DOÇ. DR. H. METE ÇEK BL
08.03.2014 • Views
Share Embed Flag

DOÇ. DR. H. METE ÇEK BL

DOÇ. DR. H. METE ÇEK BL

DOÇ. DR. H. METE ÇEK BL

SHOW MORE
SHOW LESS
ePAPER READ
DOWNLOAD ePAPER
istanbulsaglik.gov.tr

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.

START NOW

T.C.<br />

SAĞLIK BAKANLIĞI<br />

TAKSİM EĞİTİM VE ARAŞTIRMA HASTANESİ<br />

I. ÜROLOJİ KLİNİĞİ<br />

Klinik Şefi: DOÇ. <strong>DR</strong>. H. <strong>METE</strong> ÇEK<br />

BİLGİSAYAR DESTEKLİ SEMEN ANALİZ SİSTEMİ (CASA) İLE YAPILAN<br />

SPERM MORFOLOJİSİ İNCELEMELERİNİN TEKRARLANABİLİRLİĞİ ,<br />

DEĞİŞKEN ANALİZLERİ VE LABORATUAR İÇİ MANUEL YÖNTEMLE<br />

KARŞILAŞTIRILMASI<br />

(Uzmanlık Tezi)<br />

<strong>DR</strong>. AHMET ÖZGÜR GÜÇTAŞ<br />

İstanbul-2006<br />

1

T.C.<br />

SAĞLIK BAKANLIĞI<br />

TAKSİM EĞİTİM VE ARAŞTIRMA HASTANESİ<br />

I. ÜROLOJİ KLİNİĞİ<br />

Klinik Şefi: DOÇ. <strong>DR</strong>. H. <strong>METE</strong> ÇEK<br />

BİLGİSAYAR DESTEKLİ SEMEN ANALİZ SİSTEMİ (CASA) İLE YAPILAN<br />

SPERM MORFOLOJİSİ İNCELEMELERİNİN TEKRARLANABİLİRLİĞİ ,<br />

DEĞİŞKEN ANALİZLERİ VE LABORATUAR İÇİ MANUEL YÖNTEMLE<br />

KARŞILAŞTIRILMASI<br />

(Uzmanlık Tezi)<br />

<strong>DR</strong>. AHMET ÖZGÜR GÜÇTAŞ<br />

İstanbul-2006<br />

Tez Danışmanı: Doç. Dr. H. Mete ÇEK<br />

Op. Dr. Muammer AYDIN<br />

i

TEŞEKKÜR<br />

Uzmanlık eğitimim süresince bilimsel ve sosyal kişiliği ile deneyimlerinden<br />

yararlandığım Klinik Şefim Sayın Doç. Dr. H.Mete Çek’e ,<br />

Temel eğitimimde büyük emeği geçen Klinik Şef Yardımcılarımız Sayın Op.Dr.<br />

Muammer Aydın ve Adem Fazlıoğlu’na, Başasistanlar Op.Dr.Şener Karaca, Op.Dr.<br />

Metin Evirgen ve bize her konuda yardımcı olan ve destekleyen Op.Dr.Fatih<br />

Kurtuluş’a,<br />

Asistanlığım süresince beraber çalışma fırsatı bulduğum Dr. İnanç Yılmaz, Dr.<br />

Egemen Avcı, Dr. Tuncer Şenkul, Dr. Oğuzhan Parlakkılıç, Dr. Zafer Yüzüak, Dr.<br />

Gökhan Gürsoy, Dr. Yılmaz Salman, Dr. Zafer Tandoğdu ve birlikte çalıştığım ve<br />

ismini sayamadığım tüm uzman, asistan, hemşire ve personel arkadaşlarıma,<br />

Tez çalışmamda benden yardımlarını esirgemeyen Sayın Dr. Fahri Kılıç ve<br />

Anatomi Laboratuarı çalışanlarına,<br />

Birlikte çalışma fırsatı bulduğum ve asistanlığımda emeği geçen tüm II. Üroloji<br />

çalışanlarına,<br />

Benden desteğini esirgemeyen aileme ve eşime,<br />

teşekkür ederim.<br />

Dr. Ahmet Özgür Güçtaş<br />

ii

İÇİNDEKİLER<br />

GİRİŞ VE AMAÇ……………………………………………….1<br />

GENEL BİLGİLER……………………………………………...3<br />

I)Üreme Anatomisi ve Histolojisi……………….3<br />

II) Erkek Hipotalamo-Hipofizer-Gonadal Aksı ..7<br />

III) Germinal Hücreler ve Spermatogenez……..9<br />

IV) İnfertil Erkeğin Değerlendirilmesi………….13<br />

V) CASA…………………………………………….20<br />

MATERYAL VE METOD……………………………………….39<br />

BULGULAR………………………………………………………42<br />

TARTIŞMA………………………………………………………..48<br />

SONUÇ……………………………………………………………52<br />

KAYNAKLAR……………………………………………………53<br />

iii

GİRİŞ VE AMAÇ<br />

Normal sperm morfoloji yüzdesi in vitro koşullarda erkek fertilitesini<br />

öngörmede en güçlü semen parametresidir (1). Fakat vizüel sperm morfoloji<br />

incelemelerindeki değişimler sonrasında artık bu fikir tartışılmaya başlanmıştır (2).<br />

Otomatize sperm morfoloji değerlendirilmesinin, manuel sperm morfoloji<br />

incelemelerinin hatalarını, subjektivitesini, laboratuar içi ve laboratuarlar arası<br />

gözlemci farklılıklarını elimine etme potansiyeli vardır. Son yıllarda sperm morfoloji<br />

incelemesi yapan bilgisayar sistemleri yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır, ama<br />

bu sistemlerin gerçek potansiyelleri henüz anlaşılamamıştır. Bilgisayar destekli<br />

semen analiz sistemleri, normal sperm morfolojisi değerlendirmek için Kruger’in kesin<br />

kriterlerini (strict kriter) kullanır.<br />

‘Strict kriter’ konsepti 1980’li yılların başlarında internal servikal ostium<br />

seviyesinde bulunan homojen spermatozoa populasyonu temelinde ortaya çıkmıştır<br />

(3). Strict kriterleri göz önüne almak suretiyle ve normal sperm morfolojisi<br />

sonuçlarının prognostik değerini test eden ilk çalışmada fertilizasyon oranı % 82.5 ve<br />

normal form yüzdesi > %14 olan grupta hamilelik oranı %25.8 bulunmuştur (4).<br />

Normal formların yüzdesi ≤ %14 olduğunda ise, fertilizasyon % 37.0 olarak<br />

bulunurken hamilelik sağlanamamıştır. Diğer bir çalışmada, fertilizasyon için normal<br />

sperm morfolojisi cut-off değeri (≤ % 4, p-paterni) saptanmıştır (5). Daha sonra,<br />

birçok uluslararası yayında % 5’lik normal sperm morfolojisi cut-off değerinin<br />

prognostik önemi konfirme edilmiştir (1). Van der Merwe ve arkadaşlarının GIFT (<br />

Gamete Intrafallopian Tube Transfer) programındaki hastalarda, normal sperm<br />

morfolojisi oranları ≤ %14 olan grupta, normal morfolojisi > %14 gruba kıyasla<br />

hamilelik oranlarını daha düşük bulmuşlardır (6).<br />

Menkveld ve arkadaşlarının yaptıkları bir çalışmada sperm morfolojisi<br />

değerlendirmesi için strict metod kullanıldığında laboratuar içi ve laboratuarlar arası<br />

verilerinde mükemmel bir korelasyon bulmuşlardır (3). Subjektif metodlar, genel<br />

olarak özellikle değişik laboratuarlar göz önüne alındığında başarılı bilgi transferi için<br />

çok iyi bir iletişime ihtiyaç duyarlar. Teoride, sperm morfolojisi için hazırlanmış<br />

bilgisayar programları insanın spermatozoayı normal ve anormal olarak ayırabilme<br />

1

üstünlüğü yoluyla testi daha objektif ve tekrar uygulanabilir hale getirmeyi<br />

hedeflerler(7).<br />

Hamilton Thorn Research (HTR) İVOS (integrated visual optical system)<br />

semen analiz sistemi, sperm morfoloji değerlendirmesinde, şekil analizi ve aksiyel<br />

ölçümleri kombine eden ilk sistemdir. ‘signature image processing method’ ile sperm<br />

hücresinin başı bir elipsle işaretlenir (şekil analizi), buna ek olarak hücre boyutları<br />

ölçülür ve sperm incelenir (7). Tüm incelemeler strict kriter göz önüne alınarak yapılır.<br />

Bu metodun avantajı, doğru oranlara sahip olan bir hücre başını, eğer o hücre<br />

düzensiz bir dış hatta sahip, bükük ya da biçimi bozulmuş ise anormal olarak<br />

sınıflayabilmesidir. Akrozom incelemesi de sınıflama yönteminin bir parçasıdır ve<br />

fertilizasyonda çok önemlidir. Garrett ve arkadaşları, otomatize sistem kullanarak<br />

akrozomal morfoloji ile spermatozoanın zona pellusidaya tutunması arasında ilişki<br />

bulmuşlardır (8).<br />

Yeni otomatize bir sistem geliştirirken en önemli amaç bunun rutin erkek<br />

infertilitesi teşhis metodlarından biri haline gelmesidir.<br />

Bu çalışmada, Hamilton Thorn Research iVOS (versiyon 12), (sperm morfoloji<br />

analizörü 32 bit versiyonu 1.5a) semen analizörünün sperm morfolojisi<br />

incelenmesinde tekrarlanabilir bir yöntem olup olmadığı, değişken analiz sonuçları<br />

ve morfoloji değerlendirme yüzdelerinin manuel metod ile uyumlu olup olmadığı<br />

araştırılmıştır.<br />

2

GENEL BİLGİLER<br />

ÜREME ANATOMİSİ VE HİSTOLOJİSİ<br />

Embriyolojik olarak aynı kaynaktan köken alsalar da, üreme sistemi erkekte ve<br />

kadında oldukça farklı histolojik yapı gösterir (9,10). Erkek üreme sistemi testisler,<br />

genital kanallar, yardımcı bezler ve penis olmak üzere dört yapıdan oluşur (11,12).<br />

Ana organ olarak kabul edilen testislerde sürekli üretim ile gamet hücreleri<br />

olarak bilinen spermler üretilir. Bu işlem tümüyle spermatogenez olarak adlandırılır.<br />

Genital kanallar, spermin olgunlaşması, taşınması ve depolanması ile ilgilidir.<br />

Yardımcı bezler, ejakülata katılan karışık salgıları üreten, genital sistemin<br />

kanalları boyunca yerleşmiş bezlerdir. Penis ise, erkekte cinsin kopulasyon organı<br />

olarak hem ejakülatı vajinaya taşır hem de üretilen idrarın vücuttan atılmasını sağlar.<br />

Testislerde üretilen spermler, epididimde depo edilir. Ejakülasyon olduğunda,<br />

duktus deferense geçer, seminal vezikül, prostat ve bulboüretral bezlerin salgılarını<br />

da alarak üretraya geçer ve penisten dışarı atılır. Bu sıvıya ejakülat denir.<br />

Testisler<br />

Testisler hem spermleri üretir hem de androjenleri üreterek salgılar. Bunlar<br />

düşünüldüğünde testisler, bileşik, tübüler, halokrin, iç salgı ve dış salgı bezi olarak<br />

kabul edilebilir. Bu yüzden hormonal kontrol düzeneği testislerin düzenli çalışması<br />

için gereklidir. Hormonal kontrol düzeneği, hipofiz-Leydig ve Sertoli hücreleri<br />

arasındaki düzgün ilişkilerle ayarlanır. Bu ilişkilerde endokrin ve parakrin yollar<br />

kullanılır (9-14).<br />

3

Testisler dıştan kalın, gergin ve bağ dokusundan zengin bir kapsül ile sarılıdır.<br />

Bu kılıf tunika albuginea olarak adlandırılır. Kapsül üst kısımda kesintiye uğrar.<br />

Burası mediastinum testis ve epididim’in yerleştiği yerdir (11).<br />

Mediastinumda, tunika albugineadan testisin içine doğru kesintili bağ dokusu<br />

bölmeleri uzanır. Bunlarda, septula testis adıyla testisi piramidal bölmelere ayıran<br />

interstisyumun elemanlarıdır. Piramidal bölmeler (lobüller) her testiste 250-400 adet,<br />

tabanları testisin kapsülüne, uç kısımlarıda mediastinuma uzanan yapılardır. Testise<br />

ilişkin damar ve sinirler septalar aracılığı ile interstisyuma ulaşırlar (11,12,15).<br />

Testiküler lobüllerin her biri, 1-4 adet, çok kıvrımlı tübül yapısı taşır. Bu<br />

tübülller kör bir uçla başlayıp mediastinum testise ulaşırlar. Her seminifer tübül 30-70<br />

cm uzunluğa ve 150-250 mm çapa sahiptir. Seminifer tübüller insan testisinin % 66<br />

kadarını oluşturur (Şekil 1). Erişkin bir erkekte, her testisin ağırlığı yaklaşık 12 gr ve<br />

hacmi 15-20 ml’dir. Boyutları 2.5x3x4.5 cm kadardır (11).<br />

Şekil 1 Testis anatomisi<br />

4

Testisin damar, lenfatik ve sinir sistemi<br />

Testisler esas olarak aortanın lomber vertebra hizasından ayrılmış bir dalı olan<br />

internal spermatik arterle beslenir. Ayrıca, internal iliaktan dal alan vaz deferensin<br />

arteri ve eksternal iliaktan dal alan eksternal spermatik arterle beslenir (Şekil 2).<br />

Testiste tübüller arasında arterlere ve kapillerlere ayrılarak interstisyumda tübüller<br />

yakınlarında ağlar oluşturur. Kapiller endoteli fenestrasyon göstermez (11,15,16).<br />

Lenfatikler, seminifer tübüllerin peritübüler hücrelerine ve Leydig hücrelerine<br />

yaklaşan geniş labirentler oluştururlar. Lenf damarları, septula testisteki ve tunika<br />

albugineadaki geniş lenf damarlarına boşalırlar. Buradanda lomber aortik lenf<br />

düğümlerine ulaşırlar.<br />

Kapiller, tübüller arası venlere boşalırlar, bunlarda ışınsal venlerle birleşir ve<br />

venöz pleksuslara açılırlar. Testiste dönüş, pampiniform pleksusta sonlanır. Venöz<br />

kanallardan oluşan bu sistemde, venlerle arterler çok yakın seyreder (17).<br />

Sinirler, testiküler arterlere yakın seyreden testiküler pleksusu oluştururlar.<br />

