Metode de investigare a metabolismului glucidic si lipidic - PIM Copy

PIM

Profesor doctor
Vlad ARTENIE
Lector doctorand
Eugen
UNGUREANU
Lector doctor
Anca Mihaela
NEGURĂ
METODE DE INVESTIGARE
A METABOLISMULUI
GLUCIDIC ŞI LIPIDIC
– manual de lucrări practice –
EDITURA PIM
2008

CUPRINS
SECURITATEA MUNCII ÎN LABORATORUL DE BIOCHIMIE ---------------------------- I – VI
I.1. DOZAREA GLUCIDELOR SOLUBILE ---------------------------- 1
I.1.1. Dozarea monoglucidelor şi oligoglucidelor reducătoare în
plante
---------------------------- 1
I.1.2. Dozarea zaharozei în plante ---------------------------- 6
I.1.3. Dozarea glucozei în sânge (micrometoda colorimetrică cu
orto-toluidină)
---------------------------- 8
I.1.4. Dozarea fructozei în plante ---------------------------- 11
I.1.5. Dozarea hexozaminelor în serul sanguin ---------------------------- 13
I.1.6. Dozarea acidului sialic în serul sanguin ---------------------------- 15
I.1.7. Dozarea lactozei în lapte ---------------------------- 16
I. 1. 8. Determinarea glucidelor solubile prin cromatografie în
strat subţire
---------------------------- 18
I.2. DOZAREA UNOR POLIGLUCIDE ---------------------------- 21
I.2.1. Dozarea amidonului în plante ---------------------------- 21
I.2.2. Determinarea cantitativă a glicogenului în ţesuturile
animale
---------------------------- 23
I.2.3. Dozarea mucopolizaharidelor în serul sanguin ---------------------------- 26
I.3. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII UNOR ENZIME
PARTICIPANTE ÎN ANABOLISMUL ŞI CATABOLISMUL
GLUCIDELOR
I.3.1. Enzime implicate în scindarea poliglucidelor şi
oligoglucidelor
---------------------------- 27
---------------------------- 27
I.3.1.1. Determinarea activităţii amilazelor ---------------------------- 27
I.3.1.1.1. Determinarea activităţii α-amilazei în serul sanguin şi
urină (Micrometoda Metais şi Bieth)
I.3.1.1.2. Determinarea activităţii α-amilazei în salivă
(Micrometoda Metais şi Bieth, adaptată de Vlad Artenie)
I.3.1.1.3. Determinarea activităţii α-amilazei şi β-amilazei în
plante (Metoda Noelting-Bernfeld, modificată parţial de Vlad
Artenie)
I.3.1.1.4. Determinarea activităţii α-amilazei şi β-amilazei
sintetizate de microorganisme (Metoda Noelting-Bernfeld)
---------------------------- 28
---------------------------- 32
---------------------------- 35
---------------------------- 40
I. 3. 1. 1. 5. Determinarea activităţii γ-amilazei ---------------------------- 41

I.3.1.1.6. Evidenţierea izoenzimelor α-amilazei şi β-amilazei
cu ajutorul electroforezei în gel de poliacrilamidă
(Metoda Vlad Artenie şi Marius Mihăşan)
---------------------------- 43
I.3.1.2. Determinarea activităţii α - glucan fosforilazei vegetale ---------------------------- 46
I.3.1.3. Determinarea activităţii unor glicozidaze ---------------------------- 50
I.3.1.3.1. Determinarea activităţii α - glucozidazei
(Protocolul Worthington, adaptat de Vlad Artenie)
---------------------------- 50
I.3.1.3.2. Determinarea activităţii β - D - galactozidazei ---------------------------- 52
I.3.1.3.3. Determinarea activităţii β - fructofuranozidazei ---------------------------- 55
I.3.1.3.3.1. Determinarea activităţii β - fructofuranozidazei
intestinale (Metoda I. S. Lukomskaja, modificată de Vlad Artenie)
I.3.1.3.3.2. Determinarea activităţii β - fructofuranozidazei
levuriene
I.3.2. Enzime care catalizează diferite etape din metabolismul
intermediar al monoglucidelor
---------------------------- 55
---------------------------- 57
---------------------------- 59
I.3.2.1. Determinarea activităţii fosfomonoesterazelor ---------------------------- 59
I.3.2.1.1. Determinarea activităţii fosfomonoesterazelor alcalină şi
acidă în serul sanguin
I.3.2.1.1.1. Determinarea activităţii fosfomonoesterazei alcaline
Metoda Bodansky
I.3.2.1.1.2. Determinarea activităţii fosfomonoesterazei alcaline
Metoda cu para – nitrofenilfosfat
(Metoda Bessey, Lowry, Brock modificată)
---------------------------- 60
---------------------------- 60
---------------------------- 62
I.3.2.1.1.3. Determinarea activităţii fosfomonoesterazei acide ---------------------------- 64
I.3.2.1.1.4. Determinarea activităţii fosfomonoesterazei acide în
plante
---------------------------- 66
I.3.2.2. Determinarea activităţii glucozofosfat izomerazei ---------------------------- 69
I.3.2.2.1. Determinarea activităţii glucozofosfat izomerazei în
serul sanguin
(metoda Bodansky cu unele modificaţii ale lui Korovkin)
I.3.2.3. Determinarea activităţii fructozobisfosfat aldolazei
În serul sanguin (metoda Kulganek şi Klaska)
---------------------------- 69
---------------------------- 72
I.3.2.4. Determinarea activităţii lactat dehidrogenazei ---------------------------- 74
I.3.2.4.1. Determinarea activităţii lactat dehidrogenazei
în serul sanguin prin metoda Sevela şi Tovarek
în modificaţia lui Korovkin (după Vlad Artenie şi Elvira Tănase)
---------------------------- 74

