Diss Dagmar Toepfer - Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Tierärztliche Hochschule Hannover
Institut für Reproduktionsbiologie
Die Abhängigkeit der Steroidhormonsynthese
in porzinen Kumuluszellen von
der MAPK (mitogen activated protein kinase) und
dem BMP6 (bone morphogenetic protein 6)
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades
einer Doktorin der Naturwissenschaften
- Doctor rerum naturalium -
(Dr. rer. nat.)
vorgelegt von
Dagmar Töpfer
Magdeburg
Hannover 2011

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. Burkhard Meinecke
1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Burkhard Meinecke
2. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Bernd Schröder
Tag der mündl. Prüfung: 25.11.2011
Diese Arbeit entstand in Zusammenarbeit des Instituts für Reproduktionsbiologie
mit dem Virtuellen Zentrum für Reproduktionsmedizin.

Es irrt der Mensch, so lange er strebt.
Johann Wofgang von Goethe

Inhalt
1 EINLEITUNG..................................................................................................... 11
2 LITERATURÜBERSICHT.................................................................................. 13
2.1 Oogenese und Follikulogenese ........................................................... 13
2.2 Signalvermittlung ................................................................................. 16
2.2.1 MAPK (mitogen-activated protein kinase)..............................17
2.2.2 OSFs (oocyte-secreted factors) .............................................21
2.3 Steroidhormone im Ovar...................................................................... 24
2.3.1 Steroidhormonbiosynthese im Ovar.......................................26
2.3.2 Einfluss der MAPK .................................................................29
2.3.3 Einfluss von BMP6.................................................................30
2.4 Zielsetzung der Arbeit.......................................................................... 33
3 METHODEN...................................................................................................... 34
3.1 Isolierung und Klassifizierung der
Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOKs) .................................................. 34
3.2 Kultivierung der KOKs.......................................................................... 35
3.3 Vitalfärbung der Kumuluszellen ........................................................... 36
3.4 Beurteilung des Kernreifungsstatus ..................................................... 38
3.5 Bestimmung der Hormonkonzentrationen im Medium ......................... 40
3.6 Molekularbiologische Methoden .......................................................... 41
3.6.1 RNA-Extraktion ......................................................................41
3.6.2 Kontrolle der RNA-Qualität.....................................................42
3.6.3 Bestimmung der RNA-Konzentration .....................................43
3.6.4 Ermittlung der PCR-Zyklusanzahl ..........................................43
3.6.5 Allgemeines zur PCR.............................................................44
3.6.6 Durchführung der one-step Reverse Transkriptase-PCR ......46
3.6.7 Agarose-Gelelektrophorese ...................................................50
3.6.8 Auswertung der Ergebnisse...................................................51
3.6.9 Identifikation der PCR-Produkte.............................................51
3.7 Analyse der MAPK-Phosphorylierung.................................................. 52
3.7.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)............52
3.7.2 Immunoblot ............................................................................53
3.7.3 Auswertung der Chemilumineszenz.......................................54
3.8 Zusammenfassung des Versuchdesigns ............................................. 55
3.9 Statistische Auswertung....................................................................... 57
4 ERGEBNISSE................................................................................................... 58
4.1 Kernreifungsraten ................................................................................ 58
4.1.1 Einfluss von U0126 auf die Kernreifung der Oozyten ............58
4.1.2 Einfluss von BMP6 auf die Kernreifung der Oozyten .............60
4.2 Kumuluszellexpansion im Basismedium (BM), BM+U0126
und im BM+BMP6 ............................................................................... 61

