O vírus West Nile em Portugal - Faculdade de Medicina Veterinária ...
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RPCV (2006) 101 (557-558) 61-68<br />
REVISTA PORTUGUESA<br />
DE<br />
CIÊNCIAS VETERINÁRIAS<br />
O <strong>vírus</strong> <strong>West</strong> <strong>Nile</strong> <strong>em</strong> <strong>Portugal</strong> – estudos <strong>de</strong> vigilância epid<strong>em</strong>iológica<br />
<strong>West</strong> <strong>Nile</strong> virus in <strong>Portugal</strong> – epid<strong>em</strong>iological surveys<br />
Perpétua Formosinho* 1 , Maria Margarida Santos-Silva 1 , Ana Santos 1 , Pedro Melo 2 , Vítor Encarnação 3 ,<br />
Nuno Santos 3 , Telmo Nunes 4 , Ricardo Agrícola 5 , Maria Portas 5<br />
1 Centro <strong>de</strong> Estudos <strong>de</strong> Vectores e Doenças Infecciosas (CEVDI), Instituto Nacional <strong>de</strong> Saú<strong>de</strong> Dr. Ricardo Jorge (INSA), Águas <strong>de</strong> Moura, <strong>Portugal</strong><br />
2 Parque Florestal Monsanto, Câmara Municipal <strong>de</strong> Lisboa, <strong>Portugal</strong><br />
3 Instituto da Conservação da Natureza (ICN), Lisboa, <strong>Portugal</strong><br />
4 Centro <strong>de</strong> Investigação Interdisciplinar <strong>em</strong> Sanida<strong>de</strong> Animal - <strong>Faculda<strong>de</strong></strong> <strong>de</strong> <strong>Medicina</strong> <strong>Veterinária</strong> (CIISA-FMV-TULisbon), Lisboa, <strong>Portugal</strong><br />
5 Serviço Nacional Coudélico (SNC), Santarém /Lisboa, <strong>Portugal</strong><br />
Resumo: Entre 1999 e 2002 foram colhidas amostras <strong>de</strong> sangue<br />
<strong>em</strong> populações <strong>de</strong> aves e equinos, <strong>em</strong> <strong>Portugal</strong> Continental,<br />
tendo sido também capturados ixodí<strong>de</strong>os nos mesmos<br />
hospe<strong>de</strong>iros e na vegetação, com vista a <strong>de</strong>tectar a activida<strong>de</strong> do<br />
<strong>vírus</strong> <strong>West</strong> <strong>Nile</strong> (WN). Para a <strong>de</strong>tecção <strong>de</strong> anticorpos específicos<br />
contra o <strong>vírus</strong> WN recorreu-se às técnicas <strong>de</strong> Inibição <strong>de</strong><br />
H<strong>em</strong>aglutinação (IH) e Imunofluorescência Indirecta (IFI). Para<br />
confirmação dos soros positivos foram utilizadas as técnicas <strong>de</strong><br />
ELISA e Neutralização. A <strong>de</strong>tecção <strong>de</strong> RNA viral <strong>em</strong> ixodí<strong>de</strong>os,<br />
foi realizada pela técnica <strong>de</strong> RT-PCR, tendo sido também<br />
realizados ensaios <strong>de</strong> isolamento <strong>em</strong> animais e <strong>em</strong> células. Das<br />
134 aves analisadas, 11,9% apresentaram anticorpos anti-WN.<br />
A serologia efectuada <strong>em</strong> 91 amostras <strong>de</strong> soros <strong>de</strong> cavalos,<br />
d<strong>em</strong>onstraram três reacções positivas para o <strong>vírus</strong> <strong>West</strong> <strong>Nile</strong>,<br />
tendo sido registada uma prevalência <strong>de</strong> 3,3%. Nos 2153<br />
ixodí<strong>de</strong>os analisados não foi possível assinalar a presença <strong>de</strong><br />
arbo<strong>vírus</strong>. Os resultados nos hospe<strong>de</strong>iros sentinelas, não foram<br />
confirmados nas provas <strong>de</strong> neutralização, pelo que há a consi<strong>de</strong>rar<br />
a possibilida<strong>de</strong> <strong>de</strong> existir <strong>em</strong> circulação outro <strong>vírus</strong> pertencente<br />
ao género Flavivirus, tendo aves e equinos como hospe<strong>de</strong>iros no<br />
seu ciclo <strong>de</strong> transmissão. O conjunto <strong>de</strong> dados epid<strong>em</strong>iológicos<br />
obtidos durante este trabalho alerta para a ocorrência <strong>de</strong><br />
Flavi<strong>vírus</strong> <strong>em</strong> <strong>Portugal</strong>.<br />
Palavras-chave: Arbo<strong>vírus</strong>, Flavi<strong>vírus</strong>, <strong>vírus</strong> <strong>West</strong> <strong>Nile</strong>,<br />
vigilância epid<strong>em</strong>iológica.<br />
Summary: From 1999 to 2002 blood samples were collected<br />
from birds and horses, ticks were also collected from the same<br />
hosts and from vegetation to <strong>de</strong>tected the activity of <strong>West</strong> <strong>Nile</strong><br />
(WN) virus. Blood samples were tested by H<strong>em</strong>agglutination<br />
Inhibition (HI) and Immunofluorescence assay (IFA). ELISA<br />
and Neutralization techniques were used for the confirmation of<br />
host positive sera. For virus activity <strong>de</strong>tection ticks were<br />
screened by RT-PCR and isolation att<strong>em</strong>pts were ma<strong>de</strong> in<br />
animals and cells. Of 134 birds analyzed by HI, a seroprevalence<br />
of 11.9% were observed. Serologic studies by IFA performed<br />
on 91 horses serum samples had reveled three positives<br />
reactions to WN virus, confirmed by ELISA for IgG antibodies<br />