I.3.2.4.2. Determinarea activităţii lactat dehidrogenazei
în serul sanguin prin metoda Wroblewski şi La Due, modificată
de Hill (după Vlad Artenie şi Elvira Tănase)
I.3.2.4.3. Determinarea activităţii izoenzimelor
lactat dehidrogenazei
I.3.2.4.3.1. Determinarea izoenzimelor lactat dehidrogenazei
în serul sanguin, prin adsorbţie pe DEAE-Sephadex
(după Manta, Cucuianu, Benga, Hodârnău)
I.3.2.4.3.2. Determinarea izoenzimelor LDH prin inactivare
termică
I.3.2.4.3.3. Determinarea activităţii fracţiunii lactat dehidrogenazei
serice stabilă la uree
I.3.2.4.3.4. Separarea şi identificarea izoenzimelor lactat
dehidrogenazei prin electroforeză în gel de poliacrilamidă
---------------------------- 76
---------------------------- 77
---------------------------- 78
---------------------------- 78
---------------------------- 79
---------------------------- 80
I.3.2.5. Determinarea activităţii alcool dehidrogenazei ---------------------------- 83
I.3.3. Enzime participante la oxidarea biologică a
substratelor organice
I.3.3.1. Determinarea activităţii succinat dehidrogenazei metoda
Harish Padh Adaptată de Vlad Artenie
I.3.3.2. Determinarea activităţii dehidrogenazei acidului succinic
metoda cu trifeniltetrazoliu
---------------------------- 85
---------------------------- 85
---------------------------- 87
I.3.4. Enzime implicate în etapa finală a oxidării biologice ---------------------------- 88
I.3.4.1. Determinarea activităţii adenozintrifosfatazei ---------------------------- 88
I.3.4.1.1. Determinarea activităţii ATP-azei în ţesuturile animale ---------------------------- 89
I.3.4.1.2. Determinarea activităţii ATP-azei în plante ---------------------------- 91
I.3.4.2. Determinarea activităţii catalazei ---------------------------- 93
I.3.4.2.1. Determinarea activităţii catalazei în sânge
(Metoda Bach-Zubkova)
I.3.4.2.2. Determinarea activităţii catalazei în plante
prin titrare iodometrică Metoda J. B. Sumner şi G. F. Somers,
modificată de Vlad Artenie
I.3.4.2.3. Determinarea spectrofotometrică a activităţii catalazei
(Metoda Sinha)
I.3.4.3. Determinarea activităţii peroxidazei (Metoda L. V.
Gudkova şi R. G. Degtiari)
---------------------------- 93
---------------------------- 94
---------------------------- 97
---------------------------- 100
I.3.4.4. Determinarea activităţii glutation peroxidazei ---------------------------- 103