Inhalt
4.3 Hormonanalysen im Medium ............................................................... 63
4.3.1 17ß-Estradiolkonzentrationen (E2) .........................................63
4.3.2 Progesteronkonzentrationen (P4)...........................................65
4.4 RNA ..................................................................................................... 67
4.4.1 RNA-Integrität ........................................................................67
4.4.2 RNA-Konzentration ................................................................68
4.4.3 Identifikation der PCR-Produkte.............................................69
4.5 RT-PCR ............................................................................................... 70
4.5.1 StAR ......................................................................................71
4.5.2 CYP11A1 ...............................................................................73
4.5.3 3ß-HSD..................................................................................75
4.5.4 CYP19A1 ...............................................................................77
4.5.5 BMP6 .....................................................................................79
4.6 MAPK-Phosphorylierung in Kumuluszellen.......................................... 81
4.6.1 MAPK-Aktivität im BM und der Einfluss von U0126...............81
4.6.2 Einfluss von BMP 6 auf die MAPK-Aktivität ...........................83
5 DISKUSSION .................................................................................................... 85
5.1 Kernreifung während der Maturation.................................................... 85
5.2 Zelleigenes BMP6 in den KOKs........................................................... 88
5.3 Steroidhormongenese.......................................................................... 90
5.3.1 Einfluss der MAPK .................................................................90
5.3.2 Einfluss des BMP6.................................................................95
5.3.3 BMP6 und der MAPK-Signalweg ............................................ 98
5.4 Methodische Aspekte............................................................................100
5.5 Ausblick ............................................................................................. 101
6 ZUSAMMENFASSUNG................................................................................... 103
7 SUMMARY...................................................................................................... 106
8 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................ 108
9 ANHANG......................................................................................................... 124
9.1 Abkürzungsverzeichnis...................................................................... 124
9.2 Verwendete Chemikalien und Reagenzien mit Bezugsquellen.......... 127
9.3 Zusammensetzung von Medien, Lösungen, Puffern und Gelen ........ 130
9.4 Geräte und Verbrauchsmaterialien .................................................... 135
9.5 Tabellen zum Ergebnisteil.................................................................. 137

Tab. 1 Klassifizierung der KOKs
Tabellenverzeichnis
Tab. 2 Einteilung der Kernstadien nach HUNTER und POLGE (1966) sowie
MOTLIK und FULKA (1976)
Tab. 3 Zyklusanzahlen der PCR für die jeweiligen Transkripte
Tab. 4 Zielgene mit dazugehörigen Enzymen
Tab. 5 Übersicht der verwendeten spezifischen Primer
Tab. 6 Anzahl der anhand des Chromatinstatus beurteilten Oozyten
Tab. 7 Für die RT-PCR eingesetzte Gesamt-RNA-Mengen der beiden
Zelltypen (Kumuluszellen und Oozyten)
Tab. 8 Chromatinstatus von Eizellen nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94stündiger
IVM im BM
Tab. 9 Chromatinstatus von Eizellen nach 0, 5, 26 und 46stündiger IVM im
BM+U0126
Tab. 10 Chromatinstatus von Eizellen nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94stündiger
IVM im BM+BMP
S. 35
S.39
S. 44
S. 46
S. 47
S. 58
S. 69
S. 137
S. 138
S. 139
Tab. 11 Progesteronkonzentration (ng/ml) in unterschiedlichen Medien S. 140
Tab. 12 17ß-Estradiolkonzentration (ng/ml) in unterschiedlichen Medien S. 140
Tab. 13 mRNA-Expression nach RT-PCR von StAR in Kumuluszellen S. 140
Tab. 14 mRNA-Expression nach RT-PCR von CYP11A1 in Kumuluszellen S. 141
Tab. 15 mRNA-Expression nach RT-PCR von CYP19A1 in Kumuluszellen S. 141
Tab. 16 mRNA-Expression nach RT-PCR von 3ß-HSD in Kumuluszellen S. 141
Tab. 17 mRNA-Expression nach RT-PCR von BMP6 in Kumuluszellen S. 142
Tab. 18 mRNA-Expression nach RT-PCR von BMP6 in Oozyten S. 142
Tab. 19 MAPK-Phosphorylierung in Kumuluszellen
S. 142

