rezumat RO pt CD.pdf

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ
VETERINARĂ BUCUREŞTI
ŞCOALA DOCTORALĂ A FACULTĂŢII DE HORTICULTURĂ
TEZĂ DE DOCTORAT
Titlul: Obţinerea de biosurfactanţi şi
utilizarea lor în protecţia mediului şi a
culturilor horticole
(REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT)
Conducător ştiinţific:
Prof. univ.Dr. CÂMPEANU GHEORGHE
BUCUREŞTI
2011
Doctorand:
OLTEANU VIOLETA

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
REZUMATUL
tezei de doctorat cu titlul:
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului
şi a culturilor horticole
Lucrarea se bazează pe rezultatele obţinute în cadrul stagiului de pregătire a tezei de doctorat
în perioada 2006-2010 şi abordează o problemă de actualitate, şi anume obţinerea de biosurfactanţi
de la specii bacteriene izolate din medii contaminate cu hidrocarburi şi evidenţierea posibilelor
aplicaţii ale tulpinilor producătoare de biosufactanţi în protecţia culturilor horticole şi bioremediere.
Conţinutul tezei e structurat în două părţi extinse în şase capitole: Consideraţii teoretice asupra
obţinerii de biosurfactanţi şi rolul lor în protecţia plantelor şi în bioremediere, Cercetări proprii
privind izolarea din medii poluate, caracterizarea şi identificarea unor noi tulpini bacteriene din
genul Bacillus, Cercetări proprii privind testarea activităţii antifungice a tulpinilor bacteriene
selectate, Cercetări proprii privind producerea de biosurfactanţi de către tulpinile bacteriene
selectate, Cercetări proprii privind posibilele aplicaţii ale tulpinilor bacteriene producătoare de
biosurfactanţi, Concluzii generale.
În prima parte (Cap. I) sunt sintetizate principalele date bibliografice din literatura de
specialitate cu privire la obţinerea de biosurfactanţi de la diferite specii de microorganisme. S-a pus
accent pe rezultatele obţinute de specialiştii în domeniu în urma folosirii speciilor bacteriene din
genul Bacillus, care produc compuşi lipopeptidici cu activitate specifică de surfactanţi. Sunt
prezentate informaţii referitoare la clasificarea şi proprietăţile biosurfactanţilor, factorii care
influenţează producerea acestor compuşi, caracteristicile bacteriilor producătoare de lipopeptide din
genul Bacillus, precum şi aplicaţii ale tulpinilor bacteriene producătoare de biosurfactanţi în
bioremediere şi combaterea biologică a agenţilor patogeni specifici culturilor horticole. Această
parte constituie „Stadiul cunoaşterii problematicii abordate la nivel naţional şi internaţional”
Partea a doua (Cap. 2-6) este structurată în 5 capitole, în care sunt redate sistematic
cercetările proprii axate pe noi tulpini bacteriene din genul Bacillus şi prezentate în ordinea firească
a desfăşurării experimentelor: izolarea din medii poluate, caracterizarea şi identificarea noilor tulpini
din genul Bacillus, testarea activităţii antifungice concomitent cu producerea de biosurfactanţi de
1

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
către tulpinile bacteriene selectate şi evidenţierea posibilelor aplicaţii ale tulpinilor bacteriene
producătoare de biosurfactanţi. Sunt prezentate o serie de metode şi tehnici experimentale variate,
pornind de la tehnici clasice de microbiologie (izolare, cultivare şi păstrare a culturilor bacteriene
pure), de biochimie (teste de identificare a tulpinilor bacteriene, teste specifice privind screening-ul
tulpinilor bacteriene potenţial producătoare de biosurfactanţi, testarea supernatanţilor în vederea
evidenţierii compuşilor de tip biosurfactant şi separarea lor prin cromatografie în strat subţire), de
fitopatologie (testarea in vitro a activităţii inhibitoare a tulpinilor de microorganisme izolate şi a
compuşilor lipopeptidici produşi) şi ajungând la tehnici moderne de genetică şi biologie moleculară
bazate pe analiza ADN-ului, pentru caracterizarea noilor izolate bacteriene. În capitolul şase sunt
formulate concluziile, având ca bază rezultatele obţinute pe parcursul derulării experimentelor.
Lucrarea este ilustrată cu un număr de 69 figuri (poze, grafice), 26 tabele şi se bazează pe studiul a
133 lucrări bibliografice.
O parte din experimente s-au realizat prin participarea la proiectul de cercetare-dezvoltare
CNCSIS PN II IDEI-Cercetări privind activitatea unor compuşi biologici cu aplicaţii în protecţia
ecosistemelor agricole-Med_Lab (director de proiect conf. dr. Irina Grebenişan).
Studiile pentru identificarea microorganismelor şi obţinerea biosurfactanţilor s-au realizat în
Laboratorul de Ştiinţele Mediului al Facultăţii de Îmbunătăţiri Funciare şi Ingineria Mediului.
Tehnicile moleculare pentru identificarea tulpinilor bacteriene izolate şi identificarea tulpinilor
producătoare de iturin A, precum şi testele pentru determinarea activităţii antifungice a tulpinilor
bacteriene izolate şi a lipopeptidelor produse s-au realizat în Laboratorul de Genetică şi Inginerie
genetică din cadrul Facultăţii de Biotehnologii (prof. dr. Petruţa Călina Cornea). Tehnica PCR s-a
realizat în Laboratorul de Genetică (cercetător ştiinţific Matilda Ciucă), din cadrul Institutului de
Dezvoltare şi Cercetări Agricole, Fundulea.
INTRODUCERE
Un grup aparte de surfactanţi, intens studiaţi, cu aplicaţii în ramurile industriale, agricole,
medicale şi nu în ultimul rând în bioremediere, este reprezentat de biosurfactanţi. Biosurfactanţii
sunt grupaţi într-o clasă de molecule tensioactive (active la suprafaţă), diferite din punct de vedere
structural, care sunt sintetizate de microorganisme. Dezvoltarea cercetărilor din domeniul
biosurfactanţilor este foarte importantă, în principal, datorită preocupării actuale pentru protecţia
mediului. Aceste molecule reduc tensiunea superficială şi tensiunea la interfaţă atât în soluţiile
2

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
apoase cât şi în amestecul de hidrocarburi, ceea ce arată potenţialul lor în bioremediere. Ei intervin
în sporirea solubilităţii şi asimilării poluanţilor hidrofobi, determinând folosirea lor în biodegradare,
în sporirea recuperării ţiţeiului (MEOR - Microbial Enhanced Oil Recovery) şi în procesele de
de-emulsifiere. Surfactanţii de origine microbiană au mai multe avantaje decât surfactanţii chimici
datorită capacităţii lor de a se biodegrada, toxicităţii scăzute şi datorită faptului că au eficacitate la
valori extreme de temperatură, pH şi salinitate (Singh şi Cameotra, 2004). Deoarece biosurfactanţii
sunt direct biodegradabili şi pot fi produşi în cantităţi mari de către microorganisme şi astfel nu sunt
dependenţi de produşii derivaţi din ţiţei, ei pot înlocui foarte bine surfactanţii sintetici tradiţionali
(Sarubo şi colab., 2006; Singh şi Cameotra, 2004; Desai şi Banat, 1997). Se poate spune că aceste
substanţe au o compatibilitate mult mai bună cu mediul decât surfactanţii chimici, şi pentru că
biosurfactanţii nu sunt toxici pentru mediul natural şi au o capacitate ridicată de biodegradare, ei
intră în categoria substanţelor „prietenoase cu mediul”. Pot fi utilizaţi ca emulsifianţi,
de-emulsifianţi, agenţi de înmuiere, agenţi de dispersare, agenţi de spumare, ingredienţi alimentari
activi şi detergenţi, cu utilizări în diferite sectoare cum ar fi: petrol şi petrochimie, chimie organică
şi formularea lubrifianţilor, industria alimentară şi a băuturilor, cosmetică şi obţinerea detergenţilor,
industria farmaceutică, industria minieră şi metalurgică, agrochimie şi formularea pesticidelor,
protecţia şi managementul mediului (recuperarea ţiţeiului, favorizarea eliminării din solurile
contaminate a unor metale grele, etc.).
Un alt avantaj al surfactanţilor microbieni constă în capacitatea acestora de a fi sintetizaţi pe
substraturi din mai multe materii prime ieftine, de exemplu deşeuri rezultate din diferite tehnologii
industriale, agricole şi din industria alimentară, în felul acesta scăzând costul de producţie. Chiar
dacă interesul pentru biosurfactanţi este în creştere, aceşti compuşi nu pot concura din punct de
vedere economic cu surfactanţii sintetici (Moussa şi colab., 2006). Succesul producerii de
biosurfactanţi depinde de dezvoltarea procedeelor ieftine şi de folosirea materiilor prime ieftine care
să justifice 10-30% din costul total al procesului tehnologic (Sarubbo şi colab., 2006). În literatura
de specialitate se arată că o gamă largă de surse de carbon inclusiv resursele refolosibile din
agricultură sunt potrivite pentru obţinerea de biosurfactanţi, fără efecte nocive din punct de vedere
ecologic şi cu cele mai bune proprietăţi în funcţie de domeniile de aplicaţie. Producţiile optime de
agenţi tensioactivi sunt obţinute când se folosesc ca substrat carbohidraţii şi uleiurile vegetale.
Biosurfactanţii sunt compuşi amfifilici produşi la nivelul suprafeţelor celulelor microbiene
sau sunt excretate extracelular, conţin jumătăţi hidrofobe şi hidrofile şi reduc tensiunea superficială
şi tensiunile interfeţe, având proprietăţi de emulsionare. Biosurfactanţii pot avea una din următoarele
3

