella fastidiosaTospovírusTospovírusFungo: Ceratocystis fimbriataPapaya ringspot virus – type P (PRSV-P)Passion fruit woodiness virus (PWV)Potato leafroll virus (PLRV)Potato virus Y (PVY)Soybean mosaic virus (SMV)Phytoplasma palmaeBactéria - Xylella fastidiosaGrapevine leafroll-associated virus(GLRaV)Grapevine leafroll-associated virus(GLRaV)Soybean mosaic virus (SMV)Sugarcane mosaic virus (SCMV)Mosaico dourado do feijoeiroMosaico rugoso da sojaEnfezamento vermelho do milhoRisca do milhoEnfezamento pálidoMosaico rugoso da sojaGreening ou Huanglongbing (HLB)Clorose variegada dos citros (CVC)Vira-cabeçaVira-cabeçaSeca da mangueiraMosaico do mamoeiroEndurecimento dos frutosEnrolamento da folha da batateiraMosaico do pimentãoMosaico comum da sojaAmarelecimento letalClorose variegada dos citros (CVC)Enrolamento da folhaEnrolamento da folhaMosaico comum da sojaMosaico comumFeijoeiroFeijoeiro e sojaMilhoMilhoMilhoFeijoeiro e sojaCitrosCitrosFumo, tomate e outras solanáceasFumo, tomate e outras solanáceasMangueiraMamoeiroMaracujazeiroBatataSolanáceasSojaCoqueiroCitrosVideiraVideiraSojaMilho, sorgo, cana-de-açúcarThrips palmi(Thy.: Thripidae) TospovírusToxoptera citricidus(Hem.: Citrus tristeza virus (CTV)Aphididae)Papaya ringspot virus – type P (PRSV-P)Passion fruit woodiness virus (PWV)Kimati et al., 1997; Gallo et al., 2002; Oliveira et al., 2003.Vira-cabeçaTristeza dos citrosMosaico do mamoeiroEndurecimento dos frutosTabela 2: Alguns insetos predadores e suas presasORDENS E FAMÍLIAS PREDADORES PRESASColeopteraCarabidae Callida scutellaris lagartasCalosoma granulatumlagartasLebia concinalagartasCoccinellidae (joaninhas) Azya luteipes cochonilhasEriopis connexapulgõesCycloneda sanguineapulgõesPentilia egenacochonilhasRodolia cardinaliscochonilhasDermapteraForficulidae (tesourinhas) Doru luteipes lagartas e ovosDipteraSyrphidae Pseudodoros clavatus pulgõesSalpingogaster nigraninfas de cigarrinhasHemipteraAnthocoridae Orius insidiosus lagartas, ovos, tripes, pulgõesLygaeidae Geocoris sp. lagartas e ovosNabidae Nabis sp. lagartas e ovosPentatomidae Podisus nigrispinus lagartas e ovosReduviidae Zelus sp. lagartas, coleópterosHymenopteraVespidae Polistes sp. lagartasPolybia sp.lagartasNeuropteraFumo, tomate e outras solanáceasCitrosMamoeiroMaracujazeiroChrysopidae Chrysopa sp. pulgões, cochonilhas, moscas-brancasChrysoperla sp.pulgões, cochonilhas, moscas-brancasGallo et al., 2002; Silva et al., 2002; De Bortoli et al., 2008.<strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong> 11
Tabela 3: Alguns insetos parasitóides e seus respectivos hospedeirosORDENS E FAMÍLIASPARASITÓIDESHOSPEDEIROSCULTURASHymenopteraAphelinidaeBethylidaeBraconidaeChalcididaeEncyrtidaeEulophidaeIbaliidaeIchneumonidaeScelionidaeTrichogrammatidaeDipteraTachinidaeAphelinus maliEncarsia (Prospaltella) berleseiVespa-de-uganda Prorops nasutaApanteles sp.Aphidius sp.Apanteles subandinusChelonus insularisColastes letiferCotesia flavipesDiachasmimorpha longicaudataHypomicrogaster hypsipylaeBrachymeria pseudoovataAgeniaspis citricolaProacrias coffeaeTetrastichus giffardianusIbalia leucospoidesCampoletis flavicinctaCoccygomimus tomyrisMicrocharops bimaculataTelenomus podisiTrissolcus basalisTrissolcus urichiTrichogramma galloiTrichogramma pretiosumArchytas incertusArchytas lopesiArchytas pseudodaemonHemisturmia sp.Lespesia affinisTrichopoda nitensXanthozona melanopyga12 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>Pulgão-lanígero Eriosomalanigerum(Hem.: Aphididae)Cochonilha-branca Pseudaulacaspispentagona (Hem.: Diaspididae)Broca-do-café Hypothenemus hampei(Col.: Scolytidae)Mandarová-do-fumo Manduca sexta(Lep.: Sphingidae)Pulgão-verdeMyzus persicae (Hem.:Aphididae)Pulgão-do-algodoeiroAphis gossypii(Hem.:Aphididae)Pulgão-da-espigaSitobion avenae(Hem.:Aphididae)Traça-da-batataPhthorimaeaoperculella(Lep.: Gelechiidae)Lagarta-do-cartucho-do-milho Spodopterafrugiperda(Lep.: Noctuidae)Bicho-mineiro Leucoptera coffeella(Lep.:Lyonetiidae)Broca-da-cana Diatraea saccharalis(Lep.:Crambidae)Mosca-do-mediterrâneo Ceratitis capitata(Dip.: Tephritidae)Broca-do-cedroHypsipyla grandella(Lep.:Pyralidae)Traça-dos-cachos Cryptoblabesgnidiella(Lep.: Pyralidae)Minador-dos-citros Phyllocnistiscitrella(Lep.: Gracillariidae)Bicho-mineiro Leucoptera coffeella(Lep.:Lyonetiidae)Mosca-do-mediterrâneo Ceratitiscapitata(Dip.: Tephritidae)Vespa-da-madeira Sirex noctilio(Hym.:Siricidae)Lagarta-do-cartucho-do-milho Spodopterafrugiperda(Lep.: Noctuidae)Lagarta-cachorrinho Eupseudosomaaberrans (Lep.: Arctiidae)Lagarta-mede-palmo Sabulodes caberatacaberata (Lep.: Geometridae)Lagarta-da-soja Anticarsiagemmatalis(Lep.: Noctuidae)Percevejo-marrom Euschistus heros(Hem.:Pentatomidae)Percevejo-do-colmoTibracalimbativentris(Hem.: Pentatomidae)Percevejo-verde-da-soja Nezara viridula(Hem.: Pentatomidae)Percevejo-do-colmoTibracalimbativentris(Hem.: Pentatomidae)Broca-da-cana Diatraea saccharalis(Lep.:Crambidae)Broca-pequena-do-fruto Neoleucinodeselegantalis(Lep.: Crambidae)Lagarta-da-espiga-do-milho Helicoverpazea(Lep.: Noctuidae)Lagarta-do-cartucho-do-milho Spodopterafrugiperda(Lep.: Noctuidae)Lagarta-das-folhas Rolepa unimoda(Lep.:Lymantriidae)Lagarta-cachorrinho Eupseudosomaaberrans (Lep.: ArctiidaeMariposa-violácea Sarsina violascens(Lep.:Lymantriidae)Lagarta urticante Lonomiacircumstans(Lep.: Saturniidae)Lagarta-cachorrinho Eupseudosomaaberrans (Lep.: Arctiidae)Percevejo-verde-da-soja Nezara viridula(Hem.: Pentatomidae)Lagarta-das-palmeiras Brassolissophorae(Lep.: Nymphalidae)Macieira e outras rosáceasPessegueiro, amoreira e outrasfrutíferasCafeeiroFumoDiversas culturas, como assolanáceasDiversas culturas, como algodão,solanáceas e cucurbitáceasDiversas culturas, como trigo,aveia, cevadaBatataDiversas culturas, como milho,arroz, algodoeiroCafeeiroCana-de-açúcar, milho e outrasPoaceae (gramíneas)Frutíferas diversasCedro, mogno e outras espéciesflorestaisVideiraCitrosCafeeiroFrutíferas diversasPinusDiversas culturas, como milho,arroz, algodoeiroEucaliptoEucaliptoSoja e outras Fabaceae(leguminosas)SojaArrozDiversas culturas, como soja emamoeiroArrozCana-de-açúcar, milho e outrasPoaceae (gramíneas)Tomateiro e outras solanáceasMilho, sorgo e outras Poaceae(gramíneas)Diversas culturas, como milho,arroz, algodoeiroIpêEucaliptoEucaliptoCafeeiroEucaliptoDiversas culturas, como soja emamoeiroCoqueiro, dendezeiro e outraspalmeirasSampaio et al., 2001; Gallo et al., 2002; Rodrigues et al., 2004; Pratissoli et al., 2005; Carvalho, 2005; Maciel et al., 2007.
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PesquisaPesquisaECOLOGIA DE BACILLUSENTOMOPATOGÊNICOSstudos ecológicos visando à conservação de Bacillus spp.em ecossistemas aquáticos e terrestres justificam-se pelaaplicação de algumas espécies no controle biológico deinsetos. Apesar desses microrganismos apresentaremsemelhanças quanto à biologia e modo de ação, elesdiferem entre si por características particulares de cada espécie.Os aspectos relacionados à distribuição geográfica, habitatpreferencial, interações com a microbiota local, fatores queafetam crescimento, esporulação e atividade inseticida dosentomopatógenos servem como parâmetros às análises deimpacto ambiental, especialmente em agroecossistemasorizícolas. Esse conjunto de elementos fornece subsídios queauxiliam na seleção de isolados com potencial inseticida eampliam a escassa literatura sobre o papel ecológico dessesmicrorganismos no ambiente.Aline Oliboni de AzambujaBióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).Gabriela Cristina AllesBióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutorandaem Biologia: Diversidade e Manejo de VidaSilvestre (UNISINOS).Leila Lucia FritzBióloga (UNISINOS) e Mestranda em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).Maria Helena Ribeiro RecheBióloga (UPF) e Mestre e Doutoranda emBiologia: Diversidade e Manejo de VidaSilvestre (UNISINOS).Lidia Mariana FiuzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestre emFitotecnia – Fitossanidade (UFRGS), Doutoraem Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologiaVegetal (CIRAD-Montpellier).1.1 Biologia e ecologiade Bacillus spp.Atualmente são conhecidas inúmeras espécies de bactérias associadas ainsetos. Porém poucas apresentam as características desejáveis à aplicação docontrole biológico de insetos-praga das plantas cultivadas (Fiuza, 2001). Noentanto, o crescente interesse pela utilização debioinseticidas para o controle de populações de insetosprejudiciais, levou o homem a pesquisar maisprofundamente as bactérias (Habib & Andrade,1998). Entre as bactérias entomopatogênicas, o gêneroBacillus apresenta especial importância nocontrole biológico de pragas, destacando-se o Bacillussphaericus e o Bacillus thuringiensis (Priest,1992, 2000; Rabinovitch, 2000; Brighenti et al., 2005;Capalbo et al., 2005; Crickmore et al., 2008; De Melo,2008).Embora seja reconhecido que B. thuringiensis éum patógeno de insetos, a ecologia dessa bactériaainda é pouco conhecida (Jensen et al., 2003). Eleé um microrganismo ubíquo do solo, mas é tambémencontrado nos demais ambientes terrestres,aquáticos e também em insetos mortos, produtosarmazenados, plantas e detritos (Meadows et al.,1992; Meadows, 1993; Bernhard et al., 1997, Hossain et al., 1997; Forsyth &Logan, 2000; Hongyu et al., 2000; Maeda et al., 2000; Sneath, 2001; Martinez &Caballero, 2002; Silva et al., 2002; Uribe et al., 2003; Wang et al., 2003). Detoda forma, ele habita mais comumente o solo e a superfície das folhas (Forsyth& Logan, 2000). No solo, o número de células varia de 102 a 104 UnidadesFormadoras de Colônias (UFC) por grama de solo, enquanto em plantas,esse número varia de 0 a 100 UFC cm -2 (Damgaard, 2000).De acordo com Meadows (1993) existem quatro possíveis explicações paraa presença de B. thuringiensis no solo: a primeira considera que B. thuringiensisraramente desenvolve-se no solo, mas é depositado nesse substrato porfolhas, insetos, entre outros. A segunda hipótese assume que esse microrganismopode ser patógeno de insetos do solo que apresentem reduzida importânciaeconômica, com os quais poucos estudos foram realizados. A terceirahipótese pressupõe que B. thuringiensis pode desenvolver-se no solo quandoexistem nutrientes suficientes, obtidos de resíduos orgânicos em decomposição.Enquanto a última teoria afirma a existência de afinidade de B. thuringiensise Bacillus cereus, com o qual B. thuringiensis pode trocar material genético,possibilitando sua permanência no ambiente.Além de B. thuringiensis e B. cereus, existem as espécies: B. mycoides, B.pseudomycoides, B. anthracis e B. weihenstephanensis (Hansen, et al., 2003;14 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
Figura 1. Bactérias esporulantesprovenientes de amostras de soloem regiões produtoras de arrozirrigado do RSHu et al., 2004). As espécies, B. cereuse B. thuringiensis são fenotipicamentee geneticamente muito similaresentre si, havendo dificuldade nadistinção entre as duas espécies (Lecadetet al., 1999; Shisa et al., 2002).No entanto, B. cereus é consideradopatógeno facultativo devido ao seuhábito saprofítico no solo e parasitade linhagens de insetos, possuindouma proteína tóxica de baixa atividadeespecífica (Habib & Andrade,1998). Esta espécie não produz inclusõesparaesporais inseticidas atuandoatravés de ação enzimática (Guttmann& Ellar, 2000; Shisa et al., 2002). Muitascepas de B. cereus são consideradaspatógenas oportunistas de mamíferos,causando intoxicações alimentaresseguidas de vômitos e diarréias,dificultando o seu emprego no controlede insetos-praga (Hansen & Hendriksen,2001).As informações sobre o destinodas toxinas de B. thuringiensis no solosão limitadas, embora alguns trabalhosmostrem que elas unem-se a ácidoshúmicos e suplementos orgânicosou partículas do solo, que as protegemda degradação sem perder suaatividade inseticida (Polanczyk & Alves,2003). De modo geral, as bactériasentomopatogênicas permanecemno solo por meses ou anos após asua liberação. B. thuringiensis é capazde permanecer viável por maisde três anos após liberado (Fuxa,1992). A sensibilidade dos esporosdesse entomopatógeno à radiaçãosolar e à dessecação está associadacom os plasmídeos, ocorrendo trocasna composição química da coberturados esporos, reduzindo sua tolerânciaaos fatores físicos do ambiente.Nas folhas, a limitação dos esporospode ocorrer pelo tipo de folha e seusexudados, os quais contém inibidoresda germinação de esporos (Yánez& Cabriales, 2000).Considerando a hipótese de queos esporos do B. thuringiensis encontram-seno ambiente como resultadoda morte do inseto alvo, espera-se quea distribuição dessa bactéria ocorraaleatoriamente, e que os isolados deum mesmo lugar sejam similares (Fiuza,2001). No entanto, os isolados deB. thuringiensis têm sido encontradosem todos os tipos de solos e regiõesdo mundo, incluindo tundra ártica, estepe,regiões temperadas e tropicais,savanas e desertos quentes. Sua abrangênciafoi relatada em áreas da Escandináviaa Nova Zelândia e da Islândiaa Cadeias Montanhosas. No entanto,ele é raramente encontrado emareias de praias e camadas de soloabaixo de 10 cm de profundidade(Landén et al., 1994; Chilcott & Ellar,1998).B. thuringiensis tem sido freqüentementeisolado de florestas, áreas urbanas,campos e principalmente delavouras agrícolas (Martin, 1994; Fiuza,2001).Em um levantamento do Banco deBactérias Entomopotagonênicas daMicrobiologia da UNISINOS (BBE-MU), foram analisadas 278 amostrasde solo, oriundas de 29 municípios,de cinco regiões produtoras de arrozirrigado do RS. Foram isoladas 674amostras de bactérias esporulantes, amaioria pertencente ao Litoral Norte(41%), seguido do Litoral Sul (21%),da Campanha (14,4%), da DepressãoCentral (14%) e da Fronteira Oeste(10%) (Figura 1).Dessas, 31,1% correspondem a B.thuringiensis; 6% a B. cereus; 4% a B.sphaericus e 58,9% equivalem a outrasespécies de Bacillus (Fritz et al.,2007). Outras pesquisas em solos deáreas de arroz irrigado revelam aampla ocorrência de Bacillus no RS.Em 2006, Azambuja estudou a freqüênciade isolados de Bacillus spp.durante o período que compreendeo ciclo do cultivo do arroz irrigadono sistema convencional e obteve 245colônias de bactérias esporulantes,onde 143 pertenciam ao gênero Ba-Figura 2. Freqüência de Bacillus spp. nos diferentes sistemas de cultivo e fases da cultura do arroz irrigado no RS; (C)pousio, (SCC) sistema de cultivo convencional, (SCG) sistema de cultivo pré-germinado, (SCD) sistema de cultivo direto<strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong> 15
Figura 3. Abundância de Bacillus thuringiensis em relação aos distintos tratamentos fitossanitários e período de irrigaçãodo arroz no RS; (C) área controle, (H) área somente com herbicidas, (H+I) área com herbicidas e inseticida, (H+F)área com herbicidas e fungicidacillus, entre as quais foram identificadas26,6% como B. thuringiensis; 4,2%como B. sphaericus e 69,2% foramagrupadas como outras espécies deBacillus.Silva et al. (2002) reforçam a predominânciade B. thuringiensis (9,1%)em solos de todas as regiões brasileirasse comparado a B. sphaericus(5,1%), com exceção da região Sul dopaís que B. sphaericus (10,1%) foimais freqüente que B. thuringiensis(4,6%). No entanto, em solos agrícolasde diferentes áreas da Argentina afreqüência de B. sphaericus foi maior(2,1%) em relação à de B. thuringiensis(1,6%) conforme os dados deDias et al. (1999).Como foi verificada nas diversaspesquisas, a freqüência de B. thuringiensisem vários locais e as diferençasencontradas podem ser atribuídasa inúmeros fatores, incluindo variaçõesgeográficas, climáticas, atividadeagrícola, tipo de solo e método deisolamento. Contudo, Martin (1984)discute que B. thuringiensis não possuium habitat natural bem definido,pois esse entomopatógeno é caracterizadocomo um microrganismo saprofítico,sem exigências nutricionaisrestritas, podendo adaptar-se a diferentescondições ambientais.Diante disso, ainda que os entomopatógenosapresentados possuamsemelhanças quanto à biologia emodo de ação, eles diferem entre sipor características particulares de cadaespécie. Estudos ecológicos facilitama compreensão dessas bactérias noambiente, suas relações patógeno/hospedeiro e a estrutura de populações,permitindo conhecer o comportamentode microrganismos naturaise novos isolados, sejam eles modificadosgeneticamente ou introduzidosatravés de programa de controle microbiano(Sosa-Gómez et al., 1998).Ainda assim, as bactérias entomopatogênicasdo gênero Bacillus sãomatéria-prima à industrialização deinseticidas bacterianos. Seus efeitossobre as larvas são tão pronunciadosque as indústrias de inseticidas convencionaisbuscam ampliar suas utilizaçõescom o objetivo de controlaras pragas da agricultura e vetores deagentes etiológicos de doenças humanase vegetais.1.2 Bacillus spp. em amostrasde solos de agroecossistemasO crescente aumento de áreas agrícolasvem causando diversos efeitosambientais, como a mudança microbianado solo que é mediada por diversosprocessos e funções (Motavalliet al., 2004). Em agroecossistemas, asmudanças significativas e perceptíveisna comunidade microbiana do soloestão relacionadas com as condiçõesambientais, sendo conseqüência principalmentedo uso das práticas demanejo desse ambiente (Atlas et al.,1991). Práticas agrícolas, tais comotipo de manejo do solo, rotação deculturas, aplicação de agrotóxicos euso de maquinários interferem namicrobiota terrestre, afetando a qualidadedo solo, modificando as propriedadesfísicas, químicas e biológicas(Valarini et al., 2002; Andréa &Hollweg, 2004). Dessa forma, ocorremvariações no número de indivíduosou na dinâmica bioquímica naturalda comunidade de microrganismos.Porém, pouco é conhecido sobrea distribuição desses microrganismosterrestres e a maneira com queeles respondem as mudanças de manejona terra (Buckley & Schmidt,2003).Diversas populações de bactériasformadoras de endósporos ocorremem áreas agrícolas e podem contribuirdiretamente ou indiretamente naprodutividade das culturas (Gardener,2004). As bactérias gram-positivas formamuma parte importante da microbiotade solo, o qual constitui o principalambiente natural que abrigabactérias do gênero Bacillus (Ibarraet al., 2003; Mohamed et al., 2007).Muitas espécies desse gênero são consideradasde importância prática (Caccamoet al., 2001), já que espécies deBacillus são utilizadas para a síntesede uma grande variedade de produtosmédicos, agrícolas, farmacêuticosentre outros (Mohamed et al., 2007).No entanto, as transformações microbianasocorrem devido às diferentespopulações que habitam o solo, eas suas distintas reações químicas podemser alteradas sempre que o ecossistemasofrer algum tipo de interfe-16 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
Figura 4. Freqüencia de Bacillus spp. em amostras de água do Canal deIrrigação das 5 regiões produtoras de arroz do RS: Litoral Norte-LN, Campanha-CA,Fronteira Oeste-FO, Depressão Central- DC e Litoral Sul- LSrência. Assim, na aplicação de diversostipos de manejo, podem existirdiferentes disponibilidades de substratosque determinarão o favorecimentoou a inibição do estabelecimentodos diferentes grupos microbianos(Castro & Prado, 1993).Fritz (2007) analisou a abundânciade bactérias entomopatogênicaspertencentes ao gênero Bacillus obtidasde 36 amostras de solo coletadasde diferentes sistemas de cultivode arroz irrigado: sistema de cultivoconvencional (SCC), sistema de cultivopré-germinado (SCG) e sistema decultivo direto (SCD) e de uma áreade pousio (sem cultivo) por aproximadamente12 anos (C). Foram selecionadas336 colônias pertencentes aogênero Bacillus spp., onde foramidentificadas, 35,42% como B. thuringiensis,16,96% como B. cereus, 9,52%como B. sphaericus e <strong>38</strong>,10% comoBacillus sp. Todavia, não houve diferençasignificativa na freqüênciade Bacillus spp. entre os sistemasde plantio (p>0,05), embora as fasesda cultura tenham influenciadoa abundância das espécies(P
Figura 6. Ocorrência de espécies de Bacillus isoladas de amostras de águadurante o ciclo da cultura 2001/02 de arroz irrigado do Rio Grande do Sulcativa diferença para B. thuringiensis.Antes da irrigação, o microrganismofoi mais freqüente na área tratadasomente com os herbicidas, contudoquando o arroz foi inundado a abundânciafoi mais pronunciada nesseperíodo de irrigação e no tratamentocom herbicidas/fungicida (Figura 3).Os solos de arroz irrigado são predominantementeácidos, quandoocorre à inundação, o pH é elevadonaturalmente, próximo à neutralidadepelo processo de redução. Em funçãodessa nova condição, a disponibilidadede nutrientes atinge níveisestáveis durante um período de 4 a 6semanas após a inundação (IRGA,2005).As mudanças climáticas interferemde diferentes formas numa série deorganismos, que conseqüentemente,afetam outros e o conjunto destas mudançaspode prejudicar o meio ambientefísico. Sendo assim, os microrganismosestão entre os seres maissensíveis as variações ambientais, poisformam grandes populações, possuemcrescimento rápido, facilidade dedispersão e reduzido tempo de gerações,constituindo-se em potenciaisindicadores biológicos para o estudode impactos das mudanças climáticasglobais (Ghini, 2008).A influência de fatores climáticosna ocorrência de B. thuringiensis eB. sphaericus, em solos de oriziculturairrigada, foi avaliada por Azambuja(2006) e a autora sugere que a predominânciados entomopatógenos foimais acentuada no período de verãocom valores médios de temperaturado ar de 26 o C, umidade relativa de66 % e temperatura do solo de 24,7oC, contudo, essas diferenças não foramsubmetidas à análise estatística.Todavia, a temperatura é um importantefator de influência alterando aeficiência de bioinseticidas a base deBacillus entomopatogênicos. Baixase altas temperaturas reduzem a atividadelarvicida, indicando a necessidadede estudos potenciais devido aogrande número de insetos vetores emclimas tropicais (Consoli et al., 1995).Em agroecossistemas, a variação dadiversidade microbiana ao longo dasestações do ano ainda não é bemcompreendida, já que em cada estaçãoparece ocorrer uma comunidademicrobiana dominante acompanhadade outras pouco abundantes. Essas variaçõesestão diretamente ligadas aoregime hídrico, ao clima da região, aestrutura e manejo do solo e ao teore a qualidade dos resíduos vegetaisaportados (Torsvisk & Ovreas, 2002).Os solos representam um ecossistemacomplexo e as variações nos níveisde pH, compostos inorgânicos ematéria orgânica podem representarum fator limitante na colonização, estabelecimentoe esporulação de microrganismosresidentes (Melo & Azevedo,1998). Diante desse fato, muitaspesquisas procuram elucidar quaisos componentes minerais são mais favoráveisou limitantes do crescimentomicrobiano no solo. Além disso,determinadas concentrações de umdado elemento podem apresentarefeitos adversos para um mesmo microrganismo.Alguns autores descrevemque a presença de cálcio favoreceo crescimento, esporulação e aprodução da delta-endotoxina de B.thuringiensis no solo, mas em elevadasconcentrações inibe os três processos(Sikdar et al., 1991; Içgen etal., 2002; Polanczyk, 2004). Poroutro lado, há divergências quantoà presença de magnésio, sendo importantena biossíntese do cristalprotéico ou limitante do crescimento(Içgen et al., 2002; Polanczyk2004) . Também há relatos na literaturade que a adição de fosfatoorgânico (3 a 100 mM) não influenciana biossíntese do cristal, apesarde reduzir o crescimento decélulas e esporos (Içgen et al.,2002), porém Azambuja (2006) observouque B. thuringiensis foi favorecidopelas quantidades de potássiono solo.Em relação ao pH, alguns autoresmencionam que a acidez do solofavorece a adsorção da toxina deB. thuringiensis pela fração argilosado mesmo protegendo da biodegradaçãopor microrganismoscompetidores que têm sua atividadeinibida nessa condição. Os valoresacima de 5,2 favorecem o crescimentoda bactéria, mas quando opH não é controlado próximo àneutralidade ocorre à baixa produçãoda toxina (West et al., 1985; Sikdaret al., 1991; Tapp & Stotzky,1998). Sabe-se que a disponibilidadede nutrientes minerais, pH neutroe umidade dos solos favorecema germinação de B. thuringiensisrepresentando importantes fatoresnos níveis de crescimento do microrganismo(West et al., 1985).Contudo, os níveis ótimos de metaispara o crescimento de B. thuringiensise produção da delta-endotoxinasão variáveis e ainda nãoforam claramente demonstrados,conforme discutem alguns autores(Sikdar et al., 1991; Içgen et al.,2002).B. sphaericus, tem ação mosquitocida,especialmente para larvas deCulex pipiens, sendo potencializadaapós crescimento em meio decultura com os elementos mineraisKH 2PO 4, MgSO 4, MnSO 4, Fe 2(SO 4) 3,ZnSO 4, CaCl 2e pH 7,2 conformeestudos realizados por Kaflon et al.,(1983). Nos estudos de Azambuja(2006), o índice de B. sphaericusnão foi afetado pelas propriedadesfísico-químicas dos solos avaliadosde arroz irrigado. Os resultadosanteriores dos referidos autores18 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
