Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
ekletilerek fikse edilmiştir ve çıkartılıp bir kurutma kağıdı ile lamın kenarından<br />
boyanın fazlası alınmıştır, solüsyon 2’de 7 saniye, solusyon 3’te 7 saniye<br />
bekletildikten sonra çıkartılıp bir kurutma kağıdı ile lamın kenarından boyanın fazlası<br />
alınıp, musluk altında dikkatlice yıkanmıştır. Sonrasında yine oda sıcaklığında<br />
kurumaya bırakılmıştır. Yıkanmış preparatlarda da Diff-Quik boyama metodu aynı<br />
şekilde yapılmıştır.<br />
Sperm yıkama için değişik yıkama mediumları vardır .Biz bu çalışmada<br />
Spermfilter (Cryos, Aarhus, Danimarka) ve Spermwash (Cryos, Aarhus, Danimarka)<br />
mediumlarını kullandık.<br />
Spermfilter, silana kaplı silika jel parçacıklar içeren fosfat ve Hepes tamponlu<br />
bir izotonik tuz solüsyonudur. Spermfilter solüsyonunun, %100’lük solüsyonunu<br />
seyreltmek için farklı yöntemler kullanılabilir. Mesela 8 ml %80’lik ve 8 ml %40’lık<br />
spermfilter hazırlamak için; 9.6 ml %100’lük spermfilter ve 2.4 ml Spermwash<br />
(Cryos, Danimarka) dikkatlice karıştırılır. %40’lık spermfilter için ise 4 ml %80’lik<br />
gradient ile 4.0 ml spermwash medium karıştırılır. Spermwash medium EBSS içinde<br />
(Earle’s dengeli tuz solüsyonu); HSA, purivat, Hepes, fenol kırmızısı, sodyum<br />
bikarbonat ve 10 mikrogram/ml gentamisin içerir.<br />
Yıkama yapılan grupta; her deney için kapaklı steril tüpe dikkatlice 2 ml %80<br />
ve %40 spermfilter gradientlerden ikisi koyuldu. Karışmamasına dikkat edildi.<br />
Genellikle iki gradient kullanılması önerilir. Kullanılmadan önce bütün solüsyonlar oda<br />
sıcaklığına getirildi. 2 ml likefiye olmuş semen hazırlanan gradientlerin üzerine<br />
dikkatlice koyuldu. 20 dakika 300g’de santrifüj edildi. Steril bir Pastör pipeti<br />
kullanarak süpernatan atıldı. Pellet oluşmayan vakalarda santrifüj işlemini 10 dakika<br />
daha tekrar edildi. Spermi 2.5-5 ml spermwash medium ile yeniden süspanse edildi,<br />
yaklaşık 5 dakika bu solüsyon içinde bırakıldı ve 10 dakika daha santrifüj edildi.<br />
Süpernatan atıldı ve aynı işlemi bir defa daha tekrar edildi. Tüpün dibindeki sperm<br />
yumağının üzerine Spermwash koyularak istenilen konsantrasyon elde edildi.<br />
Yukarıda tariflenen boyama işlemli aynı şekilde yıkanmış örneklere de<br />
uygulanır ve arka planı minimal boyanmış, iyi kontrast ve renk diferansiasyonu<br />
sağlanan preparatlar hazırlanır.<br />
40
Change language