Metode de investigare a metabolismului glucidic si lipidic - PIM Copy

PIM

Profesor doctor 

Vlad ARTENIE 

Lector doctorand 

Eugen 

UNGUREANU 

Lector doctor 

Anca Mihaela 

NEGURĂ 

METODE DE INVESTIGARE 

A METABOLISMULUI 

GLUCIDIC ŞI LIPIDIC 

– manual de lucrări practice – 

EDITURA PIM 

2008

CUPRINS 

SECURITATEA MUNCII ÎN LABORATORUL DE BIOCHIMIE ---------------------------- I – VI 

I.1. DOZAREA GLUCIDELOR SOLUBILE ---------------------------- 1 

I.1.1. Dozarea monoglucidelor şi oligoglucidelor reducătoare în 

plante 

---------------------------- 1 

I.1.2. Dozarea zaharozei în plante ---------------------------- 6 

I.1.3. Dozarea glucozei în sânge (micrometoda colorimetrică cu 

orto-toluidină) 

---------------------------- 8 

I.1.4. Dozarea fructozei în plante ---------------------------- 11 

I.1.5. Dozarea hexozaminelor în serul sanguin ---------------------------- 13 

I.1.6. Dozarea acidului sialic în serul sanguin ---------------------------- 15 

I.1.7. Dozarea lactozei în lapte ---------------------------- 16 

I. 1. 8. Determinarea glucidelor solubile prin cromatografie în 

strat subţire 

---------------------------- 18 

I.2. DOZAREA UNOR POLIGLUCIDE ---------------------------- 21 

I.2.1. Dozarea amidonului în plante ---------------------------- 21 

I.2.2. Determinarea cantitativă a glicogenului în ţesuturile 

animale 

---------------------------- 23 

I.2.3. Dozarea mucopolizaharidelor în serul sanguin ---------------------------- 26 

I.3. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII UNOR ENZIME 

PARTICIPANTE ÎN ANABOLISMUL ŞI CATABOLISMUL 

GLUCIDELOR 

I.3.1. Enzime implicate în scindarea poliglucidelor şi 

oligoglucidelor 

---------------------------- 27 

---------------------------- 27 

I.3.1.1. Determinarea activităţii amilazelor ---------------------------- 27 

I.3.1.1.1. Determinarea activităţii α-amilazei în serul sanguin şi 

urină (Micrometoda Metais şi Bieth) 

I.3.1.1.2. Determinarea activităţii α-amilazei în salivă 

(Micrometoda Metais şi Bieth, adaptată de Vlad Artenie) 

I.3.1.1.3. Determinarea activităţii α-amilazei şi β-amilazei în 

plante (Metoda Noelting-Bernfeld, modificată parţial de Vlad 

Artenie) 

I.3.1.1.4. Determinarea activităţii α-amilazei şi β-amilazei 

sintetizate de microorganisme (Metoda Noelting-Bernfeld) 

---------------------------- 28 

---------------------------- 32 

---------------------------- 35 

---------------------------- 40 

I. 3. 1. 1. 5. Determinarea activităţii γ-amilazei ---------------------------- 41

I.3.1.1.6. Evidenţierea izoenzimelor α-amilazei şi β-amilazei 

cu ajutorul electroforezei în gel de poliacrilamidă 

(Metoda Vlad Artenie şi Marius Mihăşan) 

---------------------------- 43 

I.3.1.2. Determinarea activităţii α - glucan fosforilazei vegetale ---------------------------- 46 

I.3.1.3. Determinarea activităţii unor glicozidaze ---------------------------- 50 

I.3.1.3.1. Determinarea activităţii α - glucozidazei 

(Protocolul Worthington, adaptat de Vlad Artenie) 

---------------------------- 50 

I.3.1.3.2. Determinarea activităţii β - D - galactozidazei ---------------------------- 52 

I.3.1.3.3. Determinarea activităţii β - fructofuranozidazei ---------------------------- 55 

I.3.1.3.3.1. Determinarea activităţii β - fructofuranozidazei 

intestinale (Metoda I. S. Lukomskaja, modificată de Vlad Artenie) 

I.3.1.3.3.2. Determinarea activităţii β - fructofuranozidazei 

levuriene 

I.3.2. Enzime care catalizează diferite etape din metabolismul 

intermediar al monoglucidelor 

---------------------------- 55 

---------------------------- 57 

---------------------------- 59 

I.3.2.1. Determinarea activităţii fosfomonoesterazelor ---------------------------- 59 

I.3.2.1.1. Determinarea activităţii fosfomonoesterazelor alcalină şi 

acidă în serul sanguin 

I.3.2.1.1.1. Determinarea activităţii fosfomonoesterazei alcaline 

Metoda Bodansky 

I.3.2.1.1.2. Determinarea activităţii fosfomonoesterazei alcaline 

Metoda cu para – nitrofenilfosfat 

(Metoda Bessey, Lowry, Brock modificată) 