with a seroprevalence of 3.3%. From 2153 ticks studied no<br />
arbovirus were <strong>de</strong>tected. Due to the negative results by<br />
Neutralization Tests in sentinels hosts we can infer the possibility<br />
*Correspondência: pmnpformosinho@yahoo.com.br<br />
of circulation of another virus belonging to Flavivirus genus,<br />
where birds and horses are involved in their transmission cycles.<br />
The epid<strong>em</strong>iological data obtained during this study alert for the<br />
occurrence of Flavivirus in <strong>Portugal</strong>.<br />
Keywords: Arboviruses, Flaviviruses, <strong>West</strong> <strong>Nile</strong> virus, Epid<strong>em</strong>iological<br />
surveys.<br />
Introdução<br />
Os <strong>vírus</strong> transmitidos por artrópo<strong>de</strong>s, <strong>de</strong>signados<br />
arbo<strong>vírus</strong> são a causa <strong>de</strong> doenças infecciosas <strong>em</strong>ergentes<br />
que afectam o Hom<strong>em</strong> e os animais domésticos,<br />
consi<strong>de</strong>radas um probl<strong>em</strong>a <strong>de</strong> Saú<strong>de</strong> Pública actual.<br />
Estes <strong>vírus</strong> são transmitidos entre hospe<strong>de</strong>iros vertebrados<br />
susceptíveis por intermédio <strong>de</strong> artrópo<strong>de</strong>s vectores<br />
competentes. Os principais vectores das arboviroses<br />
são os mosquitos, as carraças, os flébotomos e os<br />
culicoi<strong>de</strong>s; sendo as aves e os roedores, os hospe<strong>de</strong>iros<br />
reservatórios vertebrados mais importantes. Nos hospe<strong>de</strong>iros<br />
tangenciais, como o Hom<strong>em</strong> e os animais<br />
domésticos, estes <strong>vírus</strong> causam infecções po<strong>de</strong>ndo<br />
resultar <strong>em</strong> casos <strong>de</strong> doença com morbilida<strong>de</strong> e mortalida<strong>de</strong><br />
significativa (Woodring et al., 1996).<br />
Os arbo<strong>vírus</strong> pertencentes à família Flaviviridae,<br />
aparentam ser os que têm maiores potencialida<strong>de</strong>s<br />
epid<strong>em</strong>iológicas <strong>em</strong> <strong>Portugal</strong>, quer pelos resultados<br />
obtidos dos estudos já efectuados (Filipe, 1971a;<br />
1971b; 1973; 1974; 1983; Filipe et al., 1973; Formosinho<br />
et al., 2002; Connel et al., 2004; Formosinho,<br />
2004) quer pela re<strong>em</strong>ergência nos últimos anos <strong>de</strong><br />
alguns <strong>de</strong>stes <strong>vírus</strong> <strong>em</strong> várias regiões <strong>de</strong> clima t<strong>em</strong>perado<br />
característico do nosso País. O <strong>vírus</strong> <strong>West</strong> <strong>Nile</strong> (género<br />
Flavivirus) é um dos últimos ex<strong>em</strong>plos <strong>de</strong> introdução<br />
<strong>de</strong> <strong>vírus</strong> exóticos <strong>em</strong> novas áreas, on<strong>de</strong> exist<strong>em</strong> hospe<strong>de</strong>iros<br />
e artrópo<strong>de</strong>s vectores susceptíveis. Este <strong>vírus</strong><br />
foi isolado pela primeira vez no Uganda (Smithburn et al.,<br />
1940). Na Europa é <strong>de</strong>scrito <strong>de</strong>s<strong>de</strong> os anos 60, sendo<br />
consi<strong>de</strong>rado a causa <strong>de</strong> arboviroses re-<strong>em</strong>ergentes <strong>de</strong>s<strong>de</strong><br />
61
Formosinho P et al.<br />
1996 com as epid<strong>em</strong>ias ocorridas na Roménia (Tsai et<br />
al., 1998), República Checa (Hubálek et al., 1998) e<br />
Rússia (Platonov et al., 2001). Em <strong>Portugal</strong> na passada<br />
década <strong>de</strong> 70, foram realizados diversos estudos epid<strong>em</strong>iológicos,<br />
nomeadamente no sul do País, que revelaram<br />
a presença <strong>de</strong> anticorpos contra o <strong>vírus</strong> <strong>West</strong> <strong>Nile</strong><br />
no Hom<strong>em</strong> e <strong>em</strong> populações animais, aves e cavalos<br />
(Filipe e Pinto, 1969; Filipe, 1971a; Filipe, 1973).<br />
Confirmando as evidências serológicas, foi efectuado o<br />
isolamento do <strong>vírus</strong> a partir <strong>de</strong> um pool <strong>de</strong> mosquitos<br />
colhidos na barrag<strong>em</strong> do Roxo, no Alentejo (Filipe,<br />
1971b). Em 1998 foi assinalado um segundo isolamento<br />
do <strong>vírus</strong> a partir da mesma espécie <strong>de</strong> mosquitos colhidos<br />
no estuário do Tejo (Fernan<strong>de</strong>s, 1998). Em 2002, a<br />
partir da colheita <strong>de</strong> mosquitos <strong>em</strong> várias regiões do<br />
País, não foi possível a <strong>de</strong>tecção <strong>de</strong> arbo<strong>vírus</strong> nestes<br />
artrópo<strong>de</strong>s (Galão et al., 2002). Mais recent<strong>em</strong>ente <strong>em</strong><br />
2004, foram <strong>de</strong>scritas evidências da activida<strong>de</strong> do <strong>vírus</strong><br />
WN na região do Algarve (Connel et al., 2004).<br />