Hem sinaptik vazomotor lifler hem de duysal lifler vardır. Testisler basınç ve ağrı<br />

hissine karşı hassastırlar (16,18).<br />

Şekil 2. Testisin damarsal anatomisi<br />

5

Peritübüler doku<br />

Seminifer tübüller, dışlarından sınırlayıcı bir doku ile sarılmışlardır. Buna<br />

tunika propria, lamina propria, sınırlayıcı membran veya yaygın olarak peritübüler<br />

doku ismi verilmektedir. Bağ dokusu ile desteklenmiş bu doku, seminifer tübülleri,<br />

tübüller arası dokudan ayırır. Tübüller arası dokunun damar ve sinirleri peritübüler<br />

dokuyu aşamazlar. Bu nedenle de seminifer tübüller damarsız yapılardır. Peritübüler<br />

doku, değişik türlerde farklılık gösterirse de genel düzenlenmesinde hücresiz ve<br />

hücreli katlar içerir (11-13,19).<br />

Hücresiz katlar, kollajen liflerle desteklenmiş fibriller ve glikoproteinlerden<br />

zengin bir ara madde taşır. Bu kat, kimyasal yapısı ile ilgili olarak, PAS (+) tepki<br />

verir.<br />

Hücreli katta, fibroblast benzeri yassı myoid hücreler vardır. Bu hücreler düz<br />

kas hücrelerine ve fibroblastlara benzeyen özellikler gösterir. Sitoplazmasında<br />

fibroblast hücrelerinde görülen düzgün yüzeyli endoplazmik retikulumu (SER),<br />

miyofibril ve miyoflamentlere sıklıkla rastlanır. Bu hücrelerin düzenli kasılmaları ile<br />

seminifer tübül içinde pasif hareket eden spermatogonyal hücrelerin lümene doğru<br />

hareketleri kolaylaştırılır (11,12,20).<br />

Seminifer tübül enine kesitlerine bakılırsa bazal membranla sınırlanmış bir sıra<br />

epitelyum hücresi bazalden lümene kadar dizilmiştir. Bu epitele germinal epitelyum<br />

veya seminifer epitel denir. Germinal epitel içinde iki tip hücre bulunur. Bunlardan<br />

birisi destek hücreleri şeklinde Sertoli hücreleri, diğeri ise spermatojenik veya<br />

germinal hücrelerdir. Bunlar, farklı bölünme ve olgunlaşma süreçleri geçiren germ<br />

hücre birliği oluştururlar (11,12).<br />

Normalde peritübüler doku, interstisyumdan tübül içine madde geçişini<br />

engellemez. Zaten germinal epitelyumun beslenmesi, perfüzyon yolu ile peritübüler<br />

dokunun geçirgenliği aracılığında olur (11,12,21).<br />

6

ERKEKTE HİPOTALAMO-HİPOFİZER-GONADAL AKS<br />

Erkek reprodüktif fonksiyonu, hipotalamus, pitüiter bez ve testisler olmak üzere<br />

üç sıradan oluşan reprodüktif aks tarafından kontrol edilmektedir. Aksın üst iki<br />

sırasının her ikisi de bir sonraki alt seviyede hormon sekresyonunda rol alan endokrin<br />

sinyal moleküllerini üretirler. Böylece, median eminens‘e yönelen aksonlarla preoptik<br />

alanda lokalize hipotalamik nöronlar, hipotalamohipofizer şant ile pituiter bezin kan<br />

damarlarının yaptığı portal sistem içine gonadotropin salıveren hormonu (GnRH)<br />

sekrete ederler. Anterior pitüiter bez (adenohipofiz) gonadotropin sekresyonu için<br />

özelleşmiş olan gonadotroplar ya da hücreler içerirler. Gonadotrop’ların sekretuar<br />

aktivitesi GnRH tarafından uyarılır. Pituiter gonadotroplar tarafından sekrete edilen<br />

iki gonadotropin, luteinize edici hormon (LH) ve folikül stimüle edici hormondur (FSH).<br />

GnRH’ya ilave olarak , dimerik peptid yapısındaki aktivinin de hipofizdeki lokal üretimi<br />

ile FSH sekresyonunu stimüle eder (22). Her iki gonadotropin, kan dolaşımına<br />

karıştıktan sonra, FSH, Sertoli hücreleri stimülasyonu ile seminifer tübül<br />

epitelyumunda spermatogenezi uyarırken; LH, interstisyumdaki Leydig hücrelerinden<br />

testosteron üretimini sağlamak için testislere ulaşırlar. Testosteron (T) sekresyonu ve<br />

sperm üretim hızı ile üst reprodüktif aks arasında, negatif feed-back ilişkiyi sağlayan<br />

bir ağ tarafından çok iyi bir şekilde düzenlenmiştir. Testosteron ve onun metaboliti<br />

olan östrodiol; GnRH , nöronları ve gonadotropların sekretuar aktivitesini baskılar.<br />

Primer olarak Sertoli hücrelerinden sekrete edilen ve bir glikoprotein olan<br />

inhibin , gonadotroplarda FSH sekresyonunu inhibe eder. İnsan Sertoli hücreleri<br />

tarafından sekrete edilen inhibin formu, α ve β alt gruplarının bir heterodimer yapısı<br />

olan β alt grubunun B varyantına sahip olduğu için inhibin B olarak adlandırılır (23).<br />

İnhibin B selektif olarak, FSH’nın β subünitini kodlayan genlerin transkripsiyonunu<br />

inhibe ederek, gonadotroplarda FSH sekresyonunu inhibe eder (24). Bozulmuş<br />

testiküler fonksiyonun belirlenmesinde bir belirleyici olarak inhibin B kullanımı<br />

tartışmalıdır (25).<br />

Erkek fetusun intrauterin gelişimi sırasında Leydig hücreleri, seminifer tübüller<br />

arasındaki testisin bağ doku stromasının mezenkimal prekürsör hücrelerinden<br />

diferansiye olur. Bu süreç gebeliğin 7. haftasından itibaren oluşmaya başlar ve bu<br />

7

dönemde fetal dolaşımda androjenler saptanır hale gelir. Leydig hücrelerinin<br />

steroidogeneze başlaması ile androjen bağımlı erkek üreme sistemi de farklılaşmaya<br />

başlar. Erken gebelik döneminde fetal hipofiz FSH ve LH sentezleme, depolama ve<br />

yüksek konsantrasyonlarda sekrete etme yeteneğine sahiptir. Gebeliğin ortalarında<br />

FSH ve LH pik yapar. Gebeliğin son dönemlerinde FSH ve LH düzeylerinin düşmesi<br />

hipotalamo-hipofizer-gonadal (HHG) aksın gonadal steriodlere negatif feedback<br />

yanıt vermesine bağlıdır (26). Ancak anensefalik fetuslarda Leydig hücre gelişiminin<br />

devam etmesi gonadotropinlerin şart olmadığını göstermektedir. İntrauterin dönemde<br />

plasentadan salgılanan insan koriyonik gonadotropin (hCG), Leydig hücre gelişimi ve<br />

androjen sentezinden sorumludur (27,28).<br />

Doğumdan sonra maternal hCG uyarısının kesilmesine bağlı olarak Leydig<br />

hücrelerinde kısa süreli bir regresyon gözlenir. Yaşamın 2-3. aylarında tekrar Leydig<br />

hücre diferansiasyonu başlar ve kısa süreli bir serum T yükselmesi gözlenir. Bu<br />

etkinin gonatropin yükselmesine bağlı olduğu düşünülmektedir. Yaşamın ilk 2-6<br />

aylarında oluşan bu androjen artışının hipotalamus, karaciğer, penis, prostat ve<br />

skrotum gibi androjen bağımlı organların tanınması ve yaşamın daha sonraki<br />

dönemlerinde etkileşimleri için gerçekleştiği sanılmaktadır. Nitekim yeni doğan<br />

döneminde bu androjen artışını gerçekleştiremeyen erkek bebeklerin pubertal<br />

androjen bağımlı penis büyümelerinin yetersiz kaldığı bildirilmiştir (29).<br />

Bundan sonra pubertal gelişime kadar Leydig hücreleri tekrar regresyona<br />

uğramakta, testisler ve HHG aks sessiz bir döneme girmektedir. Serum LH ve FSH<br />

düzeyleri 6-8, T düzeyi ise 10-12 yaşlarında dereceli olarak artmaya başlar ve LH<br />

düzeyi erişkin dönemde 116 kat artış gösterir. Hipotalamustan GnRH ‘nın pulsatil<br />

salınımı 12 yaş civarında oturmaya başlar. Puberte döneminde GnRH’nın pulsatil<br />

salınımının geceleri daha fazla olması kismen de olsa pineal bezden salgılanan<br />

melatonin hormonunun gece aktivitesinin azalmasına bağlıdır. Gonadostat hipotezine<br />

göre puberte dönemine kadar HHG aksın sessiz kalmasını sağlayan mekanizmalar,<br />

melatonin hormonunun hipersekresyonu ve T’un 5α –reduktaz ve 3α- hidroksisteroid<br />

dehidrogenaz enzimleri ile daha zayıf feedback etkileri olan dihidro testosteron (DHT)<br />

ve androstenodiol gibi androjenlere dönüşümü ile olmakta ve bu dönemde testisler<br />

steroidogenez yeteneği kazanmaktadır. Puberteye geçiş, bunların dışında beslenme<br />

durumu ve vücudun büyüme hızından da etkilenmektedir. Büyüme hormonu (GH) ve<br />

8

parakrin mediatörü olan insulin benzeri büyüme faktörü -1‘inde (IGF-1) üreme sistemi<br />

üzerinde uyarıcı etkileri olduğu gösterilmiştir (30). Yakın zamanda yapılmış bazı<br />

çalışmalarda, vücutta yağ dokularının dağılımından sorumlu bir sitokin olan leptinin<br />

puberte gelişiminde ve HHG aksın modülasyonunda rol aldığı, leptin reseptör geni<br />

defektlerinde erken obezite ve pubertal gecikme olduğu bildirilmiştir (30,31). Leptinin<br />

gonadotropin salınımını artırdığı (32), testiste reseptörleri olduğu ve burada inhibitör<br />

etki gösterdiği bildirilmesine rağmen, etki mekanizması henüz tam olarak<br />

anlaşılamamıştır (33).<br />

GERMİNAL HÜCRELER VE SPERMATOGENEZ<br />

Germinal hücreler; spermatogonyum, spermatosit, spermatid ve<br />

spermatozoonlardır (11,12,14).<br />

Bunlar primordial germ hücrelerinden köken alan gonositlerden kaynağını<br />

alırlar. Hem dişide hem de erkekte ilk primordial germ hücreleri 4. haftada yolk sac<br />

endodermi duvarında gelişerek gonad taslaklarına doğru yol alır. Gonadların<br />

oluşmasını işaret eden ilk belirtiler 5. haftada başlar. Seminifer tübül bazal membranı<br />

üzerinde oturan spermatogonyumlar, küçük diploid germ hücreleridir, puberteye<br />

kadar bölünmezler (34,35). Doğumdan önceki dönemde ortaya çıkan germ<br />

hücrelerinde üç tür spermatogonyum gelişir. Bunlar açık tip A (Ap), koyu tip A (Ad)<br />

ve B tipi spermatogonyumlardır. B tipi spermatogonyumlar primer spermatositlerle<br />

süreklilik sağlar. Yani tip B spermatogonyumların son mitoz bölünmesinden sonra<br />

primer spermatositler ortaya çıkar. Gonositlerden üreyen ilkel spermatogonyumun<br />

ileri derecede özelleşmiş spermatozoon haline gelinceye kadar geçirdiği sürece<br />

spermatogenez denir (11,12).<br />

Spermatogonyumlar<br />

Açık veya soluk A tipi spermatogonyumlar B tiplerinden daha azdır. Oval veya<br />

yuvarlak şekilli bu hücreler her zaman bazal lamina üzerine otururlar. Hücre şekline<br />

uyum gösteren yuvarlak veya oval çekirdeği ince kromatinlidir. Genelde tek bir<br />

nukleolus görülür. A tipi spermatogonyumların sitoplazmasında organeller<br />

dağınıktır. Mitokondri yuvarlak şekillidir ve çekirdek yakınında bulunur. Belirgin golgi<br />

9

kompleksi ve dağınık ribozomlar izlenir. Mitokondriyumlar genellikle 3-5 tanesi bir<br />

arada, homojen RNA’dan zengin yoğun bir madde ile birleşmiş görülürler. Açık A tipi<br />

spermatogonyumlar yedek hücrelerdir. Gerektiğinde spermatogenezi başlatmak için<br />

devreye girerler (11,12,14).<br />

Koyu A tipi spermatogonyumların bir türü de bazal lamina ile bağlantıları en<br />

çok olan, uzamış spermatogonyumlar olarak tarif edilmiştir. Bunlar koyu bazofilik<br />

boyanan, oval heterokromatik nukleuslara sahip, küçük hücrelerdir (35,36). Seminifer<br />

epitelyumun kök ya da rezerv hücreleri olarak değerlendirilirler (35,36,37). Düzensiz<br />

aralıklarla bölünerek, hem yeni tip A spermatogonyumları, hem de açık tip A<br />

hücreleri meydana getirirler (34,35,36,37,38). Sitoplazmik organeller açık tiplerden<br />

pek farklı değildir.<br />

Spermatogonyumların en çok bulunan tipi B tipi spermatogonyumlardır. Bunlar<br />

da bazal lamina üzerine otururlar. Fakat bazal lamina ile bağlantıları daha azdır.<br />

Hücrelerin çekirdeği merkezi olarak yerleşmiş ve yuvarlak şekillidir. Çekirdekte bir ya<br />

da iki koyu boyanan çekirdekçik bulunur. Sitoplazmada diğer A tiplerine göre daha<br />

fazla ribozom bulunur. Oval yerine yuvarlak olan nukleusları dışında açık tip A<br />

spermatogonyumlara benzerler (35,36). Mitozla bölünerek primer spermatositleri<br />

meydana getirirler (35).<br />

Soluk ve ya açık A tipi spermatogonyumlar kök hücrelerdir. Bunlar bölünerek<br />

hem yeni soluk A tipi spermatogonyumları yaparlar hem de koyu tip hücreleri<br />

oluştururlar. Koyu A tipi hücrelerde B tipi hücreleri oluşturmak için bölünürler.<br />

B tipi spermatogonyumların son mitotik bölünmelerinden sonra primer<br />

spermatositler ortaya çıkarlar. İlk ortaya çıkan primer spermatositlerin uzun profaz<br />

dönemleri olduğundan artan bir yoğunlaşma gösterirler. Bu hücreler mayoz<br />

bölünmenin preleptoten, leptoten, zigoten, pakiten ve diploten safhalarını geçirerek<br />

sekonder spermatositlere dönüşürler. Bunlar de ikinci bir mayoz bölünme geçirerek<br />

haploid kromozom setine sahip olan spermatidleri oluştururlar. Spermatidler herhangi<br />

bir bölünme geçirmeden, bir seri değişiklikler geçirerek spermatozoonu, onlarda tipik<br />