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
structuri: glicolipide, peptide, acizi graşi, fosfolipide, acid mycolic, antibiotice, combinaţiile
complexe polizaharide-lipide, lipoproteine, lipopeptide sau însăşi suprafaţa celulei microbiene. Deşi
tipul şi cantitatea de surfactanţi microbieni depinde, în primul rând de organismul producător, factori
precum sursele de carbon, sursele de azot, microelementele, temperatura, pH-ul, gradul de aerare,
pot de asemenea influenţa producerea biosurfactanţilor de către microorganisme (Desai şi Banat,
1997). Aceşti biosurfactanţi sunt produşi de numeroase specii de bacterii, levuri şi fungi filamentoşi
care utilizează o varietate mare de compuşi organici ca sursă de carbon şi energie pentru creşterea
lor.
Deşi mulţi biosurfactanţi sunt consideraţi metaboliţi secundari, câţiva pot avea un rol esenţial
în supravieţuirea microorganismelor producătoare de biosurfactant, favorizând transportul
nutrienţilor, interacţiunile microorganism-gazdă sau inhibarea creşterii unor organisme patogene,
ceea ce explică folosirea acestor substanţe în agricultură, pentru combaterea unor agenţi
fitopatogeni. De asemenea, aceştia determină biodisponibilitatea substraturilor insolubile în apă,
legarea de metale grele, intervin în procesul quorum sensing specific microorganismelor şi în
formarea biofilmelor (Rodrigues şi colab., 2006). Biosurfactanţii prezintă şi activităţi
antimicrobiene, cu acţiune antibacteriană, antifungică şi antivirală. Multe lucrări referitoare la
aplicaţiile biosurfactanţilor au fost focalizate pe folosirea lor în agricultură şi pentru combaterea
poluării mediului, datorită diversităţii lor, acţiunii prietenoase cu mediul, posibilităţii de a fi produşi
pe scară largă şi datorită eficacităţii lor la temperaturi extreme şi valori diferite de pH (Rodrigues şi
colab., 2006). Astfel că biosurfactanţii pot fi folosiţi pentru combaterea unor boli produse de diferiţi
agenţi patogeni (în special bacterii şi fungi) şi fac parte din metodele alternative de combatere a unor
agenţi care produc pagube mari în diferite zone agricole din lume, metode de combatere biologică
care câştigă tot mai mult teren, datorită în principal preocupării actuale pentru protecţia mediului.
OBIECTIVELE CERCETĂRILOR EFECTUATE
Datorită potenţialului aplicativ foarte mare al bacteriilor din genul Bacillus, posibilitatea
cultivării la scară industrială a acestor microorganisme şi obţinerea unor cantităţi suficiente de
biosurfactanţi constituie una dintre principalele preocupări ale cercetătorilor la nivel internaţional.
Lucrarea de faţă şi-a propus izolarea şi identificarea unor noi tulpini bacteriene din genul
Bacillus potenţial producătoare de biosurfactanţi, obţinerea compuşilor tensioactivi în condiţii
optime de cultivare a izolatelor bacteriene selectate şi studierea posibilelor aplicaţii atât ale tulpinilor
4

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
bacteriene selectate cât şi a compuşilor cu activitate de surfactant punându-se accent, în special, pe
activitatea antifungică.
În acest scop principalele obiective urmărite au fost:
1. Izolarea şi caracterizarea unor noi tulpini bacteriene capabile să producă biosurfactanţi.
Pentru aceasta au fost utilizate probe de sol contaminat cu hidrocarburi şi ape reziduale din
diferite locaţii, din care au fost izolate diverse tulpini bacteriene, precum şi metode specifice
de evidenţiere a producerii de compuşi tensioactivi. Cercetările au fost orientate în vederea
stabilirii condiţiilor optime de producere a biosurfactanţilor bacterieni.
2. Stabilirea unor metode eficiente de identificare a noilor izolate bacteriene prin realizarea
unei abordări polifazice, ce a presupus o combinare a unor metode microbiologice clasice, cu
metode moderne, inclusiv moleculare.
3. Evidenţierea capacităţii tulpinilor bacteriene selectate şi a biosurfactanţilor sintetizaţi de
acestea de a inhiba fungi fitopatogeni precum şi de a reduce nivelul unor hidrocarburi
poluante.
4. Testarea in vitro a unor posibile aplicaţii ale tulpinilor bacteriene selectate, în condiţiile
evidenţierii inocuităţii acestora.
CERCETĂRI PROPRII
Capitolul II: Cercetări proprii privind izolarea din medii poluate, caracterizarea şi
identificarea unor noi tulpini bacteriene din genul Bacillus
Cercetările care au făcut obiectul acestui capitol au fost abordate în vederea:
1. Izolării şi caracterizării unor tulpini bacteriene capabile să producă biosurfactanţi;
2. Stabilirii unor metode eficiente de identificare a noilor izolate bacteriene printr-o abordare
polifazică, ce presupune o combinare a metodelor microbiologice clasice, cu metode
moderne, inclusiv moleculare.
Recoltarea probelor pentru izolarea microorganismelor producătoare de biosurfactanţi s-a
realizat în perioada 15-17 iulie 2007. Prin izolarea bacteriilor din diverse surse naturale poluate s-au
obţinut un număr total de 80 colonii bacteriene, care au fost testate pe mediu ce conţine ulei uzat.
Izolarea tulpinilor bacteriene şi obţinerea culturilor pure s-au realizat prin metode
bacteriologice clasice. Pentru izolarea tulpinilor bacteriene s-au folosit mediile de cultură
Luria-Bertani şi geloză. Selectarea tulpinilor bacteriene potenţial producătoare de biosurfactanţi s-a
5