Devido à presença enzoótica do <strong>vírus</strong> <strong>West</strong> <strong>Nile</strong> (WN)<br />
<strong>em</strong> quase todos os países da Bacia do Mediterrâneo e<br />
pelo facto <strong>de</strong> estarmos perante um arbo<strong>vírus</strong> que já<br />
<strong>de</strong>u evidências da sua presença <strong>em</strong> <strong>Portugal</strong>, parecendo<br />
possuir no nosso território todas as condições ecológicas<br />
necessárias à sua circulação e manutenção na<br />
Natureza, este foi o Flavi<strong>vírus</strong> sobre o qual incidiu o<br />
estudo aqui apresentado. No sentido <strong>de</strong> <strong>de</strong>finir estratégias<br />
para a prevenção das arboviroses no nosso País, foram<br />
consi<strong>de</strong>rados neste trabalho, estudos <strong>de</strong> vigilância epid<strong>em</strong>iológica<br />
com vista a <strong>de</strong>tectar a activida<strong>de</strong> do <strong>vírus</strong>,<br />
quer ao nível dos hospe<strong>de</strong>iros vertebrados, através da<br />
pesquisa <strong>de</strong> anticorpos específicos contra o <strong>vírus</strong> WN<br />
<strong>em</strong> populações <strong>de</strong> animais domésticos e silváticos,<br />
quer ao nível dos artrópo<strong>de</strong>s vectores, através da<br />
pesquisa <strong>de</strong> arbo<strong>vírus</strong> <strong>em</strong> espécies ixodológicas.<br />
Material e métodos<br />
Os estudos epid<strong>em</strong>iológicos <strong>de</strong>correram entre 1999 e<br />
2002 e foram efectuados <strong>em</strong> aves, equinos e ixodí<strong>de</strong>os.<br />
Colheita e local das amostragens<br />
Aves. Periodicamente, amostras <strong>de</strong> sangue e carraças<br />
foram colhidas <strong>de</strong> diferentes espécies <strong>de</strong> aves provenientes<br />
do Parque Nacional da Peneda-Gerês (PNPG)<br />
(41040’N, 7050’W), Parque Ecológico <strong>de</strong> Monsanto<br />
(PEM) (38044’N, 908’W), Reserva Natural <strong>de</strong> Santo<br />
André (RNSA) (38001’N, 8049’W), Parque Natural do<br />
Vale do Guadiana (PNVG) (37032’N, 7031’W) e Parque<br />
Natural da Ria Formosa (PNRF) (37001’N, 7048’W), <strong>em</strong> colaboração e <strong>de</strong> acordo com a metodologia seguida<br />
pelo Instituto da Conservação da Natureza (ICN)<br />
(CEMPA/ICN, 1995).<br />
Equinos. As amostras <strong>de</strong> sangue e ixodí<strong>de</strong>os foram<br />
obtidas a partir <strong>de</strong> diferentes populações <strong>de</strong> equinos<br />
provenientes dos Concelhos <strong>de</strong> Vieira do Minho, Tomar,<br />
62<br />
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Santarém, Queluz e Portalegre, <strong>em</strong> colaboração com a<br />
Cou<strong>de</strong>laria Nacional <strong>de</strong> Santarém, o Serviço Nacional<br />
Coudélico e a <strong>Faculda<strong>de</strong></strong> <strong>de</strong> <strong>Medicina</strong> <strong>Veterinária</strong> da<br />
Universida<strong>de</strong> Técnica <strong>de</strong> Lisboa.<br />
Ixodí<strong>de</strong>os. As saídas <strong>de</strong> campo, para colheita <strong>de</strong><br />
ixodí<strong>de</strong>os na vegetação, foram efectuadas <strong>em</strong> diferentes<br />
zonas abrangendo as regiões Norte, Centro e Sul do<br />
País, nomeadamente o PNPG, Parque Natural <strong>de</strong><br />
Montesinho (PNM) (41 0 47’N, 6 0 30’W), Parque Natural<br />
das Serras <strong>de</strong> Aire e Can<strong>de</strong>eiros (PNSAC) (39 0 59’N,<br />
9 0 29’W), Tapada Nacional <strong>de</strong> Mafra (TNM) (38 0 56’N,<br />
9 0 17’W), Parque Natural da Arrábida (PNA)<br />
(38 0 28’23’’N, 9 0 1’58’’W), Parque Natural da Serra <strong>de</strong><br />
São Mame<strong>de</strong> (PNSSM) (39 0 7’14’’N, 7 0 7’51’’W) e o<br />
PNVG. Para a captura dos ixodí<strong>de</strong>os foi utilizado o<br />
método do arrastamento da ban<strong>de</strong>ira ou "flagging"<br />
(Aeschlimann, 1972). Como critério <strong>de</strong> selecção das<br />
áreas pesquisadas por este método, consi<strong>de</strong>raram-se os<br />
trilhos <strong>de</strong> passag<strong>em</strong> <strong>de</strong> animais domésticos ou os locais<br />
<strong>de</strong> captura das aves. Os ixodí<strong>de</strong>os foram i<strong>de</strong>ntificados e<br />
separados <strong>em</strong> pools por espécie, sexo, fase evolutiva e<br />
estado <strong>de</strong> ingurgitação, <strong>de</strong> acordo com a metodologia<br />
<strong>de</strong>scrita por Silva et al. (2001). Os pools foram constituídos<br />
por 1 a 6 ex<strong>em</strong>plares adultos e por 10 e 100 ninfas<br />
e larvas, respectivamente. Todos os ixodí<strong>de</strong>os foram<br />
acondicionados <strong>em</strong> tubos contendo uma solução <strong>de</strong> tampão<br />
fosfato salino (PBS) estéril com 7,5% <strong>de</strong> bovoalbumina<br />
e 0,2% <strong>de</strong> antibiótico e armazenados a –70 0 C, até<br />
posterior utilização nos ensaios <strong>de</strong> isolamento e <strong>de</strong>tecção<br />