şekilli erişkin spermleri meydana getirirler. Spermatositler de birbirleri ile sitoplazma<br />

köprüleri aracılığı ile bağlıdırlar. Bu özellikler spermatidlerde de devam eder.<br />

10

Böylece kardeş hücrelerle birlikte davranmak için fiziksel bir süreklilik sağlanır (11-<br />

13).<br />

B tipi spermatogonyumlar, mayoz bölünme geçirecek olan spermatositlere<br />

dönüşürler. Bu sırada yavaş fakat belirgin bir büyüme göstererek çapları 18 mikrona<br />

ulaşır. Hücrelerin sitoplazması spermatogonyumlarınkine benzer.<br />

Spermatidler<br />

Spermatositlerin ikinci mayoz bölünmelerinden sonra haploid kromozoma<br />

sahip spermatidler oluşur. Erken dönemde spermatidler nispeten küçük, küresel<br />

şekilli hücrelerdir. Nukleusları ince kromatinlidir, arada yoğun kromatin yumakları<br />

vardır. Nukleus kısa sürede daha da küçülür.<br />

Sitoplazmada dağınık düz endoplazmik retikulum, küçük ve perifere dizili,<br />

yuvarlak, kristası belirgin olmayan mitokondriumlar ve iyi gelişmiş golgi kompleksi<br />

görülür. Granüllü endoplazmik retikulum azdır. Küçük ve hücre zarı altında dizilmiş<br />

mitokondriumlar spermatid sitoplazmasının tanınmasını kolaylaştırır (11-13).<br />

Nukleus yakınında tipik, kitle halinde kromatin cisimciği görülür. Bu yapı<br />

düzensiz, koyu, fibrilli ve granüllü sahalar içerir, ribonükleoproteinden zengindir.<br />

Çekirdek ve sitoplazmasında bir seri değişiklikler gösteren spermatidde, birbirini takip<br />

eden fazlar izlenir. Spermatid olgunlaşması sırasındaki değişiklikler türlere göre<br />

farklılıklar göstersede genel özellikleri ile hemen hemen aynıdır. Spermatiddeki<br />

değişikler sonucu oluşan türe has genetik özellikleri taşıyan hücre spermiyumdur.<br />

Spermiyumda akrozom, oosite girmesini sağlamak için gereklidir. Akrozom<br />

oluşumu evrelerinde golgi kompleksinin ve kromatid cisimciğinin katkısı önemlidir.<br />

Hücredeki tüm kromatin, nukleus şekillenmesi sırasında homojen , koyu boyanan bir<br />

yapıya dönüşür ve hücrenin yaşamı boyunca etkin olamaz (11,14,16).<br />

Spermatid sitoplazmasındaki hücre organellerinden sentriol ve mitokondriler<br />

dışında diğerleri kullanılmaz. Memelilerde spermatidlerin spermiyum haline gelmesi<br />

belirli basamakları izler.<br />

11

Golgi fazında, önce spermatidin nukleusu etrafında golgi kompleks bölgesinde<br />

veziküllü yapılar çoğalır (proakrozomal veziküller). Bunlar birleşince büyük boşluklu<br />

yapılar oluşur (akrozom vezikülü). Bu bölgede nukleus yoğunluğunda artış görülür.<br />

Nukleusun bir kutbunda belirginleşen veziküller içinde akrozomal granül görülür ve<br />

bunlar giderek koyulaşıp büyür. Bu olgunlaşmaya, nukleus yakınında bulunan<br />

kromatid cisimcik muhtemelen katkıda bulunur. Sentriol çifti nukleusun karşı kutbuna<br />

hareket eder. Sitoplazmadaki mitokondriler hücre çeperine doğru dizilirler (12,14,16).<br />

Başlık fazında, akrozomal vezikül genişleyerek büyür, çekirdekle temas ettiği<br />

yerden başlayarak granül içeriği, çekirdeğin ön kısmını bir başlık halinde sarar.<br />

Kromatid cisimcik karşı uca kayarak çiftlerine yaklaşır. Buradan flagellum gelişir.<br />

Nukleus uzunluğu artar. Akrozomal granülden akrozom gelişir ve nukleusun<br />

2/3 ön yüzü akrozom ile kaplanır. Burası çokça glikoprotein ve glikolipid içerir. Ayrıca<br />

burada galaktoz, mannoz, fruktoz karbonhidratları ile hyalurinidaz, asit fosfataz,<br />

nukleoidaz enzimleri de yoğunlaşır.<br />

Akrozoma karşı kutupta, kuyruğu oluşturacak mikrotübüller çevresi silindirik<br />

bir kılıfla örtülüdür. Uzunluğu dizili 9 lifle çevrili olan flagellum, spermatozoanın boyun<br />

ve kuyruk bölgesini oluşturur. Mitokondriler boyun bölgesinden annulusa doğru göç<br />

ederler. Liflerin çevresinde halka şeklinde bir mitokondrial kılıf oluştururlar.<br />

Mitokondrilerle çevrili olan bu bölge orta parçayı temsil eder.<br />

Olgunlaşma fazı, spermiogenezin son evresidir. Spermatid türe has şeklini<br />

alırken spermatidin çekirdeğinden spermiyumun başı, sentrioller ile mitokondrilerden<br />

de kuyruk bölümü şekillenir. Spermatidin diğer organelleri artık cisimcikler şeklinde<br />

Sertoli hücreleri tarafından fagosite edilir. Olgunlaşma fazında spermiyumun son<br />

şeklinin kazanılması sağlanır. Testis içinde spermiyumların metabolik ihtiyaçları hala<br />

Sertoli hücreleri tarafından sağlanır. Testis dışında ise epididimden ve sekonder seks<br />

organlarından salgılanan maddelerle sağlanır (14,16,39).<br />

12

Şekil 3 Memelilerdeki spermatozoanın şekli<br />

Spermatogenez üç aşamada gerçekleşir: mitotik bölünmelerle çok sayıda<br />

spermatogonyum oluşması, mayotik bölünmede genetik çeşitlilik elde edilmesi ve<br />

kromozom sayılarının yarıya inmesi, yaygın hücre modelleşmesi oluşması ve<br />

kromozomların aktarımı ve herhangi bir zarara karşı sıkı paketlenmesinin<br />

gerçekleşmesi.<br />

İNFERTİL ERKEĞİN DEĞERLENDİRİLMESİ<br />

Üreme tıbbı 1990’lı yıllar içerisinde önemli ilerlemeler kaydetmiştir. Her ne<br />

kadar insanda kopyalama henüz başarılmış olmasa ve kopyalama fikri bile henüz<br />

şiddetle tartışılıyor olsa da, üremeye yardımcı tekniklerde blastosist ve embryo<br />

biopsisinde olduğu gibi sürekli ilerlemeler kaydedilmiştir. Nonobstrüktif azoospermili<br />

hastaların testislerinden sıklıkla sperm elde edilerek, insan oositi içine enjeksiyonu<br />

yapılabilir. Böyle ileri teknoloji gerektiren, yüksek maliyetli yöntemlerden elde edilen<br />

başarılı sonuçlar neticesinde, erkeğin değerlendirilmesi sıklıkla göz ardı edilmektedir.<br />

Bu yaklaşım varikosel, vazal obstrüksiyon ve enfeksiyon gibi erkek infertilitesinin<br />

çoğu nedeninin kolaylıkla ve etkin olarak tedavi edilebileceği gerçeği de<br />

önemsenmemektedir. Ayrıca, tam bir inceleme yapılmazsa, testis kanseri, hipofiz<br />

tümörü ve nörolojik bozukluklar gibi önemli hastalıklarda gözden kaçabilir (40).<br />

13

Nihayet erkek infertilitesinin genetik nedenleri daha iyi anlaşıldıkça, yardımcı üreme<br />

tekniklerine başlamadan önce erkeğin yeterli değerlendirilmesi ve danışmanlık<br />

konularının ne derece önemli olduğu da ortaya çıkmıştır.<br />

Normal bir çiftin bir ay içerisinde gebe kalma şansları %20-25, 6 ay içerisinde<br />

%75 ve bir yıl içerisinde ise %90’dır (41). Hem erkek hem de kadın için 24 yaşında<br />

fertilizasyon oranları en yüksektir. Fertilizasyon oranları bu yaştan sonra her iki<br />

sekste de düşmeye başlar (42,43).<br />

İnfertilite olgularının yaklaşık %20’si tamamıyla bir erkek faktöründen<br />

kaynaklanır. %30-40’ında ise hem erkek hem de kadın faktörleri birlikte görülür<br />

(44,45). Tedavi edilmemiş infertil çiftlerin %25-35‘i yalnız cinsel ilişkide bulunmakla<br />

ileride çocuk sahibi olabileceklerdir (46). İlk iki yıl içerisinde bunların %23’ünde<br />

gebelik görülürken bir % 10’luk dilimide takip eden 2 yıl içerisinde gebe kalır (47).<br />

Dolayısıyla, infertil bir çifti takip ederken ve tedavi sonuçlarını değerlendirirken, işte<br />

bu aylık %1-3’ lük gebelik şansını (nonazoospermik çiftlerde) akılda tutmak gerekir.<br />

Her ne kadar çiftler gebe kalmayı istediklerinden itibaren 12 ay geçinceye kadar tetkik<br />

edilmezlerken, artık çiftin yaşı ilerledikçe temel incelemenin ertelenmesi<br />

önerilmemektedir.<br />

İnfertil erkeğin değerlendirilmesindeki hedefler (1) düzeltilebilir durumların; (2)<br />

başka yöntemlerle düzeltilemeyen, ancak erkeğin spermi kullanılarak yapılan<br />

yardımcı üreme tekniği ile tedavi edilebilecek nedenlerin; (3) bu tekniklerle de tedavi<br />

edilemeyen ve donör inseminasyonu ve ya evlat edinmeyi gerektirecek nedenlerin;<br />

(4) altta yatan önemli tıbbi patolojilerin; ve (5) hastayı ya da çocuğunu etkileyebilecek<br />

genetik ve/ ve ya kromozomal bozuklukların belirlenmesine yöneliktir.<br />

İnfertilite şikayeti ile başvuran erkeğin detaylı hikayesi ve fizik muayenesinden<br />

sonra yapılacak basit ve ekonomik ilk test semen analizidir.<br />

14

Semen analizi<br />

İnfertil erkeğin değerlendirilmesinde semen analizi en önemli yeri tutar. Buna<br />

rağmen, semen parametrelerinin ölçülmesinin bir fertilite ölçütü olması gerekmediği<br />

de bilinmelidir.<br />

Semen parametrelerinin kalitesi azaldıkça istatistiksel olarak gebelik şansı da<br />

azalır ama sıfıra inmez. Buna rağmen doğru şekilde yapılmış bir semen analizi infertil<br />

erkeğin değerlendirilmesinde önemli bir araçtır.<br />

Sperm üretimi günlük olarak değişebildiğinden, infertilite değerlendirilmesi için<br />

en az iki semen analizi yapılmalıdır. İki örnek arasında geçen zaman en az 7 gün ve<br />

en fazla 3 hafta olmalıdır. İki değerlendirme sonuçları birbirinden çok farklı ise üçüncü<br />

bir değerlendirme yapılmalıdır (48).<br />

Toplanması<br />

Aynı hastaya ait farklı semen örneklerinin doğru biçimde karşılaştırılmasının<br />

yapılabilmesi için, örnek toplanmadan önceki cinsel perhiz süresinin sabit tutulması<br />

önem taşır. Örnek en az 48 saatlik perhiz sonrası toplanmalıdır, fakat cinsel perhiz 7<br />

günü geçmemelidir. Örnekler geniş ağızlı, temiz kaplarda toplanmalıdır. Semen<br />

örneği muayenenin yapıldığı yerde ya da evde toplanır ve toplama kabı nakil<br />

süresince sıcak kalabilmesi için vücutla temas edecek şekilde giysinin içinde<br />

muhafaza edilerek tetkikin yapılacağı yere ulaştırılır (48).<br />

Örnekler genelikle masturbasyon ile toplanır. Eğer hasta istemezse, uygun<br />

özel kondomlar da kullanılabilir. Lateks kondomlar kullanılmamalıdır. Örnek<br />

toplanmasında geri çekme yöntemi alternatif bir yöntem olmakla birlikte, ejakulatın ilk<br />

kısmı kaybedilebileceği ve içine bakteri ya da vajenin asit sekresyonu karışabileceği<br />

için ideal değildir (48). Toplanan örnek ilk bir iki saat içinde incelenmelidir.<br />

15

Fiziksel özellikler<br />

Taze ejakulat koagulum şeklindedir ve 5 ila 25 dakika arasında likefiye olur.<br />

Bu bazen 60 dakikayı bulur (48). Ejakulasyon ile atılan spermin büyük kısmı distal<br />

epididimden az bir kısmı ise vaz deferensin ampullasından gelir. Semenin<br />

likefaksiyonu, prostattan kaynaklanan ve prostat spesifik antijen ile plazminojen<br />

aktivatörünü içeren proteazlar tarafından gerçekleşir.<br />

Normal örnek homojen, gri opalesan görünüme sahiptir. Sperm<br />

konsantrasyonu düşükse daha az opak görülür. Kırmızı kan hücresi varsa kırmızı<br />

kahverengi, sarılık ya da vitamin kullanımı varsa sarı görülebilir (48).<br />

Likefiye örneğin viskositesi koagulasyondan farklı olarak değerlendirilmelidir.<br />

Viskoziteyi kontrol için 5 ml geniş ağızlı pipete örnek dikkatlice çekilir ve yerçekiminin<br />

etkisi ile damlaması beklenir. Bu sırada damla ile pipet arasında oluşan ince ipliğin<br />

uzunluğu gözlenir. Anormal viskozitelerde bu uzunluk 2 cm’den daha uzundur (48) .<br />

Sperm sayısı<br />

Sperm sayısı seminal plazmadaki sperm konsantrasyonu anlamına gelir.<br />

Sperm sayma metodlarının çoğu, içinde spermlerin sayıldığı grid sistemine dayanan<br />

sayım kamarasını kullanır. Günümüzde çok sayıda kamara mevcuttur. Metodların<br />

karşılaştırılması, kamaralar arasında önemli farklılıklar olabileceğini ortaya koymuştur<br />

(49,50). Bu nedenle farklı laboratuarlarda yapılmış semen analizlerinin<br />

karşılaştırılması zor olabilir. Semen analiz tekniklerinin detaylı tanımlamaları birçok<br />

kaynaktan elde edilebilir (48). İçinde hiç sperm görülmeyen örnekler santrifüj<br />

edildikten sonra, dipte çöken pellet içerisinde sperm aranmalıdır (48).<br />

Motilite<br />

Motilite kuyruk hareketi gösteren sperm yüzdesidir. İdeal olarak<br />

ejakulasyondan sonraki ilk 1-2 saat içerisinde ve sperm motilitesinde azalmayı<br />