Abbildungsverzeichnis
Abb.1 Bidirektionale Kommunikation der Oozyten mit den
Follikelzellen. Modifiziert nach EPPIG (2001)
S. 16
Abb.2 Vereinfachte Darstellung des MAPK-Signalwegs S. 19
Abb.3 Bidirektionale Kommunikation der Oozyte (Ooz) mit
Kumuluszellen (KZ), muralen Granulosazellen (MZ) und
Thekazellen (TZ) über oocyte-secreted factors (OSFs).
Modifiziert nach KNIGHT und GLISTER (2006)
S. 22
Abb.4 Überblick der Steroidhormonbiosynthese S. 28
Abb.5 Vitalfärbung der Kumuluszellen mit Trypanblau nach 94 h IVM
S. 37
Abb.6 Schema des Versuchsdesigns S. 56
Abb.7 Anteil (%) der Kernstadien nach 0, 5, 26 und 46 h IVM im BM
verglichen mit U0126 supplementiertem BM
Abb.8 Anteil (%) der Kernstadien nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h IVM im
BM verglichen mit BMP6 supplementiertem BM
Abb.9 Stereomikroskopische Übersicht der KOKs nach IVM im BM,
BM+U0126, BM+BMP6 nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h
Abb. 10a+b E2-Werte in ng/ml im BM verglichen mit BM+U0126 nach 0, 5,
26 und 46 h und verglichen mit BM+BMP6 nach 0, 5, 26, 46, 72
und 94 h
Abb. 11a+b P4-Werte in ng/ml im BM verglichen mit BM+U0126 nach 0, 5,
26 und 46 h bzw. verglichen mit BM+BMP6 nach 0, 5, 26, 46, 72
und 94 h
Abb. 12 Denaturierendes Agarosegel einer RNA-Extraktion von
Kumuluszellen nach IVM
Abb. 13 Elektropherogramm einer intakten Gesamt-RNA-Probe
Abb. 14 Sequenzierergebnis für den Sense Read von BMP6 (GATC
Biotech AG)
Abb 15 Gelelektrophorese einer RT-PCR von GAPDH als housekeeping-Gen
Abb. 16 1%ige Agarosegele der gefärbten PCR-Transkripte von StAR in
Kumuluszellen aus den jeweiligen Kultivierungsansätzen BM,
BM+U0126 und BM+BMP 6 mit dazugehörigen
Kultivierungszeiten
S. 59
S. 60
S. 62
S. 64
S. 66
S. 67
S. 68
S. 70
S. 70
S. 72

Abbildungsverzeichnis
Abb. 17 Relative Dichte der mRNA-Expression von StAR in
Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit
BM+U0126 über 0, 5, 26 und 46 h
Abb 18 Relative Dichte der mRNA-Expression von StAR in
Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit
BM+BMP6 über 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h
Abb. 19 1%ige Agarosegele der gefärbten PCR-Transkripte von
CYP11A1 in Kumuluszellen aus den jeweiligen
Kultivierungsansätzen BM, BM+U0126 und BM+BMP 6 mit
dazugehörigen Kultivierungszeiten
Abb. 20 Relative Dichte der mRNA-Expression von CYP11A1 in
Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit
BM+U0126 über 0, 5, 26 und 46 h
Abb. 21 Relative Dichte der mRNA-Expression von CYP11A1 in
Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit
BM+BMP6 über 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h
Abb. 22 1 %ige Agarosegele der gefärbten PCR-Transkripte von 3ß-
HSD in Kumuluszellen aus den jeweiligen Kultivierungsansätzen
BM, BM+U0126 und BM+BMP6 mit dazugehörigen
Kultivierungszeiten
Abb. 23 Relative Dichte der mRNA-Expression von 3ß-
HSD in Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit
BM+U0126 über 0, 5, 26 und 46 h
Abb. 24 Relative Dichte der mRNA-Expression von 3ß-HSD in
Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit
BM+BMP6 über 0, 5, 26, 46, 72 und 94
Abb. 25 1%ige Agarosegele der gefärbten PCR-Transkripte von
CYP19A1 in Kumuluszellen aus den jeweiligen
Kultivierungsansätzen BM, BM+U0126 und BM+BMP 6 mit
dazugehörigen Kultivierungszeiten
Abb. 26 Relative Dichte der mRNA-Expression von CYP19A1 in
Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit
BM+U0126 über 0, 5, 26 und 46 h
Abb. 27 Relative Dichte der mRNA-Expression von CYP19A1 in
Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit
BM+BMP6 über 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h
Abb. 28 1%ige Agarosegele der gefärbten PCR-Transkripte von BMP6 in
Kumuluszellen und Oozyten aus dem Kultivierungsansatz BM
mit dazugehörigen Kultivierungszeiten
S. 72
S. 73
S. 74
S. 74
S. 75
S. 76
S. 76
S. 77
S. 78
S. 78
S. 79
S. 80