<strong>de</strong> Flavi<strong>vírus</strong>. Para os dois tipos <strong>de</strong> ensaios foram previamente<br />
realizados macerados <strong>de</strong> ixodí<strong>de</strong>os <strong>em</strong> almofariz<br />
gelado com azoto líquido. Cada macera-do foi ressuspendido<br />
<strong>em</strong> 1,5-2 ml <strong>de</strong> PBS estéril e centrifugado a<br />
800 g durante 10 minutos a 4 0 C. Recolheu-se o sobrenadante<br />
e esterilizou-se, por passag<strong>em</strong> <strong>em</strong> filtro <strong>de</strong> 0,45<br />
µm para tubos esterilizados, que foram armazenados a<br />
–70 0 C até ser<strong>em</strong> testados.<br />
Pesquisa <strong>de</strong> anticorpos anti - <strong>West</strong> <strong>Nile</strong> <strong>em</strong> aves e<br />
equinos<br />
Inibição <strong>de</strong> H<strong>em</strong>aglutinação. A pesquisa <strong>de</strong> anticorpos<br />
nas amostras <strong>de</strong> aves foi efectuada pela técnica <strong>de</strong><br />
Inibição <strong>de</strong> H<strong>em</strong>aglutinação (IH) <strong>de</strong> acordo com o método<br />
<strong>de</strong>scrito por Clarke e Casals (1958) e padronizada<br />
para o <strong>vírus</strong> WN (Formosinho, 2004). Para r<strong>em</strong>oção <strong>de</strong><br />
h<strong>em</strong>aglutininas e inibidores não específicos proce<strong>de</strong>u-se<br />
à precipitação com protamina sulfato e extracção com<br />
acetona a todas as amostras <strong>de</strong> soro. Foram utilizadas 4 U<br />
h<strong>em</strong>aglutinantes <strong>de</strong> antigénio produzido <strong>em</strong> rato para a<br />
estirpe Egypt 101 do <strong>vírus</strong> <strong>West</strong> <strong>Nile</strong> (Lote M28603),<br />
proveniente do laboratório <strong>de</strong> arbo<strong>vírus</strong> do "Center for<br />
Diseases Control and Prevention" (CDC), Fort Collins.<br />
O ensaio foi realizado à t<strong>em</strong>peratura ambiente e a pH 6,4.<br />
Foram usados, como controlo negativo, um antigénio <strong>de</strong><br />
referência (Lote VB2276940070L) e como controlo<br />
positivo, um soro anti-<strong>West</strong> <strong>Nile</strong> (<strong>West</strong> <strong>Nile</strong> Eg101-<br />
MHIAF, Lote M25494A). Os soros com resultado posi-
Formosinho P et al.<br />
tivo foram enviados para o laboratório <strong>de</strong> arbo<strong>vírus</strong> do<br />
CDC, para confirmação pela prova <strong>de</strong> neutralização.<br />
Imunofluorescência Indirecta. As amostras <strong>de</strong> cavalos<br />
para <strong>de</strong>tecção <strong>de</strong> anticorpos foram testadas pela técnica<br />
<strong>de</strong> Imunofluorescência Indirecta (IFI), tendo sido utilizados<br />
como controlo positivo soros policlonais<br />
provenientes <strong>de</strong> laboratórios <strong>de</strong> referência na área dos<br />
Arbo<strong>vírus</strong>, nomeadamente, "Centre National <strong>de</strong> Référence<br />
<strong>de</strong>s Arbo<strong>vírus</strong> et <strong>de</strong>s Fièvre Hémorragiques Virales" –<br />
Institut Pasteur e a "Ecole Nationale Vétérinaire <strong>de</strong><br />
Lyon", França. O procedimento técnico foi efectuado<br />
recorrendo a lâminas <strong>de</strong> antigénio preparadas com a<br />
estirpe Egypt 101 do <strong>vírus</strong> WN (Lote M-1007), proveniente<br />
dos stocks virais existentes no Centro <strong>de</strong> Estudos<br />
<strong>de</strong> Vectores e Doenças Infecciosas (CEVDI) (Formosinho,<br />
2004). Após fixação <strong>em</strong> acetona as lâminas<br />
foram incubadas à t<strong>em</strong>peratura ambiente durante 30 min<br />
com soros teste e soros controlo diluídos 1:16. Foram<br />
realizadas duas lavagens <strong>em</strong> PBS pH 7,2 e nova<br />
incubação com o conjugado fluoresceínado (Dako)<br />
com imunoglobulinas anti IgG <strong>de</strong> cavalo diluído 1:320.<br />
As lâminas foram observadas ao microscópio <strong>de</strong> fluorescência<br />
Olympus BH2 (ampl.10x40). Os soros com<br />
reacção positiva, foram enviados para o laboratório <strong>de</strong><br />
arbo<strong>vírus</strong> do Instituto Pasteur, Lyon, para confirmação<br />
pela técnica <strong>de</strong> ELISA e posterior neutralização.<br />
Pesquisa <strong>de</strong> <strong>vírus</strong> <strong>em</strong> ixodí<strong>de</strong>os<br />
RT-PCR. A técnica <strong>de</strong> RT-PCR ("Reverse Transcriptase<br />
– Polimerase Chain Reaction"), foi usada como<br />
método <strong>de</strong> <strong>de</strong>tecção dos <strong>vírus</strong> ou para confirmação <strong>de</strong><br />
resultados inconclusivos nas culturas celulares. Para<br />
extracção <strong>de</strong> RNA foi utilizado o "RNeasy Mini Kit"<br />
(Qiagen). O procedimento técnico foi efectuado <strong>de</strong><br />
acordo com as instruções do fabricante. Na técnica <strong>de</strong><br />
RT-PCR, foi utilizado o "Gene Amp RNA PCR Kit"<br />
(Perkin Elmer). Foram utilizados um par <strong>de</strong> primers<br />