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
făcut prin cultivarea coloniilor bacteriene izolate din sol şi apă în mediul MSM cu zaharoză (Wilson
şi Zajic, 1985) şi în mediul MSM în care zaharoza a fost înlocuită cu ulei uzat 3%. La sfârşitul
perioadei de incubare de 7 zile la 28 0 C, s-a examinat intensitatea creşterii bacteriilor, aspectul
peliculei de ţiţei şi formarea de emulsii, acestea fiind principalele efecte prin care s-ar demonstra că
bacteriile testate ar produce substanţe tensioactive ce permit formarea de emulsii stabile. Dintre
noile izolate bacteriene, doar 28 au fost capabile de a forma emulsii în mediul testat. Studiile s-au
concentrat asupra bacteriilor Gram-pozitive, aparţinând genului Bacillus, scopul nostru fiind de a
identifica noi tulpini bacteriene capabile de a produce compuşi tensioactivi şi să fie sigure pentru
mediu şi sănătatea omului. De aceea, din cele 80 noi izolate au fost selectate 18 tulpini
Gram-pozitive, dintre care doar 10 au manifestat capacitatea de a produce biosurfactanţi.
Pentru a limita şi mai mult numărul de tulpini bacteriene care să fie utilizate în experimentele
ulterioare, cele 10 izolate au fost testate şi în privinţa activităţii antagoniste faţă de fitopatogenul
Alternaria tenuis, evidenţiindu-se faptul că doar două tulpini au prezentat o activitate inhibitoare
foarte clară. Aceste tulpini au fost notate B1 (tulpină izolată din sol poluat cu hidrocarburi) şi B2
(tulpină izolată din sol, din zona Techirghiol), ele fiind utilizate în experimente de identificare şi
caracterizare a proprietăţilor utile.
Pentru studii comparative, mai ales în privinţa identificării, s-a utilizat şi o tulpină de bacili
Gram-negativi, izolată din apă de mare, capabilă de a produce substanţe tensioactive. Această
tulpină, pe baza unor teste preliminare de identificare, a fost identificată ca aparţinând genului
Pseudomonas. Identificarea izolatelor bacteriene s-a făcut prin utilizarea unei abordări polifazice,
pornind de la metode microbiologice clasice până la tehnici moleculare, moderne:
1. Evidenţierea particularităţilor bacteriilor izolate şi dezvoltate pe medii solide, de geloză, prin
coloraţia Gram;
2. Identificarea tulpinilor bacteriene prin utilizarea sistemului BIOLOG, bazat pe reacţii
chimice metabolice de reducere a tetrazoliului, folosind microplăcile Biolog GP2 şi GN2,
pentru bacterii Gram-pozitive şi respectiv, Gram-negative;
3. Analizarea comunităţilor microbiene din probele naturale de sol şi apă prin tehnica FISH, o
tehnică moleculară de hibridizare in situ.
4. Caracterizarea noilor izolate bacteriene prin tehnici moleculare bazate pe:
Izolarea ADN-ului cromozomal bacterian prin folosirea kitului Wizard Genomic DNA
Purification Promega şi prin metoda Hopwood şi colab. (1985) adaptată;
Verificarea electroforetică a ADN-ului în gel de agaroză;
6

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
Amplificarea ADN-ului bacterian prin tehnologia PCR (Polymerase Chain Reaction).
În urma folosirii microplăcilor Biolog GP2 s-a evidenţiat profilul fiziologic al tulpinilor
bacteriene B1 şi B2 şi s-a stabilit apartenenţa noilor izolate la genul Bacillus, specia B. subtilis,
probabilitatea de identificare fiind de 85% pentru ambele tulpini.
Analizarea probelor în vederea identificării tulpinilor prin tehnica FISH, s-a realizat la cele
două tulpini bacteriene Gram-pozitive izolate, B1 şi B2, şi la tulpina Gram-negativă,
Pseudomonas sp. Prin folosirea sondelor moleculare marcate fluorescent şi examinarea produşilor
de hibridizare la microscopul cu epifluorescenţă, s-au evidenţiat unele deosebiri între cele două
izolate aparţinând genului Bacillus şi a izolatului din genul Pseudomonas, dar nu au permis
identificarea speciilor cărora le aparţin izolatele testate.
Prin analize moleculare, ADN-ul genomic a fost utilizat în reacţii de amplificare distincte,
utilizând diferite tipuri de primeri, atât pentru tulpina Pseudomonas sp., cât şi pentru cele două
tulpini de Bacillus. Rezultatele obţinute arată că noul izolat de Pseudomonas aparţine speciei
Ps. aeruginosa şi că noile tulpini B1 şi B2 prezintă un comportament similar celui evidenţiat la
tulpina de referinţă B. subtilis ATCC 6633, ceea ce ar sugera că aparţin speciei B. subtilis.
Deşi în cercetările noastre am pornit de la o bază de date deja existentă în ceea ce priveşte
izolarea, identificarea şi caracterizarea micoorganismelor, am considerat necesară testarea metodelor
de identificare şi caracterizare, astfel încât rezultatele să fie comparabile cu cele obţinute pe plan
internaţional. Principalele contribuţii au fost axate pe două direcţii: (a) izolarea unor noi tulpini de
Bacillus din medii poluate cu hidrocarburi şi (b) o abordare polifazică pentru identificarea noilor
izolate bacteriene prin combinarea metodelor microbiologice clasice cu cele moleculare.
Capitolul III: Cercetări proprii privind testarea activităţii antifungice a tulpinilor bacteriene
selectate
Cercetările prezentate în acest capitol au avut ca obiectiv, evidenţierea capacităţii tulpinilor
bacteriene selectate de a inhiba fungi fitopatogeni in vitro şi in vivo (în condiţii de laborator). Pentru
analizarea eficacităţii tulpinilor de interes B1 şi B2 ca agenţi de combatere biologică au fost realizate
teste de apreciere a antagonismului faţă de fungii fitopatogeni. Scopul acestor experimente a fost de
a evidenţia dacă izolatele bacteriene luate în studiu sunt competitive.
Pentru testarea in vitro s-au folosit fungii fitopatogeni Alternaria tenuis, Fusarium
oxysporum var. lycopersici, Sclerotium bataticola, Rhizoctonia solani, Pythium spp., cultivaţi în
plăci Petri cu mediul PDA. Testarea s-a făcut prin inocularea tulpinilor în poziţii juxtapuse, în vase
7

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
Petri ce conţin mediu agarizat. Prin folosirea mai multor specii de fungi fitopatogeni, s-a examinat
spectrul de acţiune al celor două tulpini bacteriene selectate.
S-a constatat că ambele tulpini bacteriene nu au capacitatea de a inhiba creşterea fungilor din
speciile Sclerotium bataticola şi Rhizoctonia solani. Cu toate acestea s-a observat că, deşi în zona de
interacţiune directă dintre tulpinile bacteriene B1, B2 şi fungii din cele două specii menţionate nu
s-a format o zonă clară de inhibare, creşterea coloniei fungice a fost încetinită, marginile coloniei
fungice nedepăşind marginea coloniei bacteriene sau depăşind-o foarte puţin, ceea ce sugerează un
efect fungistatic al celor două izolate bacteriene.
Testarea in vivo s-a făcut după ce în prealabil tulpinile bacteriene au fost cultivate în mediu
de cultură lichid cu săruri minerale, pentru obţinerea biomasei bacteriene necesară tratamentului in
vivo. Prin cultivarea tulpinilor B1 şi B2 în mediu MSM, s-a remarcat că tulpina B2 a crescut mai
bine, cantitatea de biomasă fiind mai mare.
În acest experiment s-a urmărit activitatea antifungică faţă de Alternaria spp., tulpini fungice
izolate de pe fructele de ardei şi tomate, identificate ca Alternaria alternata (A. tenuis) şi respectiv
A. alternata f.sp. lycopersici. S-au ales trei variante experimentale, concretizate prin tratarea
seminţelor cu: (1) suspensie bacteriană din tulpinile B1 şi B2, (2) cu suspensie bacteriană şi
suspensie fungică de Alternaria alternata f.sp. lycopersici/Alternaria tenuis şi (3) numai cu
suspensie fungică.
S-a constatat că, atât la ardei cât şi la tomate, plantele tratate doar cu suspensiile bacteriene
au crescut viguros (varianta V1), fără urme de stres, în timp ce plantele tratate cu bacterii şi
suspensie fungică au fost mai mici ca dimensiuni, dar aparent sănătoase (varianta V2). În cazul
variantei V3, s-a observat că tratamentul exclusiv cu fungii fitopatogeni nu a permis dezvoltarea
plantelor. În urma testării, s-a observat că tulpina bacteriană B2 are o acţiune pozitivă asupra
dezvoltării plantelor testate, atât la ardei cât şi la tomate, ceea ce arată potenţialul acestei specii
bacteriene de a favoriza creşterea plantelor. De asemenea, aceasta are un potenţial antifungic mai
bun faţă de fungii fitopatogeni testaţi, comparativ cu tulpina B1, datorită producerii compuşilor
antifungici.
Din literatura de specialitate se cunoaşte că efectul de stimulare a creşterii plantelor realizat
de unele bacterii antagoniste se datorează producerii de auxine, şi în principal de acid 3-indolil-
acetic (IAA). Pentru evidenţierea producerii de IAA de către tulpinile bacteriene B1 şi B2 s-a folosit
metoda descrisă de Brie (1991). În afară de cele două tulpini bacteriene s-a folosit şi un alt izolat
natural aparţinând genului Bacillus, notat BW şi o tulpină de B. subtilis de colecţie ATCC 6633.
8