önlemek için örnek oda ısısında ya da vücut sıcaklığında saklanarak yapılmalıdır.<br />

200 spermatozoayı değerlendirmek için en az beş mikroskopik alanda sistemik<br />

16

değerlendirme yapılır(48). Genelde sperm hareketleri 4 kategoride incelenir: a ileri<br />

hızlı hareketi (≥25 µm/s 37ºC’de) ( 25 µm, 5 sperm baş uzunluğu ya da yarım kuyruk<br />

uzunluğuna eşittir); b yavaş ileri hareketi; c ileri olmayan hareketi (< 5µm/s); d<br />

hareketin bulunmadığını belirtir. Bu sistemde her bir kategoriye giren sperm yüzdesi<br />

değerlendirmeye alınır (48).<br />

Morfoloji<br />

Spermin morfolojik incelenmesi spermatogenez kalitesinin ve fertilitenin<br />

duyarlı bir göstergesidir (51,52). Günümüzde kullanılan çok sayıda sistem arasında,<br />

sperm morfolojisinin sınıflandırılmasının yapıldığı sistem konusunda laboratuarlar<br />

arasında fikir birliği yoktur. Normal spermin tanımlanması, postkoital servikal<br />

mukustan ya da zona pellusida yüzeyinden alınan spermlerin incelenmesi ile<br />

yapılmıştır (3,53,54,55). Eski sistemlere göre sperm normal (oval baş), amorf<br />

(irregüler baş), ince sivri baş (tapered), büyük ve küçük baş ile immatür gibi<br />

kategorilerden birine girecek şekilde sınıflandırılmaktadır (56). Bu sistemlere göre<br />

‘sınırda’ formlar normal olarak sınıflandırılır ve % 60’ ın üzerinde normal form içeren ,<br />

immatür formların %3’den az olduğu örnekler normal olarak tanımlanır. Ancak<br />

günümüzde birçok labaratuar normal spermin tanımlanmasını yaparken daha kesin<br />

kriterler kullanır. Sınırda formlar anormal olarak kabul edilir (4,57).<br />

Bu kriterleri kullanarak, Kruger ve arkadaşları, sperm dansitesi 20<br />

milyon/ml’nin ve motilitesi %30’un üzerinde olan bir grup erkekte, eğer kesin kriterlere<br />

göre normal sperm oranı % 14’den az ise IVF ile fertilizasyon oranının %37, %14’ün<br />

üzerinde ise %91 olduğunu bulmuştur (4). Takip eden çalışmaların hepsi olmasa da<br />

çoğu benzer sonuçlar vermiştir (1).<br />

Şekilleri önemli ölçüde farklı olmasa da boyanmış insan spermatozoonlarının<br />

başları, orijinal semendeki canlı spermatozoaların başlarından hafifçe daha<br />

küçüktürler (48,57). Spermlerin normal morfoloji değerlerini saptarken kesin kriterler<br />

kullanılmalıdır (3). Fiksasyon ve boyama etkisinden kaynaklanan hafif azalmayı da<br />

hesaba katarak başın boyu 4.0-5.0 µm ve genişliği 2.5-3.5 µm olmalıdır. Boyun,<br />

genişliğe oranı 1.5 ile 1.75 arasında olmalıdır. Bu aralıklar papanicolaou ile boyanmış<br />

sperm başları için % 95 güven aralığındadır (67). Baş bölgesinin %40-70’ini<br />

17

kapsayan iyi tanımlanmış bir akrozomal bölgesi olmalıdır. Orta kısım ince uzun ve<br />

genişliği 1 µm ‘den az, boyu baş uzunluğunun 1.5 katı ve başa aksial olarak<br />

bağlanmış olmalıdır. Sitoplazmik artıklar normal baş alanının yarısından az olmalıdır.<br />

Kuyruk dümdüz, düzgün biçimli, orta kısımdan ince , kıvrılmamış ve yaklaşık 45 µm<br />

uzunlukta olmalıdır. Bu sınıflandırma şemasına göre bütün sınırda şekiller anormal<br />

kabul edilir (3,4).<br />

Aşağıdaki defekt kategorileri dikkate alınmalıdır:<br />

Baş defektleri: Bunlar sırasıyla geniş, küçük, yassı, armutlaşmış, yuvarlak,<br />

şekilsiz başlar, vaküollu başlar (baş alanının %20’den fazlası boyanmamış vaküoler<br />

alanlarla kaplı). Küçük akrozomal bölge içeren başlar (baş alanının %40’ından azı) ve<br />

çift başlılar ve ya bunların herhangi bir kombinasyonu.<br />

Boyun ve orta kısım defektleri: Sırası ile bunlar; bükük boyun (boyun ve<br />

kuyruk, başın uzun eksenine 90 dereceden büyük bir açı yapar), orta kısmın başa<br />

asimetrik girişi, kalın ve şekilsiz orta kısım, anormal derecede ince orta kısım (mesela<br />

hiç mitokondrial kılıf yok) , ve ya bunların herhangi bir kombinasyonu.<br />

Kuyruk defektleri: Sırasıyla kısa, birden çok, u-şeklinde kıvrık, kırık veya<br />

bükük kuyruklar (> 90 derece). Düzensiz genişlikte kuyruklar, halkalı kuyruklar, ve ya<br />

bunların herhangi bir kombinasyonu.<br />

Sitoplazmik artıklar: Normal bir sperm baş alanının 1/3’ünden büyük olanlar.<br />

Artıklar genelde orta kısım etrafında bulunur (48).<br />

Sadece kuyruğu olan spermatozoalar ayrımsal bir morfoloji sayımı içinde<br />

değerlendirilebilirler, spermatid basamağına kadar olan ve bu basamakdaki yuvarlak<br />

immatür hücreler de dahil olmak üzere spermatozoa olarak kabul edilmezler. Kopuk<br />

ve ya serbest sperm başları spermatozoa olarak kabul edilemezler fakat ayrıca kayıt<br />

edilebilirler. Halkalı kuyruklar, düşük sperm motilitesi ile ilgili olabilir ve ya spermlerin<br />

hipoozmotik bir strese maruz kaldıklarını gösterebilir. Nadiren spermlerin çoğu<br />

spesifik bir yapısal bozukluğa sahip olabilirler; örneğin küçük yuvarlak baş defektine<br />

ve ya ‘globozoospermi’ye neden olan akrozom oluşumunun yetersizliği gibi. Başdaki<br />

18

azal plate’in akrozomun karşı kutbundaki nükleusa tutunmasındaki bozukluk<br />

spermiasyonda başların ve kuyrukların ayrılmasına neden olur. Bu başlar absorbe<br />

edilir ve semendeki yalnız başına kalan kuyruklar (‘pinhead’ defektini) oluştururlar.<br />

Pinheadler, baş defekti olarak sayılmazlar çünkü bunlar nadiren bazal plate’in<br />

önünde herhangi bir kromatin ve ya baş yapısı bulundururlar. Eğer pinheadler çok<br />

miktarda görülürse bu durum ayrıca not edilmelidir (48).<br />

İlave semen parametreleri<br />

Normalde semenin pH’sı 7.2 ya da üzerindedir (48). Asit prostat sekresyonu<br />

ile alkali seminal vezikül sekresyonları arasındaki denge semen pH’sını belirler.<br />

Seminal veziküller androjen bağımlı mekanizma ile fruktoz yaparlar. Normal<br />

semen fruktoz konsantrasyonu 120-450 mg/dl arasında değişir.<br />

Sitrat, karnitin, α-glükozidaz, fruktoz, granülosit elastaz, çinko, PSA, glukoz,<br />

pepsinojen C, insülin- benzeri büyüme faktörü, bağlayıcı protein-3 ve prostaglandin D<br />

sentetaz gibi çok sayıda başka seminal plazma komponentlerinin ölçümleri de<br />

yapılmaktadır. Her ne kadar belirli bileşiklerin düzeyleri spermatojenik aktivite ile ilişki<br />

gösterebilmekteyse de, bu ölçümlerin günümüzde klinik faydası bulunmamaktadır<br />

(58,59,60).<br />

Semen analiz sonuçlarının yorumlanmasında kullanılan referans değerlerin,<br />

yeterli olan minimum seviye şeklinde tanımlanması daha doğru olur. Dünya Sağlık<br />

Örgütü (WHO 1999) aşağıdaki referans değerleri tanımlamıştır:<br />

Volüm:2 ml ve yukarısı<br />

pH: 7.2 ve yukarısı<br />

Sperm konsantrasyonu: mililitrede 20 milyon ve üzerinde olması<br />

Total sperm sayısı: 40 milyon ve üzeri olması<br />

Motilite: %50 ya da daha üzerinde spermin a+b derecesi motilite, %25 ya<br />

da fazlasının a derecesi motilite göstermesi<br />

Morfoloji: kesin kriterlere göre %15 ya da üzeri olması<br />

19

Canlılık %75, ya da üzerinde canlı sperm<br />

Lökosit: 1 milyon/ml’den az<br />

CASA<br />

Casa sperm görüntülerini analiz, işlemleme ve vizüalize etmek için dizayn<br />

edilmiştir. Optik, ışık kaynağı ve bilgisayardan oluşan bir hardware (bilgisayarın<br />

makine kısmı) ile motilite, morfoloji ve canlılık analizi yapabilen modülleri içeren bir<br />

software (bilgisayar programı) kombinasyonudur. Casa; objektif, doğru, güvenilir ve<br />

tekrar edilebilen sperm analizi ihtiyacından doğmuştur. İlk kuşak analiz aletleri 1986<br />

yılında yapılmıştır (HTM-2000). Sonrasında piyasaya değişik firmalarca ürünler<br />

sürülmüştür. İVOS (integrated visual optical system) Hamilton Thorn tarafından 1993<br />

yılında geliştirilmiştir (61) (Resim 1).<br />

Resim 1: CASA cihazı<br />

20

Resim 2: CASA internal optik sistemi ve kamerası<br />

Başlangıç<br />

İVOS 12.2 versiyonu bir hücre hareket (motilite) analizcisi, bir morfoloji<br />

analizcisi ve bilgisayar içerir. Entegre hardware içerikleri şunlardır; stroboskopik<br />

iluminasyon ile internal faz kontrast optik sistemi, internal otomatize spesmeni ısıtıcı<br />

alan, görüntü digitizer ve Pentium bilgisayar (Resim2).<br />

Birçok İVOS aygıtı Windows 2000 pro veya Windows XP pro işletim sistemi<br />

temelinde, software kontrolü altındadır. Mouse (fare) ve ya klavye kullanılarak<br />

istenilen komutlar verilir.<br />

İVOS motilite programının başlatılması (İVOS Software Guide)<br />

Windows masaüstünde HTR motility ikonuna basılır ve password girilir. CASA<br />

ekranı belirir.<br />

MOTİLİTE (CASA)<br />

1) İNFO<br />

Üç başlıkta incelenir<br />

a) Genel bilgiler:<br />

21

Setup bilgileri: Yapan kişi ve 7 değişik analiz parametresinden biri seçilir<br />

(Resim 3).<br />

Kimlik bilgileri: Hasta bilgileri girilir.<br />

Örnek bilgileri: ml cinsinden ejakulat volümü, sample-diluent oranı burada<br />

sample 1 kabul edilir ve yazılması gereken diluenttir, chamber ise kullanılan özel<br />

lamdaki her bölümü simgeler.<br />

Resim 3: Genel bilgiler ekranı<br />

b) Veri alanı : Örneğe spesifik bilgiler girilir (likefaksiyon süresi, doğum tarihi,<br />

fruktoz, vizkosite gibi) (Resim 4).<br />

22

Resim 4: Data fields ekranı<br />

c) Notlar: Data alanında olmayan ve özellikle belirtmek istenilen veriler girilir.<br />

2) SETUP (AYARLAR)<br />

Bu ekran İVOS konfigürasyonunun tüm bilgilerini kontrol eder (Resim 5).<br />

A) Analiz ayarları:<br />

1) Setup numarası:<br />

Setup numarası; analiz ayarları, optik ayarları, ve stage ayarları ekranlarında<br />

görülür. Seçilen setup numarasıyla, İVOS otomatik olarak daha önce bu numara için<br />

ayarlanan bilgileri ortaya koyar ve bu değerler doğrultusunda inceleme yapar.<br />

Setup no.1 (standart): Konsantrasyonu 0-50 M/ml arasında olan insan sperm<br />

örneklerinin genel değerlerini sağlar. Setup no.2 (Yüksek dansite): Konsantrasyonu<br />

50-150 M/ml olan örnekler içindir. Geri kalan 5 örnek tipi kullanıcı tarafından<br />

belirlenebilir.<br />

23

Resim 5: Analiz setup ekranı<br />

2) Görüntü yakalama:<br />

a) Saniyede yakalanan alan: NTSC (National Television System Committee)<br />

sisteminde, saniyede yakalanan görüntünün 60 hertz olması, İVOS’un saniyede 60<br />

görüntü yakaladığı anlamına gelir.<br />

b) Alan sayısı: Sıralı görüntülerin total sayısı, bu sayı arttıkça, her hücre yolu<br />

için fazla bilgi toplanır. Eğer yüksek konsantrasyonlu örnek var ise; 5 ila 7<br />

seçilmelidir. Eğer düşük konsantrasyonlu bir örnek var ise ; 30 yazılmalıdır.<br />