podem possivelmente ser explicadaspor Silva et al. (1999) e Alles(2008) que relacionam às diferentesorigens do entomopatógeno,como solos e águas, a utilização dealgumas cepas em estudos ecológicospela resistência a diferentes condiçõesde estresse.Na tentativa de caracterizar cepascom atividade inseticida e verificara influência do cultivo convencionalsobre os Bacillus entomopatogênicos,Azambuja (2006) obtevea distribuição de isolados de B. thuringiensiscom genes cry4, (atividadeinseticida a dípteros) em cepasprovenientes de solos de todos ostratamentos fitossanitários, excetoda área tratada com herbicidas/inseticida,sendo igualmente distribuídasentre os períodos de irrigação.Como justificativa deste dado podeseressaltar que as áreas inundadasde cultivo de arroz são habitats favoráveisà criação de mosquitos, devidoà presença de elevada matériaorgânica e resíduos poluentes provenientesdas fontes utilizadas (Batista-Filhoet al., 1998).1.3 Bacillus spp. emecossistemas aquáticosEntre as bactérias melhor adaptadasà vida no solo e na água, estãoàquelas pertencentes ao gêneroBacillus. O gênero Bacillus é fenotipicamenteheterogêneo, commembros exibindo um amplo conjuntode requerimentos nutricionais,condições de crescimento, diversidademetabólica e na composiçãobase do DNA. O conhecimento daecologia de espécies de Bacillus nosolo e na água ainda não é completo(Vilain et al., 2006).Espécies de Bacillus foram referidaspor sua capacidade metabólicadistinta (Fernandes et al., 2007;Fu et al., 2007; Fisher & Hollibaugh,2008), no Mono Lake, um lago hipersalino,alcalino do leste da Califórnia,onde existem processos deoxidação e redução de selênio e arsênioem presença de fontes de carbonodissolvido. Em lavouras de arrozno Rio Grande do Sul, (RS),Mattos et al. (2007), avaliaram o impactodo uso do inseticida carbosulfanosobre os microrganismos dosolo, o risco de contaminação dosolo, da água e do sedimento, e adegradação microbiana. Os resultadosapontaram espécies do gêneroBacillus entre os grupos Gram-positivosdos consórcios de bactérias,com maior capacidade metabólicaem degradar o carbosulfano.Relacionando diferentes ambientesaquáticos, com a viabilidade dosesporos de B. sphaericus, Youstenet al. (1995) destacam que na águadoce a fração de esporos viáveis émaior do que no mar. Pouco se sabesobre quais fatores ambientais sãomais importantes para a perda deviabilidade dos esporos dessa bactéria.Fatores como a temperaturade crescimento, pH, aeração, presençade minerais e certos compostoscarbonados e nitrogenados afetama formação dos endósporos(Sneath, 2001). Nesse sentido, Alles(2008) avaliou o crescimento decepas de B. sphaericus, frente a pesticidasquímicos, compostos orgânicose metais pesados, obtendouma expressiva heterogeneidadeentre as estirpes e uma resistênciaao metal Cádmio, considerando taiscaracterísticas fenotípicas importantespara o controle e manejo biológico,dependendo do local onde oagente de biocontrole será aplicado.Contudo, sabe-se que as formulaçõescomerciais de B. sphaericussão mais resistentes a habitats poluídose a sua reciclagem é favorecidaem certas condições, mas comestreito número de hospedeiros emrelação à B. thuringiensis israelensis(Singh e Gill, 1988; Thanabalu etal., 1991 e 1993; Nielsen-Leroux eCharles, 1992; Nicolas et al., 1993;Consoli et al, 1995; Charles et al.,1996; Silva-Filho e Regis, 2003;Schwartz et al., 2001; Silva-Filho ePeixoto, 1997).Em estudos de diversidade bacterianaem orizicultura no RS, Reche& Fiuza (2005) e Fritz et al.(2007) isolaram e identificaram espéciesde Bacillus em águas de irrigaçãoe em amostras de águas deáreas orizícolas do RS. Nessas pesquisas,B. thuringiensis, B. sphaericus,B. cereus e Bacillus sp. foramidentificados em amostras de águacoletadas nos Canais de Irrigação enos Canais de Drenagem das lavourasorizícolas do RS. As coletas foramrealizadas durante o ciclo dacultura do arroz, 2001/02, em 5 regiõesprodutoras de arroz do RS: DepressãoCentral- DC, Fronteira Oeste-FO, Campanha- CA, Litoral Norte-LN e Litoral Sul- LS (Figuras 4 e5).Os resultados apresentados nasFiguras 4 e 5, referem-se à abundânciade Bacillus spp. nas regiõesorizícolas estudadas e nos dois tratamentos,Canal de Irrigação e Parcelasde cultivo de Arroz. Característicasadaptativas a vários ambientese sob condições adversas de temperatura,pH e salinidade, lhes sãoconferidas por sua capacidade depermanecer em latência devido aformação de esporos. As variaçõesde temperatura entre as regiões e adisponibilidade de recursos, podeminfluenciar as diferenças de abundânciana distribuição das espécies(Ricackanov, 2003).As parcelas de cultivo apresentarammaior abundância de colôniasbacterianas (Figura 5) quandocomparadas com as águas de irrigaçãoda lavoura (Figura 4). Águasde lavoura de arroz recebem tratamentosfitossanitários e Bacillusparecem ter afinidade com ambientesque receberam agroquímicos,transformando-os em fontes de carbonopara a sua produção de energia.Além disso, o ambiente de lavouraalterna inundação e drenagem,o que favorece o desenvolvimentode bactérias esporulantes (Liesack,2001).Os resultados de pesquisa quantoaos isolados de Bacillus em águasde lavouras orizícolas durante o cicloda cultura, expressaram a presençade B. thuringiensis em 39,7%das amostras de água analisadas. Emsegundo lugar, Bacillus sp., 35,8%,seguidos de B. cereus, 14,6% e B.sphaericus, 9,9% (Figura 6).B. thuringiensis foi encontradoem maior freqüência nas águas decultivo de arroz (Figura 6). A presençade Bacillus sp. é mencionadapor Martiny et al. (2005), como umdos grupo bacterianos mais comunsem sistemas de distribuição de águapotável. Em estudos após desinfecçãocom cloro, em sistemas de águapotável, Szabo et al. (2007), encontraramesporos de bactérias do gêneroBacillus, aderidos nas depres-<strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong> 19
sões da tubulação de ferro corroído.Os autores concluíram que esses esporossão capazes de persistir porlongos períodos de tempo em presençade altos níveis de cloro. Essemicrorganismo pode desenvolver-seem águas ricas em nutrientes liberadospela decomposição de resíduosorgânicos, assim como foi citado parao solo, por Polanczyk & Alves (2003).Esses autores também levantaram ahipótese dessa bactéria ter algum tipode relação simbiótica com plantas, oque explicaria a produção de toxinastão específicas e eficientes.B. sphaericus é muito comum ede distribuição cosmopolita, sendoprincipalmente isolada do solo em sistemasaquáticos ou mesmo de larvasde pernilongos mortos, seu hospedeironatural (Singer, 1981; Priest et al.,1997; Alves, 1998; Wirth et al., 2001;Partridge e Berry, 2002; Wei et al.,2006).B. cereus, de acordo Vilain et al.(2006), é uma bactéria de solo quepode ocorrer na rizosfera das plantase algumas estirpes produzem antibióticoscapazes de inibir o desenvolvimentode doenças fúngicas na rizosfera;Galvão et al. (2006), em análisesmicrobiológicas de água de cultivode mexilhões, detectaram B. cereusem 6,7% das amostras. Rowan etal. (2003) referem-se a B. cereus,como um grupo heterogêneo de bactériasGram-positivas, que devido asua habilidade em formar esporos, toleramelhor ambientes hostis do queoutros entomopatógenos bacterianosnão esporulantes. B. cereus é um patógenohumano oportunista, que estápresente no solo e na água, podendoproliferar em uma gama de ambientesincluindo matérias-primas e alimentosprocessados (From et al.,2005; Tourasse et al., 2006).1.4 ReferênciasAlles, G. C. 2008. Caracterização deestirpes de Bacillus sphaericuscom atividade inseticida. Dissertação(Mestrado), Universidadedo vale do Rio dos Sinos, 2008.São Leopoldo: UNISINOS, 2008,108p.Alves, S. B. Controle microbiano deinsetos. Piracicaba: FEALQ, 1998.1163p.Andréa, M.M.; Hollweg, M.J. 2004.Comparação de métodos para determinaçãode biomassa microbianaem dois solos. Revista BrasileiraCia. do Solo, 28: 981-986.Atlas, R.M.; Horowitz, A.; Krichevsky,M.; Bej, A.K. 1991. Response ofmicrobial populations to environmentaldisturbance. 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PesquisaTOXINAS DE BACILLUSTHURINGIENSISPesquisaLaura Massochin Nunes PintoBióloga (PUCRS) e Mestre e Doutorandaem Biologia: Diversidade e Manejo de VidaSilvestre (UNISINOS).Diouneia Lisiane BerlitzBióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).Raquel Castilhos-FortesBióloga (UNISINOS) e Mestre emMicrobiologia Agrícola e do Ambiente(UFRGS)Lidia Mariana FiuzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestre emFitotecnia – Fitossanidade (UFRGS),Doutora em Ciências Agronômicas(ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora embiotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).toxicidade de B. thuringiensisestá relacionada à síntesedas proteínas Cry queatuam especificamente nointestino médio dos insetos,as quais são codificadas porgenes cry. Essas proteínas têm atividadeinseticida a diferentes ordens de insetospraga,de acordo com a presença dos genescry, nas cepas bacterianas. Além dessasproteínas, o entomopatógeno produzoutros tipos de toxinas, como exotoxinas,proteínas Vip, endotoxinas, entre outras.Sendo assim, esse artigo apresenta a atualclassificação dos genes cry, as ordens deinsetos-alvo das proteínas Cry e outros fatoresde toxicidade da bactéria.1.1 Proteínas CryJuntamente com a esporulação, B. thuringiensislibera inclusões cristalinas paraesporaisque podem conter uma ou maisproteínas inseticidas, denominadas Cry, asquais são codificadas por genes tambémdenominados cry. Estas proteínas apresentampeso molecular entre 40 e 140kDa etornam-se tóxicas a insetos, após sua ingestãoe solubilização, no intestino médiodas larvas (Bravo, 1997).Estudos sobre a seleção de B. thuringiensistêm identificado diferentes cepasdesta bactéria, as quais mostram ação sobrediversas ordens de insetos, como Lepidoptera,Coleoptera, Diptera, Hymenoptera,Homoptera, Hemiptera, Isoptera, Orthoptera,Siphonaptera, Thisanoptera eMallophaga (Feitelson et al., 1992; Maagdet al., 2001; Cavados et al., 2001; Castilhos-Fortes et al., 2002; Pinto et al., 2003; Maagdet al., 2003), além de nematóides (Marroquimet al., 2000).Assim, sabe-se que diversos grupos deinsetos são suscetíveis aos cristais tóxicosde B. thuringiensis e que uma espécie deinseto pode ser afetada por mais de umacepa da bactéria, pois estas freqüentementeproduzem diferentes proteínas inseticidas.Isso significa que um cristal protéicopode ser tóxico a uma grande variedadede insetos, principalmente lepidópteros.Além disso, as proteínas Cry de B. thuringiensispodem ter seu efeito alterado deacordo com a radiação solar, temperaturae pH (Nishiitsutsuji-Uwo et al., 1977; Rosas-Garcíaet al., 2008).A busca por novos genes cry, que sintetizemnovas proteínas Cry, com diferentesefeitos inseticidas tem sido uma dasgrandes metas na pesquisa com B. thuringiensis,desde os primeiros trabalhos publicadossobre a manipulação genética deB. thuringiensis (Schnepf & Whiteley, 1981).As toxinas Cry têm sido classificadas deacordo com sua homologia na seqüênciade aminoácidos (Figura 1), na qual a denominação“Cry” apresenta quatro ranqueshierárquicos de números e letras (maiúsculase minúsculas), como por exemplo,Cry3Aa2. As proteínas Cry (Tabela 1) comcerca de 45% de homologia em sua seqüênciasão colocadas no primeiro ranque equando apresentam 78 e 95% de identidade,constituem o segundo e terceiro ranque,respectivamente.Cinco blocos de seqüências são comunsa maioria das proteínas Cry. Quando seanalisa o tamanho destas proteínas tambémfica evidente sua diversidade entre as diferentesprotoxinas. A extensão C-terminal,encontrada nas proteínas mais longas, nãofaz parte da toxina ativa, pois é digeridapelas proteases no intestino dos insetos,mas pode ter ação na formação do cristal(Schnepf et al., 1998).A estrutura tridimensional das formasativas das toxinas Cry1 (Grochulski et al.,1995), Cry2 e Cry3 (Li et al.,1991), quandoanalisadas em cristalografia de raio X, mostraram-semuito similares, cada uma apresentandotrês domínios. As inclusões cristalíferasingeridas por larvas susceptíveisdissolvem-se no intestino dos insetos e asprotoxinas inativas são solubilizadas e clivadasna longa região C-terminal, por proteasesintestinais, originando fragmentos resistentesa proteases com cerca de 60 kDa(Maagd et al., 2003).O domínio I, N-terminal, consiste em setealfa-hélices e participa na inserção da membranaintestinal e formação do poro. O domínioII, ou beta-prisma, apresenta trêsfolhas dobradas simétricas, formando asbeta-folha. O domínio III C-terminal consisteem duas beta-folha antiparalelas. Estesdois domínios estão envolvidos no reconhecimentodos receptores e ligação,além do domínio III também ter sido associadoà formação de poros (Maagd et al.,2001).24 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
Figura 1. Dendograma de proteínas Cryde Bacillus thuringiensis (Fonte http://www.lifesci.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt. Acesso em 19/11/2008).<strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong> 25
Tabela 1. Classificação e caracterização das proteínas Cry de Bacillus thuringiensis.26 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
L- Lepidoptera; C- Coleoptera; D- Diptera; H- Hymenoptera; N- Nematoda; Le- leucócitos cancerosos humanos.<strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong> 27
Figura 2. Dendograma das proteínas Vip sintetizadas por Bacillus thuringiensis(Fonte: http://www.lifesci.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt)Atualmente, existem 428 proteínas Crydescritas, que estão classificadas em 55 classesCry (Tabela 1). O autor Crickmore mantémum site na internet, o qual reúne asinformações sobre todas as toxinas Cry jápublicadas, além de permitir o acesso àscaracterísticas moleculares de cada uma.Estes dados são atualizados periodicamentee podem ser acessados no endereço:http://www.lifesci.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt.Este número tem crescido regularmente,pois a descoberta de novos genes implicana obtenção de novas toxinas quepossam ter maior especificidade ou toxicidade.Dentre os grupos de genes cry maisestudados, destacam-se cry1, cry2, e cry9,os quais já foram descritos com amplo espectroinseticida aos lepidópteros.Dentre estes grupos, os genes cry1 sãoos mais freqüentes na natureza, representandomais de 43% dos genes cry caracterizadose freqüentemente as bactérias quepossuem genes deste grupo codificam protoxinasentre 130 e 140kDa, que são armazenadosem cristais bipiramidais (Hofte &Whiteley, 1989; Rosas-García et al., 2008;Thammasittirong & Tipvadee, 2008).O dendograma da Figura 1 mostra osgrupos de proteínas Cry, que são classificadosde acordo com a similaridade entrea seqüência de genes que codificam as referidastoxinas bacterianas.De acordo com Crickmore et al. (1998),o primeiro domínio apresenta em torno de45% de similaridade entre si, ao passo queo segundo domínio mostra-se entre 45 e 75%similares e o terceiro domínio a partir de 75%de similaridade, quando se trata da seqüênciade aminoácidos.Carlson et al. (1994) relatam que B. thuringiensisapresenta em seu genoma de 2,4 a5,7 milhões de pares de bases, e a maioria dosisolados apresentam elementos extra cromossômicoslineares ou circulares. Os genes cryestão localizados em plasmídios e muitos isoladosde B. thuringiensis possuem diversos genescry responsáveis pela síntese de diferentesproteínas inseticidas (Lereclus et al., 1993).Durante seu desenvolvimento, B. thuringiensispassa por duas fases, a fase vegetativa e aestacionária, semelhantes ao desenvolvimentode Bacillus subtilis.A primeira fase caracteriza-se pelo crescimentoexponencial das células de B. thuringiensis,momento em que há grande disponibilidadede nutrientes no meio. A fase estacionáriaocorre quando o meio se torna hostil e abactéria adapta-se à diminuição de nutrientesatravés de mecanismos genéticos. A expressãodos genes cry de B. thuringiensis geralmenteocorre na fase estacionária da célula,acumulando seu produto na célula mãe, naforma de uma inclusão cristalífera, a qual éliberada no meio ao final da esporulação (Lerecluset al., 2000). Esta inclusão pode representarcerca de 25% do peso seco de células jáesporuladas (Agaisse & Lereclus, 1995). Essesautores relatam que apesar da expressão dosgenes cry estarem estreitamente relacionadaao evento da esporulação, existem genes cryque são expressos independentemente da esporulação.A quantidade de proteína produzida poruma célula de B. thuringiensis não está diretamenterelacionada com o número de cópiasde genes cry, pois a capacidade de produçãode proteína pela célula, mesmo com apenasuma cópia de um determinado gene cry, podeser elevada. Por exemplo, a cepa B. thuringiensiskurstaki HD73, possui apenas uma cópiade gene cry1, mas sintetiza cristais bipiramidaisem quantidades semelhantes àquelas produzidaspor cepas que apresentam três ou quatrodiferentes genes cry1. Desta forma, a sínteseprotéica atinge um limite máximo, com certonúmero de cópias de genes cry na célula eacima deste não há acréscimo na produção detoxinas (Agaisse & Lereclus, 1995).As toxinas Cry são as mais proeminentesde uma série de fatores que permitem o desenvolvimentode sua virulência à morte ou enfraquecimentodos insetos. Esses dados sugeremque muitas estirpes de B. thuringiensis podemser consideradas como patógenos oportunistasde insetos. Seria de grande importância umacompreensão mais profunda das verdadeirasfunções ecológicas de B. thuringiensis, tantopara melhorar a confiabilidade da avaliação dosriscos e para o desenvolvimento de métodoseficientes de isolamento de estirpes de B. thuringiensis,contendo genes cry ativos.1.2 Proteínas VipAs proteínas VIP foram descritas por Estru-28 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
Tabela 2. Proteínas Vip com efeito tóxico a diferentes insetosEstruch (1996) e 23% das cepas avaliadaspor Rice (1999). As subfamílias Vip1 e Vip2(Tabela 2) são componentes de uma proteínabinária com atividade inseticida contraDiabrotica virgifera e D. longicornis(Han et al., 1999; Warren, 1997). As proteínasVip 3 são ativas contra lepidópteros(Tabela 2), como Spodoptera frugiperda eHelicoverpa zea. Seu modo de ação estárelacionado à formação de poros na membranado epitélio do intestino médio (Yuet al., 1997; Loguercio et al., 2002; Lee etal., 2003). Ao mesmo tempo que a Vip 3apresentou toxicidade sobre lepidópterose não mostrou efeitos sobre insetos nãoalvo(Whitehouse, 2007).Devido a sua atividade inseticida relacionadaa Heliothis zea, as proteínas Vip3A estão sendo expressas em plantas dealgodão, conferindo resistência ao inseto.Nesse sentido, Bommireddy et al. (2007),avaliaram plantas de algodão modificadassomente com a proteína Vip 3A, ou com acombinação de Vip 3A e Cry 1Ab (Vip Cot)nos lepidópteros H. zea e H. virescens. Considerandoo comportamento das lagartas,os resultados desses autores mostram quehouve maior índice de infestação em plantasnão modificadas em relação às demais(Vip 3A e Vip Cot).O conjunto desses dados demonstraque às proteínas Vip são promissoras nocontrole de insetos-praga, uma vez que possuemdiferenças estruturais em relação àsdemais proteínas de B. thuringiensis, o quepode retardar o processo de resistência naspopulações de insetos.ch et al. (1996) e recebem essa denominaçãopor serem produzidas na fase vegetativade crescimento de B. thuringiensis. Suaconcentração também permanece alta antese depois da fase de esporulação.Vários estudos foram realizados apóssua descoberta visando a caracterização,identificação de novos tipos, ação inseticidae também produção de plantas com capacidadede expressá-las. Estes estudos, porém,são incipientes quando comparadoscom as endotoxinas.A localização dos genes responsáveispor sua produção ainda não foi determinada,embora existam vários conjuntos deprimers que podem ser utilizados para identificá-lascomo vip1 e vip2 (Rice, 1999; Fanget al., 2007; Selvapandiyan et al., 2001 )vip3A (Rice, 1999), vip3Aa (Seifinejad et al.,2008), vip5 e vip6 (Loguercio et al., 2002).A Figura 2 apresenta um dendogramacom as proteínas Vip, já identificadas e catalogadas,no site: http://www.lifesci.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt. Esse dendograma mostraprimeiramente dois grandes agrupamentosde proteínas onde são encontradas seqüênciasgenéticas semelhantes entre si,subdivididos em cinco grupos menores, deacordo com essa seqüência genética. Percebe-se,claramente que esses cinco grupossimilares são formados por proteínasda mesma classe, ou seja, Vip1, Vip2 e Vip3. A diferença entre a seqüência de genesque codificam essas proteínas é que definesua classificação, como Vip1Aa, Vip1Ab, entreoutras.De acordo com Rang et al. (2005), asproteínas Vip2 exibem entre 21 e 22% desimilaridade com a proteína Vip3Ba1, enquantoas proteínas da classe Vip1 são entre8 e 22% similares à Vip3Ba1.Segundo Fang (2007) estas proteínasrepresentam uma das maiores descobertasde toxinas com capacidade inseticida, sendoextremamente relevante a ausência desimilaridade nas seqüências de aminoácidosdestas proteínas com as seqüências deaminoácidos das endotoxinas, especialmente,em termos de manejo e evolução daresistência.De acordo com o dendograma da Figura2, estas proteínas são classificadas emtrês subfamílias diferentes (Crickmore et al.,2005), sendo que ocorrem em torno de 15%das cepas de B. thuringiensis avaliadas por1.3 Demais fatores de virulênciade B. thuringiensisAlém das proteínas Cry e Vip, os isoladosde B. thuringiensis podem sintetizarproteínas denominadas Cyt, que possuematividade citolítica in vitro e especificidadein vivo aos dípteros (Höfte & Whitheley,1989; De Maagd et al., 2003). De acordocom esses autores fazem parte desse grupoas proteínas Cyt1Ca e Cyt2Aa e seumodo de ação também pode estar relacionadoa um sinergismo com outras toxinasproduzidas pelos isolados.O entomopatógeno também produzoutros fatores de virulência, como as β-exotoxinas, α-exotoxinas, hemolisinas, enterotoxinas,quitinases e fosfolipases (Höfte& Whiteley, 1989; De Maagd et al., 2001).Esses autores declaram desconhecida aexata contribuição de cada fator na virulênciada bactéria, sendo uma dificuldadedeterminar o espectro tóxico de um isoladoque sintetiza mais de uma proteína. Issoporque, quando os fragmentos tóxicos vãose ligar aos receptores da membrana dointestino médio do inseto, ocorre uma competiçãopelos sítios de ligação, que podeinterferir na toxicidade do isolado.Guttmann & Ellar (2000) identificaramisolados de B. thuringiensis com a presençade hemolisinas, quitinases e lecitinases,<strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong> 29
Tabela 3. Subespécies de Bacillus thuringiensis produtores da β-exotoxinade Barreto et al. (1999) utilizando S. frugiperdaem seus ensaios de toxicidade. Porém, devidoas suas propriedades não específicas aosinsetos, ou seja, pode também afetar organismosnão-alvo, os isolados bacterianos que sãoprodutores dessa toxina não podem ser comercializadospara serem utilizados na agriculturavisando o controle de insetos-praga.sendo eles: Bt kurstaki, Bt israelensis, Btfukuokaensis Bt kyushuensis, Bt darmastadiensis,Bt thompsoni, Bt tolworthii e Bt ostrinae.Já as subespécies Bt galleriae, Bt aizawaie Bt wuhanensis apresentaram somentehemolisina e quitinase.Os mesmos autores também relatam apresença do gene que codifica a enterotoxina,uma toxina produzida por diferentescepas de B. thuringiensis, com peso molecularem torno de 45kDa, e que pode sertóxica a vertebrados, uma vez que é análogaà toxina produzida por B. cereus. Considerandoa análise de 13 isolados de B.thuringiensis avaliados, 9 foram positivospara o gene entS que codifica a enterotoxina.No mesmo sentido, Rivera et al. (2000)avaliaram 74 isolados do entomopatógeno,em relação a presença dos genes bce, hbl enhe para a enterotoxina. Os seus resultadosmostram que o gene nhe foi o maisfreqüente, seguido de hbl e bce mostrandoassim, uma pequena diferença na distribuiçãodesses genes entre B. thuringiensis eB .cereus.Outros dados de pesquisa sobre enterotoxina(Ngamwongsatit et al., 2008), revelarama presença dos genes hbl, nhe, cytKe entFM em 205 isolados de B. thuringiensise 411 isolados de B. cereus. Os dadosdesses autores mostram que, em 149 isoladosde B. thuringiensis todos os genes ocorreramsimultaneamente, sendo os genes nhee entFM aqueles de menor freqüência. Essesautores relatam a importância desseconhecimento uma vez que a enterotoxinapode causar intoxicação alimentar, quandorelacionada ao patógeno B. cereus.Em relação à β-exotoxina, também chamadathuringiensina, é uma proteína compeso molecular de 0,7 kDa (Gohar & Perchat2001), insespecífica, termoestável,identificada por inibir a síntese de rRNA(Mackedonski & Hadjilov, 1972) e prejudicara formação do fuso mitótico, dentreoutros efeitos observados em ensaios in vitrocom Alium cepa (Sharma & Sahu, 1977).Por ser inespecífica e tóxica a vertebrados,a thuringiensina é avaliada em testes laboratoriais,utilizando roedores como cobaias.Os dados de Ohba et al. (1981) mostramque, de 740 isolados de B. thuringiensisavaliados quanto a presença da β-exotoxina,28 produziram essa toxina. Alémdesses, dois isolados da espécie B. subtilis,um isolado de B. natto e dois isolados daespécie B. megaterium também foram produtoresda thuringiensina.Nesse sentido, Hernandéz et al. (2003)revelam que 79% dos isolados de B. thuringiensisthuringiensis são produtores dessatoxina, seguidos de 20% para B. thuringiensiskenyae, 13% para B. thuringiensiskurstaki, contrastando com 0% de produçãopara B. thuringiensis aizawai.Na Tabela 3 constam dados sobre a produçãoda β-exotoxina pelas diferentes subespéciesde B. thuringiensis.A thuringiensina também apresenta atividadeinseticida a diferentes espécies deinsetos-praga, como demonstra o trabalho1.1 ReferênciasAgaisse, H. & Lereclus, D. 1995. How does Bacillusthuringiensis produce so much inseticidalcrystal protein? Journal of Bacteriol., 177:6027-6032.Bhalla, R., Dalal, M., Panguluri, S.K., Jagadish, B.,Mandaokar, A.D., Singh, A.K., Kumar, P.A.,2005. Isolation, characterization and expressionof a novel vegetative insecticidal proteingene of Bacillus thuringiensis. FEMSMicrobiology Letters 243: 467–472.Barreto, M.R., Louguercio, L.L., Valicente, F.H.,Paiva, E. 1999. 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PesquisaPesquisaMECANISMO DE AÇÃODE BACILLUS THURINGIENSISLidia Mariana FiuzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia – Fitossanidade (UFRGS),Doutora em Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora embiotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).estudo do modo de ação dasproteínas Cry de B. thuringiensisserá abordado revelandoa especificidade dessas toxinasatravés da detecção de receptorespresentes no sistema digestivo dos insetos-alvo.O tema trata do modo deação completo de B. thuringiensis, desdea ingestão do entomopatógeno até amorte do inseto. O processo de análisede receptores nos tecidos dos insetos édescrito detalhadamente, envolvendodiferentes abordagens metodológicas dedetecção de sítios de ligação das proteínasinseticidas e uma discussão comdados de diversos autores que desenvolvempesquisas nessa área.1.1 Modo de ação das proteínasCry de B. thuringiensisAs análises do modo de ação dasproteínas Cry de B. thuringiensis visamesclarecer os mecanismos pelos quaisestas proteínas exercem seu efeito entomopatogênicoe elucidar a especificidadedas diferentes toxinas (Endo eNishiitsutsuji-Uwo, 1980; Höfte e Whiteley,1989; Gill et at., 1992; Schnepf etal., 1998; Fiuza, 2004). Considerando oconjunto de informações atualmente disponíveissobre as fases entre a ingestãodos cristais e a morte das larvas dos insetossuscetíveis às proteínas Cry de B.thuringiensis, descreve-se como fases domecanismo de ação:(i)(ii)(iii)Inicia pela solubilização dos cristaisem pH alcalino no intestinomédio dos insetos, liberando asprotoxinas de 130-140 kDa paraCry1 e 70 kDa para Cry2. Essaetapa é determinante à especificidadedo isolado de B. thuringiensisà espécie alvo, tanto pelaalcalinidade do sistema digestivoquanto pela composição doscristais de B. thuringiensis.Protoxinas são ativadas pelasenzimas digestivas, formandofragmentos tóxicos de 60-65 kDa.Nessa etapa tanto a composiçãoproteolítica quanto a estruturaprotéica do cristal são importantes.Toxinas reconhecem receptoresespecíficos às microvilosidadesdas células epiteliais do intestinomédio das larvas suscetíveisàs quais elas se ligam. Os estudosrealizados com BBMV (BrushBorder Membrane Vesicles) isoladasde larvas de lepidópterosmostram que a ligação de forteafinidade entre a toxina e o receptoré reconhecido como umfator importante na determinaçãodo espectro inseticida das proteínasCry (Fiuza et al., 1996). Dadosde pesquisa mostram que háuma correlação positiva entre aligação, in vitro, da toxina noreceptor intestinal e a toxicidade,in vivo. Por outro lado, outrosestudos descrevem que oreconhecimento do receptor énecessário, mas não é suficientepara provocar a toxicidade, sugerindoa existência de outrosfatores relacionados ao modo deação das proteínas Cry. Em 1994,Knight et al., isolaram de BBMVde larvas de Manduca sexta32 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