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
Aceste tulpini bacteriene au fost crescute pe mediu NB simplu şi mediu NB suplimentat cu triptofan,
acesta fiind precursorul IAA. Mediile de cultură şi metoda de testare sunt descrise în capitolul III al
tezei, subcapitolul Rezultate şi discuţii. Rezultatele obţinute au arătat că toate cele trei izolate
naturale produc IAA, cel mai ridicat nivel fiind evidenţiat la tulpina B2, acesta crescând şi mai mult
atunci când cultivarea s-a realizat în mediu suplimentat cu triptofan.
S-a constatat că, în urma interacţiunii cu tulpina bacteriană B2, au apărut modificări la
nivelul hifelor fungice, reprezentate prin alungiri ale hifelor, îngroşări ale peretelui celular,
plasmoliză, fragmentarea membranelor citoplasmatice şi ruperea peretelui celular cu eliminarea
conţinutului citoplasmatic (pe imagini apar formaţiuni alungite asemănătoare unor vezicule la
capătul hifelor fungice). La toate preparatele fungice analizate, cea mai frecventă modificare
observată a fost plasmoliza (fig. 3.1, săgeata – fig. 3.8 b din teză).
Fig. 3.1 (Fig. 3.8.b – Teză): Modificările hifelor de Alternaria tenuis în urma interacţiilor cu tulpina
bacteriană B. subtilis B2; săgeata: fenomenul de plasmoliză.
În acest capitol am abordat tematica din perspectiva testării activităţii antifungice a izolatelor
bacteriene B1 şi B2 în două direcţii: (a) testare in vitro şi (b) testare in vivo. Am demonstrat
activitatea antifungică a tulpinilor B1 şi B2 faţă de fungii testaţi, evidenţiind efectele antagoniste
mai puternice în cazul tulpinii B2. Prin testarea in vivo am demonstrat că tulpina B2 manifestă, în
plus, şi o activitate de stimulare a creşterii răsadurilor de ardei sau roşii, punând în evidenţă
capacitatea mai mare a acestei tulpini de a produce acid indolil acetic. Extrem de interesante au fost
rezultatele obţinute în urma examinării microscopice a hifelor de A. alternata în urma interacţiunii
cu tulpinile bacteriene B1 şi B2, în special, concretizate prin modificările hifelor, apariţia
plasmolizei şi ruperea peretelui celular cu eliberarea conţinutului citoplasmatic (vizualizată prin
formarea unor vezicule, mai ales la capătul hifelor fungice).
9

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
Capitolul IV: Cercetări proprii privind producerea de biosurfactanţi de către tulpinile
bacteriene selectate
Obiectivele urmărite în acest capitol au constat în:
1. Stabilirea condiţiilor optime de producere a biosurfactanţilor bacterieni;
2. Evidenţierea producerii compuşilor tensioactivi prin metode specifice.
Pentru realizarea obiectivelor menţionate s-au folosit mai multe tipuri de tulpini bacteriene,
dintre care unele de colecţie şi altele nou izolate (tabelul 4.1 – tabelul 4.1 din teză).
Tulpini bacteriene utilizate în experimente
10
Tabelul 4.1 (Tabelul 4.1 – Teză)
Tulpina Particularităţi Origine
B. subtilis B1 Activitate antifungică slabă Izolat din sol poluat cu hidrocarburi
B. subtilis B2 Activitate antifungică Izolat din sol poluat cu diverse deşeuri
B. subtilis ATCC Tulpină de referinţă Colecţia Laboratorului de Genetică şi inginerie
6633
genetică, Facultatea de Biotehnologii
Bacillus sp. BW Activitate antifungică şi Colecţia Laboratorului de Genetică şi inginerie
antibacteriană
genetică, Facultatea de Biotehnologii
Bacillus sp.OS15 Activitate antifungică faţă Drd.Oana Sicuia, Institutul pentru Protecţia
de Fusarium oxysporum
Bacillus sp.OS17 Activitate antifungică faţă
de Fusarium oxysporum
Plantelor Bucureşti
Drd.Oana Sicuia, Institutul pentru Protecţia
Plantelor Bucureşti
Pentru detectarea producerii de biosurfactanţi s-au folosit două metode: testul hemolizei, prin
cultivarea bacteriilor pe mediul cu geloză-sânge, şi testul cu CTAB-agar, ambele descrise în
subcapitolul Materiale şi metode din capitolul IV al tezei. În cazul utilizării tehnicii de cultivare pe
geloză-sânge, s-a observat un halou clar de hemoliză în jurul tuturor coloniilor bacteriene testate, cel
mai mare fiind înregistrat la coloniile tulpinilor B1 şi B2. În schimb, în urma testării tulpinlor
bacteriene prin cultivare pe mediu cu CTAB nu s-au observat prezenţa halourilor albastre-violete în
jurul coloniilor bacteriene. Pentru verificarea rezultatelor s-au testat şi patru tulpini de
Pseudomonas sp., unde rezultatele au fost pozitive.
Pentru obţinerea unor cantităţi suficiente de biosurfactanţi, bacteriile de interes au fost
cultivate în două tipuri de medii de cultură, recomandate în literatura de specialitate în acest scop.
Astfel, s-au folosit mediile MSM şi McKeen, ultimul cu o formulă uşor modificată. Compoziţia
mediilor de cultură şi protocolul de lucru sunt prezentate în subcapitolul menţionat anterior. În urma
cultivării tulpinilor bacteriene B1, B2, B17 (B. subtilis ATCC 6633) în mediul MSM cu 30 g/L
sucroză ca sursă de carbon, s-au obţinut curbe de creştere tipice pentru o cultură bacteriană, fără
diferenţe semnificative între tulpinile analizate. Rezultatele obţinute în urma cultivării tulpinilor
bacteriene în mediul McKeen cu 2,5 % glucoză ca sursă de carbon, arată că după 12 ore de incubare

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
are loc o creştere progresivă a turbidităţii mediului de cultură la toate tulpinile bacteriene testate.
Faza de creştere exponenţială se întinde, la toate cele trei tulpini bacteriene, pe parcursul a 36 ore,
deşi, în cazul tulpinii B1 şi B2 are loc o creştere rapidă în primele 12 ore, după care ritmul de
creştere încetineşte. De remarcat că, la toate cele trei tulpini testate, s-a observat un vârf de creştere
la aproximativ 84 ore. În cazul celorlalte trei tulpini bacteriene luate în studiu, BW, OS15 şi OS17,
se constată o creştere exponenţială a bacteriilor timp de 12 ore, după care, rata de creştere scade
foarte mult, intrându-se practic într-o fază staţionară prelungită. După 96 ore, numai tulpinile OS15
şi OS17 au intrat în faza de declin, datorită limitării conţinutului de nutrienţi; la tulpina BW valorile
absorbanţei la 600 nm rămânând constante.
Evidenţierea prezenţei compuşilor lipopeptidici în supernatantele culturilor bacteriene prin
testarea activităţii de dispersare a petrolului, s-a făcut prin măsurarea diametrului zonei clare de
dispersie, formată prin deplasarea substratului. Testările s-au făcut pe diferite substraturi uleioase:
ulei de floarea soarelui, ulei de măsline, kerosen şi kerosen cu 20% motorină. Rezultatele prezentate
în tabelul 4.2 (tabelul 4.5 din teză) arată că activitatea cea mai bună de dispersare o are tulpina B2.
11
Tabelul 4.2 (Tabelul 4.5 – Teză)
Evidenţierea producerii de biosurfactanţi de către tulpinile bacteriene Bacillus subtilis B1, B2, ATCC 6633 şi
BW pe diferite substraturi
Tulpini
Zona clară formată (mm)
bacteriene Ulei de floarea Ulei de măsline Kerosen Kerosen cu 20%
soarelui
motorină
B1 4 5 26 26
B2 6 9 56 54
ATCC 6633 3 5 13 12
BW 3 6 18 15
De remarcat că valorile maxime ale zonei de dispersie au fost obţinute pe kerosen şi pe
kerosen cu motorină. Pornind de la diametrul zonei de dispersie pe substratul kerosen şi kerosen cu
motorină, s-a calculat aria de dispersie (în cm 2 ), rezultatele fiind prezentate în tabelul 4.3 (tabelul 4.6
din teză).
Tabelul 4.3 (Tabelul 4.6 – Teză)
Aria de dispersie faţă de kerosen şi kerosen cu 20% motorină a tulpinilor bacteriene testate
Tulpina
Kerosen Kerosen cu 20% motorină
bacteriană Diametrul zonei Aria zonei de
de dispersie (cm) dispersie (cm 2 Diametrul zonei Aria zonei de
) de dispersie (cm) dispersie (cm 2 )
B1 26 5,3 26 5,3
B2 56 24,61 54 22,89
ATCC 6633 13 1,32 12 1,13
BW 18 2,54 15 1,76