para uma região <strong>de</strong> 655 bp do gene codificante para a<br />
proteína NS5 dos Flavi<strong>vírus</strong>, Flav 1 FU1 (TAC AAC<br />
ATG ATG GGA AAG AGA GAG AA) e Flav 2 cFD4<br />
(ACC ACA CAA TCA TCT CCG CT) (Kuno et al.,<br />
1998) e um par <strong>de</strong> primers para uma região <strong>de</strong> 258 pb<br />
do gene codificante para a proteína NS3, WN KP7<br />
(GCA GAG TGA TCG ACA GCC G) e KP81 (CCA<br />
CCA GAC CAT TCG GCA TG) (Porter et al., 1993).<br />
A etapa da transcrição reversa foi efectuada para um<br />
volume final <strong>de</strong> 20 µl contendo 25 mM MgCl2, 10X<br />
tampão PCR (KCL 500 mM, Tris HCL 100 mM pH<br />
8,3), 10 mM <strong>de</strong> cada <strong>de</strong>oxiribonucleótido trifosfatado<br />
(dGTP, dATP, dTTP, dCTP), 20 U <strong>de</strong> inibidor <strong>de</strong> RNase,<br />
50 U <strong>de</strong> transcriptase reversa MuLV e 15 µM <strong>de</strong><br />
primer reverso. A reacção <strong>de</strong> polimerização preparouse<br />
num volume final <strong>de</strong> 100 µl contendo 5 U <strong>de</strong> ADN<br />
polimerase AmpliTaq e 15 µM <strong>de</strong> primer directo. A<br />
transcrição e amplificação foram efectuadas <strong>em</strong> termociclador<br />
Biometra T3 programado para o seguinte<br />
esqu<strong>em</strong>a <strong>de</strong> amplificação: 15 min a 42 0C, 5 min a<br />
99 0C, 5 min a 5 0C, 105 seg a 95 0C, seguidos <strong>de</strong> 35<br />
ciclos com 15 seg a 95 0C, 30 seg a 49 0C, 2 min a 72 0C e uma fase <strong>de</strong> extensão final <strong>de</strong> 7 min a 72 0C. A análise<br />
dos produtos <strong>de</strong> PCR foi feita por electroforese <strong>em</strong> gel<br />
<strong>de</strong> agarose 1,5% (Roche) com tampão Tris acetato com<br />
EDTA contendo brometo <strong>de</strong> etí<strong>de</strong>o (10 mg/ml).<br />
Inoculação <strong>em</strong> células. Foram usadas células Vero E6<br />
<strong>em</strong> cultura, nas quais se inocularam 100 ml <strong>de</strong> cada<br />
suspensão por monocamada com 75% <strong>de</strong> células confluentes.<br />
Após incubação a 37 0C durante 1h, adicionaram-se<br />
a cada frasco <strong>de</strong> células infectadas, 10 ml <strong>de</strong><br />
meio <strong>de</strong> cultura "Minimum Essential Medium"<br />
(Gibco) com 2% <strong>de</strong> soro bovino fetal inactivado e<br />
0,1% <strong>de</strong> antibiótico. Colocaram-se os frascos <strong>de</strong> células<br />
a 37 0C, tendo sido feita a observação diária ao<br />
microscópio invertido Olympus CK2 para <strong>de</strong>tecção do<br />
efeito citopatogénico.<br />
Inoculação <strong>em</strong> animais. Inocularam-se intracerebralmente<br />
ratinhos Charles River recém-nascidos com 10 µl<br />
do inóculo utilizado no ensaio <strong>de</strong> inoculação <strong>em</strong> células.<br />
Foi feita a observação diária dos animais, durante 14<br />
dias, tendo sido recolhidos os que apresentaram sinais<br />
<strong>de</strong> doença. Nos que apresentavam sintomatologia suspeita<br />
foram efectuadas passagens sucessivas. Para todos<br />
os inóculos foram realizadas provas <strong>de</strong> esterilida<strong>de</strong> <strong>em</strong><br />
meios <strong>de</strong> cultura bacteriológicos. Todas as manipulações<br />
animais foram realizadas <strong>de</strong> acordo com o Guia<br />
<strong>de</strong> Manipulação e Cuidado <strong>de</strong> Animais <strong>de</strong> Laboratório<br />
(86/609/CEE).<br />
Resultados<br />
RPCV (2006) 101 (557-558) 61-68<br />
Pesquisa <strong>de</strong> anticorpos anti-WN<br />
Aves. Foram feitos ensaios serológicos a 134 aves pertencentes<br />
a 21 espécies. A prevalência <strong>de</strong> anticorpos<br />
para o <strong>vírus</strong> <strong>West</strong> <strong>Nile</strong> por IH foi <strong>de</strong> 11,9%, IC95%<br />
[7,5%; 18,5%], (16/134 aves). Foram <strong>de</strong>tectados anticorpos<br />
contra o <strong>vírus</strong> <strong>West</strong> <strong>Nile</strong> <strong>em</strong> Accipiter gentilis<br />
(Açor), Buteo buteo (Águia-d’ asa redonda), Bubo Bubo<br />
(Bufo-real), Ciconia ciconia (Cegonha), Circaetus gallicus<br />
(Águia-cobreira), Corvus corone (Corvo), Falco tinunculus<br />
(Peneireiro-dorso malhado), Gyps fulvus (Grifo), Strix<br />
aluco (Coruja do Mato) e Tyto alba (Coruja das Torres)<br />
(Quadro 1). Os seropositivos provieram do PNPG, da<br />
RNSA, PEM e do PNVG. A confirmação dos positivos<br />
pela prova <strong>de</strong> neutralização revelou um título<br />
Formosinho P et al.<br />
para o <strong>vírus</strong> <strong>West</strong> <strong>Nile</strong>, confirmada pela técnica <strong>de</strong><br />
ELISA para anticorpos IgG, tendo sido registada uma<br />
seroprevalência <strong>de</strong> 3,3%, IC95% [1,1%; 9,3%]. Como<br />
técnica <strong>de</strong> confirmação foi efectuada a prova <strong>de</strong> neutralização<br />
