Laranja TRANSGÃNICA - Biotecnologia

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Esse peptídeo possui 39 aminoácidos epertence ao grupo das cecropinas. Emestudos in vitro, a sarcotoxina mostrou-sealtamente eficiente na inibiçãodo crescimento de algumas bactériascausadoras de doenças em plantas,especialmente para X. axonopodis pv.citri (Ohshima et al., 1999).A expressão da sarcotoxina em plantasde tabaco sob controle de umpromotor constitutivo aumentou a resistênciaa duas bactérias fitopatogênicas:P. syringae pv. tabaci e E. carotovorasubsp. carotovora (Ohshima etal., 1999). Também, plantas de tabacotransformadas com o gene da sarcotoxinasob o controle de um promotorinduzido por ácido salicílico (PR1a)apresentaram um aumento na resistênciatanto a bactérias fitopatogênicascomo a fungos Rhizoctonia solani ePythium aphanidermatum (Mitsuharaet al., 2000).Apesar de ainda serem necessáriosmais estudos sobre a segurança alimentarda sarcotoxina, resultados recentesmostram que a sarcotoxina tempouca ação sobre microrganismos benéficosque fazem parte da flora intestinalhumana (Mitsuhara et al., 2001).Transformação de citroscom o gene da sarcotoxinaFigura 6. Plantas inoculadas com isolado de X. axonopodis pv. citri (10 4cfu/ml) após 26 dias. Planta não transgênica utilizada como controle (esquerda)e planta transgênica expressando sarcotoxina (direita)A obtenção de plantas transgênicasde laranja doce de cultivares plantadosno Brasil com o gene da sarcotoxina éuma estratégia muito promissora paraaumentar a tolerância à bactéria docancro cítrico. Assim, foram realizadostrabalhos de transformação de plantasde laranja com o gene da sarcotoxinano Labotatório de Biotecnologia Vegetaldo IAPAR. O plasmídeo utilizadopara transformação (pST10) contém ogene da sarcotoxina (stx IA) ligado aum peptídeo sinal que tem a função deexportar o peptídeo para o espaçointercelular sob controle do promotorconstitutivo 35S, do vírus do mosaicoda couve-flor e o gene da neomicinafosfotransferase (npt II), que confereresistência ao antibiótico canamicina(Figura 3). Esse plasmídeo foi cedidoao IAPAR através de um convêniocientífico com o Instituto Nacional deRecursos Agrobiológicos (NIAR, Japão).A metodologia de transformaçãode laranja usou a estirpe EHA-105 deAgrobacterium tumefaciens como vetorpara inserção do gene da sarcotoxina.Um aspecto inovador da metodologiaé a utilização de segmentos finos dematerial vegetal maduro para a transformação,o que reduz em, pelo menos,cinco anos o início de produção eavaliação das plantas transgênicas. Emexperimentos preliminares, plantas delaranja Pêra regeneradas a partir detecido maduro floresceram após 12meses em casa de vegetação.Internódios de mudas de laranjaPêra mantidas em casa de vegetaçãoforam utilizados como explantes iniciais.Esses internódios foram desinfestados,cortados transversalmente em segmentosde 1-2 mm e imersos em meiocontendo Agrobacterium. Os explantesforam então co-cultivados por 72horas e transferidos para meio de induçãode gemas com 200 mg/l cefotaxima,200 mg/l timetina e 25 mg/l canamicina.Após três semanas no escuro,os segmentos que apresentavam gemasforam transferidos para meio dealongamento ainda com a presença deantibióticos. Após 3-4 semanas no meiode alongamento, as gemas regeneradasmaiores que 1 mm foram microenxertadasem plântulas de Carrizo citrangegerminadas in vitro. Quando osenxertos apresentavam de 3 a 4 folhas,pequenos segmentos de tecido foliarforam utilizados para detecção da presençado gene da sarcotoxina atravésde PCR. Enxertos apresentando a bandacorrespondente ao gene da sarcotoxina(Figura 4) foram então transplantadosdiretamente em solo ounovamente enxertados em plantas delimão cravo em casa de vegetação(Figura 5).Foram obtidos diversos eventos delaranja Pêra transgênica contendo ogene da sarcotoxina. As plantas transgênicasforam clonadas através deenxertia em porta-enxertos de limãocravo para serem inoculadas com acepa 306 da bactéria de X. axonopodispv citri.A inoculação das plantas transgênicascom a bactéria do cancro cítricoé feita pelo método de infiltração emfolhas novas utilizando-se seringas hipodérmicas.A avaliação da resistênciaé feita após três semanas através dacontagem de lesões por área foliar edo re-isolamento da bactéria.A análise de Western blot em folhasmostrou que há uma variação naexpressão da sarcotoxina nos diferenteseventos. Os resultados da inoculaçãodas plantas transgênicas com abactéria do cancro cítrico mostraramque as plantas apresentando maioresquantidades de sarcotoxina foram maisBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 23 - novembro/dezembro 2001 65
esistentes ao cancro cítrico (Figura 6).Considerações finaisO projeto para o desenvolvimentoda laranja transgênica foi iniciado em1999 e tem sido financiado pelo CNPq,através do programa RHAE, e pelaFundação Araucária (Governo do Estadodo Paraná). Deverão ser feitos ainda,estudos necessários para se conhecero efeito da introdução do gene dasarcotoxina nas plantas, na segurançaalimentar e o seu impacto no ambiente,antes que essa tecnologia possa serutilizada de maneira mais ampla. Agrande eficiência do protocolo de transformaçãode laranja desenvolvido tornapossível a inserção de novos genesque podem contribuir para minimizaroutros problemas da citricultura, taiscomo o ataque de pragas e a resistênciaa estresses abióticos.Além do Instituto Agronômico doParaná, através do Laboratório de Biotecnologia,outras instituições brasileirasque atuam no desenvolvimento deplantas transgênicas de laranja são: oCentro de Citricultura do Instituto Agronômicode Campinas (IAC), em Cordeirópolis(SP), a Escola Superior deAgricultura Luiz de Queiroz (ESALQ) eo Centro de Energia Nuclear (CENA),da USP, em Piracicaba (SP).Referências bibliográficasBespalhok F.; Kobayashi, A.K.; Pereira,L.F.P.; Hissano, Z. & Vieira, L.G.E.(2001) In vitro adventitious shootregeneration from sweet orange usingthin epicotyl sections. Crop BreedAppl Biotech 1:27-34.Boman, H.G. & Hultmark, D. (1987)Cell-free immunity in insects. AnnVer Microbiol 41:103-126.Bond, J.E. & Roose, M.L. 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