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
Faptul că faţă de kerosen şi kerosen cu 20% motorină, acţiunea de dispersare a fost ridicată
la toate tulpinile testate, sugerează nu numai că acestea produc substanţe tensioactive ci şi că ele ar
putea fi folosite în practică, în experimente de bioremediere dacă, alături de proprietatea menţionată,
tulpinile bacteriene manifestă şi capacitate de a forma emulsii stabile.
Activitatea de emulsionare a fost testată prin două metode: măsurarea densităţii optice a
supernatantelor cu diferite substraturi şi măsurarea stabilităţii emulsiei formate după 24 ore,
respectiv calcularea indicelui de emulsonare la 24 ore (E24). În urma măsurării densităţii optice la
lungimea de undă de 540 nm, s-a constatat că valorile cele mai ridicate au fost obţinute la tulpina B2
(tabelul 4.4 – tabelul 4.7 din teză).
12
Tabelul 4.4 (Tabelul 4.7 – Teză)
Testarea activităţii de emulsionare a biosurfactanţilor obţinuţi de la tulpinile bacteriene izolate Bacillus
subtilis B1, B2, ATCC 6633, BW, prin măsurarea densităţii optice la 540 nm
Substraturi Activitatea de emulsionare prin măsurarea densităţii optice la 540 nm
B1 B2 ATCC 6633 BW
Ulei de floarea
0,093 1,177 0,109 0,17
soarelui
Ulei de măsline 0,107 1,284 0,281 0,178
Kerosen
Kerosen cu 20%
0,058 0,391 0,110 0,180
motorină
0,060
0,577
0,038
0,227
Se remarcă faptul că şi valorile indicelui de emulsionare sunt mai mari în cazul tulpinii B2.
În tabelul 4.5 (tabelul 4.8 din teză) sunt prezentate valorile indicelui de emulsionare la 24 ore.
Tabelul 4.5 (Tabelul 4.8 – Teză)
Valorile indicelui de emulsionare la 24 ore (E24) la tulpinile bacteriene Bacillus subtilis B1, B2, ATCC 6633
şi BW
Tulpini
Indicele de emulsionare la 24 ore (E24) (%)
bacteriene Ulei de floarea Ulei de măsline Kerosen Kerosen cu 20%
soarelui
motorină
B1 43,90 40,24 58,54 51,22
B2 54,88 51,22 71,35 60,37
ATCC 6633 43,90 45,73 51,22 47,56
BW 47,56 49,39 64,03 53,05
Se observă că valorile cele mai ridicate ale indicelui de emulsionare s-au obţinut la tulpina
B2, în special la kerosen 71,35% şi la kerosen cu 20% motorină de 60,37%. Aceste rezultate arată că
tulpinile bacteriene testate, în special tulpina B2, produc compuşi cu proprietăţi de emulsionare şi de
stabilizate a emulsiei. În plus, chiar dacă zonele de dispersie a uleiurilor vegetale utilizate, au fost
reduse la toate tulpinile testate, indicele de emulsionare a fost ridicat pentru aceste substraturi, ceea

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
ce sugerează posibile aplicaţii ale tulpinilor bacteriene selectate pentru degradarea uleiurilor
vegetale uzate (arse).
Pentru că rezultatele obţinute au arătat capacitatea tulpinilor bacteriene B1, B2, B17 şi BW
de a produce agenţi tensioactivi, ne-am propus să examinăm dacă aceste tulpini sunt potenţial
producătoare de lipopeptide de tip iturin, folosind două perechi de primeri ituD şi lpa14. Rezultatele
obţinute sunt prezentate în mod sintetic în tabelul 4.6 (tabelul 4.9 din teză).
Rezultatele testului PCR
13
Tabelul 4.6 (Tabelul 4.9 – Teză)
Tulpina
bacteriană
Rezultate PCR Comentarii
B. subtilis ATCC Ampliconul de 1203 pb specific pentru
6633
ituD este clar, în timp ce ampliconul de
675 pb corespunzător genei lpa-14 nu
este foarte clar
Posibil producător de iturin
B. subtilis B1 Ambii ampliconi sunt prezenţi Producător de iturin
B. subtilis B2 Niciunul dintre produşii de amplificare Nu produce iturin, biosurfactanţii pe
nu a fost detectat
care îi sintetizează sunt de alt tip
B. subtilis BW Ambii ampliconi sunt prezenţi Producător de iturin
Extracţia biosurfactanţilor s-a făcut după o metodă adaptată după mai multe metode
prezentate în literatura de specialitate, fiind descrisă în capitolul IV al tezei, subcapitolul Materiale
şi metode. În experimentele noastre, în urma evaporării metanolului, s-a obţinut, pentru toate
tulpinile bacteriene luate în studiu, un depozit de culoare brun-gălbuie, fiind considerat biosurfactant
brut. S-au constatat, totuşi, diferenţe în privinţa mărimii depozitului: cel mai mare depozit s-a
obţinut la tulpina B2. În vederea evidenţierii biosurfactanţilor prin cromatografie în strat subţire
(TLC) şi pentru determinarea eventualei activităţi antifungice, sedimentele de biosurfactant au fost
reluate în 100 µl metanol sau în 100 µl n-butanol.
Pentru detectarea biosurfactanţilor prin TLC, s-a folosit sistemul solvent cloroform-metanol-
apă (65:25:4 v/v/v), iar ca soluţie de revelare o soluţie alcoolică de ninhidrină 0,2%. Aplicarea
extractelor metanolice sau butanolice pe plăcile cu silicagel, a condus la evidenţierea unor spoturi de
culoare violet, indicând prezenţa lipopeptidelor.
Deşi în cercetările noastre am pornit de la o platformă de cunoştinţe deja existente în ceea ce
priveşte creşterea acestui tip de microorganisme, având în vedere dificultatea alegerii unui mediu
bun pentru cultivarea izolatelor bacteriene selectate, potenţial producătoare de biosurfactanţi, am
considerat necesară testarea şi optimizarea creşterii tulpinilor bacteriene, astfel încât rezultatele
obţinute în cadrul etapelor următoare să fie comparabile cu cele obţinute pe plan internaţional. Am

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
arătat că prin folosirea mediului de cultură McKeen cu 2,5% glucoză, ca sursă de carbon, creşterea
bacteriilor a fost mai bună, permiţând producerea unei cantităţi mai mari de biosurfactanţi.
Prin verificarea indicelui de emulsionare faţă de uleiul de floarea soarelui şi cel de măsline,
s-a demonstrat că toate tulpinile bacteriene testate au manifestat valori ridicate, ceea ce sugerează
posibile aplicaţii pentru degradarea uleiurilor vegetale testate.
Pe lângă utilizarea mediului de cultură McKeen pentru obţinere de biosurfactanţi, ca element
de noutate putem menţiona diferenţele tulpinilor B1 şi B2 în evidenţierea producerii de lipopeptide
de tip iturin A cu două perechi de primeri (pentru genele ituD şi lpa-14). S-a demonstrat că în
genomul B1 se găsesc ambele gene ţintă, implicate în biosinteza iturinului, observându-se clar
ampliconul de 1203 pb pentru gena ituD şi cel de 675 pb corespunzător genei lpa-14. La tulpina B2
nu s-au observat produşii de amplificare pentru genele menţionate, demonstrându-se astfel că tulpina
bacteriană poate să producă alte tipuri de biosurfactanţi lipopeptidici.
De asemenea, s-a pus la punct o metodă de extracţie, adaptată după mai multe metode
prezentate în literatura de specialitate, reuşindu-se obţinerea unui biosurfactant lipopeptidic brut, sub
formă de sediment brun-gălbui, acesta fiind folosit în testările ulterioare sub formă de extracte
lipopeptidice metanolice şi butanolice.
Capitolul V: Cercetări proprii privind posibilele aplicaţii ale tulpinilor bacteriene
producătoare de biosurfactanţi
Cercetările care fac obiectul acestui capitol au fost abordate în vederea:
1. Evidenţierii capacităţii biosurfactanţilor sintetizaţi de tulpinile bacteriene selectate de a
inhiba fungi fitopatogeni;
2. Evidenţierii capacităţii tulpinilor bacteriene selectate de a reduce nivelul unor hidrocarburi
poluante;
3. Testării in vitro a unor posibile aplicaţii ale tulpinilor bacteriene selectate, în condiţiile
evidenţierii inocuităţii acestora.
Pentru determinarea capacităţii de degradare a uleiurilor uzate, s-a folosit numai tulpina
B. subtilis B2, pentru că aceasta a dovedit cea mai bună activitate de emulsifiere a diverselor
categorii de uleiuri şi kerosen. S-au folosit trei medii de cultură cu săruri minerale: MSM1, MSM2
şi McKeen. Compoziţia mediilor de cultură şi protocolul de lucru sunt prezentate în capitolul V al
tezei, subcapitolul Materiale şi metode. În toate mediile de cultură s-a adăugat glucoză numai pentru
14