Abbildungsverzeichnis
Abb. 29a+b Relative Dichte der mRNA-Expression von BMP6 in
Kumuluszellen (a) und Oozyten (b) nach IVM der KOKs im BM
nach 0, 5, 26 und 46 h
Abb. 30 Westernblots mit aufgetrennter p42- und p44-MAPK von
Kumuluszellen nach IVM im BM und im BM+U0126 nach 0, 5,
26 und 46 h
Abb. 31 Relative Dichte der MAPK-Phosphorylierung in Kumuluszellen
nach IVM der KOKs im Medium BM verglichen mit BM+U0126
nach 0, 5, 26 und 46 h
Abb. 32 Westernblots mit aufgetrennter p42- und p44-MAPK von
Kumulsuzellen nach IVM im BM+BMP6 nach 0, 5, 26, 46, 72
und 94 h
Abb. 33 Relative Dichte der MAPK-Phosphorylierung in Kumuluszellen
nach IVM der KOKs im Medium BM verglichen mit BM+BMP6
nach 0, 5, 26 und 46 h bzw. 72 und 94 h
S. 80
S. 82
S. 82
S. 83
S. 84

1 Einleitung
Einleitung
Die wesentlichen Grundlagen weiblicher Fertilität sind zyklisch ablaufende
Prozesse, in denen dominante Follikel heranwachsen, in ihnen befruchtungsfähige
Eizellen reifen und anschließend ovulieren. Die Steuerung dieser Prozesse ist von
vielen Faktoren abhängig und setzt ein regulatorisches Wechselspiel zwischen
Eizelle und den sie umgebenden Follikelzellen vorraus. Einer der bedeutenden
Prozesse ist die erfolgreiche Synthese der Steroidhormone im Ovar. Die Eizelle
interagiert in diesem Zusammenhang nicht nur mit den Theka- und
Granulosazellen, sondern auch mit den sie direkt umgebenden Kumuluszellen.
Für den koordinierten Ablauf der Hormonsynthese ist eine Kontrolle der
steroidalen Genaktivität notwendig. In der vorliegenden In-vitro-Studie wurden
porzine Kumulus-Oozyten-Komlexe (KOKs), in ihrer Fähigkeit 17ß-Estradiol (E2)
und Progesteron (P4) während der Maturation zu sezernieren, charakterisiert
indem die produzierten Hormonmengen analysiert und die mRNA-
Expressionsmuster einiger ausgewählter steroidaler Gene in den Kumuluszellen
semi-quantitativ beurteilt wurden.
Die Kontrolle der Genaktivität in ovariellen Zellen ist wie in anderen
eukaryotischen Zellen von vielen signalvermittelnden Mechanismen abhängig. Es
ist bekannt, dass der MAPK-Signalweg (mitogen-activated protein kinase-
Signalweg) als Singalkaskade bedeutend für die intra- und interzelluläre
Kommunikation ist und auch im Follikel wichtige Funktionen übernimmt. Sie hat
deshalb erheblichen Einfluss auf die Qualität und Entwicklung der Eizelle. Daher
wurde in der vorliegenden Studie nach einer Antwort gesucht, ob die MAPK in
porzinen Kumuluszellen regulatorsich an der Steroidhormonbiosynthese beteiligt
ist.
Neben dem intrazellulären Netzwerk der Signalkaskaden gibt es noch die
Möglichkeit der parakrinen Zellkommunikation über so genannte oocyte-secreted
factors (OSFs), die bedeutende Prozesse wie Zellproliferation, Apotose,
Signalweiterleitung, Steroidhormon- und Inhibinsynthese und
11