3) Hücrenin izlediği yol durumu: Burada 3 hız parametresinin VSL, VAP,<br />

VCL’nin grafiksel özeti sağlanır.<br />

VSL: Düz Çizgi Hızı(µm/s).Sperm yolunun başlangıcı ve sonu arasındaki düz<br />

çizginin oranıdır.<br />

VCL: Eğri Çizgi Hızı (µm/s). Takip edilen yoldaki hız, bir hücrenin katettiği<br />

toplam mesafe ele alınarak hesaplanır. Bunun için hücrenin katettiği yol üzerinde, bu<br />

yolu temsil eden ve birbirini izleyen 5-30 nokta arasındaki düzgün doğrular alınarak<br />

bulunan toplam mesafe toplam zamana bölünür. Tüm sperm hücreleri için bu şekilde<br />

hesap edilen yol, hız ortalamasını verir.<br />

VAP: Ortalama Rota Hızı (µm/s). Bir sperm başının ortalama rotası boyunca<br />

ortalama zamandaki hızı. Bu rota, CASA aygıtlarındaki algoritmalara<br />

göre esas<br />

24

otanın bilgisayarca düzleştirilmesi ile ortaya çıkar. Aygıtlar arasında bu algoritmalar<br />

açısından farlılıklar olabilir.<br />

ALH: Başın Lateral Yerdeğiştirme Amplitüdü (µm). Bir sperm başının ortalama<br />

rotası boyunca yan sapma uzunluğu (yalpalama). Maksimum ya da ortalama olarak<br />

ifade edilir. ALH değeri 2’den büyük olmalıdır.<br />

BCF: Çapraz Kesişme Frekansı (kesişme/saniye). Spermin eğrisel çizgi<br />

rotasının ortalama rotasıyla kesişme sıklığı ortalaması.<br />

STR: Straightness. Ortalama rotanın doğrusallığı, VSL/VAP.<br />

LIN: Linearite. Eğri çizgisel rotanın doğrusallığı, VSL/VCL.<br />

Hücre algılama: Hem motil hem de statik olan hücreleri ortaya koymak için<br />

kullanılır. İVOS bu verileri saha içindeki nesnenin sperm hücre olma potansiyelini<br />

belirlemede kullanır ve eğer bu kriterlere uyarsa, İVOS sonra hücre motil mi onu<br />

değerlendirir. Eğer obje motil değilse, İVOS bu sefer statik hücre aralıklarını (static<br />

cell gates) kullanır böylece debris mi, hücre mi anlaşılır.<br />

Minimum kontrast: Minimum kontrastın altındaki objeler analizden çıkarılır (0-<br />

255 arası). İnsan spermi için, İVOS internal 10X faz kontrast optikleri için 50-150<br />

aralığı tercih edilir. Standart kullanım 80’ dir.<br />

Minimum hücre boyutu: Minimum hücre boyutundan küçük objeler analizden<br />

çıkarılır. İnsan spermi için, İVOS internal optikler 3’ü kullanır.<br />

Progressive cells(ileri hareketli): Motil bir hücrenin progressive olarak motil<br />

sayılabilmesi için gereken minimum değerleri gösterir. Hücre iki kriteride geçmelidir<br />

(VAP, STR).<br />

Defaults(< 5 motil hücre): Statik hücreleri identifiye edebilmek için, İVOS<br />

ortalama hücre boyutu ve hücre yoğunluğunu, alandaki motil hücrelerden hesaplar<br />

ve kullanır.<br />

Hücre boyutu: İnsan sperminde 10X büyütme için önerilen fabrika çıkışı<br />

hücre boyutu değeri 6’dır.<br />

Hücre yoğunluğu: İnsan sperminde 10X büyütme için önerilen fabrika çıkışı<br />

hücre yoğunluğu değeri 160’dır.<br />

25

Yavaş hücreler: Yavaş hücreler motil ve ya statik hücre popülasyonuna dahil<br />

edilebilir. Yavaş hücreleri şu şekilde tarif edebiliriz: VAP< VAP cut-off ve ya VSL<<br />

VSL cut- off.<br />

B) Optik ayarları<br />

1) İluminasyon:<br />

a) Işığın şiddeti: Işık kaynağının parlaklığını kontrol eder (Resim 6).<br />

b) Fotometer: Görüntü alanındaki en düşük ışık şiddeti pikseli işaret edilir ve<br />

bu değer manuel olarak değiştirilmez.<br />

2) Büyütme: Doğru büyütme değerleri konsantrasyon ve hareket<br />

parametrelerinin düzgün hesaplanması için gereklidir.<br />

3) Video kaynağı: a) Hz: Analiz için gerekli olan kamera tipi ile ilişkilidir.<br />

b) Alan: Dark (koyu) alan İVOS için seçilen standart ilüminasyondur.<br />

Resim 6: Optik setup ekranı<br />

C) Bölüm ayarları:<br />

a) Analiz chamber (özel bölme): Piyasada mevcut birçok sperm analiz<br />

bölmesi (2X-cell, microcel, makler ve cannula gibi) İVOS ile kullanılabilir. Chamber<br />

(bölme) tipi ve derinliği manuel olarak değiştirilmedikçe bu setup numarası için daha<br />

önceden kaydedilmiştir (Resim 7).<br />

26

) Bölüm sıcaklığı: Genelde oda sıcaklığının 3 derece üzeri kullanılır.<br />

c) İncelenecek alan seçimi: 1) Otomatik: Preparat otomatik olarak hareket<br />

eder. 2) Manuel: Manuel olarak incelenecek alanlar seçilir (20 alan seçer).<br />

3) Manual with static override: Kullanıcı statik hücreleri manuel olarak sayabilir.<br />

Resim 7: Stage setup ekranı<br />

D) Kullanıcı ayarları: Yeni kullanıcılar eklenir (Resim 8).<br />

Resim 8: Yeni kullanıcı ekranı<br />

3) ACQUIRE:<br />

Bu ekran İVOS tarafından analiz edilen alanı kontrol eder (Resim 9,10).<br />

27

Resim 9: Acquire ekranı<br />

Resim 10: Acquire ekranı<br />

4) DİSPLAY:<br />

Hem analiz sonuçlarını hem de kalite kontrol fonksiyonlarına ulaşmayı sağlar<br />

(Resim 11,12,13).<br />

28

A) Sonuçlar<br />

Sonuçlar 1: Burada örnekteki sperm sayısı, örnek analizinden elde edilen<br />

sperm konsantrasyonu ve yüzdesi hesaplanır ve WHO limitleri ile karşılaştırılır<br />

(Resim 11).<br />

Resim11: Display ekranı, sonuçlar 1<br />

Sonuçlar 2: Ortalama sperm hareket analizleri ve ölçülen VAP değerleri ile<br />

hücreler kategorize edilir (Resim 12).<br />

Resim 12: Display ekranı, sonuçlar 2<br />

Sonuçlar 3: Bu veriler için sort (tür,cins,çeşit) software’nin yüklü olması<br />

gerekir (Resim 13).<br />

29

Resim 13: Display ekranı, sonuçlar 3<br />

B) Playback: En son analiz edilen video görüntülerini gösterir.<br />

C) Kalite Kontrol Noktalamaları:<br />

1) Hücre boyutu ile kalite kontrol grafiği: Kalite kontrol grafiğidir. Burada<br />

sperm yoğunluğu ile sperm boyutu oranlanır (Resim 14).<br />

Resim 14: Boyuta göre kalite kontrol grafiği<br />

2) Elongasyon noktalamaları ile kalite kontrol grafiği: Burada ise sperm<br />

yoğunluğu ve sperm elongasyon (baş genişliğinin, baş uzunluğuna oranı) oranlanır<br />

(Resim 15).<br />

30

Resim 15: Uzamaya göre kalite kontrol grafiği<br />

D) Bar charts: 4 tane bar verir.<br />

Bar chart 1: VAP, VSL, VCL, elongasyon<br />

Resim16: Bar chart 1<br />

31

Bar chart 2: ALH, BCF, STR,LIN<br />

Resim 17: Bar chart 2<br />

E) Kalite kontrol:<br />

Hücre boyutu ile kalite kontrol grafiği: Motil hücreler ele alınıyorsa<br />

parentez içinde motil yazar. Eğer < 5 motil hücre olursa ‘defaults in use’ yazar<br />

(Resim 14).<br />

Mavi dikdörtgen içinde ekranda verilen statik boyut ve yoğunluk aralıklarının<br />

sınırlarını verir.<br />

Dik sarı çizgi analiz ayarlarında verilen hücre bulma bölümündeki minimum<br />

hücre boyutu değeridir.<br />

Yeşil noktalar motil spermleri gösterir.<br />

Statik objeler tüm kalite kontrol noktalamalarında mavi dikdörtgen içinde kalan<br />

kırmızı noktalar olarak gösterilir.<br />

Beyaz noktalar mavi dikdörtgen dışındaki statik objeleri gösterir ( analiz<br />

dışında tutulurlar).<br />

Statik hücre aralıkları: Statik hücreler için üst ve alt size limitleri bu limitler<br />

içindeki statik objeler potansiyel olarak statik spermdir.<br />

Statik yoğunluk aralıkları: Üst ve alt yoğunluk limitlerini verir (0.5-2.00<br />

arası).<br />

Bu aralıklar sadece statik spermler (kırmızı noktalar) ve objeler (beyaz<br />

noktalar) içindir. Motil sperm (yeşil noktalar) üzerine etkili değildir.<br />

32

Elongasyon noktalamaları ile kalite kontrol grafiği: Elongasyon (x ekseni)<br />

ve yoğunluk (y ekseni). Eğer ortalamalar ; motil hücrelerin ortalama boyut/yoğunluk<br />

değerlerinden alınırsa, motil parentez içinde yazar. Eğer < 5 motil hücre var ise,<br />

analiz ayarlarındaki fabrika çıkışı hücre boyutu ve yoğunluğu ele alınır ve parentez<br />

içinde ‘defaults in size’ yazar (Resim 15).<br />

Mavi dikdörtgen, statik elongasyon ve intensite aralıklarının belirlediği<br />

sınırlardır. Yeşil, mavi ve beyaz, hücre boyutu kontrol grafiğinde anlatıldığı gibidir.<br />

Statik elongasyon aralıkları: Elongasyon, sperm başının genişliğinin,<br />

uzunluğuna oranıdır. Elongasyon artıkça hücre yuvarlak bir hal alır. Bir dairenin<br />

elongasyonu 1.00’dir yani %100. Genelde sperm başı yuvarlak değildir ve<br />

elongasyonu yaklaşık

Resim 18: Edit/sort ekranı<br />

X ve y koordinatları: Ekrandaki x,y koordinatları Mouse işaretinin o an ki<br />

pozisyonunu belirtir (Resim 19).<br />

Yoğunluk değeri: Intensity(I) Mouse işaretinin ucunun lokalize olduğu noktayı<br />

işaret eder. İntensity 0-255 arası bir skaladır, 255 maksimum parlaklığı verir.<br />

Yoğunluk değerleri, kontrast ve yoğunluk ayarlarını kontrol etmede kullanılabilir<br />

(Resim 19).<br />

Bireysel yolların incelenmesi:<br />

Resim 19: Tek bir yolun incelenmesi ekranı<br />

Hücre verileri: 12 veri verilir (Resim 19).<br />

34

Tipi: Motil hücreler 3 şekilde verilir (hızlı, orta ve ya yavaş). Bunlar analiz<br />

ayarlarındaki VAP cut-off ve VSL cut-off ile belirlenir. VAP, VCL, VSL, STR, LIN,<br />

BCF, elongasyon, baş alanı, baş boyutu, yoğunluk ve nokta değerleri verilir.<br />

Sort durumu: Sort software yüklenirse kullanılır. Seçilen hücre üç sort ayarı<br />

için geçerli (pass) ve ya geçersiz (fail) olabilir.<br />

x-y koordinatları: Bireysel track ekranında gösterilen odaklanmış hücre yolu<br />

üzerine Mouse işareti yerleştirildiğinde, yoldaki herhangi bir noktanın koordinatları<br />

görülebilir.<br />

6) SORT:<br />

Resim 20: Sort belirleme ekranı<br />

Sort opsiyonu seçilmiş bir motil hücre alt popülasyonunu (mesela hiperaktif)<br />

analiz etmeyi sağlar (Resim 20). 3 bağımsız SORT ayarı vardır, SORT A,B,C<br />

10 tane SORT parametresi mevcuttur. Bunlardan istenilen kriterler aktive<br />

edilir. Bir sort seçilir ve seçilen sort kriterlerine uymayan tüm hücreler motil hücre<br />

popülasyonundan çıkarılır.<br />

Sort analizi ve sonuçları<br />

Sayılan hücreler: Verilen sort kriterlerine uyan ve tüm alanlarda analiz edilen<br />

total motil hücre sayısı<br />

Sample(örnek): Total motil hücre sayısı<br />

Konsantrasyon: ml’deki motil hücre sayısı<br />

Yüzde: Motil hücre yüzdesi<br />

35

7) PRİNT VE DOSYALAMA<br />

Bu seçenek ile tüm veriler bilgisayara , diskete ve CD’ye kayıt edilebilir ve<br />

istenilen sayfalar print alınabilir (Resim 21).<br />

Resim 21: Print ve dosyalama ekranı<br />

DİMENSİONS (CASA MORFOLOJİ PROGRAMI)<br />

Windows morfoloji programı HTM dimensions için insan spermini strict<br />

kriterlerine göre analiz eder. Bunun için baş, akrozom,ve midpiece(orta hat) şeklinde<br />

her hücre kategorize edilir.<br />

BAŞ<br />

Baş düz ve oval konfigürasyona sahip olmalıdır. Normal baş uzunluğu 3-5<br />

mikron genişliği ise 2-3 mikron olmalıdır. Sınırda normal baş formları ve /ve ya ovale<br />

yakın başlar eğer gros anormalliği yok ise subnormal olarak sınıflandırılır.<br />

AKROZOM<br />

Akrozom anterior sperm başının % 40 ila % 70’ini içermelidir.<br />

MİDPİECE (ORTA PARÇA)<br />

Midpiece slender (aksiyel olarak tutunmalıdır), yaklaşık 1 mikron genişliğinde<br />

ve baş uzunluğunun 1.5 katı olmalıdır. Baş büyüklüğünün yarısından fazla<br />

olmayacak şekilde sitoplazmik droplet olmalıdır.<br />

Programa başlamak için Windows masaüstünde dimensions ikonuna basılır ve<br />

ana ekran gelir.<br />

36

İVOS optik ayarları<br />

Phase annulus morfoloji incelemesinde çıkarılır. Bu sadece motilite<br />

incelenirken kullanılır.<br />

Setup menü<br />

Slide ID ve boyama tipi seçilir(Diff-Quik, papaicoloao)<br />

Display mode: a)none (fast) : Yüzey analiz edildikten sonra ekranda sonuç<br />

göremezsin b) sadece klasifikasyon (classification only) : Sadece kategorize eder<br />

c) komplet : Tüm analiz sonuçları gösterilir.<br />

Işık ayarı: Burada ışık ve netlik ayarı yapılır.<br />

Skalayı kalibre etmek: Bu prosedür her 100X oil immersiyon objektifi için bir<br />

defa yapılır. Ama analiz öncesi değişmediğinin kontrol edilmesi faydalıdır.<br />

