Kultury in vitro tytoniu i ich znaczenie w rozwoju biotechnologii roślin ...
Kultury in vitro tytoniu i ich znaczenie w rozwoju biotechnologii roślin ...
Kultury in vitro tytoniu i ich znaczenie w rozwoju biotechnologii roślin ...
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
tur¹, po¿ywki – w autoklawie, narzêdzia metalowe<br />
(bezpoœrednio przed u¿yciem) – p³omieniem.<br />
Podstawowa po¿ywka Murashige-<br />
Skoog'a (MS) [9] jest roztworem wodnym<br />
zawieraj¹cym ró¿ne sole m<strong>in</strong>eralne, sacharozê<br />
i witam<strong>in</strong>y, am<strong>in</strong>okwas – glicynê. Dalszy<br />
rozwój wy³o¿onego na po¿ywkê fragmentu<br />
roœl<strong>in</strong>y czêsto zale¿y od suplementacji<br />
po¿ywki roœl<strong>in</strong>nymi regulatorami wzrostu<br />
i <strong>rozwoju</strong>, jak cytok<strong>in</strong><strong>in</strong>y, auksyny i (rzadko)<br />
giberel<strong>in</strong>y. Z eksplantatu mog¹ rozw<strong>in</strong>¹æ<br />
siê organy (organogeneza bezpoœrednia)<br />
– pêdy, korzenie, somatyczne zarodki<br />
(bezpoœrednia embriogeneza somatyczna)<br />
lub kalus, z którego mo¿na otrzymaæ organy<br />
przybyszowe (organogeneza poœrednia),<br />
kulturê komórkow¹ zawies<strong>in</strong>ow¹ lub zarodki<br />
somatyczne (poœrednia embriogeneza somatyczna)<br />
[2,12,14,21].<br />
<strong>Kultury</strong> kalusa i regeneracja<br />
z n<strong>ich</strong> roœl<strong>in</strong><br />
Kalus w naturze jest tkank¹ przyrann¹,<br />
powstaj¹c¹ wskutek uszkodzenia roœl<strong>in</strong>y. W<br />
kulturach <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> mo¿na go za<strong>in</strong>icjowaæ z<br />
ró¿nych eksplantatów, charakteryzuje siê<br />
zdolnoœci¹ do ci¹g³ych podzia³ów i wiêkszym<br />
lub mniejszym zró¿nicowaniem tkankowym<br />
[12].<br />
Kalus <strong>tytoniu</strong> mo¿na otrzymaæ (za<strong>in</strong>icjowaæ)<br />
z rdzenia ³odygi, który stanowi tkanka<br />
miêkiszowa [13] lub z fragmentów siewek<br />
[14]. Z wyizolowanego rdzenia ³odygi <strong>tytoniu</strong><br />
wy³o¿onego na po¿ywkê MS zawieraj¹c¹<br />
auksynê (IAA, w przewadze) i cytok<strong>in</strong><strong>in</strong>ê<br />
(k<strong>in</strong>etynê) rozwija siê po dwóch tygodniach<br />
kultura kalusowa, któr¹ po nastêpnych<br />
dwóch tygodniach mo¿na przenosiæ na<br />
now¹ po¿ywkê. Wraz ze zwiêkszaniem stê-<br />
¿enia cytok<strong>in</strong><strong>in</strong>y obserwuje siê proporcjonalny<br />
wzrost masy kalusa. St¹d kultura kalusa<br />
z rdzenia <strong>tytoniu</strong> nadaje siê do oznaczania<br />
si³y dzia³ania cytok<strong>in</strong><strong>in</strong>. Z kalusa wy³o¿onego<br />
na po¿ywkê o odpowiedniej proporcji<br />
auksyny do cytok<strong>in</strong><strong>in</strong>y rozwijaj¹ siê pêdy lub<br />
korzenie, a nawet roœl<strong>in</strong>ki. Kulturê kalusow¹<br />
<strong>tytoniu</strong> mo¿na te¿ ³atwo otrzymaæ z siewek<br />
(jako eksplantatów) otrzymanych przez<br />
skie³kowanie wyja³owionych nasion na po-<br />