(iv)(Lep., Sphingidae) uma aminopeptidaseN implicada na interaçãoda toxina Cry1Ac. Os modelosde receptores atualmentedescritos mostram que uminseto pode apresentar, emquantidade variável, diversasclasses de receptores que podemser reconhecidos por diferentestoxinas. Dados de pesquisarevelam que estes modelospodem explicar a especificidadedas toxinas de B. thuringiensis.Após o reconhecimento do receptor,a toxina induz a formaçãode poros na membrana celulardo epitélio intestinal. Aformação dos poros na membranacelular provoca o desequilíbrioiônico entre o citoplasmae a o meio externo àcélula. As análises histopatológicasrealizadas após a intoxicaçãodos insetos mostram adestruição das microvilosidades,hipertrofia das células epiteliais,vacuolização do citoplasmae lyse celular, levandoo inseto a paralisia e morte.Na seleção das proteínas inseticidas,sintetizadas por essa bactéria, asanálises in vitro dos receptores membranarespodem viabilizar uma rápidadeterminação do espectro de ação dasproteínas Cry contra as espécies alvo,sendo em seguida efetuada a avaliaçãoda toxicidade in vivo, apenas paraos isolados pré-selecionados como ativosin vitro. Sendo assim, o presentetrabalho trata de diferentes métodosde análise de receptores de proteínasde B. thuringiensis em formas imaturasde lepidópteros.1.2 Análise de receptores emcortes histológicos de insetos1.2.1 Tecidos dos insetosAs larvas de insetos podem serobtidas de coletas a campo, as quaisdevem passar por um período de quarentaem condições controladas, ouoriundas de criação massal de insetosmantida em laboratório, em condiçõescontroladas de temperatura, umidaderelativa e fotofase, as quais podemvariar de acordo com a espécie do inseto.Os tubos digestivos dos insetossão dissecados e fixados 24 h, em BouinHollande Sublimé a 10%, lavadospor 12 h em água destilada e desidratadosem séries crescentes de etanol,70 a 100% (Brandtzaeg, 1982). Em seguidaos tecidos são impregnados emFigura 1. Receptores de proteínas Cry biotiniladas, revelados nos tecidos delarvas de lepidópteros, com fosfatase alcalina e peroxidase (Fiuza, 1995)banhos mistos (etanol/tolueno/paraplasto)e incluídos em paraplasto100% a 58 o C. Os cortes longitudinaisou transversais, de 7 a 10 µmde espessura, preparados com micrótomoLKB, são montados em lâminasde vidro, tanadas com polyl-lysinaa 10%, e conservadas a 4 o Cpara posterior análise de receptoresem cortes histológicos.1.2.2 Proteínas CryAs cepas de B. thuringiensis podemser cultivadas em meio usualglicosado por aproximadamente 5dias, conforme o método de Mahillon& Delcour (1984). Após a lisebacteriana devem ser centrifugadase lavadas com tampão fosfato, pH6. Os cristais são separados dos esporose das células bacterianas emgradiente de renografina ou sacarosepor ultra centrifugação, conformemetodologia descrita porSharpe et al. (1975). As bandas, contendoos cristais puros, são lavadase diluídas em água milli-Q esterilizada,contendo phenylmethylsulfonyl(PMSF).As proteínas Cry são solubilizadasem tampão fosfato, pH 10. EssepH deve ser ajustado a 8,6 por diálisecontra o tampão 20 mM Tris eas proteínas Cry são ativadas porbovine pancreatic trypsin (Type I),sendo a reação inativada com trypsininhibitor (Type II). A pureza ea integridade das proteínas pode seravaliada por eletroforese em gel depoliacrilamida a 10%, SDS-PAGE(Laemmli, 1970). A concentraçãopode ser determinada pelo método Bradford(1976), usando a bovine serum albumin(BSA) como proteína padrão.1.2.3 Proteínas biotiniladasAs proteínas Cry podem ser biotiniladas,conforme o método descrito porBayer & Wilcheck (1990), onde a incorporaçãoda biotina na parte N-terminalda proteína é feita usando o BNHS (biotinyl-N-hydroxysuccinimide)em tampãode bicarbonato de sódio, pH 9. Oproduto da reação deve ser purificadoem sephadex G-25 (Sigma) e as fraçõesbiotiniladas identificadas por dot-blot,onde se utiliza membrana de nitrocelulose,o conjugado de estreptavidina-fosfatase-alcalinadiluída no tampão TST(Tris-Saline-Triton, pH 7;6) e o substratode revelação (BCIP e NBT em tampãoTris; pH 9,5). A concentração dasproteínas Cry biotiniladas pode ser determinadapelo método Bradford (1976),usando a BSA como proteína padrão. Apureza e a integridade das proteínasmarcadas pode ser avaliada em westernblot,usando membrana de nitrocelulose(Sigma) e o tampão Towbin, pH 8,3com 10% etanol. As membranas podemser reveladas usando a mesma técnicadescrita no dot-blot.1.2.4 AnticorposAs proteínas Cry são preparadas,conforme descrito anteriormente napurificação, e depois são utilizadas naobtenção de anticorpos em pequenosanimais como: coelhos, ratos e camundongos,entre outros. O soro coletadodos animais é utilizado na obtenção dasimunoglobulinas (IgGs), as quais podem<strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong> 33
Figura 2. Receptores de proteínas Cry biotiniladas, detectados nostecidos de larvas de lepidópteros com fluoresceína e observados emmicroscopia de varredura laser (Fiúza, 1995)ser separadas em colunas de sepharoseprotein-A e as frações purificadas porafinidade incubando os IgGs e as membranasde nitrocelulose, contendo osantígenos previamente transferidos porwestern-blot conforme descrito porBurke et al. (1982). A especificidade esensibilidade dos anticorpos policlonaisé determinada pelo método de dot-blote ELISA - Enzyme-linked immunosorbentassay.1.2.5 Detecção in vitro de receptoresAs análises in vitro dos receptoresde proteínas Cry de B. thuringiensis sãorealizada com cortes histológicos do sistemadigestivo das larvas dos insetos emestudo. A detecção propriamente ditacorresponde a incubação dos tecidoscom as proteínas, previamente desparafinadose reidratados.Nas análises com proteínas Cry biotiniladas,os cortes histológicos são incubadosà temperatura ambiente, durante1h, com as proteínas biotiniladas. Asproteínas não ligadas aos sítios receptoressão removidas com TST, pH 7,6.Na etapa posterior, os tecidos sãotratados com estreptavidina conjugadaa uma enzima (peroxidase ou fosfatasealcalina) ou fluorocromo (fluoresceínaou ficoeritrina), diluídos em tampão TST.O complexo da reação “proteína-receptor”,usando o conjugado com enzimaspode ser revelado com substrato DABpara peroxidase e BCIP/NBT para fosfatasealcalina (Figura 1), sendo as secçõesmontadas com Pertex, entre lâminae lamínula de vidro.Nas revelações com fluorocromos,com a fluoresceína (Figura 2), os corteshistológicos são montados com Mowiole conservados a 4°C para análise emmicroscopia óptica - MO ou microscopiade varredura Laser – MVL.Nas análises imunohistoquímicas,com proteínas não marcadas (proteínasnativas), os receptores são reveladoscom o complexo anticorpo primário(AC1, específico contra a proteína Cry)e anticorpo secundário (AC2, dirigidocontra o AC1) conjugado a uma enzimaou fluorocromo, os quais são reveladose montados de acordo com o métododescrito anteriormente. As testemunhassão preparadas pela omissão alternadade cada etapa da reação, a fim de eliminara hipótese de reações falso-positivas.As amostras reveladas com enzimas,tipo peroxidase e fosfatase alcalina,podem ser avaliadas em microscopiaóptica. Para as análises onde são utilizadosos fluorocromos pode ser utilizadaa microscopia de fluorescência convencionalou de varredura laser.1.3 ConsideraçõesAs marcagens detectadas na regiãodas microvilosidades das células do epitéliointestinal revelam a presença dereceptores membranares às proteínasCry, nas microvilosidades das célulasepiteliais do intestino médio das larvasdos insetos (Figuras 1 e 2).No caso dos tecidos tratados comocontrole, representantes da omissão alternadados diferentes componentes dareação, pode-se observar a ausência decoloração nas microvilosidades das célulasdo epitélio intestinal dos insetosem estudo.As imunodetecções e as detecçõesde proteínas Cry biotiniladas foram utilizadaspor diversos autores, para revelaçãode receptores membranares intestinais,em larvas de diferentes espéciesde lepidópteros (Bravo et al., 1992a;Denolf et al., 1993a; Estada e Ferre, 1994;Fiuza, 1995), de dípteros (Ravoahangimalalaet al., 1993) e de coleópteros(Bravo et al. 1992b; Denolf et al., 1993b;Boets et al., 1994). Esses autores comprovaramque as ligações das proteínasCry nas microvilosidades do intestinomédio das larvas de insetos correspondemà existência de um receptor específicoà referida proteína no inseto-alvo.Considerando, os estudos dos receptoresin vitro e as análises da toxicidadein vivo, pode-se inferir que os métodosde detecção de receptores membranarespodem ser aplicados na seleção dasproteínas ativas contra insetos, havendouma correlação positiva entre as análisesin vitro e in vivo. Porém, para determinara Concentração Letal Média(CL 50) de uma proteína Cry faz-se necessárioo bioensaio uma vez que as ligaçõesdas proteínas aos receptorespodem variar em concentração e afinidade,como já descrito por diversos autores,para diferentes espécies de insetos(Denolf et al., 1993a; Van Rie et al.,1990; Fiuza et al., 1996; Lee et al., 1996;Hua et al., 2001). Também há estudosdemonstrando que as proteínas Cry tóxicasaos insetos correspondem àquelasque se ligam de forma irreversívelaos receptores das células epiteliais dosinsetos alvo (Liang et al., 1995).No controle biológico de insetos, aespécie Bacillus thuringiensis ofereceas melhores alternativas à produção debiopesticidas e à engenharia genética deplantas. Sendo assim, é fundamentalavaliar o espectro de ação e a especificidadedas proteínas potencialmenteinseticidas e, nesse contexto, Fiuza(2004) menciona que a análise in vitrodos receptores membranas pode serconsiderada uma ferramenta indispensávelface ao grande número de isolados,cepas e proteínas de B. thuringiensisjá identificados, que representamum potencial no manejo de insetos-praga.1.4 ReferênciasBayer, E.; Wilcheck, M. 1990. Proteinbiotinylation. Methods in Enzymo-34 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
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PesquisaTOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSISÀS PRAGAS AGRÍCOLASPesquisaDiouneia Lisiane BerlitzBióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).Aline Oliboni de AzambujaBióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).Andresa Patrícia Regert LuchoEngenheira Agrônoma (UFRGS) e Mestre emBiologia: Diversidade e Manejo de VidaSilvestre (UNISINOS).Neiva KnaakBióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutorandaem Biologia: Diversidade e Manejo de VidaSilvestre (UNISINOS).Rogério SchünemannBiólogo (UNISINOS) e Mestre em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).Jaime Vargas de OliveiraEngenheiro Agrônomo (UFSM), Mestre emFitotecnia – Fitossanidade/Entomologia(UFPEL),Lidia Mariana FiuzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestre emFitotecnia – Fitossanidade (UFRGS), Doutoraem Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologiaVegetal (CIRAD-Montpellier).controle microbiano de insetostem sido considerado ummétodo de controle seguroaos humanos e ao meio ambiente,sendo assim nesse trabalhosão apresentados dados de toxicidadede B. thuringiensis a insetospraga,especialmente aos lepidópterose coleópteros pragas de importânciaagrícola. Os trabalhos de pesquisa enfatizamos métodos de ensaios toxicológicosem laboratório e campo, utilizandoo entomopatógeno B. thuringiensise as formas imaturas das espécies-alvo.1.1 Os insetos-pragaEntre os insetos-praga para os quaistêm sido desenvolvidos estudos e aplicaçõesde controle com B. thuringiensisestão os lepidópteros, Spodopterafrugiperda e Anticarsia gemmatalis, eo coleóptero Oryzophagus oryzae, osquais serão apresentados como modelode estudos de toxicidade com B. thuringiensis.A lagarta militar, S. frugiperda, atacae causa danos a várias culturas deimportância econômica, como: sorgo,milho, arroz, alfafa, cana-de-açúcar e algodoeiro(Cruz et al., 1999; Gallo et al.,2002), ao passo que, a lagarta da soja A.gemmatalis é praga-chave para essa culturae também tem importância paraculturas como amendoim, feijão e alfafa(Gallo et al., 2002). Já o gorgulho aquático,O. oryzae, cujas larvas são conhecidascomo bicheira-da-raiz-do-arroz, éo principal inseto-praga da cultura doarroz irrigado no sul do Brasil (Martinset al., 2004) e, por isso, é também umdos mais estudados pelas instituições depesquisa dessa região (Costa, 2003).As lagartas de S. frugiperda e A. gemmatalispodem ser criadas em laboratório,desde que respeitados determinadospadrões de temperatura, umidaderelativa e fotoperíodo (28ºC, 70%U.R.,12h de fotoperíodo). O ciclo evolutivodesses insetos, em laboratório, ocorreem torno de 30 dias, desde a fase deovo até a emergência do adulto. Os adultossão mantidos em gaiolas de acrílicocom alimentação a base de glicose aquosa(10%), onde acasalam e realizam apostura. Os ovos são retirados diariamentee acondicionados junto à dietaartificial, sendo dieta de Poitout para S.frugiperda e dieta de Greene para A.gemmatalis. As lagartas desenvolvemsenessa dieta até a formação da pupa,que então são separadas em macho oufêmea até emergir o adulto, finalizandoo ciclo.No caso de O. oryzae, por se tratarde uma larva aquática, que se alimentadas raízes das plantas de arroz, não édescrito nenhum método de criação eficientedesse inseto, em laboratório. Portanto,quando realizados os bioensaios,esses insetos são coletados diretamentede áreas de plantio de arroz infestadas,trazidos ao laboratório para então se-36 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
Figura 1. Bioensaios com lagartas de Spodoptera frugiperda (A) ou Anticarsia gemmatalis e larvas deOryzophagus oryzae (B)rem utilizados nos ensaios biológicos.1.2 Bioensaiosde B. thuringiensiscom os insetos-pragaPara determinar a atividade inseticidade isolados bacterianos, os bioensaiospodem ser classificados como preliminaresou seletivos. A utilização desuspensão de células e esporos bacterianosé uma forma de identificar isoladosativos cujas propriedades mostrameficiência no controle de insetos-praga.Bioensaios também são utilizadospara determinar a Concentração LetalMédia (CL 50), ou seja, a quantidade deentomopatógeno que deve ser utilizadapara controlar a metade da populaçãodo inseto. Para esses, são usados os isoladosque causaram um eficiente índicede mortalidade nos testes preliminares.Nesta análise são utilizadas suspensõescontendo células e esporos ou a proteínapurificada, dosados em diferentesconcentrações. Os ensaios de toxicidadesão importantes também, pois revelaminjurias e detrimento morfológico,além de determinar em quanto tempoocorre a morte do inseto, Tempo LetalMédio (TL 50). Esses dados são então analisadospara que, quando aplicado emlavouras, o bioinseticida seja eficienteno controle dos insetos-alvo.Os ensaios utilizando as lagartas deS. frugiperda e A. gemmatalis podemser realizados em mini-placas de acrílico,contendo dieta artificial, onde é aplicadaa quantidade de inóculo pré-determinadapara uma lagarta por placa(Figura 1A). A quantidade de insetospode variar entre 20 e 50 e o número derepetições entre três e cinco. No casodo coleóptero O. oryzae, os testes podemser realizados em tubos de ensaio contendouma planta de arroz, água e a suspensãobacteriana, com 5 larvas do insetopor tubo (Figura 1B). Todos os bioensaiosutilizam placas ou tubos controle,contendo os insetos e sem adição dos tratamentos.Os ensaios são acondicionadosem câmaras climatizadas nas mesmas condiçõesde criação ou manutenção dos insetosem laboratório, descritas anteriormente.Os experimentos são avaliados atéo 7º dia após a aplicação dos tratamentose os dados são utilizados para o cálculoda mortalidade corrigida pela fórmula deAbbott (1970).1.3 Controle de S. frugiperdacom B. thuringiensisApesar de inúmeras pesquisas envolvendoesse lepidóptero e seu controle, hádificuldade em encontrar um isolado bacterianopatogênico a essa espécie. Essaafirmação é comprovada no trabalho dePolanczyky et al. (2003) que, utilizando58 subespécies de B. thuringiensis em S.frugiperda demonstraram que apenas B.thuringiensis morrisoni apresentou 80%de mortalidade das lagartas. Também Silvaet al. (2004), testaram 77 isolados sendoque somente 4 foram ativos a espéciealvo.Recentemente, Berlitz & Fiúza (dadosnão publicados) testaram 132 isoladosonde apenas um apresentou alta toxicidadeao inseto, com 100% de mortalidade,quando utilizada a suspensão de célulase esporos bacterianos. Em outro trabalho,Berlitz et al. (2003) testaram 24 isoladosde B. thuringiensis provenientes dediversas regiões orizícolas do RS e obteveas maiores mortalidades entre 31,6 e 100%com apenas cinco isolados, sendo que acepa com maior potencial inseticida foianalisada quanto ao perfil protéico confirmandoa presença de proteínas ativascontra lepidópteros. As reduzidas taxas demortalidade podem estar relacionadas adiferentes fatores, como por exemplo, omodo de ação das proteínas bacterianasno intestino do inseto, ou modificaçõesno sítio de ligação dessas toxinas na membranaintestinal. Além disso, cada isoladotem uma característica genética particular,ou seja, essas toxinas são codificadaspor genes e esses têm uma determinadaespecificidade.Em outro trabalho, Berlitz & Fiuza(2004) testaram B. thuringiensis aizawaiproveniente do produto formulado Xentari® mostrando que a suspensão celularapresentou CL 50de 1,9x10 8 UFC/mL (UnidadeFormadora de Colônia/mL) reduzindoem 56,7% o consumo alimentar daslagartas. Isso indica que a bactéria inibe aalimentação do inseto-praga, o que tambémestá relacionado com a mortalidadedas lagartas.Entretanto o fato de um isolado causarmortalidade às lagartas não implicaque, quando purificadas as proteínas tóxicas,essas serão ativas ao inseto. É o queocorreu na pesquisa de Berlitz (2006), que,quando utilizada a suspensão de célulase esporos bacterianos obtiveram 100% demortalidade, entretanto quando purificadasas proteínas do isolado, essas causarambaixa mortalidade às lagartas apresentandoCL 10de 268µg/mL. Esse fato podeestar relacionado ao conjunto de fatoresde virulência presentes na bactéria, ouentão a presença de outras toxinas como,por exemplo, proteína Vip, exotoxinas, hemolisinas,quitinases, entre outras, queestão presentes na suspensão bacteriana.<strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong> 37
A CL 50de proteínas Cry de B. thuringiensisaizawai para lagartas de 3ºínstar de S. frugiperda foi determinadapor Lucho (2004). As proteínas Cryforam obtidas a partir de bioinseticidacomercial (Xentari ® ), purificadasem gradiente de sacarose, solubilizadasem tampão fosfato (pH 10) e avaliadasem SDS-PAGE. Nos bioensaiosforam avaliadas seis concentrações deproteínas Cry (0,27 a 8,80 µg/mL) etestemunha (água destilada e esterilizada),sendo aplicados 10 µL sobre asuperfície de folhas de milho acondicionadasem mini-placas de acrílico,contendo um inseto. Cada tratamentofoi constituído de 30 lagartas e 3repetições, totalizando 630 insetos.Os resultados obtidos por Lucho(2004) apontaram CL 50de 2,22; 0,41 e0,18 µg/mL para 2, 3 e 4 dias após aaplicação dos tratamentos, respectivamente,e revelaram que as proteínasCry1Aa, Cry1Ab, Cry1C e Cry1Dsintetizadas por B. thuringiensis aizawaisão altamente tóxicas à S. frugiperda.Para a mesma espécie, S. frugiperda,os dados de Knaak et al. (2006)mostram que a toxicidade das proteínasCry1Ab e Cry1Ac, sintetizadas porB.thuringiensis thuringiensis 407 (pH408) e B.thuringiensis kurstaki HD-73, respectivamente, revelaram umaCL 50de 9,29 e 1,79 µg/cm 2 às lagartasde 1º instar.Nesse sentido, os dados de Lambertet al. (1996) revelam que a proteínaCry1Ac é muito tóxica para Heliothisvirescens, mas não mostra nenhumaatividade contra Helicoverpaarmigera. Os mesmos autores relatamque Cry1Ca exibe uma atividadeforte contra S. exigua e S. littoralis,mas não contra S. frugiperda. Peyronnetet al. (1997) utilizaram Cry1Aa emLymantria dispar causando uma despolarizaçãorápida e irreversível damembrana intestinal, mas Cry1Ab eCry1Ac eram inativas. Estes resultadosestão de acordo com Van Frankenhyzenet al. (1991) que demonstraramum nível alto de toxicidade paraCry1Aa, mas nenhuma atividade àsoutras duas toxinas, confirmando assima especificidade das proteínas Cryde B. thuringiensis aos lepidópteros.Considerando os isolados brasileiros,Praça et al. (2004) selecionandocepas de B. thuringiensis efetivascontra lagartas de 2º ínstar de S. frugiperda,compararam novas cepas aoB. thuringiensis kurstaki HD-1 (CL 50de 0,285 µg/cm 2 ), obtendo CL 50de0,09 e 0,52 µg /cm 2 , para S234 e S997,respectivamente, que revelou a novacepa S234 como a mais tóxica à S.frugiperda. Já nos estudos com proteínasCry, Aranda et al. (1996) determinaramque a CL 50para S. frugiperda dasproteínas Cry1Ab e Cry1Ac foram superioresa 2 µg/cm 2 .1.4 Controle de A. gemmataliscom B. thuringiensisAs análises de mortalidade de isoladosde B. thuringiensis às lagartas de A.gemmatalis, realizados por Schünemann(2006), mostraram que entre os 158 isoladostestados, 1<strong>38</strong> foram ativos e 20inativos. Entre os isolados patogênicos,39 deles causaram até 29% de mortalidade,93 entre 30 e 69% e 6 entre 70 e100%. Análises similares foram encontradospor Bobrowski et al. (2001) como mesmo banco de bactérias.Azambuja & Fiuza (2003) obtiveram37 e 50% de mortalidade corrigida contraa lagarta-da-soja utilizando dois isoladosnaturais de B. thuringiensis provenientesde regiões orizícolas do RS.Nas avaliações de patogenicidade realizadoscom isolados primitivos, Souza etal. (1999) e Silva et al. (2004), revelamgrandes índices de isolados patogênicosa mesma ordem de inseto. Por outrolado, a ocorrência de isolados inativosa lepidópteros é bastante freqüente.As variações entre as concentraçõesde proteínas inseticidas presentes emcada suspensão bacteriana pode ser acausa dessas diferenças entre a atividadeinseticida dos isolados.A ausência de patogenicidade de isoladosde B. thuringiensis pode estar relacionadaà classe de proteínas sintetizadaspelo mesmo, a qual não apresentaespecificidade ao inseto praga-alvo.Porém, Fiuza (2003) e Praça et al. (2004)destacam que o mesmo isolado bacterianopode ter atividade inseticida sobreespécies da mesma ordem, ou até mesmoa outras ordens de insetos.Em muitos casos a diferença de toxicidadedas cepas de B. thuringiensispode estar relaciona ao próprio inseto,onde, por exemplo, a extensão da variaçãogenética de A. gemmatalis podeestar relacionada a transferência de genesentre populações geográficas e otempo em que essas populações encontram-seseparadas, onde o mecanismode isolamento reprodutivo se torna umabarreira efetiva (Sosa-Gómez, 2004).Sendo assim, os dados da suscetibilidadede A. gemmatalis aos diferentes isoladosde B. thuringiensis são importantespara um manejo local ou regionaldesse inseto-praga, pois em m trabalhosenvolvendo cepas de B. thuringiensiskurstaki, por exemplo, Mascarenhas etal. (1998) e Dias et al. (1999) encontraramdiferentes índices de mortalidadeda mesma espécie.1.5 Controle de O. oryzaecom B. thuringiensisPara O. oryzae são relacionados poucosdados na literatura a respeito da açãode proteínas de B. thuringiensis. Por setratar de uma larva que se alimenta dasraízes da planta de arroz, portanto ficasubmersa, é difícil o acesso de bioinseticidasao local. Os atuais métodos de controledessa praga restringem-se aos inseticidasquímicos que são utilizados basicamenteno tratamento de semente ou distribuídosem cobertura na água de irrigação.Na busca de métodos alternativos decontrole desse inseto, o entomopatógenoB. thuringiensis mostra-se promissor naobtenção de plantas transgênicas resistentesà praga-alvo. Nesse sentido, Pinto etal. (2003), selecionaram 6 isolados de B.thuringiensis com a presença de genesda classe cry 3 ou cry 7, que sintetizam asproteínas inseticidas à ordem dos coleópteros,e avaliaram sua atividade inseticidaà O. oryzae. Dentre os isolados testadospelos autores, dois causaram mortalidadecorrigida de 100%, três entre 59 e 67% eum em torno de 50%.Esses dados foram utilizados por Berlitz(2006) que selecionou um isolado coma presença do gene cry3 que causou 53%de mortalidade com a suspensão de célulase esporos bacterianos, onde as proteínasinseticidas foram purificadas, dosadase aplicadas nos bioensaios com osinsetos (Figura 1B). Os resultados dessapesquisa podem ser aplicados na utilizaçãode genes cry, uma vez que causou amortalidade das larvas do coleóptero,quando utilizadas às proteínas purificadas,obtendo uma CL 50de 5,4µg/mL. Em estudospreliminares com essa espécie-alvo,Steffens et al. (2000) obtiveram 53,41% demortalidade às larvas do gorgulho aquáticocom um isolado de B. thuringiensiscontendo genes cry 3, específicos a coleópteros.Considerando os dados mencionados,os resultados obtidos pelos diferentesautores confirmaram a predição daatividade inseticida de B. thuringiensispossivelmente devido à presença dos genescry3 e cry7, os quais codificam toxinasespecíficas a coleópteros (Ben-Dov etal., 1997).1.6 ReferênciasAbbott, W. S., 1925, A method of computingthe effectiveness of insecticide.J. Econ. Ent. v.18, p.265-67.Aranda E.; Sanchez, J.; Peferon, M.; Guereca,L.; Bravo, A. 1996. Interactionsof Bacillus thuringiensis Crystal Proteinswith the Midgut Epithelial Cells<strong>38</strong> <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