Otomatik görüntü kaydetme : Analiz edilen tüm alanların dijital görüntü<br />

olarak saklanmasını sağlar.<br />

Otomatik görüntü print etme: Görüntülerden print alınabilir.<br />

HARDWARE hazırlanması<br />

1) Slide yerleştirilir ve hazırlanır,<br />

2) Kondenser apertura lever’ın açık pozisyonda olduğundan emin olunur,<br />

3) Görüntü odaklanması yapılır,<br />

4) Hasta bilgileri girilir.<br />

37

ANALİZ EKRANI<br />

Resim 22: Morfoloji ekranı<br />

Frames: Ne kadar görüntü incelenmiş onu gösterir.<br />

Total sperm: İdentifiye edilen sperm sayısına, otomatik olarak iptal edilen ve<br />

ya manuel olarak iptal edilenler dahil edilmez.<br />

İluminasyon: İlumimasyon durumunu gösterir.<br />

Stage pozisyonu: Normalde İVOS üzerinde manuel olarak LOAD ve JOG<br />

butonları bulunur ve bunlarla slide kaydırılabilir, bunun yanında in ve out ekranıylada<br />

hareket ettirilebilir.<br />

Resim 23: Preparatın konulduğu alan<br />

38

ÖRNEK ANALİZİ<br />

Analiz butonuna basarak analiz edilir. Sonra alan değiştirilerek işleme devam<br />

edilir.<br />

Analiz sonuçları:<br />

Ekrandaki cell history’e (daha önce incelenen hücreler) basılır 200 hücreye<br />

kadar analizler görülür, ekranda en fazla 20 hücre görülebilir. Her hücre 5 şekilde<br />

ifade edilir.<br />

1) normal 2) anormal 3) slight anormal 4) anormal tail 5) ignore edilenler<br />

manual olarak da hücreler iptal edilebilir.<br />

Analiz edilen hücreler normal, slightly amorf ve ya anormal olarak strict<br />

kriterlerine göre klasifiye edilir. Sperm birden fazla anormalite kategorisine<br />

girebileceğinden bozuklukların total sayısı total anormal hücre sayısından fazla<br />

olabilir. Morfoloji indeksi, normal ve slight amorf hücrelerin yüzdelerinin toplamıdır.<br />

Materyal ve metod<br />

Sperm morfolojisi preparatlarının hazırlanması ve boyanması ile ilgili tekniğin<br />

önemi daha önce detaylı bir şekilde yayınlanmıştır (62).<br />

Bu çalışmaya, Ocak 2006 ile Nisan 2006 tarihleri arasında Taksim Eğitim ve<br />

Araştırma Hastanesi androloji polikliniğine başvuran 32 hasta rastgele seçilerek dahil<br />

edildi. Her hastanın tüm semen parametreleri incelendi.<br />

Semen örnekleri masturbasyon ile 2 ila 4 günlük cinsel perhiz sonrası<br />

alınmıştır. Alınan semen örneklerinin likefiye olması için ortalama 30 dakika (15 -60<br />

dk), 37º C derece inkübatör içinde beklenmiştir. Ve 1 saat içinde morfoloji<br />

preparatları hazırlanmıştır.<br />

Yıkama yapılmayan grupta semen örnekleri %70’lik alkol ile temizlenmiş<br />

lamlara ince bir şekilde yayılmıştır ve oda sıcaklığında (20-25 derece) kurumaya<br />

bırakılmıştır. Konsantrasyon, konulan damlanın miktarı ve smear tekniği her büyük<br />

büyütmede 10-20 spermatozoa ( bilgisayar ekranı için 5-10 spermatozoa) olacak<br />

şekilde standardize edilmeye çalışılmıştır (63). Bilgisayar değerlendirmesi için<br />

gereken dansite manuel değerlendirme için gerekenin iki katıdır. Oda sıcaklığında<br />

kurutulmuş preparatlar Diff-Quik boyama metodu (Merck Diagnostica, Darmstadt,<br />

Almanya) ile şu şekilde boyanmıştır: lamlar ilk olarak solüsyon 1’de 10 saniye<br />

39

ekletilerek fikse edilmiştir ve çıkartılıp bir kurutma kağıdı ile lamın kenarından<br />

boyanın fazlası alınmıştır, solüsyon 2’de 7 saniye, solusyon 3’te 7 saniye<br />

bekletildikten sonra çıkartılıp bir kurutma kağıdı ile lamın kenarından boyanın fazlası<br />

alınıp, musluk altında dikkatlice yıkanmıştır. Sonrasında yine oda sıcaklığında<br />

kurumaya bırakılmıştır. Yıkanmış preparatlarda da Diff-Quik boyama metodu aynı<br />

şekilde yapılmıştır.<br />

Sperm yıkama için değişik yıkama mediumları vardır .Biz bu çalışmada<br />

Spermfilter (Cryos, Aarhus, Danimarka) ve Spermwash (Cryos, Aarhus, Danimarka)<br />

mediumlarını kullandık.<br />

Spermfilter, silana kaplı silika jel parçacıklar içeren fosfat ve Hepes tamponlu<br />

bir izotonik tuz solüsyonudur. Spermfilter solüsyonunun, %100’lük solüsyonunu<br />

seyreltmek için farklı yöntemler kullanılabilir. Mesela 8 ml %80’lik ve 8 ml %40’lık<br />

spermfilter hazırlamak için; 9.6 ml %100’lük spermfilter ve 2.4 ml Spermwash<br />

(Cryos, Danimarka) dikkatlice karıştırılır. %40’lık spermfilter için ise 4 ml %80’lik<br />

gradient ile 4.0 ml spermwash medium karıştırılır. Spermwash medium EBSS içinde<br />

(Earle’s dengeli tuz solüsyonu); HSA, purivat, Hepes, fenol kırmızısı, sodyum<br />

bikarbonat ve 10 mikrogram/ml gentamisin içerir.<br />

Yıkama yapılan grupta; her deney için kapaklı steril tüpe dikkatlice 2 ml %80<br />

ve %40 spermfilter gradientlerden ikisi koyuldu. Karışmamasına dikkat edildi.<br />

Genellikle iki gradient kullanılması önerilir. Kullanılmadan önce bütün solüsyonlar oda<br />

sıcaklığına getirildi. 2 ml likefiye olmuş semen hazırlanan gradientlerin üzerine<br />

dikkatlice koyuldu. 20 dakika 300g’de santrifüj edildi. Steril bir Pastör pipeti<br />

kullanarak süpernatan atıldı. Pellet oluşmayan vakalarda santrifüj işlemini 10 dakika<br />

daha tekrar edildi. Spermi 2.5-5 ml spermwash medium ile yeniden süspanse edildi,<br />

yaklaşık 5 dakika bu solüsyon içinde bırakıldı ve 10 dakika daha santrifüj edildi.<br />

Süpernatan atıldı ve aynı işlemi bir defa daha tekrar edildi. Tüpün dibindeki sperm<br />

yumağının üzerine Spermwash koyularak istenilen konsantrasyon elde edildi.<br />

Yukarıda tariflenen boyama işlemli aynı şekilde yıkanmış örneklere de<br />

uygulanır ve arka planı minimal boyanmış, iyi kontrast ve renk diferansiasyonu<br />

sağlanan preparatlar hazırlanır.<br />

40

Deney 1 (hücre-hücre varyasyonu)<br />

Bu deneyin amacı tek bir hücre incelendiğinde semen analiz sisteminin<br />

tekrarlanabilirliğini ölçmektir. Bu deneyde tek bir hastadan örnek alınmıştır. 6 adet<br />

yıkanmış sperm morfoloji lamından 300 hücre seçilip 3’er kez incelenmiştir. Sonra 6<br />

adet yıkanmamış sperm morfoloji lamından 300 hücre seçilmiş ve 3’er defa<br />

incelenmiştir.<br />

Deney 2 (intralam varyasyonu)<br />

Bu deneyin amacı aynı lamı birden fazla incelerken semen analiz cihazının<br />

tekrarlanabilirliğini ölçmektir. Bir hastadan semen örneği alınmış ve 20 adet yıkanmış<br />

sperm morfoloji lamı hazırlanmıştır ve 3’er kez incelenmiştir.<br />

Deney 3 (interlam varyasyonu)<br />

Bu deneyde aynı örneğin değişik preparatlarda incelenerek tekrarlanabilirliği<br />

ölçülmüştür. 30 hastadan semen örneği toplanmış ve her örnekten 3 adet morfoloji<br />

lamı hazırlanmıştır ve en az 100 hücre incelenmiştir.Bu örneklerin tamamı sperm<br />

yıkama işleminden geçirilerek preparatlar hazırlanmıştır.<br />

Deney 4 (insan- bilgisayar karşılaştırılması )<br />

Bu deneyde deneyimli bir kişinin manuel incelemesi ile deney 3’deki<br />

preparatların CASA morfoloji incelemeleri karşılaştırılmıştır. Bu deneyde preparat ilk<br />

önce başka biri tarafından CASA dimensions morfoloji programı ile incelenmiştir.<br />

Sonrasında incelenen aynı alan manuel olarak inceletilmiştir.<br />

Tüm incelemelerde HTR İVOS (12 versiyonu) sperm analiz sistemi (sperm<br />

morfoloji analizörü 32 bit versiyonu 1.5a) kullanılmıştır. Mikroskop ayarları HTR<br />

manuel kitabında anlatıldığı gibi yapılmıştır. Lamlar mikroskop alanına yerleştirilmiş<br />

ve elektronik olarak ışık kaynağına yerleştirilmiştir. Görüntü odaklanmış ve<br />

ilüminasyon ayarlanmıştır. İmersiyon yağı kullanılarak 100x büyütmeli ışık<br />

mikroskopu altında her preparat için dikkatlice odaklama yapılarak inceleme<br />

yapılmıştır.<br />

41

kullanılmıştır.<br />

Manuel incelemeler, için Olympus BX51 faz kontrast mikroskopu<br />

İstatistik<br />

Κ istatistiği Kruger ve arkadaşları tarafından tekrarlayan incelemelerdeki fikir<br />

birliğini ölçmek için kullanılmıştır (7), ve > 0.75’lik bir κ istatistik değeri mükemmel bir<br />

uyumu gösterir. Ayrıca bu çalışmada ortalama (SS) değerler, tekrarlayan analizlerde<br />

varyans analizi, Wilcoxon analizi ve paired t test kullanılmıştır.<br />

Sonuçlar<br />

Deney 1<br />

300 tane rastgele seçilmiş sperm hücresi üç kez incelenmiş (X1, X2, X3) ve<br />

normal (n) veya anormal (a) olarak sınıflandırılmıştır (Tablo1, Tablo 2).<br />

300 likefiye (yıkanmamış) hücre ele alındığında sonuçlar şu şekildedir.<br />

Ortalama κ istatistik değerleri üç okuma için 0.716’dır.<br />

Κ değerleri<br />

X1-X2 = 0.72(p

İlk okuma normalse, ikinci okumanın normal olma ihtimali %73.2 ‘dir; bu,<br />

anormal incelemeye oranla düşüktür (%97.8).<br />

3 inceleme ele alındığında prediktif değerler şöyledir:<br />

P(X3=aI X1+x²= a+a)= %98.5 (X3; üçüncü okuma)<br />

İlk iki okuma anormal ise üçüncü okumanın anormal olma ihtimali verilir<br />

(%98.5).<br />

P(X3=nIX1+x²= a+a)= %1.5 (Birinci okuma anormal, ikinci okuma anormal ise<br />

üçüncü okumanın normal olma ihtimali)<br />

P(X3=aIX1+x²= n+a)= %57.1 (Birinci okuma normal, ikinci okuma anormal ise<br />

üçüncü okumanın anormal olma ihtimali)<br />

P(X3=nIX1+x²= n+a)= %42.9 (Birinci okuma normal, ikinci okuma anormal ise<br />

üçüncü okumanın normal olma ihtimali)<br />

P(X3=aIX1+x²= n+n)= % 15.8 (Birinci okuma normal, ikinci okuma normal ise<br />

üçüncü okumanın anormal olma ihtimali)<br />

P(X3=nIX1+x²= n+n)= % 84.2 (Birinci okuma normal, ikinci okuma normal ise<br />

üçüncü okumanın normal olma ihtimali)<br />

İlk iki okumada normal ve anormal sonuçlar alındığında üçüncü okumanın<br />

normal (%42.9) ve anormal (%57.1) olma ihtimalleri yakındır.<br />

300 yıkanmış hücre ele alındığında sonuçlar şu şekildedir.<br />

Ortalama κ istatistik değerleri üç okuma için 0.77’dir.<br />

Κ değerleri<br />

X1-X2 = 0.72(p

P(x²=nIX1=a)=%2.1 (ilk okuma anormal ise, ikinci okumanın normal olma<br />

ihtimali) (X1; birinci okuma)<br />

İlk okuma normalse, ikinci okumanın normal olma ihtimali %77.8 ‘dir; bu,<br />

anormal incelemeye oranla düşüktür(%97.9).<br />

3 inceleme ele alındığında prediktif değerler şöyledir:<br />

P(X3=aIX1+x²= a+a)= %99.6 (Birinci okuma anormal, ikinci okuma anormal<br />

ise üçüncü okumanın anormal olma ihtimali)<br />

(X3; üçüncü okuma)<br />

P(X3=nIX1+x²= a+a)= %0.4 (Birinci okuma anormal, ikinci okuma anormal ise<br />

üçüncü okumanın normal olma ihtimali)<br />

P(X3=aIX1+x²= n+a)= %50 (Birinci okuma normal, ikinci okuma anormal ise<br />

üçüncü okumanın anormal olma ihtimali)<br />

P(X3=nIX1+x²= n+a)= %50 (Birinci okuma normal, ikinci okuma anormal ise<br />

üçüncü okumanın normal olma ihtimali)<br />

P(X3=aIX1+x²= n+n)= % 7.1 (Birinci okuma normal, ikinci okuma normal ise<br />

üçüncü okumanın anormal olma ihtimali)<br />

P(X3=nIX1+x²= n+n)= % 92.9 (Birinci okuma normal, ikinci okuma normal ise<br />

üçüncü okumanın normal olma ihtimali)<br />

İlk iki okumada normal ve anormal sonuçlar alındığında üçüncü okumanın<br />

normal (%50) ve anormal (%50) olma ihtimalleri eşit bulunmuştur.<br />

Yıkanmış ve likefiye preparatlar arasında önemli fark bulunamamıştır, fakat<br />

yıkanmış preparatlarda üç incelemede de anormal ve normal gelme ihtimalleri daha<br />

yüksek bulunmuştur.<br />

44

Tablo 1 Likefiye 300 hücrenin analiz sonuçları<br />

deney1 Yıkanmamış<br />

X1 X2 X3 Frekansı<br />

a a a 264<br />

a a n 4<br />

a n a 3<br />

a n n 3<br />

n a a 4<br />

n a n 3<br />

n n a 3<br />

n n n 16<br />

Toplam 300<br />

X1= birinci okuma; X2= ikinci okuma; X3= üçüncü okuma<br />

n= normal hücre a= anormal hücre<br />

Tablo 2 Yıkanmış 300 hücrenin analiz sonuçları<br />

deney1 yıkanmış<br />

X1 X2 X3 frekansı<br />

a a a 275<br />

a a n 1<br />

a n a 4<br />

a n n 2<br />

n a a 2<br />

n a n 2<br />

n n a 1<br />

n n n 13<br />

Toplam 300<br />

X1= birinci okuma; X2= ikinci okuma; X3= üçüncü okuma<br />

n= normal hücre a= anormal hücre<br />

Deney 2<br />

Hem 100 hem de 200 hücre incelendiğinde , üçer defa yapılan incelemede<br />

elde edilen ortalama değerler arasında önemli bir fark bulunamamıştır.<br />

100 hücre için average variation coefficient (Ortalama varyasyon katsayısı)<br />