¿ywce MS. Po trzech tygodniach siewki tnie<br />
siê i <strong>ich</strong> fragmenty wyk³ada na po¿ywkê MS<br />
z k<strong>in</strong>etyn¹ i IAA (w przewadze), utrzymuje<br />
w ciemnoœci i temperaturze 27-30°C. Po<br />
szeœciu tygodniach kalus odc<strong>in</strong>a siê od eksplantatów<br />
(fragmentów siewek) i pasa¿uje<br />
na tak¹ sam¹ po¿ywkê, na nastêpne 6 tygodni<br />
w celu przyrostu kalusa. Niedawno<br />
wydatnie poprawiono wzrost i stabilnoœæ genetyczn¹<br />
kalusa <strong>tytoniu</strong> przez zamianê w<br />
po¿ywce MS nieorganicznego azotu i fosforu<br />
na organiczny w postaci peptonu sojowego<br />
i kwasu fitowego (heksafosforan <strong>in</strong>ozytolu)<br />
[11].<br />
Roœl<strong>in</strong>y haploidalne<br />
Szczególnymi eksplantatami s¹ ziarna<br />
py³ku, czyli mikrospory, z których, w wyniku<br />
procesu zwanego androgenez¹, mo¿na zregenerowaæ<br />
roœl<strong>in</strong>y haploidalne [13]. Materia³em<br />
wyjœciowym kultur s¹ pylniki zawieraj¹ce<br />
jednoj¹drowe mikrospory wyizolowane<br />
z wyja³owionych nie otwartych p¹czków<br />
kwiatowych <strong>tytoniu</strong> (gdy korona i kiel<strong>ich</strong><br />
maj¹ jednakow¹ d³ugoœæ). Pylniki wyk³ada<br />
siê na po¿ywkê MS bez regulatorów wzrostu.<br />
Z mikrospor rozwijaj¹ siê haploidalne<br />
roœl<strong>in</strong>ki, które po potraktowaniu kolchicyn¹<br />
staj¹ siê roœl<strong>in</strong>ami diploidalnymi – homozygotycznymi.<br />
Zalet¹ <strong>ich</strong> jest utrzymanie po-<br />
¿¹danych cech recesywnych.<br />
Protoplasty i <strong>ich</strong> fuzja<br />
Protoplast to komórka roœl<strong>in</strong>na, z której<br />
usuniêto œcianê komórkow¹. Szczególnie<br />
³atwo jest otrzymaæ protoplasty z mezofilu<br />
(miêkisz zieleniowy) liœcia <strong>tytoniu</strong> [13]. Po<br />
zdjêciu dolnej skórki liœcia i zanurzeniu w<br />
roztworze hipertonicznym mannitolu i nastêpnie<br />
w roztworze enzymów celulolitycznych<br />
i pektynolitycznych nastêpuje uwolnienie<br />
protoplastów, które wydziela siê przez<br />
wirowanie w roztworze sacharozy. Po przeniesieniu<br />
protoplastów na po¿ywkê regeneruj¹<br />
œciany komórkowe.<br />
<strong>Kultury</strong> protoplastów mog¹ s³u¿yæ do<br />
badañ fizjologii. Protoplasty ró¿nych odmian,<br />
gatunków, a nawet rodzajów, mo¿na ³¹czyæ<br />
(fuzja) dzia³aj¹c ró¿nymi czynnikami, np.<br />
polietylenoglikolem (PEG). Z uzyskanych<br />
hybryd po regeneracji œcian komórkowych<br />
mo¿na wyprowadziæ pe³ne roœl<strong>in</strong>y stanowi¹ce<br />
mieszañce somatyczne. Fuzja protoplastów<br />
pozwala na uzyskanie mieszañców<br />
roœl<strong>in</strong>, których nie udaje siê otrzymaæ w sposób<br />
tradycyjny – przez krzy¿owe zapylanie.<br />
Dodatkowo, protoplasty mog¹ byæ bezpoœrednio<br />
transformowane genetycznie z u¿yciem<br />
elektroporacji lub glikolu polietylenowego<br />
i mo¿na z n<strong>ich</strong> uzyskaæ wtedy roœl<strong>in</strong>y<br />
transgeniczne.<br />