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TOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSISPesquisaAOS INSETOS SOCIAISPesquisaas interações com as plantas,as formigas e os cupinspodem se tornar pragas enesse caso faz-se necessárioo controle, onde os entomopatógenosassumem um papelimportante no controle biológico.Nesse contexto, alguns dados de pesquisasobre os ensaios de toxicidadede B. thuringiensis às formigas cortadeirase aos cupins de montículo sãoapresentados nesse artigo.1.1 Os insetos sociaisNas sociedades de insetos, o sistemade castas possibilita uma divisãodo trabalho, permitindo a execução demúltiplas tarefas, nas quais indivíduosestéreis são responsáveis pela manutençãoda colônia (obtenção de alimento,defesa e cuidados com a prole), eos reprodutores limitam-se a reprodução.O Brasil está entre os países quecontemplam a maior diversidade deinsetos sociais do mundo.As formigas estão entre os organismosmais abundantes do planeta,somando, em conjunto, mais de 10%da massa de todos os organismos terrestres,incluindo mamíferos de grandeporte (Hölldobler e Wilson, 1990).De acordo com estes autores, em umhectare da Floresta Amazônica vivemmais de oito milhões de formigas.As formigas cortadeiras são osprincipais herbívoros dos Neotrópicos.Abundantes nas suas numerosascolônias desfolham a vegetação,sendo consideradas importantes pragasagrícolas no Brasil, com prejuízosestimados em milhões de reais.O gênero Acromyrmex representauma ameaça às plantas cultivadas.Esses insetos também se destacampor atacarem uma ampla variedadede vegetais, incluindo plantas ornamentais,reflorestamento e pastagens.As diferentes espécies deste gêneroapresentam ampla distribuição geo-Raquel de Castilhos-FortesBióloga (UNISINOS) e Mestre em MicrobiologiaAgrícola e do Ambiente (UFRGS)Aline Oliboni de AzambujaBióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).Laura Massochin Nunes PintoBióloga (PUCRS) e Mestre e Doutoranda emBiologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).Lidia Mariana FiuzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestre emFitotecnia – Fitossanidade (UFRGS), Doutora emCiências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) ePós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).Figura 1. Bioensaios com cepas de Bacillus thuringiensis e Nasutitermesehrhardti, em laboratório40 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
Figura 2. Representação esquemática dos bioensaios com Acromyrmexlundi e Bacillus thuringiensisgráfica no Rio Grande do Sul, evidenciandohábitos de forrageamento bastantediversos (Gusmão e Loeck, 1999).Os cupins estão presentes praticamenteem todos os ambientes terrestresou que sofreram alguma perturbaçãoantrópica, alimentando-se basicamentede celulose, obtida atravésdesta capacidade de ajustar-se a diversosecossistemas. Muitas espéciesdesempenham um papel ecológicosignificativo, reciclando nutrientesminerais no solo e participando na regeneraçãode ambientes devastados.Porém, várias outras espécies se destacamcomo os organismos mais daninhosà cultura agrícola e florestal(Berti-Filho, 1993). No Brasil, além dedificultarem seriamente os tratos culturais,os cupins de montículo são consideradosimportantes pragas de pastagense culturas de arroz, milho, canade-açúcar,amendoim e eucalipto. Asprincipais espécies responsáveis porestes danos pertencem aos gênerosCornitermes, Syntermes, Heterotermes,Nasutitermes, entre outros.O controle desses insetos vem sendorealizado basicamente com a aplicaçãode inseticidas químicos, sendoum método alternativo as bactérias entomopatogênicasque podem ser isoladasnaturalmente do corpo dessesinsetos, representando mais uma ferramentade combate ao inseto-praga,sem prejudicar o meio ambiente.1.2 B. thuringiensisisolados de insetos-sociaisNa análise da patogenicidade deB. thuringiensis sobre um determinadoinseto, o primeiro passo a ser adotadoé a correlação da atividade dasproteínas Cry no inseto-alvo já descrita.Caso este efeito ainda não tenhasido avaliado, uma das alternativaspoderá ser por meio do isolamento domicrorganismo de indivíduos da espéciede inseto-alvo. Diversos trabalhossão publicados anualmente descrevendoo isolamento de novas cepasde B. thuringiensis de diferentessubstratos, inclusive dos próprios insetos(Borm et al., 2002). Nesse sentido,Azambuja et al. (2001) obtiveram,a partir de 80 indivíduos de Acromyrmexsp., 35 isolados do gênero Bacillus,entre os quais 14 foram identificadoscomo B. thuringiesis. Através desteestudo pode-se constatar a elevadaocorrência de B. thuringiensis associadoa formigas cortadeiras.Para tanto, os insetos devem ser coletadoscom pinça e acondicionados emfrascos esterilizados a -18ºC até o momentode sua utilização. O isolamentoé realizado através da maceração de10 insetos em solução salina, sendo que1mL desta suspensão é submetida apasteurização, em seguida a inoculaçãoem Ágar Nutriente e incubaçãodurante 24h a 30°C.As colônias obtidas devem ser entãoinoculadas em meio seletivo (PenicilinaG) e mantidas a 30°C e 180rpmdurante 24 horas. As amostras positivasdevem ser avaliadas em microscopiade contraste de fase para identificaçãodas inclusões paraesporais, característicasde B. thuringiensis.Os isolados de B. thuringiensis,oriundos de A. lundi, que causarammortalidade ao referido inseto foramavaliados por PCR quanto a sua constituiçãode genes cry conforme descritopor Pinto et al. (2003). Os autores identificaramque sete dos nove isoladosque apresentaram toxicidade a A. lundiamplificaram fragmentos de DNAcorrespondentes a pelo menos uma dasclasses de genes cry avaliadas, sendoelas cry1 e/ou cry9. Os genes cry2,cry3, cry7 e cry8, os quais tambémforam avaliados na pesquisa, não foramdetectados nas amostras testadas.Além disso, 22% dos isolados obtidosde A. lundi não amplificaram com nenhumdos primers avaliados, podendoFigura 3. Patogenicidade de Bacillus thuringiensis à Nasutitermes ehrhardti, em ensaios de laboratório; B. thuringiensissooncheos (Bts); B.thuringiensis roskildiensis (Btr); B. thuringiensis yunnanensis (Bty); B. thuringiensis huazhongensis (Bth);B. thuringiensis braliliensis (Btb); B. thuringiensis colmeri (Btc) e B. thuringiensis kurstaki (Btk)<strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong> 41
Figura 4. Isolados de Bacillus thuringiensis a partir da maceração de Nasutitermes ehrhardti infectados;A- Bacillus thuringiensis soocheon; B- Bacillus thuringiensis roskildiensisrepresentar novos genes cry.1.3 Bioensaios de B. thuringiensiscom insetos-sociaisCupins e formigas sofrem ação de diversostipos de patógenos como: vírus,bactérias, fungos e nematóides, sendo adefesa contra os mesmos pouco conhecida.A complexidade do comportamento ea biologia dificultam o controle destes insetos(Leonardo, 1989; Diehl-Fleig, 1993).Portanto, técnicas de bioensaios evidenciandoo efeito desses entomopatógenossobre os insetos sociais, consideradospragas, são escassos. Nessa linha depesquisa, Castilhos-Fortes et al. (2002)avaliaram a patogenicidade de diferentescepas de B. thuringiensis, sobre Nasutitermesehrhardti, onde foram utilizadassuspensões contendo uma misturade células vegetativas, esporos e cristais.Porções de celulose (1cm 2 ), utilizadascomo substrato alimentar, foram mergulhadasnas suspensões de B. thuringiensis,as quais foram colocadas em placasde acrílico com seis compartimentos de5,5 cm de diâmetro. Em cada compartimento,contendo 1cm 2 de celulose tratada,foram colocados dez insetos (Figura1).O acondicionamento dos ensaios foifeito em estufa incubadora tipo B.O.D., a28 O C, 70% de umidade relativa, no escuro.A mortalidade dos insetos foi avaliadadiariamente até o 7° dia após a instalaçãodos bioensaios, observando-se os cupinsmortos com sintomas característicos deintoxicação por B. thuringiensis.Em 2003, Pinto et al. testaram o efeitode B. thuringiensis em formigas cortadeiras,cujo método de bioensaio foidesenvolvido objetivando a sobrevivênciados indivíduos por no mínimo setedias, tempo suficiente para a avaliaçãode bioensaios. Esse método foi constituídode uma dieta líquida composta depeptona bacteriológica, glicose e extratode levedura, com substituição periódicade 48 horas, previamente acondicionadaem pequenos frascos de polipropileno,acrescida de cinco indivíduos deAcromyrmex lundi (Figura 2).Utilizando o referido método de bioensaiode B. thuringiensis comAcromyrmex lundi, pode-se obter 100%de sobrevivência das formigas por 180horas (7,5 dias), tempo suficiente para aavaliação dos bioensaios com o entomopatógeno.1.4 Toxicidade de B. thuringiensisaos cupins e formigas cortadeirasAs referências de B. thuringiensiscontra isópteros são restritas, havendopoucos dados disponíveis, como os deCowie et al. (1989), que citam algumascepas de B. thuringiensis tóxicas a váriasespécies de térmitas em condiçõeslaboratoriais. Khan et al. (1985), tambémressaltam a carência de trabalhos desenvolvidosvisando testar B. thuringiensisem térmitas, embora tenham citado ostrabalhos de Smythe & Coppel (1965),os quais constataram que a solução comB. thuringiensis mostrou-se tóxica a trêsespécies de Reticulitermes, bem como aZootermopsis angusticollis. Khan et al.(1977) isolaram B. thuringiensis a partirde ninfas do isoptero Bifiditermes beesoniinfectadas, encontradas em campo.Nos testes de toxicidade contra Microcerotermeschampion, a suspensão debactérias testada causou alta mortalidadeem condições laboratoriais.Considerando a patogenicidade deB. thuringiensis para N. ehrhardti, Castilhos-Fortesel al. (2002) testaram 57cepas desta bactéria, sendo que setemostraram-se mais efetivas: B. thuringiensissooncheon (Bts) e B. thuringiensisroskildiensis (Btr) com uma mortalidadede 100%; seguidos dos isolados B. thuringiensisyunnanensis (Bty) com 71,4%;B. thuringiensis huazhongensis (Bth)com 57,1%; B. thuringiensis brasiliensis(Btb) com 52,3%; B. thuringiensis colmeri(Btc) com 42,85% e B. thuringiensiskurstaki (Btk) com 28,57% de mortalidadeao 7 o dia após a aplicação dos tratamentos,conforme resultados apresentadosna Figura 3.Para a determinação da CL 50de B.thuringiensis os referidos autores utilizaramos isolados B. thuringiensis sooncheone B. thuringiensis roskildiensis osquais causaram 100% de mortalidade nosensaios pré-seletivos. As CL 50de B. thuringiensissooncheon observadas foram46,98x10 8 , 66,19x10 6 e 5,14x10 5 esporos/ml, aos três, cinco e sete dias após ostratamentos, respectivamente. Para B.thuringiensis roskildiensis foram30,78x10 5 , 48,40x10 6 e 16,80x10 4 esporos/mlaos três, cinco e sete dias, respectivamente.A toxicidade de B. thuringiensis paraN. ehrhardti foi confirmada pelos autoresatravés de observações microscópicasde cupins macerados aos três, cincoe sete dias após a aplicação dos tratamentos.As estruturas de B. thuringiensisformadas por células em forma debastonete, cadeias, esporos e inclusõesparaesporais podem ser observadas naFigura 4A para B. thuringiensis sooncheone na Figura 4B para B. thuringiensisroskildiensis.A patogenicidade e o desenvolvimentode B. thuringiensis foram estudadospor Khan et al. (1985) nos isópteros Microtermeschampioni e Bifiditermes beesoni,que se mostraram suscetíveis àinfecção causada pela bactéria após aaplicação do formulado Thuricide-HP.De acordo com a análise histopatológica,foi constatado que a ação de B. thu-42 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
ingiensis é mais rápida em M. championiquando comparado a B. beesoni, sendoo intestino médio do inseto invadidopela bactéria seis horas após a ingestão,a qual penetra a cavidade corporal, o tecidoadiposo e células hipodérmicas 20 a24 horas após a infecção. Em B. beesoni,a bactéria instalou-se próximo à membranaperitrófica depois de 24 horas, atacouo epitélio e células regenerativas após 48horas e alcançou a membrana basal dointestino médio 72 horas após a infecção.Nos estudos do efeito patogênico deB. thuringiensis contra A. lundi foramidentificados isolados ativos contra estaformiga cortadeira, sendo que o isoladoBt HA48 atingiu 100% de mortalidade (Pintoet al., 2003).1.5 PerspectivasEm insetos sociais, aspectos comohábitos comportamentais devem ser considerados,uma vez que a eliminação deuma porção da colônia não é suficientepara a extinção. Os fragmentos restantestêm capacidade de recuperação e novainfestação, portanto há necessidade deeliminação da rainha das colônias (Martins,1998).O uso de organoclorados é o métodomais utilizado para controlar populaçõesde cupins e formigas e embora, commenos freqüência, outros métodos podemser citados como o controle cultural, açãode predadores e aplicação de extratosvegetais (Wilcken e Raetano, 1995).O controle biológico é uma alternativaao controle químico e vem ganhandodestaque em pesquisas de manejo depopulações de pragas. Os principais organismosutilizados para o controle deformigas e cupins são microrganismospatogênicos, em especial fungos e nematóides,e até o momento poucas pesquisasforam realizadas em laboratório comB. thuringiensis.As pesquisas têm publicado resultadossatisfatórios no controle de formigasutilizando os fungos Beauveria bassiana,Metarhizium anisopliae e Paecilomycesfarinosus (Loureiro e Monteiro, 2005),além do microsporídeo Thelohania solenopsae(Williams e Deshazo, 2004). Omesmo ocorre com cupins avaliados frentea fungos entomopatogênicos, como B.bassiana (Bao & Yendol, 1971) e M. anisopliae(Kramm & West 1981; Hänel 1981 e1982).Diferentes estudos visam determinarquais os organismos patogênicos como fungosou nematóides, que poderiam ser utilizadoscontra os térmitas. Os resultados,geralmente, têm sido discrepantes. Outraslinhagens ou espécies de patógenos deveriamser testadas contra os térmitas subterrâneos,mas os testes de campo devem serprecedidos de estudos de laboratório paradeterminação da patogenicidade dos diferentespatógenos e linhagens. Isto pode ajudara avaliar o potencial do agente patogênicoe fornecer a base para estimar as concentraçõesrequeridas em campo.Fernandes (1994) relatou que os principaisproblemas enfrentados na pesquisasobre controle biológico de cupins são acarência de conhecimentos biológicos, opequeno número de taxonomistas que trabalhacom isópteros e a falta de outros grupostrabalhando em conjunto neste assunto.Contudo, bactérias entomopatogênicaspodem ser consideradas agentes de controlebiológico com potencial de patogenicidadee surgem como uma alternativa eficiente,ecológica e econômica para a soluçãodos danos causados por cupins e formigas.1.6 ReferênciasAzambuja, A.O. De; Pinto, L.M.N. & Fiuza,L.M. 2001. 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PesquisaTOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSISÀS PRAGAS URBANAS E VETORESPesquisaGabriela Cristina AllesBióloga (UNISINOS) e Mestre eDoutoranda em Biologia: Diversidade eManejo de Vida Silvestre (UNISINOS).Marcus HübnerBiólogo (FURG) e Mestre em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).Lidia Mariana FiuzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia – Fitossanidade(UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) ePós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).utilização de bactérias entomopatogênicasdo gêneroBacillus, como agente decontrole populacional depragas urbanas e vetores deagentes patogênicos, temrelevância nas pesquisas nacionais e internacionais.Sendo assim, esse trabalho tratado controle desses insetos, utilizando as espéciesB. thuringiensis e B. sphaericus,onde se destacam as características das espéciesdo grupo Bacillus, sua ocorrência ealguns dados de autores que realizaram pesquisasna área da saúde pública.1.1 Bacillus spp. no controle devetores de doenças1.1.1 Insetos vetores de doençasAlgumas espécies dos gêneros Anopheles,Aedes, Culex e Mansonia podem serimportantes vetores de patógenos humanosresponsáveis por enfermidades comomalária, febre amarela, encefalite, denguee filariose. Estas doenças atingem um númerosignificativo de pessoas em diversospaíses da Ásia, África e Américas. O Culexquinquefasciatus é responsável pela transmissãoda Wuchereria bancrofti, agente etiológicoda filariose bancroftiana no Brasil,além de ser um potencial vetor para o Vírusdo Oeste do Nilo (VNO), originado naÁfrica, onde as aves são os hospedeiros ereservatórios naturais, podendo acometero homem, cavalos e outras espécies, causandodesde febre, dor de cabeça e mialgiasaté encefalite severa e meningite. Desde1999 ocorrem epidemias da doença nosEUA e, até o momento, já foram registradosmais de 19 mil casos de infectados commais de 750 óbitos (Centers for DiseaseControl and Prevention, 2006). Recentemente,o vírus passou a circular no Caribee já foi isolado na Colômbia e em cavalosmortos na Argentina (Berrocal, 2006; Morales,2006). O Brasil tem um plano de vigilânciapara detectar a introdução do VNOno país, visto que o Cx. quinquefasciatus,potencial vetor, é abundante, além de umcontingente considerável de aves migratóriasque ocorre no país por ser origináriode rotas das Américas e de países vizinhos,onde ocorre a circulação do vírus (Luna etal., 2003).É importante ressaltar que há uma grandedificuldade do controle populacionaldestes mosquitos devido a suas característicasbiológicas como curto ciclo de vida,alta capacidade reprodutiva e de adaptaçãoao ambiente. O controle, através douso de inseticidas químicos tem apresentadoproblemas devido ao seu modo de açãonão específico, além da possibilidade derápida seleção de resistência de insetos aestes compostos. Por estas razões, a procurapor agentes mais seletivos aumentoue, com isso, a adoção de métodos de controlebiológico cresceu (Centers for DiseaseControl and Prevention, 2006).1.1.2 Bactérias entomopatogênicasA microflora bacteriana dos insetos,confinada no intestino, é rica, diversa ecompreende bactérias Gram-positivas enegativas. Entre as bactérias Gram-positivas,algumas auxiliam na digestão dos alimentos,porém outras são patogênicas erecebem grande atenção dos pesquisadoresdevido ao seu potencial para o controlede pragas (Priest, 2000; Fiuza, 2001). Entreestes patógenos destacam-se as bactériasdo gênero Bacillus, com potencial biopesticidaque representam cerca de 90% domercado mundial (Schnepf et al., 1998), sendoamplamente utilizados como uma alternativaaos inseticidas químicos em termosde segurança a organismos não-alvo equando ocorre o desenvolvimento de resistênciaa inseticidas químicos (Rodrigo-Simón et al., 2006).Duas espécies de bactérias entomopatogênicasse destacam no controle biológicodos insetos vetores: B. sphaericus e B.thuringiensis israelensis. Estes microrganismosestão sendo comercializados há maisde uma década, pois produzem proteínasinseticidas que, ao serem ingeridas, são letaispara as larvas dos mosquitos devido asua ação no trato digestivo. O Bti tem atividadedecrescente para os gêneros Aedes,Simulium, Culex e Mansonia, já o B. sphaericusé particularmente eficiente para ocontrole de larvas de Cx. quinquefasciatuse produtos comerciais à base desta bactériaestão disponíveis no Brasil.O principal fator tóxico do B. sphaericuspara larvas de Cx. quinquefasciatus é atoxina binária (Bin) contida em um cristalprotéico produzido durante a fase de esporulaçãoda bactéria. Após a ingestão destecristal pelas larvas, ocorre a sua solubilizaçãoem pH intestinal alcalino e a protoxinaliberada no lúmen é clivada por serinoproteasespara atingir a forma de toxina ativa.A toxina Bin ativa interage com receptoresespecíficos presentes na membrana apicaldas células do epitélio intestinal das larvas,principalmente nas regiões do ceco gástricoe intestino posterior.O B. sphaericus apresenta uma grandevantagem em relação ao Bti: a ótima persistênciaem criadouros ricos em matériaorgânica, típicos de larvas de Culex, alémde seus esporos sofrerem reciclagem noscadáveres das larvas, o que pode ampliarseu período de persistência nos criadouros(Nicolas et al., 1987; Skovmand & Bauduin,1997).Populações de larvas de Culex podemapresentar resistência ao B. sphaericus após44 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