específica para o <strong>vírus</strong> <strong>West</strong> <strong>Nile</strong>, com o<br />
resultado <strong>de</strong> um título
Formosinho P et al.<br />
Ixodí<strong>de</strong>os colhidos <strong>em</strong> equinos. Todas as amostras <strong>de</strong><br />
espécies ixodológicas colhidas <strong>em</strong> equinos foram<br />
provenientes <strong>de</strong> Vieira do Minho a partir <strong>de</strong> uma raça<br />
selvag<strong>em</strong> – Garranos, sendo a espécie Rhipicephalus<br />
bursa a prevalente com 98% numa amostra total <strong>de</strong> 156<br />
ex<strong>em</strong>plares (Quadro 4). Todos os ex<strong>em</strong>plares foram<br />
examinados para <strong>de</strong>tecção <strong>de</strong> RNA e para ensaios <strong>de</strong><br />
isolamento <strong>de</strong> <strong>vírus</strong>, no entanto não foi possível quer a<br />
<strong>de</strong>tecção, quer o isolamento <strong>de</strong> estirpes virais.<br />
Quadro 3 - Ixodí<strong>de</strong>os capturados <strong>em</strong> aves e examinados <strong>em</strong> ensaios <strong>de</strong> <strong>de</strong>tecção e isolamento viral<br />
Espécies <strong>de</strong> aves Orig<strong>em</strong> a<br />
RPCV (2006) 101 (557-558) 61-68<br />
Ixodí<strong>de</strong>os colhidos na vegetação. A maioria das<br />
colheitas <strong>de</strong> ixodí<strong>de</strong>os foram efectuadas na vegetação.<br />
Dos 1267 ex<strong>em</strong>plares, não foram obtidos resultados<br />
positivos <strong>em</strong> relação à <strong>de</strong>tecção e isolamento <strong>de</strong><br />
Flavi<strong>vírus</strong> (Quadro 5). Desta forma foi colocada a<br />
hipótese do próprio macerado das carraças possuir<br />
inibidores conduzindo a falsos negativos. Assim<br />
sendo, foram seleccionados 10% dos macerados e<br />
diluídos com um controlo positivo proveniente do<br />
Ensaios c<br />
Espécie ixodí<strong>de</strong>os Pools b Flav d Arb f<br />
Alcedo atthis RNSA Hyalomma marginatum 7n - -<br />
1n - -<br />
Acrocephalus scirpaceus RNSA Hyalomma marginatum 1n - -<br />
Athene noctua PNVG Hyalomma marginatum 1n - -<br />
Bubo bubo PNVG Hyalomma marginatum 1n - -<br />
4n - -<br />
Hyalomma lusitanicum 1m - -<br />
Ixo<strong>de</strong>s canisuga 1n - -<br />
Rhipicephalus sanguineus 3m - -<br />
Rhipicephalus turanicus 1m - -<br />
1f - -<br />
Rhipicephalus pusillus 1f - -<br />
2f - -<br />
Buteo buteo PEM 1n - -<br />
PNPG Ixo<strong>de</strong>s frontalis<br />
Rhipicephalus sanguineus 1m - -<br />
1m - -<br />
Rhipicephalus turanicus 3f - -<br />
Buteo swainsonii ? Hyalomma marginatum 1n - -<br />
Luscinia megarhynchos PEM Hyalomma marginatum 1n - -<br />
Saxicola torquata RNSA Hyalomma marginatum 2n - -<br />
1n - -<br />
1n - -<br />
Tyto alba PNPG Ixo<strong>de</strong>s ventalloi 6n - -<br />
Total (24 aves) † 43 * 43 * 43 *<br />
a (RNSA) Reserva Natural <strong>de</strong> Santo André; (PNVG) Parque Natural do Vale do Guadiana; (PEM) Parque Ecológico <strong>de</strong> Monsanto; (PNPG) Parque<br />
Nacional da Peneda-Gerês; b (m) macho; (f) fêmea; n (ninfa); c (-) negativo; d ensaio <strong>de</strong> <strong>de</strong>tecção <strong>de</strong> flavi<strong>vírus</strong>; e ensaio <strong>de</strong> isolamento <strong>de</strong> arbo<strong>vírus</strong>; † distribuídas<br />
por 10 espécies; * distribuídas <strong>em</strong> 25 pools<br />
Quadro 4 - Colheitas <strong>de</strong> ixodí<strong>de</strong>os <strong>em</strong> equinos<br />
Hospe<strong>de</strong>iro Orig<strong>em</strong> Espécie ixodí<strong>de</strong>os Pools a Ensaios b<br />
Flav c Arb d<br />
Eqqus caballus Vieira do Minho Rhipicephalus bursa 62 m - -<br />
Hyalomma marginatum 91f - -<br />
2m - -<br />
1f - -<br />
Total (91 cavalos) 156 † 156 †<br />
a (m) macho; (f) fêmea; n (ninfa); b (-) negativo; c ensaio <strong>de</strong> <strong>de</strong>tecção <strong>de</strong> flavi<strong>vírus</strong>; d ensaio <strong>de</strong> isolamento <strong>de</strong> arbo<strong>vírus</strong>; † distribuídas por 20 pools<br />
65
Formosinho P et al.<br />
antigénio <strong>West</strong> <strong>Nile</strong> Eg 101 e processados novamente<br />
por RT-PCR com os primers WN KP7 e KP81. Foi<br />
observado produto amplificado com 250 pb correspon<strong>de</strong>ntes,<br />
eliminando <strong>de</strong>sta forma a possibilida<strong>de</strong> da presença<br />
<strong>de</strong> inibidores <strong>de</strong> reacção nas próprias amostras.<br />
Discussão<br />
Nos estudos serológicos, das populações <strong>de</strong> aves<br />
silváticas foram <strong>de</strong>tectados anticorpos anti-WN por IH,<br />
quer <strong>em</strong> aves migradoras, quer <strong>em</strong> aves resi<strong>de</strong>ntes e<br />
juvenis. Estes resultados corroboram outros trabalhos<br />
que <strong>de</strong>screv<strong>em</strong> evidências serológicas do <strong>vírus</strong> <strong>West</strong><br />
<strong>Nile</strong> <strong>em</strong> aves, no nosso País (Filipe, 1971a; 1979). A<br />