Szansa zregenerowania roœl<strong>in</strong> z wyizolowanych<br />
protoplastów jest jednak wzglêdnie<br />
niska. Gatunki nale¿¹ce do rodz<strong>in</strong>y Solanaceae,<br />
w tym Nicotiana regeneruj¹ naj-<br />
³atwiej [12].<br />
Regeneracja roœl<strong>in</strong> transgenicznych<br />
Eksplantatami s¹ liœcie roœl<strong>in</strong> gruntowych<br />
(wymagaj¹ wyja³owienia podchlorynem)<br />
lub liœcie siewek skie³kowanych ze sterylnych<br />
nasion. Z liœci wyc<strong>in</strong>a siê kr¹¿ki, które<br />
wyk³ada siê na po¿ywkê, a po dwóch dniach<br />
umieszcza w zawies<strong>in</strong>ie transgenicznej bakterii<br />
Agrobacterium tumefaciens (15s do 1<br />
m<strong>in</strong>) na p³ytkach Petriego. Nastêpnie po<br />
wysuszeniu kr¹¿ków liœciowych na bibule<br />
filtracyjnej (celem usuniêcia zawies<strong>in</strong>y bakterii)<br />
wyk³ada siê je na po¿ywkê MS z cytok<strong>in</strong><strong>in</strong>¹<br />
(BA w przewadze) i auksyn¹ (NAA)<br />
na 2 dni i nastêpnie przenosi na tak¹ sam¹<br />
po¿ywkê dodatkowo z antybiotykami (kanamycyn¹<br />
i karbenicyl<strong>in</strong>¹) w celu elim<strong>in</strong>acji<br />
bakterii i selekcji transformantów. Po 2-4<br />
tygodniach kultury wyrastaj¹ pêdy, które<br />
przenosi siê na po¿ywkê ukorzeniaj¹c¹ bez<br />
regulatorów wzrostu, zawieraj¹c¹ obydwa<br />
antybiotyki [14].<br />
<strong>Kultury</strong> komórkowe <strong>tytoniu</strong><br />
Szczególnego znaczenia nabra³a kultura<br />
zawies<strong>in</strong>owa l<strong>in</strong>ii komórkowej <strong>tytoniu</strong> o<br />
nazwie BY-2 uzyskana z kalusa z rdzenia<br />
³odygi odmiany hodowlanej <strong>tytoniu</strong> N.tabacum<br />
cv. Bright Yellow No. 2 w Japonii, w<br />
1968 roku [15]. Pod wzglêdem w³aœciwoœci<br />
jest ona porównywalna z l<strong>in</strong>i¹ ludzk<strong>ich</strong> komórek<br />
HeLa. Komórki BY-2 s¹ komórkami<br />
bezzieleniowymi, dziel¹cymi siê niezwykle<br />
szybko na odpowiedniej po¿ywce i w odpowiedn<strong>ich</strong><br />
warunkach – czas podwojenia kultury<br />
wynosi 13 godz<strong>in</strong>, a w ci¹gu tygodnia<br />
liczba komórek mo¿e wzrosn¹æ 100-krotnie.<br />
Co wiêcej bardzo ³atwo mo¿na uzyskaæ kulturê<br />
synchroniczn¹ czyli z³o¿on¹ z komórek<br />
w tej samej fazie cyklu komórkowego. Z<br />
tego wzglêdu l<strong>in</strong>ia komórkowa BY-2 sta³a<br />
siê modelowym systemem badania biologii<br />
komórki roœl<strong>in</strong>nej i jej kompartmentów - podzia³ów<br />
komórkowych w tym cytok<strong>in</strong>ezy, <strong>rozwoju</strong><br />
cytoszkieletu i organelli, sygnalizacji<br />
hormonów roœl<strong>in</strong>nych. Komórki BY-2 s¹<br />
równie¿ podatne na transformacjê genetyczn¹,<br />
co znacznie rozszerzy³o mo¿liwoœci <strong>ich</strong><br />
zastosowañ [1,3,8,20].<br />
Biosynteza w kulturze<br />
<strong>in</strong> <strong>vitro</strong> <strong>tytoniu</strong><br />
Ze wzglêdu na mo¿liwoœæ pe³nej kontroli<br />