Tabela 1. Mortalidade corrigida de Blatella germanica ePeriplaneta americana, submetidas aos tratamentos comsorovares de Bacillus thuringiensisMortalidade Corrigida (%)Tratamentos B. germanica P. americanaB.t. sorovar colmeri 6,65 0,0B.t. sorovar yunnanensis 14,85 0,0B.t. sorovar huazhangiensis 15,00 0,0B.t. sorovar roskildiensis 16,65 0,0B.t. sorovar sooncheon 30,00 0,0serem submetidas à forte pressão de seleção,sob condições de laboratório (Amorim,2007; Georghiou, 1992; Pei, 2002; Rodcharoen& Mulla, 1994) ou de campo(Mulla, 2003). Estes resultados apontampara a necessidade de racionalizar o usodo B. sphaericus, a fim de evitar a seleçãode populações resistentes.A primeira população resistente obtidasob condições de laboratório, foi submetidaà forte pressão de seleção e atingiu umnível de resistência da ordem de 100.000vezes, em relação à colônia susceptível(Georghiou, 1992). Em outro estudo realizadoem laboratório, foram selecionadasduas colônias de Cx. quinquefasciatus, noBrasil e na China, que atingiram um altonível de resistência (>100.000) (Pei, 2002).Também foi demonstrado que é possívelselecionar a resistência ao B. sphaericuscepa IAB59, sob condições de laboratório,embora, esta seleção tenha ocorrido deforma mais lenta em relação ao B. sphaericus2362. O nível de resistência chegou amais de 40.000 vezes (Amorim, 2007). Emcampo, já foram detectadas populações comníveis de resistência variáveis na França(Chevillon, 2001), Índia (Rao, 1995), China(Yuan, 2000), Tunísia (Nielsen-Leroux,2002) e na Tailândia (Mulla, 2003). O processode seleção da resistência em populaçõesde campo é modulado por diversosfatores que incluem o background genéticoda população, bem como fatores ecológicose ambientais.1.1.3 Controle integrado de vetoresO conceito do Manejo Integrado deVetores (MIV) surgiu como resultado deuma mudança de paradigma após o usointensivo de inseticidas químicos nas décadasde 1940-60. Em outras palavras, oMIV é definido como uma combinação racionalde diversos métodos de controledisponíveis, objetivando manter a populaçãode vetores em níveis aceitáveis e damaneira mais efetiva, econômica e segura,incluindo componentes biológicos, químicos,físicos e ambientais, visando interferiro mínimo possível no ecossistema. No MIV,várias ações são empregadas na tentativade englobar todas as causas do problema.No âmbito do controle de mosquitos, estasações podem incluir a melhoria da rede deesgoto e distribuição de água, eliminaçãofísica de criadouros, uso de barreiras físicasnas habitações, medidas de proteçãoindividual, uso de larvicidas específicos emcriadouros que não podem ser eliminados,além da conscientização e participação dacomunidade. Dentre estas ações, o uso debiolarvicidas apresenta vantagens, como aespecificidade para o inseto alvo e segurançapara o meio ambiente (Georghiou etal., 1992).O principal objetivo de estratégias decontrole integrado de vetores é reduzir adensidade populacional de mosquitos paraníveis em que a atividade é minimizada oua transmissão de doenças reduzidas ou interrompidacom o mínimo de efeitos ambientais.Idealmente, programas de controle integradodevem incluir intervenções maiseficazes e ambientalmente compatíveis.Devido à sua eficácia e aparente especificidade,tanto Bt israelensis quanto B. sphaericuspodem ser ideais para o programaintegrado de controle de pragas. (Lacey &Orr, 1994). A combinação de Bt israelensiscom outros agentes de controle biológicoresultou em um excelente controle e, emalguns casos, a supressão prolongada delarvas de mosquitos.Mulligan & Schaefer (1982) relataramum controle inicial de larvas de Cx. tarsalisem uma das zonas úmidas em que otratamento com Bt israelensis foi seguidopor abatimento em longo prazo com larvasde insetos predadores. Do mesmomodo, Mulla et al. (1993) observaram queas populações de Cx. quinquefasciatus, Cx.stigmatosoma e Cx. tarsalis não se recuperaramapós o tratamento com Bt israelensisdevido a subsequentes predações de larvaspor macroinvertebrados aquáticos euma redução na oviposição atrativa da pecuárialocal.Regis & Nielsen-Leroux (2000) revisandoestratégias de manejo de resistência B.sphaericus recomendaram o acompanhamentoda susceptibilidade das espécies-alvode B. sphaericus antes e durante o tratamento,alternando o uso de B. sphaericuscom Bt israelensis. Zahiri et al. (2004) demonstraramque utilizando suspensões demisturas contendo formulações comerciaisde Bt israelensis e B. sphaericus, não resultouem resistência em colônias de Cx. quinquefasciatus,enquanto que somente suspensõesde B. sphaericus gerou resistência.1.2 B. thuringiensisno controle de baratasSegundo Wilson (1972), estudos comparativosrealizados entre famílias primitivasde térmitas e baratas revelaram a existênciade múltiplas características em comumque, segundo o autor, poderiam consideraros térmitas como baratas sociais,cujos diagramas de filogenia, não só reforçameste parentesco, como também, relacionama evolução da flora microbiana intestinalentre as ordens Isoptera e Blattodea.Nesse contexto, a partir do trabalho deCastilhos-Fortes et al. (2002), Hübner (2004)testou cinco isolados de B. thuringiensisem Blatella germanica e Periplaneta americana:B. thuringiensis yunnanensis, B.thuringiensis colmeri, B. thuringiensis huazhangiensis,B. thuringiensis sooncheon eB. thuringiensis roskildiensis, oriundos doInstituto Pasteur, Paris.Para o estudo, adultos e ootecas de B.germanica e P. americana foram coletadosem estabelecimentos comerciais e residenciais,no município de Gramado, RioGrande do Sul. Ambas as espécies permaneceramem caixas de plástico (564 x <strong>38</strong>5x 371 mm e 400 x 270 x 362 mm), com asbordas superiores preenchidas com umamistura de água e talco neutro, para evitara fuga dos insetos. A umidade foi mantidaatravés de algodão umedecido, trocado acada 48 horas. Substratos de papelão corrugadoforam utilizados para mimetizar seuhábitat natural. Na alimentação foi utilizada0,5 g de ração animal moída Whiskas®,sendo os insetos mantidos em condiçõescontroladas (30ºC, 70% de U.R., 12h fotofase).Nos bioensaios, baratas adultas de ambasas espécies foram agrupadas em caixasplásticas (262 x 177 x 85 mm), contendoplacas de Petri com algodão umedecido emágua destilada e outra contendo 0,5g deração animal moída e 1000µL das suspensõesbacterianas a 1.10 10 células/mL. Nastestemunhas, os isolados foram substituídospor água destilada esterilizada. Paracada isolado bacteriano e cada espécie foramutilizados 30 insetos. A mortalidade foianalisada durante 7 dias após a aplicaçãodos tratamentos e corrigida pela fórmulade Abbott (Alves, 1998).Os dados de patogenicidade, utilizandoos cinco isolados de Bacillus thuringiensis,demonstraram uma baixa ação tóxicasobre B. germanica (6,65% a 30% demortalidade), e uma inatividade (0% de<strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong> 45
mortalidade) à P. americana, levando-se emconsideração que os índices de mortalidadecorrigida apresentados na Tabela 1.Apesar de Wilson (1972) ter descrito umparentesco evolutivo entre as famílias primitivasde térmitas e baratas, inclusive quanto asua flora bacteriana, o presente estudo demonstraque não há uma correlação da açãode B. thuringiensis sobre B. germanica e P.americana, pertencentes às famílias mais evoluídas.Cavados (2003) cita que o controle biológicocom bactérias entomopatogênicas temcomo principal vantagem a especificidade.Dependendo da composição de proteínas Cryno cristal bacteriano, os isolados podem apresentarum espectro de ação limitado às ordensde insetos (Fiuza, 2001). Assim, os dadosobtidos sugerem que as delta-endotoxinasproduzidas pelos cinco isolados de B. thuringiensistestados não apresentam proteínasCry com ação tóxica para a ordem Blattodea,uma vez que causaram uma menor ação sobreos insetos-alvo do trabalho de Hübner(2004).Lambiase et al. (1996) mencionam umadiferenciação na localização dos sítios bacterianosem B. germanica e P. americana, oque poderia justificar o fato de ter-se obtidouma ação inseticida para a primeira espécie euma ausência de efeito para a segunda.Também forma realizados ensaios de toxicidadein vivo para verificar a ação de B.thuringiensis oswaldocruzi (H-<strong>38</strong>) e B. thuringiensisbrasiliensis (H-39) contra Periplanetaamericana e Blatella germanica. Porém,nesses ensaios não houve ação patogênica dascepas avaliadas às duas espécies de baratasutilizadas nos bioensaios (Hübner, 2004).1.3 ReferênciasAmorim, L. B. 2007. Development of Culexquinquefasciatus resistance to Bacillussphaericus strain IAB59 needs long termselection pressure. Biol. Control, 42: 155-160.Alves, S. B. 1998. Controle Microbiano de Insetos.2ed. Piracicaba. FEALQ. p. 1163.Berrocal, L. 2006. West Nile virus; ecology andepidemiology of an emerging pathogenin Colombia. Rev. Salud Publica, 8: 218-228,.Castilhos-Fortes, R. 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PesquisaINTERAÇÕES DE BACILLUS THURINGIENSISE O CONTROLE DE FITOPATÓGENOSNeiva KnaakBióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutoranda emBiologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).Aline Oliboni de AzambujaBióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).Andresa Patrícia Regert LuchoEngenheira Agrônoma (UFRGS) e Mestre emBiologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).Diouneia Lisiane BerlitzBióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).Lidia Mariana FiuzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestre emFitotecnia – Fitossanidade (UFRGS), Doutora emCiências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) ePós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).s tratamentos fitossanitáriosconstituem uma rotina noscultivos agrícolas, os quaisvisam o controle de plantasdaninhas, insetos e fitopatógenos.Como agentes do manejointegrado das culturas, os pesquisadorestêm priorizado a aplicação de inimigosnaturais (parasitóides e predadores),extratos vegetais e microrganismos. Nessecontexto, dados referentes às interaçõesdesses agentes de controle são apresentados,com ênfase nas bactérias entomopatogênicasda espécie B. thuringiensis. Considerandoo controle biológico de fitopatógenos,a doença não é só a interação entrepatógeno e hospedeiro, mas o resultadoda interação entre patógeno, hospedeiro euma série de microrganismos não patogênicosque também repousam no sítio deinfecção. Esses agentes não patogênicos podemlimitar ou aumentar a atividade do patógeno,ou a resistência do hospedeiro. Osucesso do biocontrole depende das propriedadesantagonistas e dos mecanismosde ação do hiperparasita. Desse modo,nesse trabalho são apresentadas várias pesquisasque relatam o efeito antagônico deB. thuringiensis aos fungos fitopatogênicos.1.1 Interações de métodosde controle de insetosO interesse por obter produtos agrícolasem sistemas sustentáveis estimula o estudoe o uso de estratégias do Manejo Integradode Pragas (MIP) e do Manejo Ecológicode Pragas (MEP). Sendo assim, extratosvegetais apropriadamente selecionadose em concentrações adequadas podemser usados em associação com entomopatógenosobtendo-se efeitos aditivos ou sinergéticosno controle (Saito & Luchini,1998).Segundo os autores, o efeito estressordesses extratos sobre a praga pode determinaruma ação mais rápida do entomopatógenoe/ou um maior índice de mortalidade.Assim essa associação pode ser positivaou benéfica quando o inseto-alvo temmecanismos comportamentais de defesacontra entomopatógenos, quando as condiçõesambientais não são favoráveis ou asquantidades de inóculo necessárias são elevadas.Nesse sentido, Lucho (2004) estudou ainteração entre B. thuringiensis aizawai eextrato de folhas de Melia azedarach (cinamomo)para o controle de lagartas deSpodoptera frugiperda, em laboratório. Napesquisa foram avaliados quatro tratamentos:extrato de folhas de M. azedarach; B.thuringiensis aizawai; mistura de B. thuringiensisaizawai e extrato de M. azedarach;controle (água destilada) sendo amortalidade das lagartas observada diariamente,até o sétimo dia após aplicação dostratamentos (DAT). O uso de B. thuringiensis,isoladamente ou em associação como extrato de M. azedarach mostrou-se letalno 1º DAT. Nas lagartas submetidas somenteao extrato, a mortalidade iniciou aos 2 DATe ao final do bioensaio, a mortalidade acumuladafoi maior na associação do biopesticidae do inseticida botânico. Os percentuaisde mortalidade de S. frugiperda observadosaos 7 DAT foram de 55, 70 e 90%para os tratamentos com extrato, B. thuringiensisaizawai e a associação de B. thuringiensisaizawai com extrato de M. aze-48 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
Tabela 1. Aplicações simultâneas de entomopatógenos e extratos vegetias no controle de pragas de grãosarmazenados (adaptada de Sabbour, 2003)Redução da CL 50(%)PlantasFolhas de T. distichumÓleo volátil de T. distichumÓleo volátil de B. carterriInsetosPlodia interpeculataEphesia cautellaEphesia küehniellaPlodia interpeculataEphesia cautellaEphesia küehniellaPlodia interpeculataEphesia cautellaEphesia küehniellaB. thuringiensis716369676374677279B. bassiana4535204343343046<strong>38</strong>darach, respectivamente. Assim, foi observadoum efeito sinérgico dos ingredientesativos de B. thuringiensis aizawai e extratode M. azedarach contra S. frugiperda,pois o resultado da associação foi superiorao uso dos bioinseticidas isoladamente.Apesar disso, a interação de métodosde controle nem sempre apresenta o efeitodesejado sobre o inseto. Isso foi demonstradopor Berlitz (2006) que utilizou B. thuringiensissimultaneamente com o cinamomo,M. azedarach. As concentrações utilizadasnesse trabalho não demonstrarameficiência, pois a mortalidade do lepidópteroS. frugiperda foi de, apenas 6% e paralarvas do coleóptero Oryzophagus oryzaefoi de 11%. Esse fato pode estar associadoa um possível efeito inibitório da bactériasobre o extrato vegetal ou vice-versa.Em relação ao uso simultâneo de bioinseticidas,Sabbour (2003) realizou ensaioscom extrato das folhas e óleo volátil deTaxodium distichum (L. Rich) e Boswellacarterri, em combinação com a bactéria B.thuringiensis e o fungo Beauveria bassiana(Vuillemin, 1912), em pragas de produtosarmazenados. Em seus resultados a combinaçãodos entomopatógenos com as plantas,reduziu significativamente o valor daConcentração Letal Média (CL 50), conformemostra a Tabela 1.De acordo com Novan, (1992) a utilizaçãode extratos vegetais reduz a alimentaçãodo inseto através de seus aleloquímicos,o que otimiza a atividade inseticida domicrorganismo, resultando em um maioríndice de mortalidade.Já os autores Zhang et al. (2000) utilizaramB. thuringiensis kurstaki em diferentesconcentrações e suplementado com tripsinade soja mostrando uma inibição nocrescimento larval de H. armigera (P
as plantas são importantes “meios de comunicação”,pois ao serem atacadas por umherbívoro, liberam substâncias voláteis pelasfolhas, as quais orientam as fêmeas dosparasitóides a encontrarem as lagartas e depositarseus ovos. Sendo assim, os odorestêm papel fundamental na organização dosindivíduos nos agroecossistemas (Vendramin,2002; Vilela &Palini, 2002).As interações tri-tróficas podem serexemplificadas nas culturas da soja e domilho. A cultura é atacada pela largarta-dasoja,A. gemmatalis que é combatida atravésda aplicação de vírus, o Baculovirusanticarsia, e predada por Geocoris sp. Nocaso do milho, as lagartas de S. frugiperdapodem ser parasitadas por Trichogrammasp. e controladas através do entomopatógenoB. thuringiensis.De acordo com Ferry et al. (2004), osinsetos são causadores de perdas mundiaisentre 10 e 20% da produção agrícola. Comisso as pesquisas na área biotecnológicaestudam diferentes formas de induzir a resistênciade uma planta a seu predador.Apesar disso as técnicas convencionais decontrole químico ainda são largamente utilizadas,sendo que o controle biológico encontraalgumas resistências, principalmentedevido aos elevados custos aos produtoresagrícolas.Agrawal (2000) relata que as plantaspodem ser atrativas ou benéficas a algunsinimigos naturais de herbívoros, mas tambémpodem ser tóxicas ou prejudiciais aesses. Assim, as interações tri-tróficas podemidentificar esses mecanismos de modoa poder manipulá-los, o que irá ampliar ocontrole e reduzir o uso de inseticidas.Os autores Ferry et al. (2004) identificaramdiferentes estratégias de defesa dasplantas a seus predadores. Dentre essas,pode-se citar mecanismos de defesa endógenose moleculares, sinalização das plantase a produção de substâncias voláteis.Em resposta, os insetos também desenvolveramestratégias de defesa a esses compostos,principalmente através da produçãode proteinases e de mecanismos especiaisde desintoxicação utilizando, porexemplo, citrocomo P450, monoxigenasese glutatione S-transferases.Entretanto, a complexidade química dasplantas pode manipular seus fenótipos e,conseqüentemente de seus inimigos naturais(Wittstock e Gerhenzon, 2002). Venzonet al. (2001) relatam que, quando inseridouma quantidade de inimigos naturaisou removendo-se determinadas espécies deum agroecossistema, uma grande quantidadede interações indiretas pode ser esperada.Essas interações podem ser positivasou negativas ao controle biológico, devendo-sedar importância aos níveis de interaçõesentre as espécies.As interações tri-tróficas também podemser exemplificadas através do trabalho deDequech et al. (2005) que avaliaram lagartasde S. frugiperda parasitadas por Campoletisflavicincta e infectadas por B. thuringiensisaizawai. Em seus resultados ouso conjunto dos componentes biológicoscitados, aumentou a mortalidade do inseto-pragae diminuiu seu consumo de alimento.Resultados semelhantes foram encontradospor Moraes et al. (2004) que identificarama influência de silício em plantasde trigo, no pulgão-verde (Schizaphis graminum)e seus inimigos naturais. Os dadosdesses autores mostram que a aplicaçãode silício na cultura aumentou a resistênciadas plantas de trigo diminuindo apreferência alimentar do pulgão-verde, nãoafetando seus inimigos naturais.Através desses trabalhos nota-se a importânciade novas pesquisas visando identificarrelações tri-tróficas benéficas e eficientesque podem ser utilizadas junto àspráticas de Manejo Integrado de Pragas.1.3 Compatibilidade deprodutos fitossanitários com BacillusentomopatogênicosO controle biológico ocorre naturalmenteno ambiente através da ação de inimigosnaturais, mantendo em níveis relativamentebaixos as populações de inúmeraspragas (Lacey et al. 2001). As bactériasBacillus thuringiensis e B. sphaericus sãoentomopatógenos que desempenham opapel de agentes de controle microbianode pragas de importância agrícola e vetoresde agentes etiológicos de doenças humanas(De Maagd et al., 2003). Diante disso,a utilização e conservação desses microrganismos,dentro de agroecossistemas,é uma das estratégias utilizadas no Manejointegrado de Pragas, já que são encontradasnaturalmente nesses ambientes. Assim,torna-se importante conhecer a ação dosprodutos fitossanitários, determinando a suaseletividade e compatibilidade sobre os entomopatógenos,com o objetivo de minimizaros impactos tanto no ambiente quantona microbiota residente (Batista-Filho et al.,2001).A excessiva aplicação de defensivosagrícolas vem ocasionando uma série dedesequilíbrios ambientais, especialmentenas populações de entomopatogênos, verificadasatráves da inibição do crescimento,esporulação, mutações genéticas, reduçãoda toxicidade a determinada praga,influenciando diretamente no estabelecimentoe sobrevivência (Alves et al., 1998).No entanto, a ação dos agroquímicos sobreos microrganismos pode variar em funçãoda espécie e linhagem do microrganismo,como também da formulação químicae dosagens dos produtos (Batista-Filho etal., 2001). Contudo, alguns produtos apresentamseletividade aos entomopatógenos,podendo potencializar o seu efeito e contribuirpara o controle do inseto-alvo (Benz,1971; Chen et al., 1974). Assim, a associaçãode inseticidas químicos e biológicoscontribuem para minimizar os efeitos negativossobre os agroecossistemas (Chenet al., 1974; Batista-Filho et al., 2001).Grande parte das reações dos pesticidas,atualmente utilizadas no controle de pragas,é desconhecida devido à carência de informaçõesa respeito da compatibilidade dessesprodutos sobre entomopatógenos (Morris,1977). Para B. thuringiensis, majoritariamenteos trabalhos realizados sobre interação sãoproveniente da década de 70, como reflexoda demasiada aplicação de inseticidas sintéticosorgânicos como hidrocarbonetos clorinados,oganofosforados, metilcarbamatos e piretróides(Casida e Quistad, 1998). Para B.sphaericus, quase a totalidade dos trabalhosse referem à toxicidade às larvas de dípteros,ressaltando a importância de estudos que visamà proteção desse inimigo natural, atravésda compatibilidade com os pesticidas químicos.Ainda na década de 70, Doughert et al.(1971) obtiveram respostas variadas na sensibilidadede B. thuringiensis thuringiensis emfunção dos diversos solventes utilizados paraos mesmos pesticidas. A presença de emulsificantese outros aditivos concentrados, utilizadosnas preparações, podem gerar problemasde compatibilidade com entomopatógenosdevendo ser considerado na elaboraçãode novas formulações comerciais (Morris,1977). O mesmo autor testou a compatibilidadede 27 pesticidas sobre a germinação ereplicação de B. thuringiensis kurstaki, concluindoque o grupo dos carbamatos foramos mais compatíveis, as piretrinas altamentebacteriostáticas e os produtos acefato, triclorfon,metomil, carbaril, mexacarbato e PH 60-40 (derivado da uréia) podem ser utilizadosem conjunto com a bactéria.Os trabalhos mais atuais nessa linha depesquisa avaliaram o efeito de diferentes concentraçõesde defensivos agrícolas sobre microrganismosentomopatogênicos. Especialmentepara B. thuringiensis, os dados mostramque tiametoxam, carbosulfan, diafentiuron,imidacloprid, acefato, utilizados nas concentraçõesmáximas, não apresentaram diferençasignificativa nas unidades formadorasda colônia - UFC (Batista-Filho et al., 2001;Batista-Filho et al., 2003; Almeida et al., 2003).Por outro lado, essas pesquisas revelam queendosulfan, monocrotofós, deltametrina e ciproconazole+ tiametoxam inibiram a formaçãodas colônias. Já, na concentração mínima,o diafentiuron foi sinérgico e o tiametoxame ciproconazole + tiametoxam não afetaramB. thuringiensis. Utilizando ambas asconcentrações, o endosulfan, deltametrina eprofenofós + lufenuron inibiram as colôniasda bactéria e tiametoxam + cipermetrina foramcompatíveis.Há poucas pesquisas que avaliam a compatibilidadede bactérias entomopatogênicascom os pesticidas mais utilizados em diversasculturas, como por exemplo, o arroz irrigado.No caso, Azambuja (2006) testou seisprodutos fitossanitários, comumente utilizadosna orizicultura irrigada, sobre as bactériasB. thuringiensis e B. sphaericus, em condiçõeslaboratoriais e observou que os herbicidasglifosato e propanil foram significativa-50 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
mente antagônicos ao desenvolvimento de B.thuringiensis, e os mesmos produtos, incluindoo fungicida azoxistrobina, reduziram ocrescimento de B. sphaericus, afetando essemicrorganismo com mais intensidade. Entretanto,relatou uma provável compatibilidadedos herbicidas quincloraque e pirazosulfuronetile o inseticida fipronil para ambos entomopatógenosnaturais do solo, propondo asua utilização em Programas de MIP.Complementando os dados anteriores,Batista-Filho et al. (2001) verificaram que oinseticida fipronil apresentou um efeito sinérgicoaumentando a UFC de B. thuringiensis(Dipel ® ) quando utilizado na concentração mínima,mas não teve influência quando utilizadona concentração máxima. Entretanto,Rohr (2005) mostrou que azoxistrobina, quincloraquee fipronil não apresentaram interaçõessignificativas sobre os bioinseticida deB. thuringiensis kurstaki (Dipel ® ) e B. thuringiensisaizawai (Xentari ® ).Os dados dos ensaios realizados in vitroexpõem ao máximo os microrganismos a açãodos produtos fitossanitários, podendo diferirdas condições de campo, onde outros fatoresinterferem, diminuindo a intensidade dasreações. Nesse sentido, Alves et al. (1998) salientamque a seletividade de um produtotestado in vitro pode ser confirmado em campo,mas o antagonismo apresentado em laboratórionem sempre pode ser verificado nocampo.Os dados referentes às interações entreentomopatógenos e pesticidas em condiçõesde campo são ainda mais reduzidos (Alves etal., 1998). Nesse enfoque, Azambuja (2006),em laboratório, concluiu que os agroquímicos:fipronil, azoxistrobina, quincloraque, glifosato,propanil e pirazosulfuron-etil não interferiramna abundância de B. thuringiensisnem de B. sphaericus. Ressaltando esse padrão,Batista-Filho et al. (2001) estudaram acompatibilidade do tiametoxam e B. thuringiensis(Dipel ® ), aplicados em lavouras defeijão, revelando que o inseticida não interferiuno potencial de inóculo do entomopatógeno,assim como in vitro, recomendandoa utilização do produto em conjunto com abactéria. Conforme foi verificado, no ambientenatural, os diversos fatores bióticos eabióticos atuam minimizando os possíveisimpactos sobre os Bacillus spp. da ação diretados produtos fitossanitários (Alves et al.,1998).Em outro trabalho, Das et al. (2003) verificarama influência de dois inseticidas emdiversos microrganismos presentes nos solosde cultivo de arroz. Esses autores mencionamque forato e carborufam estimularam ocrescimento das populações de bactérias e asproporções de Bacillus sp. No entanto, o efeitosinérgico de carbofuram foi mais pronunciado.Esse fato está relacionado à capacidadede alguns microrganismos desse gêneroutilizarem o inseticida e degradarem seus produtospara o seu próprio desenvolvimentono solo.Como já mencionado, na literatura a respeitode interações de microrganismos entomopatogênicose agroquímicos, em condiçõesde campo, é muito restrita e quase atotalidade dos trabalhos realizados dessanatureza se referem aos fungos entomopatogênicosavaliados in vitro. A falta de padronizaçãona realização dos testes é umdos problemas desse tipo de estudo que,em muitos casos, não permite uma comparaçãoefetiva entre os produtos (Alves etal., 1998).Diante disso, os microrganismos entomopatogênicosque habitam naturalmenteos agroecossistemas devem ser preservadosatravés de técnicas culturais e principalmentena utilização de pesticidas compatíveisnão comprometendo o MIP (Almeidaet al., 2003).1.4 Controle microbianode Fitopatógenos1.4.1 Fungos Fitopatogênicos:Os fungos constituem um grupo deorganismos que se caracteriza por nuncaapresentarem tecido verdadeiro, por seremeucarióticos e aclorofilados. A maioria dasespécies fúngicas é saprofítica, mas algumasdesenvolveram a capacidade de parasitarplantas, causando a morte ou um retardamentodo desenvolvimento do hospedeiro.Devido aos sistemas intensivos deprodução agrícola, o índice e a prevalênciade doenças têm aumentado significativamente,podendo, em alguns casos, causarperda total da produção. Esse aumentode doenças em áreas agrícolas se deve principalmenteao desequilíbrio entre as diferentespopulações microbianas do solo, dorizoplano, do fitoplano e endofíticas queinteragem com plantas, permitindo o estabelecimentoe o desenvolvimento dos fungospatogênicos (Esposito & Azevedo,2004).Os autores relatam que para o fungopatogênico colonizar a planta hospedeira,inicialmente ele precisa quebrar o seu sistemade defesa. Para isso, produz enzimashidrolíticas (cutinases, celulases, ligninasese outras) que quebram a cutícula e a parededa celular hospedeira; toxinas que reduzemou inibem completamente a atividadedas células da planta a ser parasitadae/ou produzem substâncias específicas deplantas (hormônios) que quebram o equilíbriofisiológico da célula vegetal, causandodistúrbios no crescimento e na diferenciaçãodas células da planta (Esposito e Azevedo,2004).Em geral, os fungos patogênicos apresentamtrês estágios de colonização da plantahospedeira. Esses estágios são caracterizadospela germinação do esporo na superfíciedos tecidos da planta hospedeira,pelo reconhecimento da superfície, pelaformação de apressório e pela penetraçãonos tecidos vegetais. Estando no interiorda planta, o fungo pode colonizar os espaçosintercelulares e/ou intracelulares deforma parasítica e, posteriormente, produzirestruturas reprodutivas que permitam asua disseminação (Esposito e Azevedo, 2004).1.4.2 Efeitos de B. thuringiensisem fitopatógenos:Alguns microrganismos, como bactérias,fungos e actinomicetos, produzem metabólitoscapazes de inibir o crescimento de outrosmicrorganismos. Estas substâncias sãodiferentes na sua estrutura e distribuição, serestringindo aos poucos compostos e estandopresentes em apenas alguns microrganismos(Kennedy, 1999). Os produtos do metabolismosecundário microbiano são alvos depesquisas cada vez mais intensas na buscade substâncias bioativas, para atuação em diversasáreas como a agricultura, veterináriae farmácia (Woodruff, 1980).Grande parte dos microrganismos envolvidosno controle biológico atua através deantibiose, onde ocorre a interação entre organismos,um metabólito produzido por umdeles tem um efeito prejudicial sobre o outro.A produção de metabólitos pode resultarna completa lise e dissolução da estruturacelular e independe do contato físico entreos microrganismos (Bettiol & Ghini, 1995),dessa forma, a busca por microrganismosantagônicos a fungos fitopatogênicos temaumentado (Benitez et al., 2004). Diversasespécies de Bacillus são citadas como produtorasde antibióticos, podendo secretar metabólitoscomercialmente importantes, comoenzimas aminolíticas e enzimas proteolíticas(Bettiol & Ghini, 1995).Bettiol (1988), em trabalho de seleçãode microrganismo antagônico a Pyriculariaoryzae, verificou que B. subtilis foi o maiseficiente em inibir o crescimento micelial dopatógeno, e constatando também que o antagonistaapresenta boas características parauso como agente de controle biológico, pois,além de rápido desenvolvimento, tanto emmeio de cultura como na natureza, produzemendósporo e antibióticos, crescem emlarga faixa de temperatura e adaptam-se avárias condições ambientais.O processo para que ocorra o antagonismoexige a degradação da parede celularfúngica por hidrolases secretada por microrganismos.Como quitina e beta-1,3-glucanasão os principais componentes estruturais daparede celular fúngica, quitinases e glucanasespodem ser importantes no controle biológicodesses microrganismos (Kulminskayaet al., 2001). Knaak et al. (2007) testaram ascepas e proteínas Cry1Ab e Cry1Ac sintetizadaspor Bacillus thuringiensis thuringiensis407 (pH 408) e B. thuringiensis kurstaki HD-73, respectivamente, sobre os fungos fitopatogênicosPyricularia grisea, Rhizoctonia solani,Fusarium oxysporum e F. solani. Verificaramque as cepas B. thuringiensis, quesintetizam as proteínas Cry1Ab e Cry1Ac, reduziramo crescimento micelial dos fungosR. solani, P. grisea, F. oxysporum e F. solanidurante o período avaliado, quando comparadoaos controles. As duas cepas inibiram ocrescimento dos fitopatógenos testados atésete dias após a incubação, onde houve diferençasignificativa (P
