Pełny tekst (PDF) - Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie ...

Nicienie i ich identyfikacja 1773
IV. KLASYCZNE I MOLEKULARNE METODY OZNACZANIA
GATUNKÓW NICIENI
Zapobieganie stratom, powstałym wskutek żerowania nicieni na roślinach i grzybach,
wymaga stałego monitoringu gleby, materiału siewnego i roślin pod kątem występowania
gatunków mających znaczenie gospodarcze. Przed podjęciem decyzji o sposobie
zwalczania bezwzględnie konieczna jest identyfikacja gatunku szkodnika ze względu
na różnice pomiędzy ich cyklami rozwojowymi, zakresem roślin żywicielskich i patogenicznością
względem uprawianych odmian.
Tradycyjne metody oznaczania nicieni, opierające się na porównaniu cech morfologicznych
i anatomicznych są czasochłonne, wymagają wysokiej klasy sprzętu optycznego
i dużego doświadczenia osoby oznaczającej. Ponadto, trudności w identyfikacji
gatunków nicieni metodą klasyczną, są spowodowane:
– mikroskopijnymi rozmiarami ciała nicieni i niewielkim kontrastem pomiędzy
poszczególnymi organami,
– dużą zmiennością cech osobniczych w obrębie populacji,
– względnością cech taksonomicznych u niektórych grup nicieni,
– koniecznością pozyskania odpowiedniej liczby osobników dorosłych, gdyż stadia
młodociane, stanowiące przeważnie 60–80% populacji, są praktycznie nieoznaczalne,
– skomplikowaną i czasochłonną procedurą preparowania nicieni.
Współczesne osiągnięcia biologii molekularnej pozwalają na opracowanie metod
szybkiej identyfikacji gatunków na podstawie sekwencji wybranych fragmentów DNA,
co pozwala:
– identyfikować gatunki w każdym ich stadium rozwojowym (DNA we wszystkich
komórkach jest identyczne) oraz
– pracować z minimalną ilością materiału biologicznego (nawet z jedną komórką).
Do identyfikacji gatunków zwierząt można stosować wiele metod molekularnych.
Trzy z nich są obiecujące dla nematologii.
Metody PCR (Floyd i wsp. 2005) pozwalają zidentyfikować gatunek na podstawie
wielkości i/lub temperatury topnienia produktu amplifikacji. Są to metody szybkie,
tanie, umożliwiające wykrycie kilku gatunków w analizowanej próbce, wymagają jednak
sprawdzenia specyficzności w odniesieniu do spokrewnionych gatunków. Gatunkowo-specyficzne
pary starterów można zaprojektować korzystając z odpowiedniego
oprogramowania (np. AlleleID, PremierBiosoft). Innym sposobem detekcji i różnicowania
jest metoda RFLP-PCR, która polega na amplifikacji wybranych sekwencji metodą
PCR, a następnie trawieniu enzymami restrykcyjnymi powstałych produktów reakcji.
Przynależność gatunkową określa się na podstawie różnic w długości fragmentów
restrykcyjnych.
Barkoding DNA (Ratnasingham i Hebert 2007; Elsasser i wsp. 2009; Derycke
i wsp. 2010). Kolejność ułożenia nukleotydów w określonym obszarze DNA jest charakterystyczna
dla danego gatunku – kod DNA. Praktycznie oznacza to, że każdy gatunek
można „metkować” kodem DNA, podobnie, jak oznacza się towary w sklepie kodem
paskowym. Dlatego tę metodę identyfikacji organizmów określa się jako „DNA
barcoding” (ang. barcode – kod paskowy). Do identyfikacji wszystkich towarów w skle-