nad rozwojem materia³u roœl<strong>in</strong>nego w<br />
kulturze <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> mo¿na w niej sterowaæ równie¿<br />
biosyntez¹ okreœlonych metabolitów.<br />
Nale¿y rozró¿niæ biosyntezê de novo, czyli<br />
ze sk³adników pokarmowych po¿ywki oraz<br />
biosyntezê z prekursorów, czyli zwi¹zków<br />
poœredn<strong>ich</strong> danego szlaku biosyntezy dodawanych<br />
do po¿ywki. Przyk³adem badañ<br />
dotycz¹cych obydwu rodzajów biosyntezy<br />
s¹ badania nad biosyntez¹ kwasu chlorogenowego<br />
w kulturze komórkowej zawies<strong>in</strong>owej<br />
Nicotiana plumbag<strong>in</strong>ifolia [4]. Kwas<br />
chlorogenowy to estrowe po³¹czenie kwasu<br />
kawowego i ch<strong>in</strong>owego o w³aœciwoœciach<br />
przeciwutleniaj¹cych, hamuj¹cych glikogenolizê,<br />
obni¿aj¹cych poziom cukru we krwi.<br />
Badania wp³ywu warunków kultury na akumulacjê<br />
tego zwi¹zku wykaza³y, ¿e hamowana<br />
jest ona w ciemnoœci. Wzbogacanie<br />
po¿ywki o kwas kawowy nieoczekiwanie<br />
zmniejsza³o zawartoœæ kwasu chlorogenowego,<br />
w miejsce którego powstawa³y trzy<br />
nowe niezidentyfikowane zwi¹zki. Natomiast<br />
wzbogacanie po¿ywki o kwas ch<strong>in</strong>owy pozosta³o<br />
bez wp³ywu.<br />
W <strong>tytoniu</strong> mo¿na produkowaæ zwi¹zki<br />
obce dla tego gatunku dziêki <strong>in</strong>¿ynierii metabolicznej,<br />
polegaj¹cej na wprowadzeniu do<br />
komórek genu enzymu – katalizatora tej syntezy.<br />
Z kolei poziom zachodz¹cej ju¿ syntezy<br />
mo¿na zwiêkszyæ (elicytowaæ) za pomoc¹<br />
jasmonianu metylu, który jest zwi¹zkiem<br />
stresowym (elicytorem) nasilaj¹cym biosyntezê<br />
metabolitów wtórnych w roœl<strong>in</strong>ach.<br />
Przyk³adem w kulturach Nicotiana tabacum<br />
jest <strong>in</strong>¿ynieria biosyntezy limonenu, lotnego<br />
zwi¹zku monoterpenowego, zapachowego<br />
(aromat cytryny) maj¹cego zastosowanie<br />
w przemyœle spo¿ywczym i kosmetycznym<br />
[10]. Do komórek <strong>tytoniu</strong> wprowadzono<br />
nie wystêpuj¹cy w nim gen (cDNA) enzymu<br />
syntazy limonenu pochodz¹cego z<br />
<strong>in</strong>nej roœl<strong>in</strong>y (Perilla frutescens) przez transformacjê<br />
za poœrednictwem bakterii Agrobacterium.<br />
Zastosowano trzy ró¿ne konstrukty<br />
genowe, tak aby gen zosta³ wprowadzony<br />
albo do plastydów albo cytozolu<br />
albo do retikulum endoplazmatycznego<br />
(RE). Substratem tego enzymu jest difosforan<br />
geranylu, konstytutywny dla <strong>tytoniu</strong> jako<br />
prekursor biosyntezy karotenoidów i fitosteroli,<br />
ale nie monoterpenów. Stwierdzono<br />
najwiêksz¹ aktywnoœæ enzymu zlokalizowanego<br />
w plastydach, ni¿sz¹ w cytozolu i brak<br />
jego aktywnoœci w RE. Stwierdzono, ¿e liœcie<br />
zregenerowanych transgenicznych roœl<strong>in</strong><br />
produkuj¹ limonen <strong>in</strong> vivo, którego za-<br />
892 Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 10 A. Budzianowska
Change language