mentos bacterianos e os grupos controle.Na avaliação da ação das proteínas Cry1Abe Cry1Ac, sobre R. solani, P. grisea, F. oxysporume F. solani, não foi observada a formaçãodo halo de inibição de crescimento.Nos resultados obtidos para germinaçãodos conídios também não houve diferençasignificativa (P
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PesquisaTOXICIDADE DE BACILLUS THURINGIENSISEM ORGANISMOS NÃO-ALVOAndresa Patrícia Regert LuchoEngenheira Agrônoma (UFRGS) e Mestre emBiologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).Diouneia Lisiane BerlitzBióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).entomopatógeno B. thuringiensistem elevada especificidade,porém para uma utilizaçãosegura são necessáriosensaios toxicológicos com diferentesorganismos não-alvo,sendo nesse trabalho apresentados dadosreferentes à toxicidade aos inimigos naturais,especialmente aos parasitóides e predadoresde insetos, assim como às aves eaos mamíferos.1.1 Efeitos de B. thuringiensis sobrepredadores e parasitóidesEmerson Luiz Nunes CostaEngenheiro Agrônomo (UFRGS) e Mestre e Doutor emFitotecnia – Fitossanidade (UFRGS)Lidia Mariana FiuzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia –Fitossanidade (UFRGS), Doutora em CiênciasAgronômicas (ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora embiotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).Os inimigos naturais dos insetos sãode suma importância, pois, além de desenvolveremseu papel ecológico de predaçãoou parasitismo, podem ser associadosaos métodos alternativos de controlede pragas-alvo, através de criação massalem laboratórios (Gallo et al., 2002). O usode inseticidas pode causar danos diretos eindiretos ao controle biológico natural, aocausar a mortalidade de insetos benéficosou reduzir sua fonte alimentar pela mortalidadede insetos-praga (Shepard et al.,1987; Wick & Freier, 2000; Berti Filho &Ciociola, 2002). Por isso, o uso de bioinseticidasque controlam as pragas com baixoimpacto sobre organismos benéficos deveser incentivado (Fragoso et al., 2001; Degrandeet al., 2002).Nesse sentido, Dequech et al. (2005)estudaram a interação entre o parasitóideCampoletis flavicincta e B. thuringiensisaizawai em lagartas de Spodoptera frugiperdaem condições de laboratório. Osautores avaliaram o consumo alimentar ea mortalidade de lagartas parasitadas, infectadaspela bactéria, e parasitadas e infectadas,além da biologia dos parasitóidesemergidos a partir de lagartas infectadase não infectadas pela bactéria. O menorconsumo foliar e a maior taxa de mortalidadeforam observados em lagartas afetadaspelos dois agentes de controle biológico.No caso do parasitóide, não foramverificadas alterações nas características biológicasdos seus descendentes emergidosde lagartas infectadas com B. thuringiensis.Segundo Stevenson & Walters (1983),embora a toxicidade de inseticidas possaser avaliada em condições de laboratório,só é possível medir o efeito real do pesticidaem condições de campo, onde ocorremas situações naturais de abrigo, proteção,alternativas de escape, alimentação e sobrevivênciadas espécies. Esses autores tambémdestacam que as condições meteorológicas,o comportamento e o ciclo de vidade cada espécie e a dose aplicada são fatoresque influenciam a toxicidade dos inseticidas.Lucho (2004) avaliou a emergência deparasitóides em lagartas de S. frugiperdarecapturadas em arroz irrigado com e semtratamento de B. thuringiensis aizawai emcondições de telado e a campo. A emergênciade parasitóides das famílias Braconidae,Ichneumonidae e Tachinidae ocorreuem lagartas recapturadas em plantas nãotratadas, mantidas em condições de telado.Das lagartas coletadas em áreas tratadas como bioinseticida, tanto em telado quanto acampo, não foi observada emergência deparasitóides.Já Costa (2007), durante dois anos agrícolas,avaliou o efeito de inseticidas sobreos inimigos naturais de insetos-praga, pormeio da quantificação de grupos taxonômicosde inimigos naturais presentes antese após a aplicação de produtos químicos ebiológicos em lavoura de arroz irrigado.Nesse estudo foram avaliados seis tratamentos(quatro inseticidas químicos sintéticos,um inseticida à base de B. thuringiensis aizawaie testemunha sem inseticidas) e cincoépocas de amostragem realizadas comrede de varredura do florescimento ao enchimentode grãos (prévia e aos 2, 7, 14 e21 dias após a aplicação dos tratamentos -DAT). Entre os inimigos naturais coletadosforam considerados oito subgrupos: aranhas,micro-himenópteros, coleópteros,odonatos, dermápteros, neurópteros, dípterose hemípteros. No primeiro ano doestudo não foram observados efeitos significativosdos inseticidas sobre os inimigosnaturais. No segundo ano, o inseticida lambdacialotrinareduziu o total de inimigos naturaiscoletados aos 2DAT. O número de54 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
Figura 1. Mortalidade de camundongos CF1 submetidos aos tratamentosintraperitoneais com Bacillus thuringiensis, ( Susp. = suspensão contendo célulase esporos; Sob. = sobrenadante da cultura; Prot. = proteína purificada; Test. =testemunha tratada somente com água; Número total de indivíduos = 15 portratamento)coleópteros predadores, representados emsua maioria por Coccinellidade (“joaninhas”),foi reduzido significativamente aos2DAT por lambdacialotrina, carbaril, malationae imidacloprido. Nos dois anos doestudo não foi observado efeito significativode B. thuringiensis sobre o número deinimigos naturais coletados após a aplicaçãodo bioinseticida.Em outra pesquisa, Nascimento et al.(1998) avaliaram o efeito de B. thuringiensiskurstaki sobre o predador de lagartas delepidópteros, Podisus nigrispinus, em laboratório.Em seus resultados, não foi observadaa presença de esporos ou células vegetativasdo entomopatógeno na hemolinfado predador, apenas no intestino médioe nas fezes. Os autores relatam que, em laboratório,são utilizadas altas dosagens debiopesticida e oferecido apenas uma alternativaalimentar e que, em campo, o predadortem alternativas de alimentação, nãodependendo somente de uma presa infectada.Além dos produtos formulados a basede B. thuringiensis, atualmente as pesquisasna área biotecnológica visam a transformaçãogenética de plantas com os genescry de B. thuringiensis para conferir a resistênciadessas plantas aos insetos-praga.Plantas de milho, algodão e batata transgênicostêm sido comercializados (Shelton etal. 2002), porém, os dados de O’Callaghanet al. (2005) revelam que não foram detectadosefeitos dessas plantas em insetos benéficos,como polinizadores e inimigos naturais.Nesse contexto, Romeis et al. (2008)relatam que dados como a descrição dacultivar, as características moleculares doselementos genéticos inseridos na planta, anatureza e a estabilidade da expressão protéica,o espectro de ação das proteínas, acomposição de macro e micronutrientes eas características morfológicas e agronômicasda planta, são exigidos pelas autoridadespara a regulamentação dessas plantas.Os autores mostram que o milho modificadocom o gene expressando a proteína Cry1Ab de B. thurigniensis, ativa a insetos daordem Lepidoptera, não afeta insetos deoutras ordens. Ou seja, as proteínas de B.thuringiensis são altamente específicas, nãoatingindo artrópodes não alvos.Na revisão de Fontes et al.(2002) sãodiscutidos princípios e questões ecológicas,impacto ambiental e efeitos de plantas geneticamentemodificadas no ambiente. Emrelação aos inimigos naturais, os autoresrelatam a existência de fatores importantesem relação às plantas, como o ciclo de vida(anual ou perene) que difere na composiçãodas comunidades de artrópodes associadosa essas plantas. Dos 41 trabalhos avaliadospelos autores, 20 foram conduzidosem laboratório e desses, 14 não mostraramefeito sobre inimigos naturais, quando utilizadasplantas modificadas e não modificadas.No restante (6 trabalhos) não foramobservados efeitos em alguns inimigos naturais.E em 14 de 21 trabalhos avaliadosem campo, os autores não mostraram diferençana densidade de inimigos naturaisentre áreas com plantas-Bt e plantas nãotransgênicas. Porém, nos 7 casos restantesocorreu um decréscimo nessa densidade.No trabalho de Chen et al. (2008) foramavaliados os efeitos diretos e indiretosda proteína Cry1Ac de B. thuringiensisque está presente em plantas transgênicasde milho e algodão, sobre o parasitóideda lagarta Plutella xilostella, Diadegmainsulare. Os autores utilizaram a plantatransgênica e a proteína proveniente deuma formulação líquida comercial (MC),em três tratamentos: a proteína purificada,o produto comercial e a planta transgênica.Também avaliaram o efeito de inseticidasa base de spinosad, indoxacarb, lambda-cialotrinae cipermetrina. Em seus resultados,observaram que, mais de 90% daslagartas foram parasitadas após a ingestãodos tratamentos, indicando que esses nãoinfluenciam o parasitismo. Porém, o númerode D. insulare emergidos das lagartas,diferiu entre o controle e o grupo tratadocom a formulação comercial, mas nãodiferiu entre o controle e as lagartas tratadascom a planta expressando a proteínaCry 1Ac ou somente com a proteína purificada.Os autores citados também demonstraramque o parasitóide D. isulare foi altamentesuscetível aos inseticidas comumenteutilizados para o controle das lagartasde P. xylostella, ocorrendo a mortedos mesmos após duas horas de contato.Sendo assim, os inseticidas usados afetamas populações do parasitóide e, conseqüentementeaumentam as populações doinseto praga-alvo, no caso, P. xylostella.Estudo semelhante foi realizado porTorres & Ruberson (2008) com a mesmaproteína expressa em plantas de algodão.Os resultados desse estudo mostraram quea proteína foi detectada em três níveis tróficosavaliados, porém, os insetos predadorese parasitas das lagartas de S. exiguanão foram afetados quando as lagartas formaalimentadas com algodão transgênico.Um caso bem polêmico entre a comunidadecientífica, foi o trabalho de Losleyet al. (1999) que mostrou que o milho geneticamentemodificado com a proteínaCry1Ab de B. thuringiensis, afetou severamentea população da borboleta monarca,Danaus plexippus. Em seu trabalho foicomparado a alimentação, o crescimentoe a mortalidade de lagartas que se alimentavamde plantas com pólen Bt, com pólende milho não modificado e plantas sempólen. O resultado apresentou sobrevivênciade 56% com milho-Bt e 100% de sobrevivênciacom pólen normal e sem pólen.Entretanto novas pesquisas foram realizadasposteriormente como Stanley-Horn,et al. (2001) que avaliou 6 híbridos de B.thuringiensis em quatro cidades diferentes(EUA) divididos em duas etapas (naborda e na parte interna das lavouras) frenteà D. plexippus. As conclusões dos auto-<strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong> 55
es fornecem evidências de que a quantidadede pólen e a expressão de Cry1Ab nopólen predizem um impacto na alimentaçãodas lagartas da monarca, porém issoocorre em lagartas do 1º instar, sendo quenão ocorrem diferenças significativas da sobrevivênciada monarca nas regiões commilho-Bt e milho não transgênico. Alémdisso, os autores identificaram a mortalidadede lagartas poucas horas após a alimentaçãoem áreas com milho não transgênicopulverizados com λ-cialotrina. A sobrevivênciae o crescimento foram afetados tambémem áreas próximas ao local. Entretanto pesquisasdevem continuar sendo realizadaspara entender o impacto do milho não transgênicosendo que é relativamente de baixatoxicidade a borboletas monarca.Apesar desses dados o conhecimento arespeito da influência de novas tecnologiasseja para a produção de biopesticidas oupara a transgenia, ainda são carentes deinformação. Entretanto, os estudos realizadosaté então indicam que efeitos nocivosem organismos não-alvo verificados em laboratóriosão raramente detectados no ambiente,provavelmente porque a quantidadede produto utilizada em laboratório ésuperior àquela utilizada e recomendada emcampo.1.2 Efeitos deB. thuringiensis sobre avesUm grupo de predadores de lagartas,os pássaros, também deve ser avaliado emrelação ao uso de biopesticidas ou plantasgeneticamente modificadas. Porém existempoucos dados na literatura a respeito desseassunto. Os autores Sopuck et al. (2002)relatam a utilização do produto comercialForay 48B a base de B. thuringiensis. kurstaki,para o controle de Lymantria dispar eavaliaram a resposta de pássaros associadosao sul da Ilha de Vancouver, no Canadá.Em seus resultados não observaram diferençana abundância relativa de pássarosnas áreas tratadas e não tratadas com o biopesticida,entre os anos de 1999 e 2000,indicando que o tratamento não influenciana presença dos mesmos.Já Norton et al. (2001) avaliaram o efeitosecundário da mesma subespécie de B.thuringiensis citada acima porém provenientedo produto Thuricide, em aves da espécieDendragapus canadensis. Os autorescitam essa ave como um herbívoro primário,porém os pintos, em suas primeirasduas semanas de vida, são essencialmenteinsetívoros. Lattner (1982) descreve a alimentaçãodessa ave como sendo cerca de64% de lagartas, seguido de gafanhotos(10%), formigas (7%) e outras variedadesde invertebrados e partes de plantas. O trabalhode Norton et al. (2001) teve comoobjetivo avaliar os itens da dieta e o crescimentode D. canadensis em áreas tratadase não tratadas com B. thuringiensis kurstaki.Os resultados indicam que o crescimentodos pintos foi afetado em relação àsduas áreas, ocorrendo uma redução de 30%no tamanho desses na área tratada com abactéria. Porém esses dados podem estarrelacionado ao fato de que, com a mortedas lagartas devido à ingestão do patógeno,os pintos passaram a se alimentar principalmentede formigas e estas tem um baixoíndice de proteínas em comparação comàs lagartas. Isso pode ser determinante parao decréscimo no tamanho dos pintos, umavez que a dieta alimentar teve seu teor deproteínas também reduzido.1.3 Efeitos de B. thuringiensissobre mamíferosPequenos mamíferos, como ratos e camundongos,também estão associados àsáreas agrícolas uma vez que esses animaispodem se alimentar dos grãos das culturas.Então também existem pesquisas que avaliamo possível efeito do entomopatógenonesses mamíferos, sendo que a bactéria tambémpode produzir toxinas ativas a essesanimais.Na área da saúde, os trabalhos de Prasad& Shethna (1975) sugerem que as proteínasde B. thuringiensis têm atividadeantitumoral em sarcoma Yoshida em ratos,além de acentuarem a resposta imune deovelhas. Yamashita et al. (2000), tambémdemonstram efeito citocida em células deleucemia, em ensaios in vitro.Em relação a humanos, a revisão de Siegel(2001) apresenta dados em que o produtoThuricide (B. thuringiensis thuringiensis)foi ingerido (100mg) e inalado(100mg) por 18 pessoas, durante 5 dias, eesses não apresentaram nenhuma reaçãodecorrente do microrganismo. Além dessareportagem, o trabalho apresenta algunsdados sobre isolados de B. thuringiensis queforam re-isolados de queimaduras ou feridasde pessoas, entretanto foi averiguadoque a água utilizada para a limpeza dessesferimentos estava contaminada. Além disso,o autor relata que o isolado pode sedesenvolver nesses locais feridos quando osistema imune não está respondendo deforma adequada ao ferimento, mas não causanenhuma reação.Betz et al. (2000) relatam que B. thuringiensiskurstaki foi administrado em humanosvoluntários durante 3 dias, na quantidadede 1000mg/pessoa ou 1x10 10 esporos/mL,e não apresentaram sintomas detoxicidade, nem culturas de células bacterianasnas amostras de sangue avaliadas. Osautores relatam a presença das proteínas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry 2Aa no isoladotestado.Diferentes autores relatam os resultadosde suas pesquisas com ratos tratados comB. thuringiensis. No caso de Bishop et al.(1999), a aplicação oral de 5.10 10 esporos/dia de B. thuringiensis thuringiensis e B.thuringiensis israelensis, em ratos não mostroudiferença significativa no peso corporaldos animais tratados e não tratados. Nosdados de Siegel (2001), ratos foram tratadosvia oral com 10 9 esporos/dia, por 730dias, também não apresentaram nenhumareação.Também em ensaios toxicológicos, Berlitzet al. (2006) avaliaram o efeito da suspensãode células e esporos de B. thuringiensisaizawai proveniente do produto comercialXentari e B. thuringiensis thuringiensis(H1), em ratos Wistar. Os autores avaliaramo conteúdo estomacal e as fezes emSDS-PAGE, onde os resultados sugerem queas proteínas são degradadas no estômagodos animais. Os estômagos foram avaliadosem estereomicroscópio (40x) não apresentandomodificações superficiais, como pipocasvermelhas ou raias hemorrágicas, emrelação ao grupo controle. Os autores concluíramque as proteínas de B. thuringiensisnão afetam os ratos quando administradasoralmente.Em outra pesquisa, Berlitz (2006) avalioua suspensão e as proteínas purificadasde dois novos isolados bacterianos, em camundongosCF1, via oral e intraperitoneal,divididos em grupos de 5 animais e três repetições.Os dados dos tratamentos, via oral,não causaram mortalidade dos camundongos,porém nas administrações intraperitoneaisos camundongos morreram a partirde 6horas após a aplicação dos tratamentos,quando aplicada a suspensão bacterianacontendo células e esporos (Figura 1).Apesar desses resultados, deve-se salientarque injeções intraperitoneais não sãouma via de acesso natural do entomopatógenonos mamíferos. Essa mortalidade tambémnão deve estar associada à thuringiensina,uma proteína tóxica a vertebrados queé produzida pelo entomopatógeno, poisessa toxina está presente no sobrenadanteda cultura, e esse tratamento não causou amortalidade dos animais.O tratamento via oral, não causou reaçõesnos camundongos. Nesse sentido, Betzet al. (2000) revelam que as proteínas Cry1,Cry2 e Cry3 são degradadas em 30 segundosapós a ingestão, em ensaios in vitro,resultando em proteínas de 2 kDa. Também,os dados de Vasquez-Padrón et al. (2000) eMoreno-Fierros et al. (2000) revelaram quecamundongos Balb/c apresentaram elevadaprodução de anticorpos IgA, seguidosde IgG e IgM, após a administração oral,retal e intraperitoneal da proteína Cry1Ac,mostrando uma eficiente resposta imunedesses animais.Como já comentado anteriormente, aspreocupações têm sido em torno dos efeitosdas plantas geneticamente modificadascom genes de B. thuringiensis em seus consumidores.Porém, Azevedo & Araújo (2003)mostram a ausência de efeitos tóxicos, mutagênicos,teratogênicos ou clastogênicosdessas plantas. Betz et al. (2000) tambémrelatam que as proteínas Cry de B. thuringiensisnão são tóxicas em contato direto,sendo que a exposição de animais não-alvoé extremamente baixa e a presença dessasproteínas nos tecidos vegetais também ocorreem baixas concentrações. Romeis et al.56 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
(2008) também comentam que os testes laboratoriaisutilizando essas plantas, são conduzidoscom elevadas concentrações daproteína purificada, muito acima daquelasconcentrações encontradas nos tecidos dasplantas.Apesar desses dados, periodicamenteestão sendo lançados produtos comerciaisà base de B. thuringiensis e que, para chegaremao mercado devem passar por diferentesanálises para confirmar a não toxicidadeem organismos não-alvo. O mesmoocorre com as plantas geneticamente modificadasque são testadas em diferentesorganismos para garantir a sua segurança.Nesse sentido, a Lei de Biossegurança nº11.105, estabelece as normas de segurançae os mecanismos de fiscalização de atividadesque envolvam organismos geneticamentemodificados e seus derivados.1.4 ReferênciasAzevedo J L, Araújo W L 2003. Geneticallymodified crops: environmental andhuman health concerns. Mutation Research.544: 223-233.Berti Filho, E.; Ciociola, A.I. Parasitóides oupredadores? Vantagens e desvantagens.In: Parra, J.R.P. 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PesquisaPRODUTOS DE BACILLUS THURINGIENSIS:REGISTRO E COMERCIALIZAÇÃOLidia Mariana FiúzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestreem Fitotecnia – Fitossanidade (UFRGS),Doutora em Ciências Agronômicas(ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora embiotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).Diounéia Liziane BerlitzBióloga (UNISINOS) e Mestre emBiologia: Diversidade e Manejo de VidaSilvestre (UNISINOS).onsiderando os biopesticidas,aqui serão apresentadosaspectos básicos relacionadosàs avaliações toxicológicasdos produtosformulados à base de B. thuringiensis,assim como os procedimentos relacionadosao registro desses produtoscomerciais, os quais seguem a leibase dos agrotóxicos.Atualmente aproximadamente 98%dos biopesticidas, utilizados na agriculturae na saúde, correspondem àsformulações de B. thuringiensis (Schnepfet al., 1998; Polanczyk, 2003).No início desse milênio as vendasdesses produtos foram de aproximadamenteUS$ 2 milhões. Em algunspaíses, como no Brasil, o acesso a essesprodutos ainda é limitado, pois oscustos das formulações são elevadose as multinacionais que os comercializamnão mantém uma distribuiçãoregular nas diferentes regiões do país.Além desses problemas soma-se abaixa persistência de alguns produtose a falta de informações dos produtoressobre o potencial e as vantagensdos biopesticidas.No Brasil, a prospecção de entomopatógenosbacterianos é realizadaem laboratórios de pesquisa ligados àagricultura e saúde pública, como:Embrapa, Fiocruz, Universidades Públicase Privadas. Essas mesmas instituiçõestêm desenvolvido os produtosou efetuado convênio com EmpresasParticulares. Os registros dosprodutos à base de B. thuringiensisseguem basicamente as mesmas regrasdos químicos sintéticos, cujosórgãos federais responsáveis pela avaliaçãoe registro são Ministério da Agricultura,Pecuária e Abastecimento(MAPA), Agência Nacional de VigilânciaSanitária (ANVISA) e Instituto Brasileirodo Meio Ambiente e dos RecursosNaturais Renováveis (IBAMA),os quais prometem no atual contextopriorizar os biopesticidas em relaçãoaos agrotóxicos convencionais, facilitandoassim o registro dos produtoscomprovadamente menos agressivosaos organismos não-alvo e ao ambiente.1.1 Legislação e Registrode produtosA utilização de biopesticidas, assimcomo dos demais agrotóxicos baseia-sena relação “riscos x benefícios”que requer ensaios, os quais revelama segurança ao homem e ao meioambiente. Sendo assim, a legislaçãodeve assegurar a sociedade que o biopesticidaautorizado para comercializaçãoe aplicação no controle biológicofoi adequadamente avaliadoquanto aos parâmetros agronômicos,saúde pública e meio ambiente (Meadows,1993; Alves, 1998; Gallo et al.,2002).O registro de produtos à base deB. thuringiensis segue a “Lei dos Agrotóxicos”,cuja legislação básica é a Lein. 7.802 de 11 de julho de 1989, ondeos produtos são avaliados pelo Ministérioda Agricultura e Ministério daSaúde quanto aos seguintes aspectos:58 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