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
culturile preinocul. Pentru evidenţierea creşterii tulpinii bacteriene B2 în medii cu hidrocarburi s-a
înlocuit glucoza cu ulei ars de motor. Determinările s-au făcut eşalonat la 5, 10, 15 şi 20 zile.
În urma testării, s-a constatat că în mediul MSM2 s-a obţinut cel mai bun nivel al creşterii
bacteriene. Se remarcă faptul că, după 10 zile de incubare, nivelul creşterii bacteriilor se menţine
ridicat, ceea ce ilustrează viabilitatea şi, prin urmare, activitatea metabolică a acestora. Determinarea
viabilităţii bacteriilor în mediile respective (prin însămânţarea unor plăci Petri ce conţin mediu LB
agarizat cu diluţii ale suspensiilor bacteriene), susţine ideea că bacteriile continuă să rămână viabile
şi active din punct de vedere metabolic o lungă perioadă de timp, fapt ce reprezintă importanţă în
condiţiile utilizării in vivo a acestora. În plus, s-a observat emulsionarea uleiului de motor, ceea ce
semnifică producerea unui compus lipopeptidic extracelular cu activitate de biosurfactant. Putem
spune că activitatea de emulsionare a tulpinii B2 faţă de uleiul uzat este ridicată, iar tipul de mediu
utilizat nu influenţează în mod semnificativ această activitate. De altfel, rezultatele confirmă datele
prezentate în capitolul IV, care au arătat că nivelul activităţii de emulsionare rămâne ridicat, cel
puţin pentru tulpina B2, indiferent de varianta de mediu sintetic utilizată pentru testări.
În vederea evidenţierii capacităţii antifungice a biosurfactanţilor bacterieni, extractele
lipopeptidice de la tulpinile bacteriene B1, B2, ATCC 6633 şi BW au fost testate pe speciile fungice
A. tenuis şi S. bataticola, în timp ce extractele de la tulpinile bacteriene OS15 şi OS17 au fost testate
pe F. oxysporum var. lycopersici. Plăcile Petri s-au însămânţat cu extractele metanolice şi butanolice
ale lipopeptidelor produse de tulpinile bacteriene, cu tulpina bacteriană testată şi cu sedimente
bacteriene rezultate de la cea de-a treia extracţie cu metanol, în patru puncte la o distanţă de 1 cm de
porţiunea centrală reprezentată de specia fungică de interes.
Rezultatele obţinute în urma testării activităţii antifungice a extractelor lipopeptidice
demonstrează capacitatea lor de a inhiba creşterea speciilor fungice testate. În a patra zi de
observaţii a interacţiunilor dintre tulpinile bacteriene B1, B2, ATCC 6633 şi BW faţă de A. tenuis,
se observă zone clare de inhibiţie a creşterii miceliului la toate zonele delimitate pe plăcile Petri, în
cazul tulpinilor bacteriene BW şi B2 (fig. 5.1 – fig. 5.14 din teză).
15

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
Fig. 5.1 (Fig. 5.14 – Teză): Interacţiile dintre tulpinile bacteriene Bacillus subtilis B1, B2, ATCC
6633 (notată A), BW şi a extractelor lipopeptidice metanolice şi butanolice faţă de Alternaria
tenuis, după 96 ore la 28 0 C
În urma interacţiilor faţă de S. bataticola, rezultatele obţinute sunt negative. Extractele
lipopeptidice metanolice şi butanolice ale tulpinilor bacteriene nu au activitate antifungică faţă de
specia patogenă testată. La tulpinile B1 şi B2 rezultatele obţinute sunt confirmate de testele in vitro
privind activitatea antifungică prezentate în capitolul III al tezei.
În urma măsurătorilor realizate la plăcile cu tulpinile bacteriene OS15 şi OS17, privind
activitatea antifungică faţă de F. oxysporum var lycopersici, s-a constatat că miceliul fungic s-a
dezvoltat predominant în zonele cu extracte lipopeptidice metanolice şi butanolice. Inhibiţia s-a
observat la nivelul tulpinilor bacteriene şi a sedimentului bacterian, fapt ce demonstrează activitatea
antifungică a izolatelor bacteriene asupra fungului patogen testat (fig. 5.2 – fig. 5.16 din teză).
16

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
Fig. 5.2 (Fig. 5.16 – Teză): Interacţiile dintre tulpinile bacteriene Bacillus subtilis OS15, OS17 şi a
extractelor lipopeptidice metanolice şi butanolice faţă de Fusarium oxysporum var. lycopersici, după
96 ore la 28 0 C
Analizând rezultatele obţinute la tulpinile de interes B. subtilis B1 şi B2, putem spune că
lipopeptidele produse de B2 sunt mult mai active decât cele produse de tulpina B1, având o
activitate antifungică mult mai pregnantă faţă de A. tenuis.
S-au realizat preparate microscopice pentru a vizualiza modificările hifelor fungice în urma
interacţiilor cu extractele metanolice ale lipopeptidelor produse de tulpina bacteriană B2 (fig. 5.3 –
fig. 5.21 din teză).
Fig. 5.3 (Fig. 5.21 – Teză): Modificările hifelor fungice de Alternaria tenuis în urma interacţiilor cu
extractele lipopeptidice metanolice ale tulpinii bacteriene Bacillus subtilis B2
Se constată îngroşarea hifelor, întreruperi ale membranelor citoplasmatice, condensarea
citoplasmei şi ruperea membranelor, observându-se formaţiuni asemănătoare unor picături la capătul
hifelor, care ar putea fi conţinut cioplasmatic.
Pentru a demonstra posibilitatea obţinerii unui biopreparat din una sau mai multe tulpini
bacteriene care au capacitatea de a produce biosurfactanţi, s-au făcut interacţii între tulpinile
bacteriene testate, pentru a evidenţia dacă apar reacţii antagoniste, de inhibare a creşterii coloniilor
bacteriene. Din observaţiile preliminare s-a constatat că tulpinile bacteriene B2, OS15 şi OS17
prezintă un uşor antagonism faţă de BW. Tulpinile bacteriene B2, OS15 şi OS17 nu prezintă
17

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
antagonism între ele, ceea ce ar favoriza folosirea acestor tulpini pentru obţinerea unui biosurfactant
care să prezinte activitate antifungică bună faţă de F. oxysporum var. lycopersici şi alte specii
fungice care produc daune culturilor de tomate şi ardei.
Pentru folosirea tulpinilor bacteriene precum şi a compuşilor cu activitate de surfactant în
combaterea biologică a agenţilor patogeni şi bioremediere, se impune determinarea toxicităţii
bacteriilor de interes. În acest scop noi am folosit metoda BACTOX, o analiză rapidă care foloseşte
ca organism senzor, protozoarul ciliat Tetrahymena pyriformis. Acesta este nepatogen, are formă de
lacrimă şi poate fi folosit în medii ieftine. Pentru testarea toxicităţii s-au folosit tulpinile bacteriene
B1 şi B2. Testarea propriu-zisă s-a realizat pe plăci de culturi tisulare cu 12 orificii, în care s-au
pipetat suspensia de protozoare şi cea bacteriană. Monitorizarea s-a făcut prin observarea fiecărui
orificiu al plăcii de culturi tisulare, cu ajutorul unui microscop cu fază inversată după 10 minute, 2, 4
şi 8 ore de incubare. Prin cuantificarea rezultatelor după o scală adaptată de Shlimme şi colab.
(1999), s-a constatat că tulpinile bacteriene testate nu au efecte asupra protozoarului ciliat, ceea ce
corespunde cu un indice de toxicitate de 0% echivalent cu aproximativ 100% protozoare vii.
Prin realizarea obiectivelor propuse în acest capitol putem menţiona ca element de noutate
demonstrarea viabilităţii tulpinii B2 în medii de cultură lichide cu adaos de ulei de motor, ca unica
sursă de carbon. S-a observat că tulpina bacteriană a rămas activă din punct de vedere metabolic şi
după 20 zile de incubare în mediile cu ulei de motor. Prin testele realizate s-a observat emulsionarea
uleiului de motor în toate mediile de cultură folosite, ceea ce demonstrează că tulpina B2 produce un
compus lipopeptidic extracelular cu activitate de biosurfactant.
În acest capitol cercetările au fost extinse şi prin demonstrarea unei activităţii antifungice
bune a extractelor lipopeptidice produse de tulpina bacteriană B2 faţă de A. tenuis. De asemenea s-a
evidenţiat efectele extractelor metanolice ale lipopeptidelor produse de tulpina B2 faţă de hifele
fungice de A. tenuis, concretizate prin îngroşarea hifelor, condensarea citoplasmei, ruperea pereţilor
celulari, observându-se formaţiuni asemănătoare unor picături, mai ales la capătul hifelor.
Un alt aspect important prezentat în acest capitol constă în absenţa antagonismului între
tulpinile bacteriene cu potenţial antifungic testate. Acesta este un avantaj important în perspectiva
folosirii tulpinilor respective pentru obţinerea unui biopreparat cu activitate antifungică.
Un alt aspect de noutate îl constituie testarea toxicităţii tulpinilor B1 şi B2 asupra
protozoarului Tetrahymena pyriformis. S-a demonstrat că aceste tulpini nu au efecte negative asupra
organismului test menţionat, extrem de sensibil la modificările apărute în mediu, astfel că tulpinile
18