Einleitung
Kumuluszellexpansion regulieren. Von diesen löslichen parakrinen Faktoren sind
bisher 35 OSFs der TGF-ß-Superfamilie (transforming growth factor-beta) bei
Säugetieren bekannt, wohingegen die Funktion sowie der Ursprung in den
verschiedenen Zelltypen noch weitgehend unklar ist. Einer der möglichen OSFs ist
das BMP6 (bone morphogenetic protein 6). In wenigen Studien, vor alllem mit
Granulosazellen, wurde eine Beteiligung des BMP6 an der
Steroidhormonsynthese gezeigt. Daher wurde in dieser Arbeit die Möglichkeit in
Betracht gezogen, dass dieser Faktor auch in Kumuluszellen des Schweins einen
Einfluss auf die Steroidhormonproduktion hat. Um diese Fragestellung zu
bearbeiten, wurde den KOKs während der Maturation exogenes BMP6 zugeführt,
und anschließend die Menge der sezernierten Steroidhormone E2 und P4
gemessen. Neben den Produkten der Steroidhormonsynthese wurde auf der
mRNA-Ebene der dafür notwendigen Enzyme nach einem Einfluss des BMP6
gesucht.
Nachdem eine Beteiligung der MAPK an der Steroidhormongenese in der
vorliegenden Arbeit gezeigt werden konnte, entstand die Hypothese, dass BMP6
als möglicher OSF auf den MAPK-vermittelten Regulationsmechanismus der
Hormonsynthese Einfluss hat. Dafür wurde die MAPK-Aktivität der mit BMP6
behandelten Kumuluszellen untersucht.
Die folgende Studie soll dazu beitragen, zeitliche und funktionelle Abläufe
innerhalb des Follikels bis zur Ovulation einer befruchtungsfähigen Eizelle besser
zu verstehen und somit zur Verbesserung der IVM-Bedingungen beizutragen.
12

2 Literaturübersicht
2.1 Oogenese und Follikulogenese
Literaturübersicht
Die in der Rindenschicht des Ovars stattfindende Oogenese ist die Entwicklung
einer Eizelle bis zum Zeitpunkt ihrer Befruchtung. Der Ursprung der Oogonien, die
Primordialkeimzellen, entstehen in den ersten Wochen der embryonalen
Entwicklung und wandern aus dem Entoderm des Embryos in die Genitalleiste,
wobei der Mechanismus dieser Wanderung noch nicht vollständig erklärbar ist
(FREEMAN 2003).
Die Oogonien teilen sich nun mehrfach mitotisch in relativ kurzer Zeit. Dieser
Teilungsprozess in der Gonadenanlage ist in den meisten Tierarten in der frühen
pränatalen Entwicklung abgeschlossen und endet mit dem Verlust ihrer Motilität.
Nach der mitotischen Vermehrungsphase treten die Oogonien in die erste
meiotische Teilung, der Reduktionsteilung, ein. Die jetzt als primäre Oozyten
bezeichneten Eizellen durchlaufen die fünf Stadien der Prophase I (Leptotän,
Zygotän, Pachytän, Diplotän, Diakinese), um zwischen dem Diplotän- und
Diakinese-Stadium, im sogenannten Diktyotän ihre weitere Entwicklung vorläufig
einzustellen. Somit unterbricht diese Arretierung die Meiose I bis zur Pubertät. Bis
dahin nimmt der Kern der Eizelle an Größe zu und wird als Germinalvesikel (GV)
bezeichnet. Die Eizelle ist während dieser Phase durch eine hohe metabolische
und mRNA-Syntheseleistung gekennzeichnet, während die Chromosomen im
Kern in despiralisierter Form verharren. Die Oozyte besitzt nun die Fähigkeit die
Meiose wieder aufzunehmen. Mit der Aufhebung dieser Arretierung beginnt
gleichzeitig die meiotische Endreifung. Sie ist durch die Auflösung der Kernhülle,
die Kondensation des Chromatins und den Aufbau des Spindelapparates
charakterisiert und wird als germinal vesicle breakdown (GVBD) bezeichnet
(MOTLIK u. FULKA 1976).
13