Tabela 1. Produtos comerciais de Bacillus thuringiensis para controle de pragas agrícolasProdutosDipelThuricideAgreeBacturEcotech ProBactospeineJavelinForayBiobitFoil/CondorDelfinCutlassLarvo BtNubilacidMVPBac-controlXenTariM-OneDi-TerraTridentNovodorM-One PlusFoilEmpresasAbbottSandozMitsuiMilenia AgrociênciasBayerSolvaySandozNovo-NordiskNovo-NodiskEcogenSandozEcogenFermoneRadonjaMycogenAgricontrolAbbottMycogenAbbottSandozNovo NordiskMycogenEcogenB. thuringiensis (Bt)Bt kurstakiBt kurstakiBt aizawaiBt kurstakiBt kurstakiBt kurstakiBt kurstakiBt kurstakiBt kurstakiBt kurstakiBt kurstakiBt kurstakiBt kurstakiBt kurstakiBt kurstakiBt kurstakiBt aizawaiBt san diego Bt tenebrionisBt san diego Bt tenebrionisBt san diego Bt tenebrionisBt san diego Bt tenebrionisBt san diego Bt tenebrionis (empacotadas)Bt (recombinante)Insetos-alvolepidópteroslepidópteroslepidopteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroscoleópteroscoleópteroscoleópteroscoleópteroscoleópteroscoleópterospesquisas; experimentação; produção;embalagem e rotulagem; transporte; armazenamento;comercialização; propagandacomercial; utilização; importação;exportação; destino final de resíduos eembalagens; registro; classificação; controle;inspeção e fiscalização de produtos.A “Lei dos Agrotóxicos” foi regulamentadapelos Decretos n. 98.816, de11 de janeiro de 1990 e Dec. 4.074 de04 de janeiro de 2002, sendo que atualmentepara registro de um biopesticidano Brasil estão envolvidos os seguintesministérios:• MAPA: avaliação dos aspectosagronômicos.• ANVISA: avaliação da toxicologiaao homem, incluindo as análisesde resíduos em alimentos.• IBAMA: avaliação das interaçõesdos agrotóxicos com o meio ambientee seus componentes bióticos.Ao Ministério da Agricultura competembasicamente as determinaçõessobre as pragas a serem controladas,assim como as dosagens e o númerode aplicações dos produtos, cujos dadospodem ser consultados no Compêndiode Defensivos Agrícolas (Andrei,1999) e o seu complemento editado em2003.O Ministério da Saúde baseia-se 26ensaios de exposição aguda em animaisde laboratório, cujos dados são extrapoladospara o homem, estabelecendoassim 4 Classes Toxicológicas aos agrotóxicos:• Classe I - Extremamente tóxicos- rotulagem vermelha• Classe II – Altamente tóxico -rotulagem amarela• Classe III – Moderadamente tóxico– rotulagem azul - Bt• Classe IV – Pouco tóxico – rotulagemverde - BtNo caso das formulações de B. thuringiensis,essas se encontram predominantementedistribuídas entre as classesIII e IV, as quais se classificam comomoderadamente ou pouco tóxicas. Essasclasses toxicológicas referem-se semprea manipulação dos produtos pelosfabricantes, transportadores, aplicadorese outros.Também compete a ANVISA o estabelecimentode “tolerância” que se refereaos limites máximos dos resíduos,os quais são avaliados em estudos deexposição subcrônica e crônica e dadosdesses resíduos nos produtos agrícolas.Junto ao MAPA são determinadosos “períodos de carência” dos produtos,que fazem referência ao intervalode segurança.O Ministério do Meio Ambiente requer20 ensaios ecotoxicológicos, 36estudos de características físico-químicas,4 testes de metabolismo e degradação.Em seguida o produto é classificadoquanto ao seu potencial de periculosidadeno meio ambiente:• Classe I – Produto altamenteperigoso• Classe II – Produto muito perigoso• Classe III – Produto perigoso -Bt• Classe IV – Produto pouco perigoso- BtComo anteriormente, nesse caso osprodutos de B. thuringiensis se enquadramcomo perigosos ou pouco perigososao meio ambiente. Os dados quecompetem ao IBAMA envolvem os aspectos:físico-químicos que revelam aidentidade da molécula do biopesticida;ecotoxicológicos que englobam estudoscom organismos não alvos (abelhas,minhocas, microcrustáceos, peixes,aves, microrganismos do solo e outros);comportamento no meio ambiente que<strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong> 59
avalia a lixiviação, mobilidade nosolo e bioconcentração nas cadeiastróficas, entre outros.Nos estudos toxicológicos dos biopesticidaspodem ser avaliados somenteo ingrediente ativo ou a formulaçãoque se deseja registrar, podendoambas as formas serem avaliadassimultaneamente. Após as análisesrequeridas pela ANVISA e IBA-MA, é o MAPA quem registra a formulaçãodo produto, publicando adecisão no Diário Oficial da União,com validade nacional e tempo indeterminado(Gallo et al.,2002).1.2 Produtos comerciaisà base de B. thuringiensisEntre os biopesticidas, a base deB. thuringiensis (Entwistle et al, 1993;Schnepf et al., 1998), apresentadosna Tabela 1, alguns se destacam nocontrole biológico de pragas agrícolaspor serem utilizados há váriasdécadas, levando atualmente esseentomopatógeno a quase totalidadedo mercado dos pesticidas microbianos.B. thuringiensis é um importanteagente de controle de insetos-praga,principalmente para lepidópteros ecoleópteros, porque seu ingredienteativo tóxico, representado por proteínasCry, pode ser considerado atóxicoaos vertebrados e aos insetosnão-alvo (Siegel, 2001). Por outrolado, as formulações comerciais deB. thuringiensis apresentam uma estabilidadelimitada a campo, além deapresentarem um período de aplicaçãocrítico devido à redução da suscetibilidadecom o desenvolvimentolarval dos insetos.Para complementar e manter atualizadasessas informações recomenda-sea revisão de alguns sites queindicados a seguir:- www.andef.com.br (AssociaçãoNacional de Defesa)- www.epa.gov (EPA – EnvironmentalProtection Agency)- www.anvisa.gov.br- www.ibama.gov.br- www.agricultura.gov.br- http: www. pesticide.net- http://pesticideinfo.org- http://foodchemicalnews.com- http://www.cnpma.embrapa.brQuanto às formulações de B. thuringiensisisraelensis e comercializaçãoem escala mundial contra dípteros,especialmente os vetores de doençashumanas como Aedes aegypti, destacamseos seguintes produtos (Thomas eEllar, 1983; Armstrong et al., 1985; Thieryet al., 1996; Andrade, 2008):• Vectobac, Skeetal, Bactimos(Abbot)• Teknar (Sandoz)• Aquabac (Becker Microbials)• LarvX SG (Meridian PrecisionRealease Technologies)• Biotouch (Zohar Dalia)• Culinex (Culinex Gmbh)• Bacticide( Biotech InternationalLtd)• Bactivec (Labiofam)• Bt Horus SC (Bthek) (http://www.bthek.com.br)Os mesmos autores também mencionamalgumas formulações comerciaisde B. sphaericus para o controle de larvasde Culex pipiens, como:• Spherimos e Vectolex (Abbot)• Sphericide (Biotech InternationalLtda)• Spicbiomoss (Turicorin AlkaliChemicals and Fertilisers Ltda).Apesar de haver um número significativode produtos à base de B. thuringiensis,ainda há um longo percursopara que sejam atingidas a maioria dasordens de insetos-praga de importânciaagrícola e vetores de doenças humanas.Enquanto mais pesquisas vêmsendo desenvolvidas nessa área, devemser priorizados os biopesticidas já registradose comercializados para o controlede insetos a fim de reduzir a contaminaçãoambiental causada pelos inseticidasquímicos.1.3 ReferênciasANDRADE, C.F.S. 2008. Controle Biológicode Borrachudos – Dosagens deProdutos a Base de Bacillus thuringiensisvar. israelensis Artigos Técnicos- Unicamp, Instituto de Biologia,Dep. de Zoologia, Campinas,2008. Site Ecologia Aplicada, 19p.Disponível em: http://www.ib.unicamp.br/profs/eco_aplicada/. Acesso em: 04.12.08ANDREI, E. Compêndio de defensivosagrícolas. 6 ed. São Paulo, OrganizaçõesAndrei. 1999. 672p.ALVES, S.B. 1998. Controle microbianode insetos. 2 ª ed. Piracicaba, SP.FEALQ, 1163 p.ARMSTRONG, J.L.; ROHRMANN, G.F.& BEAUDREAU, G.S. 1985. Delta-endotoxinasof Bacillus thuringiensissubspecies israelensis.Journal Bacteriology 161:39-46.ENTWISTLE P. F., CORY J.S., BAILEYM.J. & HIGGS S. 1993. Bacillusthuringiensis, an environmentalbiopesticide : theory and practice.John Wiley & Sons, NewYork, USA, 311p.GALLO, D. (in memoriam); NAKA-NO, O.; NETO, S.S.; CARVALHO,R.P.L.; BAPTISTA, G.C.; BERTIFILHO, E.; PARRA, J.R.P.; ZUCCHI,R.A. ; ALVES, S.B.; VENDRAMIM,J.D.; MARCHINI, L.C.; LOPES,J.R.S.; OMOTO, C. 2002. 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PesquisaPLANTAS AS TRANSGÊNICAS QUE SINTETIZAMTOXINAS DE BACILLUS THURINGIENSIS E OUTRASLidia Mariana FiúzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia –Fitossanidade (UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas(ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologiaVegetal (CIRAD-Montpellier).Laura Massochin Nunes PintoBióloga (PUCRS) e Mestre e Doutoranda emBiologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).o contexto das aplicaçõesbiotecnológicas do entomopatógenoB. thuringiensis,aqui se encontramdados bibliográficos sobrea transformação genéticade plantas, com genes deB. thuringiensis e outros, que conferemresistência ou tolerância das plantas hospedeirasaos insetos-praga. As espécies vegetaisapresentam naturalmente uma resistênciaaos insetos fitófagos, diferenciandoassim os grupos de pragas em funçãodas plantas hospedeiras. A resistênciavegetal está baseada em vários mecanismosde defesa, incluindo uma gamade metabólitos secundários nocivos produzidospelas plantas. A biotecnologia vegetal,através do desenvolvimento de técnicasde biologia celular e molecular devegetais superiores oferece novas possibilidadesao melhoramento de plantas cultivadas,facilitando a obtenção de plantasresistentes ao ataque dos insetos. A transformaçãogenética e a regeneração in vitrode plantas, somadas à disponibilizaçãode genes de interesse agronômico,destinados a introdução em plantas, têmpermitido a geração de plantas transgênicascom características específicas, sem orompimento de combinações genéticas jáselecionadas pelos programas convencionaisde melhoramento genético de plantascultivadas. A transformação de plantascom genes de origem microbiana, vegetale animal, os quais codificam especificamentetoxinas com efeito inseticida,vem sendo considerada uma alternativa relevantejunto aos métodos de controle deinsetos-praga das plantas de interesse econômico,onde se destacam as plantas-Btresistentes a diversas ordens de insetos,principalmente aos lepidópteros e coleópteros.1.1 Genes deB. thuringiensis em plantasB. thuringiensis apresenta um genomade 2,4 a 5,7 milhões de pares de bases,com elementos extracromossômicoslineares ou circulares (Carlson et al., 1994).Os genes cry estão localizados em plasmídios,sendo esses responsáveis pela síntesede diferentes proteínas inseticidas,cuja clonagem e caracterização dessesgenes em 1981 (Schnepf & Whiteley, 1981)revelou novas perspectivas de aplicaçãodo entomopatógeno. Entre essas se encontraa transgenia que permite introduzir osgenes de B. thuringiensis codificadores dastoxinas nos genomas dos vegetais, permitindoa expressão contínua das proteínasem todos os tecidos da planta e atingindo,assim, apenas os insetos-praga que sealimentam dos tecidos (de Maagd et al.,1999). A primeira geração de plantas transgênicasresistentes a insetos foi desenvolvidacom o uso de genes codificadores deproteínas inseticidas de B. thuringiensis(Fischhoff, 1987; Vaeck et al., 1987).Os genes cry de B. thuringiensis sãotalvez os exemplos mais conhecidos degenes exógenos para os quais tem sidodifícil obter um nível satisfatóriode expressão emplantas transgênicas (Diehnet al.,1996). A baixa expressãodos genes de B. thuringiensisem plantas tem sidoassociada à instabilidadedas moléculas de mRNA,uma característica amplamenteobservada da expressãodestes genes em plantasé o pouco ou nenhumacúmulo de mRNA mesmoquando sob controle depromotores fortes. Para tantovárias modificações têm sido testadaspara aumentar a eficiência de expressãodestes genes, como adaptar os códons preferenciaisde bactérias para códons preferenciaisde plantas e/ou aumentar o conteúdode G/C nas seqüências codificantes(Perlak et al., 1991), retirada de sítios desplicing, modificações dos sinais de poliadenilaçãodentro da região codificante(Koziel et al., 1993), inserção de íntronsna região 5’ da seqüência não traduzida(Jouanin et al., 1998) bem como a inserçãode genes nativos em cloroplastos inicialmenterestrita a tabaco (McBride et al.,1995).Genes parcialmente ou totalmente sintéticostêm sido construídos, nestes genesa seqüência de nucleotídeo é modificadasem a troca da seqüência de aminoácido,a expressão destes genes em plantas aumentousignificativamente (de menos de0,001% de proteína solúvel na folha paraaté 1%), sendo os genes totalmente sintéticosos mais eficientes em testes de campo(Jouanin et al., 1998).Os estudos iniciais se basearam emplantas como tabaco e tomate (Barton etal., 1987; Fischhoff et al., 1987; Vaeck etal., 1987) devido às facilidades de transformação,cultivo em casa de vegetação ecrescimento rápido. Vários genes quiméricoscontendo um gene promotor de origemvegetal; a seqüência completa do genecry e uma região de poliadenilação foramintroduzidos em tabaco e tomate, porémnenhuma expressão foi detectada em tabacoe níveis muito baixos foram observadosem tomate (Perlak et al., 2001).A truncagem da seqüência codificadorado gene cry por eliminação da metade 3’desta seqüência aumentou a expressãopara níveis detectáveis de proteína e mRNA(Estruch et al., 1997). Os primeiros testesde campo com versões truncadas do genecry foram eficientes no controle de Helicoverpazea no caso do tomate (Perlak &Fischhoff, 1993), porém não no controlede Heliothis virescens no caso do algodão(Jenkins et al., 1991). Os resultados maisefetivos foram obtidos utilizando genes sintéticos(Perlak et al., 1990; Perlak et al.,1991; Van der Salm et al., 1994).62 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
Tabela 1. Genes de B. thuringiensis utilizados na engenharia genética de plantasPlantas Genes Insetos-Alvo ReferênciasÁlamoAlfafaAlgodãoAmendoimArrozBatataBerinjelaBrócolisCanolaFumoMilhoRepolhoSojaTomatecry1Aacry3Aacry1Cacry1Abcry1Ac e cry2Abcry1F e cry1Accry1Ab e Vip3Aacry1Accry1Accry1Aacry1Abcry1Accry1Ab e cry1Accry1Bcry1Ccry2Acry1Abcry1Abcry3Aacry1Abcry3Acry3Bcry1Ccry1Accry1Accry1Aacry1Abcry1Ab e cpTIcry1Abcry1Accry1Ccry2Acry1Abcry9ccry1Fcry1Accry3Bb1cry34Ab1 e cry35Ab1cry1Ab1 e cry3Bb1cry1F + cry34Ab1 ecry35Ab1cry3A e cry1Abcry1A e cry2Ab2cry1A + cry2Ab2 ecry3Bb1cry1Accry3Acry1Abcry1Accry1Abcry1AcLymantria dispar (L.)Chrysomela tremulae F.Spodoptera litoralis (Boiusduval)Heliothis virescens, Helicoverpa zeaSpodoptera exigua, Pseudoplusia includens (Walker)Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Pectinophora gossypiella, Estigmeneacrea, Bucculatrix thurberiella, Pseudoplusia includens, Spodopteraexigua, Spodoptera frugiperda, Spodoptera ornithogalli, Ostrinianubilalis-lepidópterosElasmopalpus lignosellusChilo suppressalisCnaphalocrocis medinalis, Chilo suppressalis, Scirpophagaincertulas,Cnaphalocrocis medinalis, Herpitogramma licarisalis;Sesamia inferens, Naranga anescens, Mycalesis gotama, Parnaraguttata.Chilo suppressalis, Nilaparrata lugens, Scirpophaga incertulasChilo suppressalis, Scirpophaga incertulas, Ostrinia nubilialis,Cnaphalocrocis medinalisChilo suppressalisScirpophaga incertulas, Cnaphalocrocis medinalisScirpophaga incertulas,Cnaphalocrocis medinalisPhthorimaea operculella (Zeller)Heliothis armigera (Hübner)Leptinotarsa decemlineataLeucinodes orbonalis GuenéeLeptinotarsa decemlineata (Say)Leptinotarsa decemlineataPlutella xylostella (L.)Thrichoplusia ni (Hübner), Spodoptera exigua (Hübner), Heliothisvirescens (Fabr.), Helicoverpa zea (Boddie)Plutella xylostellaManduca sexta (L.)Manduca sextaManduca sextaManduca sextaHeliothis virescens, Helicoverpa zea, Spodoptera littoralisSpodoptera littoralisHelicoverpa armigera, Heliothis virescens, Helicoverpa zea, SpodopteraexiguaOstrinia nubilalis (Hübner)Ostrinia nubilalisDiatraea grandilosella, Ostrinia nubilalisOstrinia nubilalisDiabrotica virgifera, Diabrotica barberiDiabrotica virgiferaOstrinia nubilalis, Diatraea grandiosella, Diatraea crambidoides,Diatraea saccharalis, Helicoverpa zea, Spodoptera frugiperda,Elasmopalpus lignosellus, Diabrotica virgifera, Diabrotica barberiOstrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Helicoverpa zea, Spodopterafrugiperda, Elasmopalpus lignosellus, Diabrotica virgifera, Diabroticabarberi, Diatraea crambidoides, Diatraea grandiosella, Diatraeasaccharalis, Striacosta albicostaDiabrotica virgifera, Diabrotica barberi--Ostrinia nubilalisDiabrotica virgifera, Diabrotica barberiPlutella xylostellaHeliothis virescens, Helicoverpa zea, Pseudoplusia includensHeliothis virescensHelicoverpa armigeraMcCown et al. (1991)Cornu et al. (1996)Sthrizhov et al. (1996)Perlak et al. (1990)Adamczyk et al. (2001)EPA (2008)EPA (2008)USDA (2008)Singsit et al. (1997)Breitler et al. (2004)Shu et al. (2000), Ye et al. (2003), Wunn et al.(1996), Datta et al. (1998), Ghareyazie et al.(1997), Alam et al. (1998), Wu et al. (1997),Husnain et al. (2002)Loc et al. (2002), Khanna e Raina (2002),Nayak et al. (1997), Han et al. (2007)Cheng et al. (1998), Ahmad etal. (2002), Tu et al. (2000)Breitler et al. (2000 e 2001)Tang et al. (2006)Maqbool et al. (1998), Chen et al. (2005)Peferoen et al. (1992), Rico et al. (1998)Chakrabarti et al. (2000)Adang et al. (1993), Perlak et al. (1993),Coombs et al. (2002)Kumar et al. (1998)Jelenkovic et al. (1998)Iannacone et al. (1997)Zhao et al. (2001)Stewart et al. (1996b)Halfhill et al. (2001)Barton et al. (1987)Vaeck et al. (1987)Perlak et al. (1991)Williams et al. (1993)McBride et al. (1995)Strizhov et al. (1996)Selvapandiyan et al. (1998);Kota et al. (1999)Koziel et al. (1993)Jansem et al. (1997)EPA (2008)EPA (2008)EPA (2008)EPA (2008)EPA (2008)EPA (2008)EPA (2008)EPA (2008)EPA (2008)USDA (2008)USDA (2008)Bhattacharya et al. (2002)Stewart et al. (1996a)Fischolff et al. (1987)Mandaokar et al. (2000)<strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong> 63
Genes de B. thuringiensis codificadoresde proteínas Cry foram isolados e introduzidosem plantas agronomicamenteimportantes utilizando diferentes métodosde transformação genética como aquelesque empregam Agrobacterium, transformaçãodireta de protoplastos e bombardeamentode partículas ou biobalística.No início dos anos 80, o primeiro genecry foi clonado e expresso em Escherichiacoli (Schnepf & Whitley, 1981), sendono final dessa década produzida a primeiraplanta de tomate com genes de B.thuringiensis (Fischhoff, 1987). O milhoMaximizer da Novartis, o algodão Bollgarde a batata Newleaf da Monsantoforam introduzidas no mercado norteamericanoem 1995, sendo genericamenteconhecidas como plantas-Bt (Jouaninet al.,1998). Atualmente, o milho-Bt é aplanta transgênica mais cultivada no mundo,ocupando 15% da área global cultivadacom transgênicos em países comoEUA, Canadá, Argentina, África do Sul,Espanha e França. O algodão-Bt ocupa osegundo lugar em áreas plantadas, representandoaproximadamente 7% da áreacultivada com transgênicos (James, 2000).Além do milho, da batata, do tomate e doalgodão, outras plantas cultivadas expressamuma ou várias proteínas Cry para ocontrole de lepidópteros e coleópteros(Tabela 1) e outras plantas-Bt de espéciescultivadas estão em fase de desenvolvimentoem laboratórios ou em testes decampo (Oecd, 2001).Atualmente estão registradas mais de300 seqüências de genes cry, indicandoque a próxima geração de plantas-Bt deveráapresentar múltiplos genes cry, oferecendoaos produtores um maior espectrode proteção contra diferentes insetospragae reduzindo a probabilidade dosmesmos desenvolverem resistência.As pesquisas também estão voltadaspara o incremento da expressão dos genesde B. thuringiensis em plantas, naseleção de novas variantes de B. thuringiensismais ativas e/ou na modificaçãodas seqüências dos genes cry de maneiraa aumentar a produção de toxinas no interiordas plantas. Nesse sentido, Schuleret al. (1998) relata que uma estratégia paraa maior efetividade tóxica das plantas-Btcontra insetos seria a introdução de genesnativos de B. thringiensis no genomados cloroplastos, o que resulta num elevadonível de expressão. A natureza procarióticados plastídios vegetais permitea transcrição dos genes de B. thringiensise a tradução e processamento dos mR-NAs de forma mais eficiente. Nesse caso,alguns autores mencionam que o entraveestaria associado à transformação de cloroplastosa qual se restringe apenas a algumasplantas-modelo, como por exemplotabaco e tomate (Jouanin et al., 1998;Kota et al., 1999).1.2 Outros genes em plantasConsiderando outros genes de interesseà engenharia genética de plantas, osinibidores de proteinases vegetais são polipeptídiosou proteínas que se encontramnaturalmente nas plantas e fazem partedo sistema de defesa das mesmas contraherbívoros. Nos insetos as proteinases sãoclassificadas em diferentes grupos, variandoconforme a ordem ou espécie, sendoestas responsáveis pela digestão dosalimentos de onde são assimilados nutrientesessenciais ao crescimento e ao desenvolvimentodos mesmos.Os inibidores de proteinases serínicase cisteínicas vêm sendo mencionadoscomo inibidores do crescimento e do desenvolvimentode alguns insetos das ordenslepidóptera e coleóptera, respectivamente.A atividade antimetabólica dosinibidores não foi bem elucidada, podendoestes: inibirem as enzimas digestivasdiretamente; provocarem a hipersecreçãode enzimas no intestino provocando o esgotamentodos aminoácidos essenciais;afetarem o balanço hídrico, as trocas e aregulação enzimática dos insetos (Schuleret al., 1998).Inibidores de alfa-amilases podem serconsiderados um segundo inibidor de enzimas,também utilizados na transformaçãode plantas (Tabela 2). Ensaios realizadoscom Callosobruchus sp. e Bruchussp. mostram que esses inibidores, comoalfa-AI-Pv oriundo do feijão comum (Phaseolusvulgaris), são glicoproteínas termoestáveisque inibem alfa-amilases no intestinomédio desses coleópteros pragasde grãos armazenados, bloqueando assimo seu desenvolvimento larval (Schuler etal.,1998).As lectinas são proteínas naturalmenteproduzidas por plantas, principalmentepelas leguminosas, como Glycine maxe Canavalia ensiformes, respectivamente.O modo de ação destas proteínas vegetaisnão foi bem elucidado, mas algunsresultados de pesquisa sugerem que estasse ligam às células epiteliais do intestinodos insetos (Carlini & Grossi-de-Sá, 2002).Dados de pesquisa mostram que váriaslectinas identificadas têm efeito inseticidacontra diversas ordens de insetos,principalmente coleópteros, hemípteros ehomópteros, porém algumas apresentamefeito tóxico para mamíferos, enfatizandoassim a necessidade de maiores investigaçõesnessa área (Carlini & Grossi-de-Sá, 2002).Alguns genes de quitinases, peroxidasese triptofano-descarboxilases vêm sendointroduzidos em plantas visando principalmenteà resistência a insetos da ordemHomoptera (Schuler et al., 1998). Poroutro lado, os conhecimentos sobre osmecanismos de ação desses produtos sãorestritos devido à elevada complexidadedo sistema.No controle de pragas de importânciaagrícola, observa-se que, a possibilidadede obtenção de plantas que sintetizam toxinasletais aos insetos através da transformaçãovegetal com genes oriundos deoutras plantas, microrganismos e animais,abriu novas perspectivas ao Manejo Integradode Pragas. Outro aspecto importantesão as novas alternativas de controle deinsetos de difícil acesso através dos métodosconvencionais, seja pelo modo de vidasubterrâneo ou endofítico da praga alvo.A utilização de plantas transgênicasresistentes permite o acúmulo do produto(toxina) entomotóxico nos tecidos vegetais,afetando diretamente a espécie alvoquando a mesma se alimenta do tecidotransgênico, sem causar danos às espéciesnão alvo, representando assim um métodoalternativo para o controle de pragasdas plantas cultivadas associado à preservaçãodo meio ambiente.1.3 Segurança dasplantas transgênicasA liberação comercial das plantas geneticamentemodificadas com genes cryde B. thuringiensis, relatada na publicaçãode Dunwell (1999), revela que os produtoresnorte-americanos têm adotado asplantas transgênicas como um elementochave no aumento da produção vegetal.Esse marco histórico só chegou ao Brasilem 2005, através da regulamentação e liberaçãodo cultivo e comercialização dasplantas transgênicas. Para maior detalhamentosobre esse assunto consultar os seguintessites:- www.ctnbio.gov.br (Comissão TécnicaNacional de Biossegurança)- www.anbio.org.br (Associação Nacionalde Biossegurança)Os dados de revisão de Fontes et al.(2002) relatam a segurança, riscos ambientaise eficiência no controle de pragasatravés do emprego das plantas-Bt. Tambémos trabalhos de revisão de Bobrowskiet al. (2003) e Polanczyk et al. (2003)citam alguns benefícios do uso dessa tecnologia,como:• Diminuição dos efeitos ambientaissobre as toxinas;• Segurança na utilização;• Redução do uso de inseticidas químicos;• Eficiência no controle das pragas;• Proteção vegetal;• Preservação dos inimigos naturais;• Redução de doenças fúngicas.1.4 Considerações e perspectivasOs dados de pesquisa têm reveladoque certas espécies de insetos, principal-64 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