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
bacteriene B1 şi B2 pot fi folosite în combaterea biologică, iar biopreparatele care ar putea fi
obţinute pot fi sigure pentru mediu.
CONCLUZII GENERALE
1. În experimente au fost utilizate 20 probe de sol şi de apă prelevate din diferite zone ale ţării:
5 probe de sol contaminat cu hidrocarburi provenit din Ploieşti Prahova, din apropierea
zonelor de extracţie petrolieră; 5 probe de sol din localitatea Techirghiol, de pe un teren
poluat cu deşeuri menajere, ape reziduale menajere şi hidrocarburi (în special benzină şi
motorină); 5 probe de apă din Marea Neagră din zona Cazinoului şi zona Pescărie,
Constanţa; 5 probe de apă din lacul Techirghiol.
2. Metoda de izolare a bacteriilor din sursele naturale poluate a permis obţinerea unui număr
total de 80 colonii izolate a căror morfologie a fost examinată. Toate cele 80 de colonii
bacteriene au fost testate pe mediu ce conţine ulei uzat, pentru alegerea izolatelor capabile de
a produce biosurfactanţi. Dintre noile izolate bacteriene, numai 28 au fost capabile de a
forma emulsii stabile în mediul testat.
3. Pentru că scopul principal al cercetărilor este acela de a identifica noi tulpini bacteriene
capabile de a manifesta proprietăţi utile şi care să fie sigure pentru mediu şi pentru om, deci
să nu fie patogene, studiile s-au concentrat asupra bacteriilor Gram-pozitive, aparţinând
genului Bacillus. De aceea, cele 80 noi izolate au fost examinate în privinţa caracterului
Gram, selectându-se în final 18 tulpini Gram-pozitive, dintre care doar 10 au manifestat
capacitatea de a produce compuşi tensioactivi.
4. Pentru a limita şi mai mult numărul de bacterii de studiat, cele 10 de izolate Gram-pozitive
posibil capabile de a produce biosurfactanţi au fost examinate şi în privinţa activităţii
antifungice, faţă de o tulpină de Alternaria alternata (A. tenuis). În final doar două tulpini
bacteriene au prezentat proprietăţile dorite, ele fiind notate B1 (izolată din sol poluat cu
hidrocarburi din Ploieşti, Prahova) şi B2 (izolată din probele de sol poluat cu deşeuri
menajere, ape reziduale menajere şi hidrocarburi - motorină, benzină, recoltate din
localitatea Techirghiol).
5. Deoarece aplicaţiile practice ale oricărui organism nou sunt condiţionate, între altele, de
identificarea speciei căreia îi aparţine, în experimente a fost utilizată o abordare polifazică
19

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
pentru identificarea celor două tulpini bacteriene. Metodele aplicate au fost variate: sistemul
BIOLOG, tehnica FISH şi metode moleculare (ARDRA, PCR-specie specific).
6. Prin utilizarea sistemului BIOLOG s-a ajuns la concluzia că cele două izolate ar aparţine
speciei B. subtilis, cu o probabilitate de aproximativ 85%. Tehnica FISH a permis
diferenţierea între două noi izolate aparţinând genului Bacillus şi un izolat Gram-negativ,
aparţinând genului Pseudomonas. Sondele moleculare utilizate au condus la evidenţierea
unor deosebiri dar nu au permis identificarea speciilor cărora le aparţin izolatele testate.
7. Metodele moleculare constituie, de regulă, metodele ce asigură confirmarea de precizie a
încadrării taxonomice a unor noi izolate. Deoarece condiţia de bază pentru a realiza
asemenea experimente este izolarea şi purificarea ADN genomic, s-au testat mai multe
metode de izolare, cele mai bune rezultate fiind obţinute cu ajutorul kit-ului comercial
Promega. De asemenea, prin aplicarea tehnicilor moleculare bazate pe tehnologia PCR
pentru analiza regiunilor din ADN ce codifică sinteza ARNr respectiv ARNt, a fost
confirmat faptul că tulpinile bacteriene B1, B2 şi B17 (tulpina de referinţă) aparţin aceleiaşi
specii, Bacillus subtilis.
8. Tulpinile bacteriene, B1 şi B2 au manifestat, in vitro, activitate inhibitoare faţă de mai multe
specii de fungi fitopatogeni: tulpini de A. alternata izolate de pe ardei sau de pe roşii,
Fusarium oxysporum var. lycopersici şi, parţial faţă de Pytium spp., dar nu au avut efect
inhibitor clar faţă de Sclerotium bataticola şi Rhizoctonia solani. Efectele antagoniste au fost
mai evidente în cazul tulpinii B2, tulpina respectivă fiind folosită pentru teste in vivo.
9. În urma testărilor in vivo s-a constatat că tulpina B2 manifestă o activitate de stimulare a
creşterii răsadurilor de ardei sau roşii. De asemenea, cele două tulpini bacteriene, în prezenţa
fitopatogenului A. alternata f.sp. lycopersici la roşii sau A. tenuis (A. alternata) la ardei au
asigurat protecţie pentru plantele tratate faţă de infecţia fungică.
10. Cercetările ce au avut ca scop determinarea unora dintre mecanismele de acţiune ale
bacteriilor care au determinat stimularea creşterii plantelor, au permis evidenţierea producerii
de către tulpina B2 a unei cantităţi importante de acid indolil acetic (IAA).
11. Prin examinarea microscopică a efectelor produse in vitro asupra hifelor de A. alternata, de
interacţiunea cu tulpinile bacteriene B1 şi B2, s-au constatat o serie de alungiri ale hifelor,
îngroşări ale peretelui celular, plasmoliză, fragmentarea membranelor citoplasmatice şi
ruperea peretelui celular cu eliberarea conţinutului citoplasmatic. Efectele produse de
bacterii asupra fungilor ţintă se datorează unor compuşi solubili, excretaţi de celulele
20