I.3.4.4.1. Determinarea activităţii glutation peroxidazei
în serul sanguin Metoda Fukuzawa şi Tokumura
adaptată de Costel Darie şi Vlad Artenie
I.3.4.4.2. Determinarea activităţii glutation peroxidazei
în ţesuturile animale Metoda Fukuzawa şi Tokumura
I.3.4.5. Determinarea activităţii superoxid dismutazei metoda
Winterbourn, Hawkins, Brian şi Carrell adaptată de Vlad Artenie
I.3.4.6. Determinarea activităţii ascorbat oxidazei în plante
metoda M. F. Oberbacher şi H. M. Vines
I.4. DOZAREA UNOR PRODUŞI INTERMEDIARI ŞI FINALI AI
METABOLISMULUI GLUCIDIC
---------------------------- 103
---------------------------- 105
---------------------------- 108
---------------------------- 111
---------------------------- 113
I.4.1. Dozarea acidului piruvic ---------------------------- 113
I.4.2. Dozarea acidului lactic
Metoda Barker şi Summerson modificată
I.4.3. Determinarea cantitativă a alcoolului etilic
Metoda Martin – Boiden
---------------------------- 116
---------------------------- 120
I.4.5. Dozarea acidului adenozintrifosforic (ATP) în ţesuturile vii ---------------------------- 125
II.1. DOZAREA LIPIDELOR TOTALE ---------------------------- 127
II.1.1. Dozarea lipidelor totale în ţesuturile animale (metoda Folch
şi colaboratori, Modificată de I. F. Dumitru)
II.1.2. Dozarea lipidelor totale în serul sanguin
(metoda cu reactivul sulfofosfovanilc)
---------------------------- 127
---------------------------- 129
II.2. ANALIZA TRIACILGLICEROLILOR ---------------------------- 131
II.2.1. Determinarea cantitativă a triacilglicerolilor în plante ---------------------------- 131
II.2.1.1. Determinarea cantitativă a triacilglicerolilor în plante prin
metoda Soxhlet indirectă
II.2.2. Dozarea triacilglicerolilor în serul sanguin (metoda Tixier şi
Claude)
---------------------------- 131
---------------------------- 134
II.2.3. Determinarea indicelui de aciditate ---------------------------- 137
II.2.4. Determinarea indicelui de saponificare ---------------------------- 139
II.2.5. Determinarea indicelui de iod (metoda Hanus) ---------------------------- 142
II.2.6. Metode de determinare a unor produşi rezultaţi în oxidarea
peroxidică a lipidelor în organismele vii
---------------------------- 145
II.2.6.1. Determinarea indicelui peroxidic ---------------------------- 145
II.2.6.2. Determinarea spectrofotometrică a conjugării dienice a
acizilor graşi superiori nesaturaţi (metoda I. D. Stalinaja)
---------------------------- 148

II.2.6.3. Determinarea cantitativă a dialdehidei malonice cu
ajutorul acidului tiobarbituric
II.2.6.3.1. Dozarea malon dialdeidei în serul sanguin (adaptată
după metoda Phelps S., Harris W.,1993 şi metoda Truţia Eugen
et al., 1999)
II.2.6.3.2. Dozarea malon dialdehidei în ţesuturile animale
(adaptată după metoda Dobrian A. D. et al., 2001)
---------------------------- 149
---------------------------- 150
---------------------------- 151
II.2.6.4. Determinarea indicelui benzidinic ---------------------------- 153
II.3. ANALIZA STERIDELOR ---------------------------- 154
II.3.1. Dozarea colesterolului liber şi total în serul sanguin ---------------------------- 154
II.4. ANALIZA GLICEROFOSFATIDELOR ŞI
SFINGOFOSFATIDELOR
II.4.1. Determinarea cantitativă a fosfolipidelor totale din serul
sanguin
II.4.2. Separarea lipidelor din membranele biologice prin
cromatografia în strat subţire
II.5. DETERMINAREA CANTITATIVĂ A LIPOPROTEINELOR
SERICE PRIN METODA KUNKEL
II.6. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII UNOR ENZIME
IMPLICATE ÎN METABOLISMUL LIPIDELOR
---------------------------- 157
---------------------------- 157
---------------------------- 159
---------------------------- 161
---------------------------- 162
II.6.1. Determinarea activităţii lipazei ---------------------------- 162
II.6.1.1. Determinarea activităţii lipazei vegetale ---------------------------- 162
II.6.1.2. Determinarea activităţii lipazei din ţesuturile animale ---------------------------- 165
II. 7. DOZAREA UNOR PRODUŞI INTERMEDIARI ŞI FINALI AI
METABOLISMULUI LIPIDELOR
---------------------------- 166
II.7.1. Dozarea acizilor graşi liberi în serul sanguin ---------------------------- 166
II.7.2. Dozarea corpilor cetonici în sânge (metoda W. Neuweiler) ---------------------------- 168
ANEXĂ ---------------------------- 171
BIBLIOGRAFIE ---------------------------- 181