% 9.8’dir.<br />

200 hücre için average variation coefficient % 9.92’dir.<br />

45

Tablo 3 Yıkanmış 100 ve 200 hücrenin sonuçları<br />

100 hücre 200 hücre<br />

ortalama SS ortalama SS P değeri<br />

R1 15,75 (8-22) 4,08 17,25 (12-22) 2,63 ,175<br />

R2 15,90 (9-20) 3,55 17,30 (12-21) 2,27 ,146<br />

R3 16,00 (10-21) 3,49 17,05 (12-22) 2,84 ,303<br />

R1: ilk okuma R2:ikinci okuma R3: üçüncü okuma<br />

100 ve 200 hücrenin incelemesi için, üç okumanın ortalama değerleri<br />

arasında anlamlı fark bulunamamıştır (Tablo 3). 200 hücre incelendiğinde bulunan<br />

ortalama normal sperm morfolojisi değerleri, sadece 100 hücre bakılan gruptan fazla<br />

bulunmuştur. 100 hücre aynı preparatta 3 kez incelendiğinde ortalama varyans<br />

analizi % 9.80 bulunmuştur. 200 hücre incelendiğinde ise bu değer % 9.92<br />

bulunmuştur.<br />

Deney 3<br />

Aynı örnekten hazırlanan 3 preparat incelendiğinde ortalama normal sperm<br />

morfolojisi değerlerinde önemli fark bulunamamıştır.<br />

Average variation coefficient % 38.62<br />

Tablo 6 30 ayrı örneğin sonuçları<br />

ortalama<br />

Standart sapma<br />

R1 5,43 3,76<br />

R2 5,03 3,85<br />

R3 5,90 4,16<br />

P değeri 0,350<br />

Aynı örnekten hazırlanan 3 preparatın incelenmesinde ortalama normal sperm<br />

morfolojisi değerleri arasında önemli fark bulunamamıştır. Ortalama varyans<br />

analizinde % 38.62’lik bir değer bulunmuştur.<br />

46

Deney 4<br />

Deney üçteki 30 hastanın preparatları manuel olarak incelenmiştir.<br />

Tablo 7 30 hastanın verileri<br />

Deney 4 Manual–CASA karşılaştırması<br />

Manuel<br />

CASA<br />

Normal morfoloji yüzdesi Normal morfoloji yüzdesi<br />

AK 7% 5%<br />

AT 10% 15%<br />

AY 1% 2%<br />

BK 3% 3%<br />

EA 7% 7%<br />

EK 9% 9%<br />

EÇ 6% 3%<br />

İT 1% 1%<br />

HÇ 7% 5%<br />

Mİ 3% 4%<br />

İB 4% 5%<br />

MK 4% 0%<br />

MB 9% 9%<br />

NT 2% 2%<br />

RD 5% 3%<br />

SB 7% 10%<br />

TŞ 6% 4%<br />

MY 8% 5%<br />

MY 6% 5%<br />

ÖG 9% 3%<br />

RB 2% 1%<br />

TA 8% 5%<br />

TÖ 12% 12%<br />

TG 10% 10%<br />

ÜA 6% 6%<br />

Vİ 5% 5%<br />

YT 10% 5%<br />

YS 3% 3%<br />

ZY 5% 5%<br />

MY 18% 18%<br />

47

Tablo 8 CASA ve Manuel Pearsons korelasyonu<br />

CASA<br />

MANUAL 0,844<br />

Tablo 9 Manuel ve CASA karşılaştırması<br />

MANUEL<br />

CASA<br />

Ortalama SS Ortalama SS p<br />

Morfoloji % 6,43 3,63 5,67 4,10 0,067<br />

Wilcoxon (Paired Samples Statistics)<br />

20<br />

16<br />

12<br />

8<br />

MANUAL<br />

4<br />

0<br />

0<br />

4<br />

8<br />

12<br />

16<br />

20<br />

CASA<br />

Grafik 1 CASA ve Manuel grafiği<br />

Yıkanmış sperm üzerinden yapılan, manuel ve CASA incelemeleri sonucunda<br />

normal sperm morfolojisi yüzdeleri arasında anlamlı fark bulunamamıştır.<br />

Tartışma<br />

Androloji laboratuarları rutin olarak manual sperm morfolojisi<br />

değerlendirmelerinin yanlışlıkları ve güvenilirsizlikleri ile mücadele etmek zorundadır.<br />

Manuel incelemelerin bu kısıtlamalarına rağmen, Coetzee ve arkadaşları birçok<br />

çalışmada normal sperm morfolojisinin, fertilizasyonun in vitro ön görülmesinde etkili<br />

48

olduğunu göstermişlerdir (1). Semen analizinin otomasyonu bu problemlerin<br />

üstesinden gelinmesine yardımcı olabilir ve böylece semen analizinin klinik önemi<br />

artırılabilir. Fakat, bu sistemlerin tüm dünyaca kabul görmesi için, doğruluğunun<br />

deneyimli bir gözlemci (manuel metod) ile karşılaştırılması gerekir.<br />

Bir sistemin sperm morfolojisi değerlendirmesindeki kesinliği, güvenilir bir<br />

semen analizinin ve teşhisin temelini oluşturur. Bizim çalışmamızda, hücre-hücre<br />

incelemesinden formüle edilen hem ikili hem de üçlü prediktif ihtimal eşitliklerinde,<br />

sistemin yüksek düzeyde tekrarlanabilir olduğu gösterilmiştir (> ± %90). Kruger ve<br />

arkadaşlarının yaptığı çalışmada, likefiye preparatlardan 255 hücre üçer defa<br />

incelenmiş ve ortalama κ istatistiği 0.83 bulunmuştur (7). Bizim çalışmamızda likefiye<br />

grupta bu değer 0.71 iken yıkanmış grupta 0.77 olarak bulunmuştur.<br />

Coetzee ve ark yaptığı çalışmada alınan sonuçlarda, birinci okumanın normal,<br />

ikinci okumanın anormal olup üçüncü okumanın normal olma ihtimali % 48 iken<br />

anormal olma ihtimali %52 bulunmuştur, yani iki sonuçta da minimal farklılıklar<br />

bulunmuştur (65). Coetzee’nin çalışmasında 300 adet yıkanmış hücre üçer defa<br />

Hamilton Thorne Research IVOS (versiyon 10) ( Dimension spesific software,<br />

versiyon 3.0) ile analiz edilmiş ve boyama yöntemi olarak Diff-Quik kullanılmıştır.<br />

Bizim çalışmamızda, yıkanmış hücre–hücre analizinde normal ve anormal<br />

değerlendirme sonuçlarında farklılık bulunamamıştır (%50, %50). Coetzee ve<br />

Kruger’in çalışmalarında kullanılan İVOS cihazları daha eski versiyonlardır.<br />

Barroso ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada, hem laboratuar içi hem de<br />

laboratuarlar arası manuel likefiye semen ve komputerize yıkanmış semen analizleri<br />

incelenmiş (68). Buna ek olarak manuel ve komputerize yıkanmış semen analizleride<br />

karşılaştırılmış ve orta derecede uyum bulunmuştur. Bizim yaptığımız çalışmada, 300<br />

adet yıkanmış ve 300 adet likefiye semen sadece komputerize yöntem ile<br />

karşılaştırılmış ve sonuçlar arasında anlamlı fark bulunamamıştır.<br />

Çalışmalarda iki şekilde reanaliz yapılabilir, birincisinde analiz edilecek bölge<br />

odaklandıktan sonra kaydedilir ve kayıt üzerinden yeniden analiz yapılır, ikincisinde<br />

analiz ekranı tekrar odaklanıp kaydedilmeden incelenebilir, ikisi arasında anlamlı<br />

49

farklılık bulunamamıştır (7,65). Biz çalışmamızda, yeniden odaklayarak tekrar analizi<br />

uyguladık.<br />

Normal sperm yüzdesinin tekrarlanabilir varyans analizleri laboratuar içinde ve<br />

laboratuarlar arasında %100’lük bir değere ulaşabilir ve birçok laboratuar için<br />

ortalama varyans analiz değerleri %30 ile %60 arasındadır (64). Şu anda otomatize<br />

sperm analiz sistemlerinin tekrarlanabilirliğini karşılaştırmada tek pratik yöntem<br />

manuel sperm morfoloji incelemesidir. Menkveld ve arkadaşları, strict kriterlerin<br />

güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini inceleyen bir çalışma yapmışlardır (3). İntralam<br />

varyasyon (4 preparat her biri 10 kez incelenmiş) çok deneyimli bir gözlemciye<br />

rağmen , %5.21 ile %27.76 arasında bulunmuştur. Başka bir çalışmada, iki deneyimli<br />

gözlemci arasında ortalama %16’lık bir varyans (%8.6 ila %-7.3, Bland ve Altman<br />

limits of agreement) bulunmuştur (7). Bu sonuçlar ışığında eğer otomatize bir sistem<br />

ile yaklaşık %15’lik bir varyans coefficient bulunursa , bu deneyimli bir gözlemcinin<br />

ortalama varyansı ile karşılaştırılabilecek düzeydedir. Coetzee ve arkadaşlarının<br />

yaptığı çalışmada, intralam varyans coefficient %9.73 (100 hücre) ve %8.30 (200<br />

hücre) bulunmuştur (65). Bizim çalışmamızda ise 100 hücre için %9.8 , 200 hücre için<br />

ise %9.92 bulunmuştur.Tüm bu değerler hedeflenen %15’lik değerin altındadır.<br />

Coetzee ve arkadaşlarının çalışmasında interlam varyans coefficient değeri<br />

%15.39 bulunurken, bizim çalışmamızda bu değer %38.62 gibi yüksek bir değer<br />

bulunmuştur (65). Bu değişim, intrinsek değişimleri önlemek için, örnek ve preparat<br />

hazırlanmasının ne kadar titiz yapılması gerektiğini vurgulamaktadır.<br />

İstatistiki varsayımlar yüzünden, sperm morfoloji sonucu için ortalama varyans<br />

coefficient’ın hem değerlendirilen spermatozoa sayısının fonksiyonunu hem de<br />

normal formların yüzdesini gösterdiği belirtilmiştir (63,66). Diğer bir deyişle, düşük<br />

normal sperm morfolojisi yüzdeleri olan semen örneklerinde tekrar analizlerinde<br />

değişkenlik oranları yüksek bulunacaktır. Davis ve Gravance, normal sperm yüzdesi<br />

verebilmek için en azından 200 hücre incelemek gerektiğini vurgulamışlardır (63).<br />

Bizim çalışmamızda da 200 hücre incelenen grupta daha yüksek oranda normal<br />

sperm morfolojisi yüzdesi bulunmuştur (R1:17.25, R2:17,30, R3:17.05).<br />

50

Günümüzde sperm morfoloji incelemesi için gereken minimum hücre sayısı<br />

100 olarak kabul edilmektedir. Bizim çalışmamızda 100 hücre için bulunan ortalama<br />

varyans analiz sonucu %9.8 bulunmuştur. Çalışmamızda 100 hücre için normal<br />

sperm yüzdesi 15.75 ile 16 arasında değişmektedir, Davis ve Gravance, her<br />

spesmenden yaklaşık 600 spermatozoa incelenerek < %10’luk ortalama varyans<br />

değerine ulaşılabilineceğini vurgulamışlardır (63).<br />

Yoğun bir androloji laboratuarında preparat başına 200 hücre incelemek<br />

uygun olabilir. Bu çalışmada kullanılan sistem saniyede 1 hücre inceler. Yani, bir<br />

görüntüyü analiz etmek için gereken zaman kısıtlayıcı faktör değildir, ama kalite<br />

(alandaki hücre sayısı ve evalue edilecek alan sayısı) ve kişinin tecrübesi çok<br />

önemlidir. Bu sistemde 100 hücreyi incelemek yaklaşık 4 ila 8 dakika sürer. Bir<br />

çalışmada, 2000 obje (20 preparat) incelenmiş ve 19 obje (%0.95) cihaz tarafından<br />

spermatozoa olarak değerlendirilmiş ama debris olarak yorumlanmıştır (65). Bu<br />

yaklaşık 100 hücrede 1 yanlış sonucu işaret eder. Bu tip hatalar normal sperm<br />

morfolojisi değerleri çok düşük olan hastalarda önem kazanır. Ayrıca ağır<br />

oligozoospermik hastalarda, alanda 100 hücre bulup incelemek oldukça zaman<br />

almaktadır.<br />

Kruger ve ark’nın yaptığı bir çalışmada, 30 hastanın likefiye semen örnekleri<br />

alınmış ve Papanicolaou metodu ile boyanarak morfoloji preparatları hazırlanmış ve<br />

manuel olarak ve CASA ile örnekler incelenmiştir (7). Manuel yöntemde Nikon<br />

mikroskop kullanılmış. Manuel ve CASA arasındaki korelasyon 0.85 olarak<br />

bulunmuştur. Bizim çalışmamızda bu değer 0.84 olarak bulunmuştur. Yani her iki<br />

yöntem de birbiri ile oldukça uyumludur. Kruger’in çalışmasındaki önemli notlardan<br />

biri de, normal morfolojisi > %20 olan durumlarda, manuel ve İVOS sonuçları<br />

arasında farklılıklar bulunmasıdır (7). Kruger, buna neden olacak en önemli faktörün<br />

mikroskopik alanda çok fazla hücre olması olduğunu vurgulamıştır. Bizim<br />

çalışmamızda da, özellikle likefiye semen örneklerinden hazırlanan preparatlarda bu<br />

sorun yaşanmış ve CASA ekranında örneği seyreltmemiz gerektiğiyle ilgili uyarı<br />

görülmüştür. Böyle bir durumda başka alanlarda sperm aranabilir ya da semen örneği<br />

seyreltilebilir.<br />

51

Sonuç<br />

Bu çalışma ile Hamilton Thorne Research IVOS semen analiz sisteminin hızlı,<br />

güvenilir ve tekrar edilebilir bir yöntem olduğu gösterilmiştir. Sperm morfolojisi<br />

değerlendirmelerindeki değişim %10’un altına indirilebilir. Bunun için dikkat edilmesi<br />

gereken bazı noktalar şöyledir; örnek alımı ve preparat hazırlanması standardize<br />

edilmelidir, dikkatli odaklama yapılmalıdır, optimum sayıda hücre incelenmelidir.<br />