presença <strong>de</strong> anticorpos contra arbo<strong>vírus</strong> <strong>em</strong> aves<br />
silváticas adultas, indica somente a interacção <strong>vírus</strong> –<br />
hospe<strong>de</strong>iro, não explicando quando e on<strong>de</strong> a infecção<br />
ocorre, po<strong>de</strong>ndo esta ter sido contraída nos seus abrigos<br />
<strong>de</strong> Inverno durante o seu trajecto migratório. Contrariamente,<br />
os anticorpos <strong>de</strong>tectados nas aves juvenis,<br />
reflect<strong>em</strong> uma transmissão local <strong>de</strong>ste agente infeccioso.<br />
Contudo, a técnica <strong>de</strong> neutralização não confirmou<br />
os resultados da IH, po<strong>de</strong>ndo este facto ser interpretado<br />
como a presença <strong>de</strong> anticorpos heterólogos para<br />
Flavi<strong>vírus</strong>. Há que ter <strong>em</strong> conta o facto da prova <strong>de</strong> neutralização<br />
ter sido realizada com a estirpe NY99-4132<br />
(estirpe americana), o que po<strong>de</strong> ter interferido nos<br />
resultados <strong>em</strong> termos da especificida<strong>de</strong>, uma vez que<br />
esta estirpe já se revelou com características diferentes,<br />
nomeadamente ao nível da virulência (Centers for<br />
Disease Control and Prevention, 1999a; 1999b).<br />
Quadro 5 - Ixodí<strong>de</strong>os capturados na vegetação (n=1267)<br />
Local <strong>de</strong> Espécie N.º e estado Local <strong>de</strong> Espécie N.º e estado<br />
colheita evolutivo colheita evolutivo<br />
PNA D. marginatus 1 m / 3 f PNSSM R. bursa 1 m / 1 f<br />
H. lusitanicum 5 m / 5 f R. pusillus 1 f<br />
I. ricinus 8 m / 15 f / 12 n R. sanguineus 3 m / 4 f<br />
R. pusillus 4 m / 4 f R. turanicus 62 m / 81 f<br />
R. sanguineus 14 m / 37 f PNVG D. marginatus 1 f<br />
PNPG I. ricinus 1 f H. inermis 5 f<br />
R. bursa 18 m / 13 f H. lusitanicum 1 m / 8 f<br />
R. sanguineus 1 m / 1 f R. pusillus 1 m /1 f<br />
PNSAC H. lusitanicum 39 m/ 31 f R. sanguineus 14 m / 3 f<br />
R. pusillus 4 m / 7 f TNM D. marginatus 11 m / 17 f<br />
PNM D. marginatus 46 m / 62 f H. inermis 1 m<br />
D. reticulatus 1 m / 3 f H. punctata 24 m/ 16 f / 12 n<br />
PNSSM D. marginatus 29 m / 43 f H. lusitanicum 1 m / 1 f<br />
H. lusitanicum 2 m / 1 f H. marginatum 1 f<br />
H. marginatum 1 m I. ricinus 105 m / 91 f / 373 n<br />
H. punctata 2 m R. pusillus 5 m / 5 f<br />
I. ricinus 4 m<br />
Sub-total 1 417 Sub-total 2 850<br />
m - macho; f - fêmea; n - ninfa<br />
66<br />
RPCV (2006) 101 (557-558) 61-68<br />
Quanto aos estudos para <strong>de</strong>tecção do <strong>vírus</strong> <strong>West</strong> <strong>Nile</strong><br />
<strong>em</strong> populações <strong>de</strong> equinos as serologias positivas obtidas<br />
pela técnica <strong>de</strong> IFI, foram confirmadas por ELISA. No<br />
entanto, estes resultados não foram confirmados pela<br />
prova <strong>de</strong> neutralização específica para o <strong>vírus</strong> <strong>West</strong><br />
<strong>Nile</strong>, o que sugere a presença <strong>de</strong> outro Flavi<strong>vírus</strong><br />
provavelmente pertencente ao serogrupo das Encefalites<br />
Japonesas. Os dados obtidos revelam o contacto dos<br />
animais com estes agentes virais, não tendo sido possível<br />
a <strong>de</strong>terminação específica do <strong>vírus</strong> <strong>em</strong> causa. No<br />
entanto são <strong>de</strong> gran<strong>de</strong> importância, todos os dados obtidos<br />
acerca do papel dos cavalos na transmissão <strong>de</strong>stes<br />
<strong>vírus</strong>, uma vez que epid<strong>em</strong>ias nestes animais pod<strong>em</strong><br />
causar graves consequências económicas, sendo ex<strong>em</strong>plo<br />
a epizootia que ocorreu <strong>em</strong> França no ano 2000<br />
(Murgue et al., 2001; Durand et al., 2002).<br />
Quanto à prevalência <strong>de</strong> Flavi<strong>vírus</strong> <strong>em</strong> ixodí<strong>de</strong>os, não<br />
foi <strong>de</strong>tectada infecção por estes <strong>vírus</strong> no total das espécies<br />
examinadas. Contudo reveste-se <strong>de</strong> gran<strong>de</strong> importância<br />
o estudo nestes vectores, uma vez que estes artrópo<strong>de</strong>s<br />
têm sido <strong>de</strong>scritos como tendo um papel prepon<strong>de</strong>rante<br />
na sobrevivência dos Flavi<strong>vírus</strong> às condições ambientais<br />
do Inverno <strong>em</strong> regiões <strong>de</strong> clima t<strong>em</strong>perado (Schmidt et<br />
al., 1964 in Rosen, 1987; Germain et al., 1979 in<br />
Rosen, 1987).<br />
As possíveis hipóteses que pod<strong>em</strong> estar na explicação<br />
<strong>de</strong>stes resultados po<strong>de</strong>rão estar relacionadas, com o<br />
baixo nível <strong>de</strong> infecção que as carraças capturadas<br />
podiam ter, uma vez que estes <strong>vírus</strong> são mantidos na<br />
Natureza <strong>em</strong> pequenos microfocos com baixos níveis<br />