Tabela 2. Outros genes utilizados na obtenção de plantas transgênicas resistentes aos insetos (adaptado de Schuler et al., 1998)GENES / PRODUTOSINSETOS-ALVOPLANTAS TRANSFORMADAS / PRODUTOSCMe (cevada); CMTI (abóbora); MTI-2 (mostarda);PI-IV (soja); KTi3 e SKTI (soja); inibidor deproteinase I e II (tomate); SI (animal);α1AT(animal)Pot PI-I e Pot PT-II (batata); BPTI (pâncreasbovino);C-II (soja); CpTI (cowpea)OC-1 (arroz)anti-quimiotripsina (Manduca sexta), anti-elastase(M. sexta), anti-tripsina (M. sexta)Inibidores de alfa-amilaseWMAI-1 (cereais)αAI-Pv (feijão)LectinasGNA (anêmona), p-lec (ervilha)WGA (trigo), lectina (arroz), jacalinOutrosBCH – quitinase (feijão)Quitinase (Manduca sexta)Quitinase(tomate), Peroxidase(fumo)TDC (crisântemo)14K-CL (bifuncional) *LepidopteraLepidoptera, OrthopteraColeoptera, LepidopteraColeoptera, HomopteraHomopteraLepidopteraColeopteraLepidoptera, HomopteraLepidoptera, ColeopteraLepidoptera, HomopteraLepidopteraLepidoptera, Homoptera, ColeopteraHomopteraLepidoptera, Coleopterafumo, arabidopsis, batata, alfafa, beladona,tomatepetúnia, fumo, bétula, alface, arroz, batata,trevo brancocolza, álamo, batata, fumo, maçã, alface, arroz,morango, girassol, batata-doce, tomatecolza, álamo, fumoalgodão, fumo, alfafafumofeijão, ervilha, fumouva, colza, batata, arroz, batata-doce, canade-açúcar,girassol, fumo, tomatemilhobatatafumocolza, fumo, tomatefumofumo* bifuncional: inibidor de proteinases serínicas e de alfa-amilasesmente lepidópteros, têm adquirido resistênciaàs proteínas Cry de B. thuringiensis,reforçando assim o compromisso dasfuturas pesquisas na identificação de novastoxinas inseticidas. Também são consideradosimportantes os estudos sobreexpressão gênica, espectro de ação e especificidadedas proteínas inseticidas, permitindoa disponibilização freqüente denovas versões gênicas mais eficazes, maisespecíficas e com vantagens ainda maioressobre as práticas convencionais decontrole de pragas. Ainda para evitar ouretardar o surgimento de resistência deinsetos às plantas transgênicas, recomenda-sea adoção de técnicas de manejo adequadas,sendo algumas já relatadas porPeferoen (1997) há mais de uma década.A aplicação integrada das plantastransgênicas na agricultura convencional,já ultrapassou a aceitação pública da tecnologiados transgênicos e atualmente representauma realidade no incremento daprodução de alimentos de origem vegetal,com baixo custo e impacto ambiental.1.5 ReferênciasADAMCZYK, J.J.; ADAMS, L.C.; E HAR-DEE, D.D. 2001. Field efficacy and seasonalexpression profiles for terminalleaves of single and double Bacillus thuringiensistoxin cotton genotypes. 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PesquisaEVOLUÇÃO E MANEJODA A RESISTÊNCIA DE INSETOSOS“O conhecimento nos permite contornar muitos problemas, mas muitasvezes, apenas nos possibilita adiar o inevitável, transferindo para algum ponto futuroos acontecimentos que buscamos com todo empenho evitar – Vilmar Machado”Vilmar MachadoBiólogo (UNISINOS) e Mestre e Doutor emGenética e Biologia Molecular (UFRGS)Lidia Mariana FiúzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestre emFitotecnia – Fitossanidade (UFRGS),Doutora em Ciências Agronômicas(ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora embiotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).ste artigo apresenta alguns aspectosrelacionados à evolução e aomanejo da resistência do pontode vista da biologia evolutiva.Aqui são abordados os mecanismosbiológicos envolvidos noprocesso de adaptação dos insetos-pragaaos agentes de controle e, também,como o conhecimento destes se refletenas estratégias utilizadas para reduzir avelocidade de evolução da resistênciaàs plantas transgênicas.1.1 IntroduçãoA resistência aos inseticidas é umfenômeno mundial e as estimativas atuaisindicam que mais de 500 espéciesde artrópodes desenvolveram resistênciaa um ou mais pesticidas (Georghiou& Lagunes-Tejeda, 1991). A resistênciatambém foi observada para uma variedadede produtos naturais e reguladoresdo crescimento de insetos. Dentreo que aprendemos com a utilização deinseticidas químicos foi que a capacidadede resposta adaptativa dos insetosé quase inevitável e ocorre relativamenterápido. Para muitos esse fenômenoparece ser surpreendente, masnão devemos esquecer que uma das característicasmais relevantes dos organismosvivos é sua capacidade de evoluircontinuamente.O processo de evolução ocorre deforma “automática” - sem a influênciade forças externas ou de um agente direcionadorpara compreender como asmudanças evolutivas acontecem, precisamosanalisar aspectos básicos da biologiados seres vivos os quais influenciama evolução da diversidade biológicapossibilitando a adaptação aos diferentesambientes e também respostasespecíficas a pressões seletivas mais diretas,como a predadores, parasitas oua agentes de controle desenvolvidospela espécie humana, como antibióticosou inseticidas químicos.Nossa relação com insetos-praga,bactérias e vírus, mesmo que pareça estranhapara alguns, pode ser analisadacomo um processo de co-evolução.Nossas respostas, nesse processo, sãofrutos da aplicação do conhecimento científicoenquanto o que observamos,através da evolução da resistência, nãoé. Indiferentes aos nossos esforços, populaçõesde insetos se reproduzem passandode uma geração para outra asinformações genéticas. Esse processo dereprodução não é aleatório: em cadageração alguns indivíduos deixarão maisdescendentes que outros; o sucesso napassagem dos genes para as próximasgerações está associado à presença decaracterísticas genéticas que contribuempara a reprodução e a sobrevivênciaàs condições ambientais vigentes.A descrição acima pode ser simples,mas nos possibilita ter uma idéia geraldo processo de evolução da resistênciaaos antibióticos e inseticidas químicos.Para uma compreensão mais apuradado processo podemos fazer, no mínimo,duas perguntas relevantes. Quaisas características importantes do materialgenético passado de uma geraçãopara outra no processo de evolução?Porque a sobrevivência e a reproduçãonão são aleatórias?As respostas para estas perguntas68 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
nos permitirão compreender, em linhasgerais, a evolução da resistência aos inseticidase antibióticos, e também analisaras possibilidades de evolução daresistência às plantas geneticamente modificadascom genes de B. thuringiensis,denominadas plantas-Bt. Além disso,ajudarão a compreender os procedimentosutilizados nas estratégias demanejo da evolução da resistência.1.2 Diversidade genética naspopulações e evolução da resistênciaA evolução de respostas adaptativasocorre pelo efeito de seleção naturalsobre a variação genética existentenas populações. A aplicação repetidade inseticidas do mesmo grupo químicoe modelo de ação favoreceram variantesgenéticas específicas nas populaçõesalvos levando à substituição dosindivíduos susceptíveis pelos indivíduosresistentes. O gene para resistênciaque aumenta em freqüência numa populaçãopode se espalhar para outraspopulações através do fluxo gênico.As diferenças genéticas entre os indivíduosde uma população são consideradasa matéria prima da evolução,existindo uma relação entre valor adaptativomédio de uma população e osníveis de variabilidade que ela apresenta.Segundo o teorema fundamental deFisher (1930), a taxa de mudança evolutivaé proporcional à diversidade genéticaexistente nas populações.A diversidade genética é a base pararespostas às mudanças ambientais. Aimportância do estudo da variabilidadepode ser compreendida pela quantidadede trabalhos sobre o tema, em especialprocurando identificar os fatoresenvolvidos na sua manutenção. Nos trabalhoscom populações naturais, a preocupaçãocom a existência da diversidadegenética aparece de formas variadas.Para programas de conservação emanejo da vida silvestre, um dos temascentrais é a manutenção da variabilidadegenética em ambientes fragmentados,pois é consenso que a persistênciafutura das populações pode dependerda preservação de componentes específicosda diversidade genética (Gilpin& Sóule, 1986; Meffe & Carrol, 1997).Em programas de manejo e controle depragas e vetores, essa preocupação estáassociada, por um lado, à busca por linhagensde agentes de controle quesejam específicas a uma determinadapraga (Potting et al. 1997; Vink et al.,2003) e por outro, à identificação devariantes resistentes aos agentes de controlenas espécies consideradas pragasou vetores de doenças (Ofuya & Credland,1995; Winder et al. 1997; Guiraoet al. 1997; Nicol et al. 1998; Szalanskiet al. 1999; 2000; Oliveira et al. 2001;Birungi & Munstermann, 2002). A importânciae as implicações de existênciade variação genética nas populaçõesnaturais de pragas e vetores foram salientadaspor Diehl & Bush (1984) emseu trabalho sobre “biotypes”. Segundoos autores, o não reconhecimentodesse fator pode frustrar ou dificultarprogramas de manejo e controle biológicode pragas. Para Newman et al.(1998), a diversidade genética nas populaçõesé um dos elementos que contribuempara reduzir a eficiência de programasde controle químico e/ou biológico.Essa também é uma preocupaçãoconsiderada por programas envolvidosno desenvolvimento de variedadesde plantas resistentes a insetos-praga(Sardesai, 2000; Heinrichs, 2001).A importância da variabilidade genéticapara programas de manejo e controlede pragas tem sido discutida pordécadas, mas seu estudo tornou-se possívelapenas com o desenvolvimento demarcadores baseados na análise deDNA. A aplicação desses marcadorestornou-se uma ferramenta importantepara o estudo da dinâmica e dos fatoresque influenciam populações naturais(Edwards, 1993; Smith & Wayne,1996; Schierwater & Desale, 1998). Estudosdetalhados sobre a importânciada variabilidade genética em insetospragaou vetores são recentes e entreeles destacam-se: Winder et al. (1997);Guirao et al. (1997); Nicol et al. (1998);Szalanski et al. (1999); Downie (2000);Geurgas et al. (2000; 2002); Appleby &Credland (2003).Estudos recentes têm registrado variaçãointra-específica na susceptibilidadea agentes de controle químico e/oubiológico em várias espécies, como porexemplo, Microctonus aethiopoides,Schizaphis graminium e Spodopterafrugiperda. Em Microctonus aethiopoides(Hymenoptera: Braconidae), um parasitóideutilizado em programas decontrole de biológico de pragas, foramidentificadas linhagens (biotipos) adaptadasa hospedeiros diferentes, analisando-sea variação intra-específica no genepara Citocromo Oxidase I (Vink et al.,2003). Uma das dificuldades no controlede Schizaphis graminium (Hemiptera:Aphididae), uma das mais importantespragas de cereais do mundo, é aexistência de linhagens diferentes aolongo da sua área de distribuição. Paraesse inseto estão sendo realizados estudosvisando selecionar marcadoresmoleculares específicos para identificaras diferentes linhagens e, desta forma,melhorar as condições de controle utilizandoagentes específicos para cadauma (Aikhionbare & Mayo, 2000; Lopesda Silva et al., 2004). Em Spodopterafrugiperda (Lepidoptera: Noctuide),uma praga de várias culturas importantes,lagartas coletadas em hospedeirosdiferentes apresentaram diferenças significativasna susceptibilidade a determinadosinseticidas e a endotoxinas deB. thruringiensis (Adamczyk, et al.,1997).Exemplos mais interessantes da diversidadegenética em insetos-pragaocorre em Bemisia tabaci, consideradapor muitos a principal praga agrícolado mundo, tendo sido registrada suaocorrência em mais de 600 espécies deplantas e, até o momento, são conhecidosmais de 20 biotipos (Oliveira et al.,2001; Omondi el al., 2005; Carabali etal., 2005). No Brasil, esse inseto é conhecidocomo mosca-branca e os prejuízoscaudados decorrem da atividadede sucção de seiva, injeção de toxinase pela transmissão de vírus de plantas.A variabilidade genética intra-específicae a diversidade de hospedeiros estãoentre os grandes desafios para ocontrole desse inseto (Perring, 2001).Os parágrafos acima reforçam a idéiade que é preciso levar em conta a diversidadegenética existentes nas populaçõesdos insetos-alvo em programasde manejo e controle. Vários estudosdemonstram que essa variabilidadetambém está presente nos mecanismosbiológicos que possibilitam a ação dastoxinas de B. thuringiensis.A resistência às toxinas de B. thuringiensispode envolver: a não ativaçãoda toxina, a imobilização da toxinana membrana peritrófica, sua incapacidadede ligar-se aos receptores da membrana,sua incapacidade de criar porosna membrana do epitélio e sua baixaeficiência pelo rápido reparo dos danoscausados por ela às células afetadas(Ferre & Van Rie, 2002; Griffitts &Aroian, 2005; Baxter et al. 2008).O mecanismo mais comum envolvendoa resistência às toxinas de B. thuringiensisé a redução na capacidadede ligação aos receptores nas microvilosidadesdo intestino médio dos insetos(Ferre et al., 1991; 2003; Pigott &Ellar, 2007; Wang et al., 2007; Rodrigo-<strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong> 69
Simón et al., 2008). Modificações nosgenes que codificam os receptores paraas proteínas Cry foram encontradas emvárias espécies. Mutações nos receptorespara proteína Cry1A estão envolvidasna resistência em Heliothis virescens(Gahan et al., 2001), Pectinophora gossypiella(Morin et al., 2003), Helicoverpaarmigera (Xu et al., 2005; Luo et al,2006) e P. xylostella (Ballester et al.,1999). Em C. elegans foram identificadosquatro genes diferentes para resistênciaà toxina (Griffitts et al., 2005).Além disso, foram descritos mecanismosde resistência a B. thuringiensis envolvendogenes diferentes em H. virescens,P. xylostella (Jurat-Fuentes & Adang,2006) e P. interpunctella (Herrero et al.,2001). Em H. virescens em cada 1000insetos 1,5 é portador do gene para resistênciaa B. thuringiensis (Gould etal., 1995; 1997).As informações acima demonstramclaramente a presença de genes pararesistência às toxinas de B. thuringiensisem populações de várias espéciesmesmo que em baixa freqüência. É precisodestacar que até o momento nãofoi registrada nenhuma população naturalresistente a essas toxinas. O que énecessário para que estes genes aumentemem freqüência nas populações naturais?A resposta simples é: que as aplicaçõesdas toxinas B. thuringiensis tornem-senuma pressão de seleção constantee intensa.1.3 Fluxo gênicoEstudos sobre a estrutura genéticade populações têm demonstrado, aolongo do tempo, que as espécies raramentesão constituídas por populaçõesúnicas e panmíticas; pelo contrário, diferençasgenéticas são encontradas entreas populações. Essas diferenças sãocomponentes importantes da diversidadegenética da espécie. Em geral, a trocade genes ocorre com maior probabilidadeentre populações próximas geograficamentedo que entre populaçõesmais distantes, sendo influenciada pelaestrutura geográfica e espacial das populações.Portanto, o estudo da estruturagenética das populações é um componenteimportante de programas demanejo e controle de pragas, pois podemfornecer informações sobre níveisde variabilidade genética, graus de diferenciaçãoentre as populações e padrõesde fluxo gênico. Além disso, podepossibilitar o monitoramento das mudançasna freqüência de genes específicos.A caracterização genética das espéciesalvo, ao longo de sua área dedistribuição, é um dos fatores quepodem contribuir para o sucesso deprogramas de controle biológico(Hoelmer & Kirk, 2005). O fluxogênico é um componente importantepara as estratégias de manejo daevolução da resistência e seus efeitospodem ter reflexos em pequenae grande escala.Em pequena escala (populaçõeslocais) espera-se que ele contribuapara diluição da resistência levandoao cruzamento entre insetos resistentese não resistentes. Sua intensidadetem efeitos na taxa de aumentoda freqüência dos genes para resistência.A capacidade de dispersãode um inseto praga é relevante paradefinição do tamanho e distribuiçãodas áreas de refúgio, uma vez queestas são os locais para manutençãode indivíduos susceptíveis possibilitandoo fluxo de genes não-resistentespara grupos de indivíduos resistentesnas áreas de plantas-Bt (Vacheret al., 2006).Em grande escala, o fluxo gênicopode determinar a possibilidadedos genes para resistência se espalharemao longo da área de distribuiçãogeográfica da espécie. Essefenômeno influencia a velocidadeem que uma adaptação que surgenuma população local pode se espalhar.Os possíveis impactos do fluxogênico na evolução da resistênciatorna fundamental dispor de estudosprecisos sobre a estrutura genéticadas populações de insetos-praga visandoestimar seu impacto em populaçõeslocais e também em longasdistâncias. Especialmente nocaso de pragas com ampla área dedistribuição que atacam culturas diferentes.Estudos de estrutura genética têmpotencial para responder questõesrelevantes para o manejo destas espécies,como por exemplo: os insetosque atacam plantas diferentes formamlinhagens distintas? Qual o graude diferenciação genética entre aslinhagens? Quando as linhagensocorrem na mesma área, os cruzamentossão aleatórios ou não? Quala capacidade de dispersão a longasdistâncias? A reprodução ocorre antesou depois da dispersão dos insetos?1.4 Efeito de seleção eevolução da resistênciaA seleção natural pode ser definidacomo diferenças na taxa de reproduçãoe/ou sobrevivência entre indivíduoscom características distintas. De umamaneira mais simples, os indivíduoscom as melhores respostas aos problemasde sobrevivência e reproduçãodeixam mais genes para as próximasgerações. O efeito da seleção naturalsobre as populações aumenta a freqüênciados alelos com resposta “positiva”,gerando uma mudança adaptativa. Deacordo com a hipótese da rainha vermelha(Van Valen, 1973) é preciso evoluir(adaptar-se) continuamente paranão ser “superado” pelos seus competidores.A capacidade de evoluir é uma característicados organismos vivos, mesmoque no processo ocorram extinçõesde muitas linhagens, mas a “vida” noplaneta Terra tem mantido sua capacidadede encontrar novos caminhos,reinventando a si mesma de diferentesmaneiras.Nossa relação com os insetos-pragaé apenas parte do processo e, por maiorque seja nosso empenho, não conseguimossuperá-las; até hoje apenasnos esforçamos para reduzir seu impactosobre nossa existência. Essa relaçãoiniciou quando inventamos a agriculturae desde então estamos envolvidosnuma corrida ao armamento. Nossasarmas envolvem os diferentes métodosde controle, com destaque para a aplicaçãoem massa de produtos químicossintéticos após a segunda guerra mundiale, mais recentemente, o desenvolvimentodas plantas-Bt.A crescente utilização de B. thuringiensiscomo biopesticidas e a ampliaçãodas áreas de plantio com plantas-Bt certamente aumentam a pressão deseleção desse agente sobre as populaçõesalvo.O primeiro formulado comercial deB. thuringiensis surgiu na França, em19<strong>38</strong> e sua introdução nos Estados Unidosocorreu em 1950. Desde então essabactéria vem sendo utilizada amplamentepara controle de pragas (Sayyed eWright, 2002). Em 1996, foram comercializadose plantados algodão-Bt emilho-Bt em milhares de hectares nosEstados Unidos (Gould, 1998). A partirde então, foram produzidas outras plan-70 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong>
tas com genes B. thuringiensis, e a áreaplantada foi ampliada, estendendo-separa outros continentes. Em 2002 foramplantados, no mundo, 14 milhõesde hectares apenas de algodão-Bt e milho-Bt(James, 2002; Bourguet et al.,2005).A expressão das toxinas de B. thuringiensisnas plantas transgênicas éconsiderada um dos maiores avançosno uso de biopesticidas. Segundo James(2007), as lavouras de plantas-Btaumentaram anualmente, atingindo114,3 milhões de hectares no mundo,em 2007.As informações disponíveis indicamclaramente que as condições para evoluçãoda resistência contra as toxinasde B. thuringiensis existem, ou seja, aspopulações apresentam genes para resistência(mesmo que em freqüênciabaixa) e a pressão de seleção aumentaanualmente.Cientes desta situação os profissionaisda área de manejo e controle depragas colocaram em prática o que chamamosde manejo da resistência, istoé, um conjunto de procedimentos quetem por objetivo retardar ao máximo osurgimento de populações resistentesem campo.1.5 Manejo da Evoluçãoda ResistênciaUma população se torna resistentequando a maioria dos insetos susceptíveisao método de controle utilizado foiremovida. A maior taxa de cruzamentosentre insetos portadores do genepara resistência tornará o controle maisdifícil a cada geração.No intuito de eliminar ou retardar oaumento na freqüência dos genes pararesistência às toxinas de B. thuringiensisem populações de insetos-alvo, foramdesenvolvidas várias estratégias demanejo da evolução da resistência. Afinalidade destas estratégias é reduzir apressão de seleção, diminuindo a velocidadede crescimento da população deinsetos resistentes.A estratégia mais utilizada no manejoda resistência é denominada dealtas doses/refúgio estruturado e fundamenta-seem modelos teóricos e testesexperimentais realizados em pequenaescala (Georghiou & Taylor, 1977;1999; Gould, 1998; Peck et al., 1999;Caprio, 2001, Onstad et al., 2002; Liu &Tabashnik, 1997; Shelton et al., 2000;Wenes et al., 2006).As premissas dessa estratégia são:(i) o gene para resistência ocorre emfreqüência baixa nas populações;(ii) as quantidades de toxinas de B.thuringiensis produzidas pelas plantassão altas o suficiente para eliminaçãoda população os insetos homozigotosnão resistentes e os heterozigotos resistentes;(iii) os indivíduos resistentes (homozigotos)que nascem nas áreas complantas-Bt cruzam aleatoriamente comos indivíduos não resistentes que nascemnas áreas dos refúgios.No manejo da resistência, o refúgioé a área na qual não são cultivadas plantas-Bte sua finalidade é manter na populaçãoindivíduos susceptíveis às toxinasde B. thuringiensis, ou seja, aquelesque não possuem genes para a resistência.Sua contribuição é a produçãode insetos adultos susceptíveis àstoxinas de B. thuringiensis para cruzaremcom insetos homozigotos resistentes,“diluindo”, dessa forma, a resistênciana população. A dispersão para foradas áreas dos refúgios é necessária paraque os cruzamentos aconteçam.As dimensões e a distribuição dasáreas de refúgio são definidas com baseem estudos teóricos e experimentos decampo podendo variar de acordo coma cultura ou praga em questão. A áreados refúgios para milho-Bt varia entre20 e 50%; simulações de computadorindicam que áreas menores podem acelerara evolução da resistência. Para algodão-Bt,por outro lado, recomendaseque 5 a 20% da área de plantio sejadestinada ao refúgio (Technology UseGuide, 2007-2008).São fatores relevantes na definiçãoda área de refúgio: a capacidade de dispersãoda praga, sua biologia reprodutivae seus hábitos alimentares. A distribuiçãodos refúgios também procurareduzir a possibilidade de cruzamentosentre indivíduos homozigotos para ogene da resistência (Peck et al., 1999;Caprio, 2001; Ives & Andow, 2002; Vacheret al., 2006; Tyutyunov et al., 2007;2008; Hanur, 2008).A expressão “doses altas” significaque as plantas vão produzir quantidadesdas toxinas de B. thuringiensis suficientespara eliminar da população osindivíduos que possuem uma única cópiado gene para resistência, ou seja,os heterozigotos. Por definição, “dosealta”, é aquela suficiente para matar maisdo que 95% dos insetos heterozigotos(Georghious & Taylor, 1977; Roush,1994; Gould, 1998).Essa estratégia torna a resistênciauma característica funcionalmenterecessiva, uma vez que apenas osportadores de duas cópias do genesobrevivem às doses de toxina produzidapelas plantas-Bt (Tabashnik& Croft, 1982). Nas áreas com plantas-Btsobreviverão apenas os rarosportadores de duas cópias do genepara resistência, ou seja, os homozigotosrecessivos. Os cruzamentosaleatórios entre os raros indivíduosresistentes nas áreas com plantas-Bt e os indivíduos não resistentesdos refúgios, produziria indivíduossusceptíveis que seriam eliminadosquando se alimentassem de plantas-Bt (Gould, 1998; Vacher et al., 2006).Na teoria, a estratégia “altas doses/refúgiosestruturados” funcionamuito bem, ou seja, dentro das premissasela realmente reduz a velocidadede aumento na freqüência dogene para a resistência nas populaçõesaumentando, com isso, o tempode uso das plantas-Bt. O mundoreal, porém, tem diversas maneirasde se desviar das aceitações do modelo.Estudos sobre o padrão de herançada resistência indicam queoutros mecanismos genéticos podemocorrer, como por exemplo, dominânciae herança poligênica (Heckelet al., 2007). Além disso, os cruzamentospodem não ocorrer aleatoriamente;para isso, basta que existamdiferenças na velocidade de desenvolvimentoentre indivíduos resistentese susceptíveis. A assincroniano desenvolvimento pode determinaruma freqüência maior decruzamentos entre indivíduos resistentes,o que pode acelerar a evoluçãoda resistência (LIU et al., 2000;Medvinsky et al., 2007).1.6 ConsideraçõesA espécie humana, não tem muitasrespostas para explicar como avida surgiu no planeta Terra, masao longo do tempo fez muitas descobertassobre as forças envolvidasno processo de evolução da biodiversidadee nas mudanças adaptativasnas diferentes linhagens de organismos.A evolução é um processo complexo,influenciado pela mutação,seleção natural, fluxo gênico, deri-<strong>Biotecnologia</strong> Ciência & <strong>Desenvolvimento</strong> - nº <strong>38</strong> 71
va genética e sistema de cruzamentos.As interações entre estes fatoressão complexas e de difícil compreensão.A construção de modelos parasimular o efeito destes fatores permiteanalisar parcialmente estas interações.Atualmente em muitos casostemos respostas relativamente precisasde como as coisas aconteceram,por exemplo, sobre a evolução da resistênciaaos inseticidas e/ou antibióticos.Podemos fazer muitas previsões,porém estas estão envolvidas nummundo de incertezas, determinadaspela presença do acaso ou das interaçõesque nossos modelos não podemestimar, pois são uma simplificaçãodo mundo real.Muitos pesquisadores acreditamque o surgimento de linhagens resistentesa agentes de controle químicoe/ou biológico em populações naturaisnão é uma questão de “se” vaiacontecer, mas sim, “quando” iráocorrer. Estas preocupações são válidastambém para as plantas-Bt (Wrightet al., 1997; Gould, 1998; Tabashnik& Carriére, 2004, Tabashnik et al.,2004 e 2008; Bourguet et al., 2005).Quando analisamos um fenômenobiológico do ponto de vista da teoriada evolução, as unidades de tempodevem ser pensadas em perspectivasdiferentes; estas envolvem geraçõesque se sucedem ao longo dotempo. As unidades de tempo envolvemperíodos maiores do que aquelesque usamos para datar a históriada civilização, ou seja, 50 ou mesmo100 anos, podem ser pouco relevantes.As constantes pesquisas por novastoxinas e/ou a produção de plantascom capacidade de expressar maisdo que uma toxina é um indicativode nossa consciência de que as plantas-Btcultivadas atualmente podemser sucessos temporários.No momento, nossa melhor alternativaé continuar aplicando as estratégiasde manejo da evolução daresistência e aprimorar as pesquisaspor novos métodos para reduzir osimpactos das pragas sobre a produçãode alimentos.Devemos ter em mente, porém,que essa relação evolutiva só poderáterminar com a extinção de um dosenvolvidos, mas dada à dinâmica doprocesso evolutivo, podemos afirmarque novas relações irão surgir.1.7 ReferênciasAdamczyk, J.; Holloway, J.W.; Leonard,B.R. & Graves, J.B. 1997. Susceptibilityof fall armyworm collectedfrom different plant host to selectedinsecticides and transgenic Btcotton. 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