Ayrıca, bu otomatize sistem ile sperm morfolojisi değerlendirmesi, manuel yöntem ile<br />

uyum göstermektedir. Bundan sonra da daha ileri teknoloji kullanan sperm analiz<br />

cihazları piyasaya çıkacaktır ve bunlarla yapılacak çalışmalar ile ideal sperm<br />

morfolojisi analiz sistemlerinin güvenle kullanılabileceği gösterilebilecektir.<br />

52

KAYNAKLAR<br />

1. Coetzee K, Kruger TF, Lombard CJ(1998) Predictive valueof normal<br />

sperm morphology a structured review. Hum Reprod Update 4:73-82.<br />

2. Ombelet W, Pollet H, Bosman E, Vereecken A (1997) Results of a<br />

questionnaire on sperm morphology assessment. Hum Reprod<br />

12:1015-1020.<br />

3. Menkveld R, Stander FSH, Kotze TJvW, Kruger Tf, van Zyl JA. The<br />

evaluation of morphological characteristics of human spermatozoa<br />

according to stricter criteria. Hum Reprod 1990;5:586-92.<br />

4. Kruger TF, Menkveld R, Stander FSH, Lombard GJ, van der Merve JP,<br />

van zyl JA, et al. Sperm morphological features as a prognostic factor in<br />

in vitro fertilization. Fertil Steril 1986;46:1118-23.<br />

5. Kruger TF, Acosta AA, Simons KF, Swanson RJ, Matta JF, Oehninger<br />

S. Predictive value of abnormal sperm morphology in in vitro<br />

fertilization. Fertil Steril 1988;49:112-7.<br />

6. Van der Merwe JP, Kruger TF, Swart Y, Lombard CJ. The role of<br />

oocyte maturity in the treatmant of infertility because of<br />

teratozoospermia and normozoospermia with gamete intrafallopian<br />

transfer. Fertil Steril 1992;58:581-6.<br />

7. Kruger TF, Menkveld R, du Toit TC, Lombard CJ, Franken <strong>DR</strong>. Sperm<br />

morphology: assessing the agreement between the manual method<br />

(strict criteria) and the sperm morphology analyzer IVOS. Fertil Steril<br />

1995;63:134-41.<br />

53

8. Garrett C, Liu DY, gordon Baker HW (1997) Selectivity of the human<br />

sperm-zona pellucida binding process to sperm head morphometry.<br />

Fertil Steril 67:362-371.<br />

9. Johnson M, Everitt B: Essential Reproduction. Third ed. Blackwell<br />

Scientific publ, 1988.<br />

10. Steinberger A, Steinberger E: Testicular Development, Structure, and<br />

Function. New York , Raven Press, 1980.<br />

11. Junqueira LC, Carneiro J: Basic Histology.10th Edition.Mcgraw<br />

Hill,2003.<br />

12. Weiss L: Histology.Cell and Tissue Biology.Fifth Ed . Elsevier<br />

Biomedical,1983.<br />

13. Amann RP: Structure and function of the normal testis and epididymis.<br />

J am Coll Toxicol 1989;8(3):457-71.<br />

14. Clermont Y:Kinetics of spermatogenesis in mammals: Seminiferous<br />

epithelial cycle and spermatogenial renewal. Physiol Rev 1972;52:198-<br />

236.<br />

15. Nistal M, Paniagua r (eds): Testicular and Epididymal Pathology New<br />

York , Thieme Stratton Inc , 1984.<br />

16. Russel LD, Etlin RA, Hikim APS , Clegg ED: Histological and<br />

Histopathological Evaluation of the Testis. Cache River Pres, 1990.<br />

17. Talerman A, Roth LM (edr): Pathology of the Testis and its Adnexa.<br />

New York , Edinburg, London, Melbourne, Churchill Livingstone, 1986.<br />

18. Setchell BP: The Mammalian Testis. Ithaca, Cornell Univ. Pres, 1978.<br />

54

19. Burger H, de Kretser D: Comprehensive Endocrinology in the Testis<br />

.New York, Raven Pres ,1981.<br />

20. Hamilton DW, Greep Ro(eds): Handbook of Physiology in Reproductive<br />

System. 7th Section , Vol.V. Washington Dc, American Physiology<br />

Society, 1975.<br />

21. Johnson Ad, gomes WR (Eds): The Testis. Vols 1-4. Academic Press ,<br />

1977.<br />

22. de Kretser DM, Meihardt A, Meehan T, et al: The roles of inhibin related<br />

peptids in gonadal function. Mol Cell Endocrinol 2000;161:43-46.<br />

23. de Kretser DM, Robertson DM: The isolation and physiology of inhibin<br />

and related proteins. Biol Reprod 1989;40:33-47.<br />

24. Clarke IJ, Rao A, Fallest PC, Shupnik MA: Transcription rate of the<br />

follicle stimulating hormone (FSH) beta subunit gene is reduced by<br />

inhibin in sheep but this does not fully explain the decrease in mRNA.<br />

Mol Cell Endocrinol 1993;91:211-216.<br />

25. Kolb BA, Stanczyk FZ, Sokol RZ: Serum inhibin B levels in males with<br />

gonadal dysfunction. Fertil Steril 2000;74:234-238<br />

26. Weinbauer GF, Gromoll J, Simini M, Nieschlag E: Physiology of<br />

testicular function . In Nieschlag E, Behre HM(eds): Andrology , Berlin,<br />

Springer, 2000(second edition), pp 23-61.<br />

27. El-Gehani F; Zang FP, Pakarinen P, Rannikko A, Huhtaniemi I:<br />

Gonadotropin-independent regulation of steroidogenesis in the fetal rat<br />

testis. Biol. Reprod 1998;58(1):116-23.<br />

28. Majdic G, Saunders PT, Teerds KJ: Immunoexpression of the<br />

steroidogenic enyzmes 3-beta hydroxysteroid dehydrogenase and 17<br />

55

alpha-hydroxylase, C17,20 lyase and the receptor for luteinizing<br />

hormone(LH) in the fetal rat testis suggests that the onset of Leydig cell<br />

steroid production is independent of LH action. Biol reprod<br />

1998;58(2):520-525.<br />

29. Main KM, Schmidt IM, Skakkebaek NE: a possible role for reproductive<br />

hormones in newborn boys: progressive hypogonadism without the<br />

postnatal testosterone peak. J Clin Endocrinol Metab 2000;85(12):<br />

4905-7.<br />

30. Barthke A: Role of growth hormone and prolactin in the control of<br />

reproduction: what are we learning from transgenic and knock-out<br />

animals? Steroids 1999;64(9):598-604.<br />

31. Quinton ND, Smith RF, Clayton PE, Gill MS, Shalet S, Justice SK,<br />

Simon SA, Walters S, Postel-Vinay MC, Blakemore AI, Ross RJ: Leptin<br />

binding activity changes with age:The link between leptin and puberty. J<br />

Clin Endocrinol Metab 1999;84(7):2336-41.<br />

32. Dearth RK, Hiney Jk, Dees WL:Leptin acts centrally to induce the<br />

prepubertal secretion of luteinizing hormone in the female rat. Peptides<br />

2000;21(3):387-92.<br />

33. Tena-Sempere M, Pinilla L, Gonzalez LC, Casanueva FF, Dieguez C,<br />

Aguilar E: Homologous and heterologous down-regulation of leptin<br />

receptor messenger ribonucleic acid in rat adrenal gland. J Endocrinol<br />

2000;167(39):479-86.<br />

34. Barratt CLR: Spermatogenesis. In Grudzinskas JG, Yovich JL (ed):<br />

Gametes –The spermatozoon . Cambridge, Cambridge University<br />

Pres, 1995, pp 250-267.<br />

56

35. Gartner LP, Hiatt JL: Color Textbook of Histology. Pennsylvania, W.B.<br />

Saunders Company, 1997, pp 406-412.<br />

36. Ross MH, Kaye GI, Pawlina W: Histology: a Text and Atlas, 4th edt,<br />

Lippincott Williams-Wilkins , Philedelphia, 2003 , pp 689-696.<br />

37. Parks JE, Lee <strong>DR</strong>, Huang S, Kaproth MT: Prospects for<br />

spermatogenesis in vitro. Theriogenology 2003;59:73-86.<br />

38. Syed V, Hecht NB: Disruption of germ cell-Sertoli cell interactions leads<br />

to spermatogenic defects. Mol Cell Endocrinol (MCE) 2002;186:144-<br />

157.<br />

39. Johnson L: Spermatogenesis and aging in the human. J Androl<br />

1986;7:331-354.<br />

40. Jarow JP: Life-threatening conditions associated with male infertility.<br />

Urol Clin North Am 1994;21:409-415.<br />

41. Spira A: Epidemiology of human reproduction. Hum Reprod<br />

1986;1:111-115.<br />

42. Noord-Zaadstra BM, Looman CW, Alsbach H, et al: Delaying<br />

childbearing: Effect of age on fecundity and outcome of pregnancy.<br />

BMJ 1991;302:1361-1365.<br />

43. Ford WC, North K, Taylor H,et al: Increasing paternal age is associated<br />

with delayed conception in a large population of fertile<br />

couples:Evidence for declining fecundity in older men. The ALSPAC<br />

Study Team ( Avon Longitudinal Study of Pregnancy and Childhood) .<br />

Hum Reprod 2000;15:1703-1708.<br />

44. Mosher WD, Pratt WF: Fecundity and infertility in the United States:<br />

Incidence and trends. Fertil steril 1991;56:192-193.<br />

57

45. Thonneau P, Marchand S, Tallec A, et al:Incidence and main causes of<br />

infertility in a redident population(1,850,000) of three French<br />

regions(1988-1989). Hum Reprod 1991;6:811-816.<br />

46. Collins JA, Wrixon W, Janes LB, et al: treatment-independent<br />

pregnancy among infertile couples. N Engl J Med 1983;309:1201-1206.<br />

47. Aafles JH, van der Vijver JC, Schenck PE>. The duration of infertility:<br />

An important datum for the fertility prognosis of men semen<br />

abnormalities. Fertil Steril 1978;30:423-425.<br />

48. World Health Organization: WHO laboratory Manuel for the examination<br />

of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Interaction. Cambridge,<br />

England, Cambridge university Pres, 1999.<br />

49. Imade GE, Towobola OA, Sagay AS, et al: Discrepancies in sperm<br />

count using improved Neubauer, Makler, and Horwells counting<br />

chambers. Arch Androl 1993;31:17-22.<br />

50. Mahmoud AM, Depoorter B, Piens N, et al: The performance of 10<br />

different methods for the estimation of sperm concentration. Fertil<br />

Steril 1997;68:340-345.<br />

51. Talbot P, Chacon RS: A triple-stain technique for evaluating normal<br />

acrosome reactions of human sperm. J Exp Zool 1981;215:201-208.<br />

52. Kruger TF, Acosta AA, Simmons KF, et al: Predictive value of abnormal<br />

sperm morphology in in vitro fertilization. Fertil Steril 1988;49:112-117.<br />

53. Fredricsson B, Bjork G: Morphology of postcoital spermatozoa in the<br />

cervical secretions and its clinical significance. Fertil Steril 1977;28:841-<br />

845.<br />

58

54. Mortimer D, Leslie EE, Kelly RW, et al: Morphological selection of<br />

human spermatozoa in vivo and in vitro. J Reprod Fertil 1982;64:391-<br />

399.<br />

55. Liu DY, Baker HW: Morphology of spermatozoa bound to the zona<br />

pellucida of human oocytes that fail to fertilize in vitro.J Reprod Fertil<br />

1992;94:71-84.<br />

56. MacLeod J: Seminal cytology in the presence of varicocele. Fertil Steril<br />

1965;16:735-757.<br />

57. Katz DF, Overstreet JW, Samuels SJ, et al: Morphometric analysis of<br />

spermatozoa in the assessment of human male fertility. J Androl<br />

1986;7:203-210.<br />

58. Diamandis EP, Arnett WP, Foussias G, et al: Seminal plasma<br />

biochemical markers and their association with semen analysis<br />

findings. Urology 1999;53:596-603.<br />

59. Chia SE, Ong CN, Chua LH, et al:Comparison of zinc concentrations in<br />

blood and seminal plasma and various sperm parameters between<br />

fertil and infertil men. J Androl 2000;21:53-57.<br />

60. Zopfgen A, Priem F, Sudhoff F, et al: Relationship between semen<br />

quality and the seminal plasma components carnitine, alphaglucosidase,<br />

fructose, citrate and granulocyte elastase in infertile men<br />

compared with anormal population. Human Reprod 2000;15:840-845.<br />

61. Hamilton Thorne-IVOS Installation and getting started Guide. Hamilton<br />

Thorne Biosciences, 2002.<br />

62. Lacquet FA, Kruger TF, du toit TC, Lombard CJ, Sanchez Sarmiento<br />

CA, de viliers A, Coetzee K (1996) Slide preparation and staining<br />

59

procedures for reliable results using computerised morphology (IVOS).<br />

Arch Androl 36:133-138.<br />

63. Davis RO, Gravance CG (1993) Standardization of specimen<br />

preparation, staining, and sampling methods improves automated<br />

sperm-head morphometry analysis. Fertil Steril 59:412-417.<br />

64. Davis RO, Bain DE, Siemers RJ, Thal DM, Andrew JB, Gravance<br />

CG(1992) Accuracy and precision of the Cell Form-Human automated<br />

sperm morphometry instruments. Fertil Steril 58:763-769.<br />

65. Coetzee K, Kruger TF, Lombard CJ: Repeability and variance analysis<br />

on multiple computer-assisted(IVOS) sperm morphology readings.<br />

Androl 1999;31:163-168<br />

66. Cooper TG, Neuwinger J, Bahrs S, Nieschlag E (1992) Internal quality<br />

control of semen analysis. Fertil Steril 58:172-178.<br />

67. Katz DF, Overstreet JW, Samuels SJ, Niswander PW, Bloom TD,<br />

Lewis EL: Morphometric analysis of spermatozoa in the assessment of<br />

human male infertility. Journal of Andrology 1986;7:203-210.<br />

68. Barroso G, Mercan R, Ozgur K, Morshedi M, Kolm P, Coetze K, Kruger<br />

T, Oehninger S: Intra- and inter-laboratory variability in the assessment<br />

of sperm morphology by strict criteria: impact of semen preparation<br />

techniques and manual versus computerized analysis. Human Reprod<br />

1999;14:2036-2040.<br />

60

logo

Ürünler

Kaynaklar

Şirketler

Terms of service
Privacy policy
Cookie policy
Cookie settings
Imprint
Change language
Made with love in Switzerland
© 2024 Yumpu.com all rights reserved

Hooray! Your file is uploaded and ready to be published.

Saved successfully!

Ooh no, something went wrong!