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
bacteriene în mediu şi care acţionează la distanţă (inhibarea creşterii fungilor nu implică un
contact direct cu celulele bacteriene).
12. Prin cultivarea tulpinilor bacteriene pe mediile de MSM cu 30 g/l sucroză şi McKeen cu
2,5% glucoză nu s-au observat diferenţe semnificative în privinţa profilului curbelor de
creştere şi a acumulării de biomasă. În experimentele ulterioare a fost utilizat mediul
McKeen pentru faptul că se foloseşte glucoza ca unică sursă de carbon, iar creşterea
bacteriilor a fost mai bună, permițând producerea unei cantităţi mai mari de biosurfactanţi.
13. Pentru evidenţierea şi cuantificarea producerii de biosurfactanţi s-au utilizat două metode:
testul răspândirii petrolului şi testul emulsionării. La tulpinile B1 şi B2 s-a observat o acţiune
de dispersare ridicată faţă de kerosen şi kerosen cu motorină, ceea ce sugerează că acestea
produc substanţe tensioactive. De asemenea, cele mai mari valori ale indicelui de
emulsionare faţă kerosen şi kerosen cu motorină au fost înregistrate la tulpinile B2 şi BW
(71,35% cu 60,37% şi respectiv 64,03% cu 53,05%). De remarcat că indicele de emulsionare
faţă de uleiurile vegetale testate (uleiul de floarea soarelui şi cel de măsline) a fost ridicat la
toate tulpinile bacteriene testate, ceea ce sugerează posibile aplicaţii pentru degradarea
uleiurilor vegetale uzate.
14. Capacitatea tulpinilor bacteriene selectate de a produce biosurfactanţi, în principal din
categoria lipopeptidelor a fost examinată şi prin utilizarea unor tehnici moleculare. Astfel, au
fost folosite două perechi de primeri, specifici pentru două gene bacteriene implicate in
producerea iturinului (pentru genele ituD şi lpa-14). S-a constatat că în genomul tulpinilor
B1 şi BW se găsesc ambele gene ţintă, observându-se clar ambii ampliconi specifici
(ampliconul de 1203 pb pentru gena ituD şi cel de 675 pb corespunzător genei lpa-14), în
timp ce la tulpina B2 aceşti produşi au fost absenţi. Aceasta sugerează faptul că tulpina B2 ar
putea să producă alte tipuri de biosurfactanţi lipopeptidici: surfactin, fengycin sau alţi
membri ai familiei lipopeptidice iturin (mycosubtilin, bacillomycin L, D şi F).
15. Studierea particularităţilor biosurfactanţilor bacterieni ca şi a efectelor antifungice este
condiţionată de extracţia acestora. Metoda aplicată a permis obţinerea unui sediment de
culoare brun gălbui (biosurfactantul brut) care a fost supus cromatografiei în strat subţire,
pentru separarea componentelor specifice. Spoturile de culoare violet evidenţiate pe plăcile
cu silicagel au indicat prezenţa lipopeptidelor la toate tulpinile bacteriene testate.
16. Pentru evidenţierea unor eventuale aplicaţii practice ale bacteriilor selectate, au fost
optimizate condiţiile de cultivare în vederea obţinerii unei cantităţi crescute de biomasă
21

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
celulară. Pentru această testare au fost selectate mediile de cultură lichide MSM1, MSM2 şi
McKeen cu adaos de ulei de motor ca unica sursă de carbon, acestea permiţând tulpinii B2 o
creştere semnificativă şi menţinerea viabilităţii pe o perioada lungă de timp (cel puţin 20
zile). Datele obţinute sunt relevante, superioare celor raportate în literatura de specialitate
pentru tulpini bacteriene similare (aparţinând aceleiaşi specii sau unor specii înrudite): astfel,
procentul de biodegradare al uleiului de motor uzat obţinut cu tulpina B2 a fost de
aproximativ 66,67%, ceea ce conferă tulpinii respective importanţă în procesul de
bioremediere a unor medii poluate cu astfel de produse.
17. Extractele de biosurfactanţi bacterieni au fost examinate în vederea evidenţierii efectului
antifungic, demonstrându-se că extractele lipopeptidice de la tulpinile bacteriene B2 şi BW
au activitate antifungică bună faţă de A. tenuis. S-au obţinut valori ale eficacităţii extractelor
lipopeptidice metanolice şi butanolice de 77,50% şi 78,75% pentru tulpina bacteriană BW, în
timp ce la tulpina B2 valorile au fost de 73,75% şi respectiv 77,50%.
18. Extractele metanolice ale lipopeptidelor produse de tulpina bacteriană B2 acţionează asupra
hifelor fungice de A. tenuis, determinând îngroşarea hifelor, condensarea citoplasmei,
întreruperi ale membranelor citoplasmatice şi ruperea membranelor observându-se
formaţiuni asemănătoare unor picături, în principal la capătul hifelor.
19. Datele obţinute în legătură cu potenţialul antifungic al biosurfactanţilor produşi de bacteriile
selectate evidenţiază faptul că acestea sunt capabile de efecte importante, posibil sinergice.
Din acest motiv, pentru o eventuală condiţionare a culturilor bacteriene în vederea obţinerii
de biopreparate cu activitate antifungică, este important ca tulpinile bacteriene utilizate să nu
manifeste antagonism între ele. Rezultatele au evidenţiat absenţa acestui antagonism, ceea ce
înseamnă că ele ar putea fi folosite pentru obţinerea unui biopreparat cu activitate antifungică
faţă de unele specii fungice.
20. Utilizarea practică a unor biopreparate microbiene este deseori blocată de lipsa informaţiilor
legate de inocuitatea acestora. Din acest motiv, pentru tulpinile bacteriene selectate a fost
aplicat, pentru prima dată în România, testul BACTOX, una dintre puţinele metode de
determinare a ecotoxicităţii atât a bacteriilor cât şi a produşilor microbieni folosiţi în
combaterea biologică. Testul s-a realizat prin co-incubarea bacteriilor cu protozoarul ciliat de
apă dulce Tetrahymena pyriformis, dovedindu-se că tulpinile bacteriene B1 şi B2 nu au
efecte toxice asupra acestuia (rezultatele au arătat un indice de toxicitate de 0% ceea ce
corespunde cu aproximativ 100% protozoare vii). Faptul că aceste tulpini bacteriene nu au
22

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
efecte negative asupra protozoarului T. pyriformis, organism test extrem de sensibil la
modificările apărute în mediu, demonstrează că tulpinile bacteriene selectate ar putea fi
utilizate în cadrul unor tehnologii de bioremediere a mediilor poluate cu hidrocarburi şi/sau
de obţinere de biopreparate antifungice.
CONTRIBUŢII ORIGINALE ALE TEZEI
Tema de cercetare propusă prezintă importanţă la nivel internaţional, prin faptul că poate
contribui la elaborarea unor metode biotehnologice netoxice pentru mediu, utile pentru protecţia
plantelor şi pentru bioremedierea solurilor poluate, în general, cu hidrocarburi. Deşi există produse
biologice pe bază de microorganisme deja comercializate, cercetările în acest domeniu vor prezenta
interes deoarece pot fi utilizate noi microorganisme pentru producerea biosurfactanţilor. Abordarea
cercetărilor în cadrul acestei teze prezintă noutate şi originalitate, îmbinând o gamă diversă de
metode de studiu în vederea identificării şi evidenţierii aplicaţiilor unor microorganisme utile din
punct de vedere practic.
Materialul biologic utilizat în experimente este nou, tulpinile bacteriene selectate fiind pentru
prima dată descrise şi utilizate pentru evidenţierea capacităţii de a utiliza uleiul uzat şi, în acelaşi
timp, de a inhiba o serie de agenţi fitopatogeni. Din acest punct de vedere, rezultatele obţinute au
caracter de originalitate: tulpinile bacteriene selectate manifestă simultan proprietăţi antagoniste faţă
de fungi fitopatogeni precum şi capacitate de a degrada o serie de hidrocarburi poluante pentru
mediu. S-a analizat capacitatea tulpinilor bacteriene izolate de a creşte pe medii de cultură cu ulei
uzat de motor, pentru evidenţierea capacităţii bacteriilor de a utiliza uleiul uzat şi de a fi folosite în
aplicaţii de bioremediere.
Prin studierea cineticii şi parametrilor care influenţează producerea biosurfactanţilor
bacterieni realizată în cadrul acestei lucrări, sunt create bazele pentru o optimizare viitoare a
proceselor biotehnologice în care acestea ar fi utilizate, putându-se astfel obţine bioproduse la un
nivel de cost scăzut, produse care pot înlocui, în anumite situaţii, o parte a produselor chimice care
au dezavantajul că sunt toxice şi prezintă risc de poluare a mediului. S-a descris o metodă de
extracţie a compuşilor lipopeptidici, care a fost adaptată prin studierea unui număr mare de tehnici
de extracţie folosite pe plan internaţional.
S-au făcut studii privind toxicitatea tulpinilor bacteriene izolate şi respectiv a compuşilor
produşi de acestea faţă de organisme acvatice dulcicole, Tetrahymena pyriformis, ceea ce constituie
23

Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole
un element de noutate pe plan naţional şi internaţional şi contribuie la dezvoltarea cunoştinţelor în
acest domeniu.
S-a studiat activitatea antifungică a tulpinilor bacteriene izolate şi, mai ales, a
biosurfactanţilor produşi de acestea, pentru obţinerea unui biopreparat care să poată fi folosit în
combaterea biologică a fungilor patogeni care produc pagube culturilor legumicole de tomate şi
ardei.
24