<strong>de</strong> virémia, pelo que a prevalência <strong>de</strong> infecção nas carraças<br />
é muito baixa (Sonenshine, 1993). Para o <strong>vírus</strong>
Formosinho P et al.<br />
TBE ("Tick-borne encephalitis") estão <strong>de</strong>scritos níveis<br />
<strong>de</strong> infecção inferiores a 0,01-0,1% (Korenberg, 1994).<br />
Este aspecto é <strong>de</strong> consi<strong>de</strong>rar especialmente nos ex<strong>em</strong>plares<br />
colhidos na vegetação, uma vez que quando<br />
ocorre o processo <strong>de</strong> alimentação no hospe<strong>de</strong>iro, os<br />
agentes infecciosos pod<strong>em</strong> reactivar a sua multiplicação.<br />
Neste sentido está <strong>de</strong>scrito que a alimentação das<br />
carraças <strong>em</strong> animais experimentais, para permitir a<br />
multiplicação do agente infeccioso e assim tornar mais<br />
fácil a sua <strong>de</strong>tecção (Telford et al., 1997). Esta abordag<strong>em</strong><br />
<strong>de</strong>verá ser consi<strong>de</strong>rada na continuação dos<br />
trabalhos <strong>de</strong> <strong>de</strong>tecção <strong>de</strong> Flavi<strong>vírus</strong> <strong>em</strong> ixodí<strong>de</strong>os, no<br />
sentido <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminar se a percentag<strong>em</strong> real <strong>de</strong> infecção<br />
supera ou não a observada durante este estudo. Por outro<br />
lado, <strong>de</strong>ve ter-se <strong>em</strong> linha <strong>de</strong> conta, que a prevalência <strong>de</strong><br />
Flavi<strong>vírus</strong> nas populações <strong>de</strong> ixodí<strong>de</strong>os estudadas po<strong>de</strong><br />
estar <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>nte do limite <strong>de</strong> sensibilida<strong>de</strong> das técnicas<br />
usadas para a investigação <strong>de</strong>stes <strong>vírus</strong>, quer no que diz<br />
respeito à própria técnica, quer na constituição da população<br />
amostral.<br />
O conjunto <strong>de</strong> dados epid<strong>em</strong>iológicos obtido durante<br />
este trabalho alerta para a ocorrência <strong>de</strong> Flavi<strong>vírus</strong> <strong>em</strong><br />
<strong>Portugal</strong> e apontam para várias hipóteses relativamente<br />
à circulação do <strong>vírus</strong> <strong>West</strong> <strong>Nile</strong>. O <strong>vírus</strong> po<strong>de</strong> ter-se<br />
mantido <strong>em</strong> activida<strong>de</strong> mas apenas limitado a pequenos<br />
focos naturais, uma vez que não exist<strong>em</strong> registos cont<strong>em</strong>porâneos<br />
<strong>de</strong> doença equina ou humana específica<br />
para este <strong>vírus</strong>, nas populações locais. Contudo, são<br />
gran<strong>de</strong>s as potencialida<strong>de</strong>s epid<strong>em</strong>iológicas <strong>de</strong>sta<br />
arbovirose <strong>em</strong> <strong>Portugal</strong>, dada a elevada afluência anual<br />
<strong>de</strong> aves migradoras, associada ao facto <strong>de</strong> vários potenciais<br />
vectores pertencer<strong>em</strong> à ixodofauna e culici<strong>de</strong>ofauna<br />
portuguesa, estando algumas das espécies referidas<br />
entre as mais comuns (Ribeiro et al., 1988; Santos-Silva<br />
et al., 2006; Caeiro, 1999). Por outro lado é <strong>de</strong> consi<strong>de</strong>rar<br />
a possibilida<strong>de</strong> da sua reintrodução anual <strong>em</strong> <strong>de</strong>terminados<br />
locais através das aves durante as suas rotas<br />
migratórias e a possível transmissão a vertebrados, através<br />
<strong>de</strong> espécies <strong>de</strong> vectores autóctones consi<strong>de</strong>rados<br />
vectores potenciais noutros países. No entanto, uma vez<br />
que os resultados nos hospe<strong>de</strong>iros sentinelas, como<br />
aves e equinos, não foram confirmados nas provas <strong>de</strong><br />
neutralização realizadas especificamente para o <strong>vírus</strong><br />
<strong>West</strong> <strong>Nile</strong>, é <strong>de</strong> consi<strong>de</strong>rar a possibilida<strong>de</strong> <strong>de</strong> existir <strong>em</strong><br />
circulação outro <strong>vírus</strong> pertencente ao género Flavivirus,<br />
associado também às aves e equinos como hospe<strong>de</strong>iros<br />
no seu ciclo <strong>de</strong> transmissão.<br />
Agra<strong>de</strong>cimentos<br />
Os autores agra<strong>de</strong>c<strong>em</strong> o apoio <strong>de</strong> todos os técnicos do<br />
ICN e Parques Naturais, cuja colaboração foi fundamental<br />
para a realização <strong>de</strong>ste trabalho. Agra<strong>de</strong>c<strong>em</strong>os ainda<br />
à Dr.ª Paula Tilley da FMV a sua colaboração no envio<br />
das amostras <strong>de</strong> equinos. Por último um agra<strong>de</strong>cimento<br />
ao Professor Armindo Filipe pelo seu papel no encaminhamento<br />
do trabalho <strong>de</strong>senvolvido.<br />
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