---------------------------- 60 

---------------------------- 60 

---------------------------- 62 

I.3.2.1.1.3. Determinarea activităţii fosfomonoesterazei acide ---------------------------- 64 

I.3.2.1.1.4. Determinarea activităţii fosfomonoesterazei acide în 

plante 

---------------------------- 66 

I.3.2.2. Determinarea activităţii glucozofosfat izomerazei ---------------------------- 69 

I.3.2.2.1. Determinarea activităţii glucozofosfat izomerazei în 

serul sanguin 

(metoda Bodansky cu unele modificaţii ale lui Korovkin) 

I.3.2.3. Determinarea activităţii fructozobisfosfat aldolazei 

În serul sanguin (metoda Kulganek şi Klaska) 

---------------------------- 69 

---------------------------- 72 

I.3.2.4. Determinarea activităţii lactat dehidrogenazei ---------------------------- 74 

I.3.2.4.1. Determinarea activităţii lactat dehidrogenazei 

în serul sanguin prin metoda Sevela şi Tovarek 

în modificaţia lui Korovkin (după Vlad Artenie şi Elvira Tănase) 

---------------------------- 74

I.3.2.4.2. Determinarea activităţii lactat dehidrogenazei 

în serul sanguin prin metoda Wroblewski şi La Due, modificată 

de Hill (după Vlad Artenie şi Elvira Tănase) 

I.3.2.4.3. Determinarea activităţii izoenzimelor 

lactat dehidrogenazei 

I.3.2.4.3.1. Determinarea izoenzimelor lactat dehidrogenazei 

în serul sanguin, prin adsorbţie pe DEAE-Sephadex 

(după Manta, Cucuianu, Benga, Hodârnău) 

I.3.2.4.3.2. Determinarea izoenzimelor LDH prin inactivare 

termică 

I.3.2.4.3.3. Determinarea activităţii fracţiunii lactat dehidrogenazei 

serice stabilă la uree 

I.3.2.4.3.4. Separarea şi identificarea izoenzimelor lactat 

dehidrogenazei prin electroforeză în gel de poliacrilamidă 

---------------------------- 76 

---------------------------- 77 

---------------------------- 78 

---------------------------- 78 

---------------------------- 79 

---------------------------- 80 

I.3.2.5. Determinarea activităţii alcool dehidrogenazei ---------------------------- 83 

I.3.3. Enzime participante la oxidarea biologică a 

substratelor organice 

I.3.3.1. Determinarea activităţii succinat dehidrogenazei metoda 

Harish Padh Adaptată de Vlad Artenie 

I.3.3.2. Determinarea activităţii dehidrogenazei acidului succinic 

metoda cu trifeniltetrazoliu 

---------------------------- 85 

---------------------------- 85 

---------------------------- 87 

I.3.4. Enzime implicate în etapa finală a oxidării biologice ---------------------------- 88 

I.3.4.1. Determinarea activităţii adenozintrifosfatazei ---------------------------- 88 

I.3.4.1.1. Determinarea activităţii ATP-azei în ţesuturile animale ---------------------------- 89 

I.3.4.1.2. Determinarea activităţii ATP-azei în plante ---------------------------- 91 

I.3.4.2. Determinarea activităţii catalazei ---------------------------- 93 

I.3.4.2.1. Determinarea activităţii catalazei în sânge 

(Metoda Bach-Zubkova) 

I.3.4.2.2. Determinarea activităţii catalazei în plante 

prin titrare iodometrică Metoda J. B. Sumner şi G. F. Somers, 

modificată de Vlad Artenie 

I.3.4.2.3. Determinarea spectrofotometrică a activităţii catalazei 

(Metoda Sinha) 

I.3.4.3. Determinarea activităţii peroxidazei (Metoda L. V. 

Gudkova şi R. G. Degtiari) 

---------------------------- 93 

---------------------------- 94 

---------------------------- 97 

---------------------------- 100 

I.3.4.4. Determinarea activităţii glutation peroxidazei ---------------------------- 103

I.3.4.4.1. Determinarea activităţii glutation peroxidazei 

în serul sanguin Metoda Fukuzawa şi Tokumura 

adaptată de Costel Darie şi Vlad Artenie 

I.3.4.4.2. Determinarea activităţii glutation peroxidazei 

în ţesuturile animale Metoda Fukuzawa şi Tokumura 

I.3.4.5. Determinarea activităţii superoxid dismutazei metoda 

Winterbourn, Hawkins, Brian şi Carrell adaptată de Vlad Artenie 

I.3.4.6. Determinarea activităţii ascorbat oxidazei în plante 

metoda M. F. Oberbacher şi H. M. Vines 

I.4. DOZAREA UNOR PRODUŞI INTERMEDIARI ŞI FINALI AI 

METABOLISMULUI GLUCIDIC 

---------------------------- 103 

---------------------------- 105 

---------------------------- 108 

---------------------------- 111 

---------------------------- 113 

I.4.1. Dozarea acidului piruvic ---------------------------- 113 

I.4.2. Dozarea acidului lactic 

Metoda Barker şi Summerson modificată 

I.4.3. Determinarea cantitativă a alcoolului etilic 

Metoda Martin – Boiden 

---------------------------- 116 

---------------------------- 120 

I.4.5. Dozarea acidului adenozintrifosforic (ATP) în ţesuturile vii ---------------------------- 125 

II.1. DOZAREA LIPIDELOR TOTALE ---------------------------- 127 

II.1.1. Dozarea lipidelor totale în ţesuturile animale (metoda Folch 

şi colaboratori, Modificată de I. F. Dumitru) 

II.1.2. Dozarea lipidelor totale în serul sanguin 

(metoda cu reactivul sulfofosfovanilc) 

---------------------------- 127 

---------------------------- 129 

II.2. ANALIZA TRIACILGLICEROLILOR ---------------------------- 131 

II.2.1. Determinarea cantitativă a triacilglicerolilor în plante ---------------------------- 131 

II.2.1.1. Determinarea cantitativă a triacilglicerolilor în plante prin 

metoda Soxhlet indirectă 

II.2.2. Dozarea triacilglicerolilor în serul sanguin (metoda Tixier şi 

Claude) 

---------------------------- 131 

---------------------------- 134 

II.2.3. Determinarea indicelui de aciditate ---------------------------- 137 

II.2.4. Determinarea indicelui de saponificare ---------------------------- 139 

II.2.5. Determinarea indicelui de iod (metoda Hanus) ---------------------------- 142 

II.2.6. Metode de determinare a unor produşi rezultaţi în oxidarea 

peroxidică a lipidelor în organismele vii 

---------------------------- 145 

II.2.6.1. Determinarea indicelui peroxidic ---------------------------- 145 

II.2.6.2. Determinarea spectrofotometrică a conjugării dienice a 

acizilor graşi superiori nesaturaţi (metoda I. D. Stalinaja) 

---------------------------- 148

II.2.6.3. Determinarea cantitativă a dialdehidei malonice cu 

ajutorul acidului tiobarbituric 

II.2.6.3.1. Dozarea malon dialdeidei în serul sanguin (adaptată 

după metoda Phelps S., Harris W.,1993 şi metoda Truţia Eugen 

et al., 1999) 

II.2.6.3.2. Dozarea malon dialdehidei în ţesuturile animale 

(adaptată după metoda Dobrian A. D. et al., 2001) 

---------------------------- 149 

---------------------------- 150 

---------------------------- 151 

II.2.6.4. Determinarea indicelui benzidinic ---------------------------- 153 

II.3. ANALIZA STERIDELOR ---------------------------- 154 

II.3.1. Dozarea colesterolului liber şi total în serul sanguin ---------------------------- 154 

II.4. ANALIZA GLICEROFOSFATIDELOR ŞI 

SFINGOFOSFATIDELOR 

II.4.1. Determinarea cantitativă a fosfolipidelor totale din serul 

sanguin 

II.4.2. Separarea lipidelor din membranele biologice prin 

cromatografia în strat subţire 

II.5. DETERMINAREA CANTITATIVĂ A LIPOPROTEINELOR 

SERICE PRIN METODA KUNKEL 

II.6. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII UNOR ENZIME 

IMPLICATE ÎN METABOLISMUL LIPIDELOR 

---------------------------- 157 

---------------------------- 157 

---------------------------- 159 

---------------------------- 161 

---------------------------- 162 

II.6.1. Determinarea activităţii lipazei ---------------------------- 162 

II.6.1.1. Determinarea activităţii lipazei vegetale ---------------------------- 162 

II.6.1.2. Determinarea activităţii lipazei din ţesuturile animale ---------------------------- 165 

II. 7. DOZAREA UNOR PRODUŞI INTERMEDIARI ŞI FINALI AI 

METABOLISMULUI LIPIDELOR 

---------------------------- 166 

II.7.1. Dozarea acizilor graşi liberi în serul sanguin ---------------------------- 166 

II.7.2. Dozarea corpilor cetonici în sânge (metoda W. Neuweiler) ---------------------------- 168 

ANEXĂ ---------------------------- 171 

BIBLIOGRAFIE ---------------------------- 181

Metode de investigare a metabolismului glucidic si lipidic - PIM Copy

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?