Literaturübersicht
Nach dem GVBD organisieren sich die Chromosomen an der Äquatorialplatte und
erreichen die Metaphase I (M I). Anschließend durchläuft die Eizelle die Stadien
der Anaphase I (Ana I), Telophase I (Telo I) und erreicht schließlich das Stadium
der befruchtungsfähigen Eizelle, die Metaphase II (M II). Mit dem Erreichen der
M II vollendet die Oozyte ihre erste Reifeteilung, hat das erste Polkörperchen
ausgeschleust und arretiert erneut (KECK et al. 2002). Die beschriebene
Zeitspanne vom GVBD bis zum zweiten Arrest in der M II wird als Maturation
bezeichnet und umfasst die nukleären, zytoplasmatischen und molekularen
Reifungsvorgänge der Eizelle (SIRARD et al. 2006).
Das Wachstum und die Reifung der Eizellen kann nur im Zusammenhang mit der
funktionalen Gesamtheit des Ovars und der Follikulogenese betrachtet werden.
Den Ursprung der Follikulogenese stellen die Primordialfollikel dar, aus denen
dominante präovulatorische Follikel selektiert werden. Zum Zeitpunkt der Geburt
liegen die meisten im Diktyotän der Meiose arretierten Oozyten, den primären
Oozyten, als funktionale Einheit des Ovars vor und bilden zusammen mit einer
einzelnen Schicht außen aufliegender epithelialer Zellen, den Granulosazellen,
und der umgebenden Basallamina den Primordialfollikel (EPPIG 1996). Durch
mitotische Zellproliferation entsteht aus den epithelialen Follikelzellen eine
mehrlagige Granulosazellschicht. Die innere Granulosazellschicht baut sich
säulenartig auf der Zona pellucida auf und wird als Corona radiata bezeichnet. Die
Regulation der Granulosazellproliferation und –differenzierung umfasst Vorgänge,
die bisher noch Gegenstand aktueller Forschung sind. Es konnte jedoch gezeigt
werden, dass Ratteneizellen im Stadium des Primordialfollikels
Wachstumsfaktoren produzieren, die daran beteiligt sind. GDF9 (growth
differentiation factor 9) und BMP15 (bone morphogenetic protein 15) aus der
Familie der TGF-ß-Familie (transforming growth factor beta) wurden dabei in In-
vitro-Studien als Faktoren für die Granulosazellproliferation in präantralen Follikeln
ausfindig gemacht (VITT et al. 2000a; OTSUKA et al. 2000).
Im weiteren Verlauf des Follikelwachstums sezernieren die Granulosazellen
Follikelflüssigkeit, den Liquor folliculi. Durch die Einlagerung dieses Liquors
entsteht im Granulosazellepithel ein Hohlraum, das Antrum folliculi. Es ist bisher
14

Literaturübersicht
nicht genau geklärt, welche Mechanismen zur Antrumbildung im Follikel führen. Es
wird jedoch von einer zunehmenden Hyaluronsäuresekretion von Granulosazellen
durch Stimulation von paracrinen oocyte-secreted factors (OSFs) ausgegangen,
die zu einer Schwellung im extrazellulären Raum führt (ELVIN et al. 2000).
Im Stadium des Sekundärfollikels, noch vor der Antrumbildung, entwickelt sich das
Follikelepithel zur mehrschichtigen Körnerzellschicht, dem Stratum granulosum.
Um diese Schicht differenziert sich die zweischichtige Theca folliculi, bestehend
aus Theka interna (innen) und Theka externa (außen). Diese Zellen exprimieren
zusammen mit dem Follikelepithel FSH-(follikelstimulierendes Hormon) und LH-
(luteinisierendes Hormon)–Rezeptoren. Während der Flüssigkeitseinlagerung reift
der Tertiärfollikel zum Graafschen Follikel heran. Die Granulosazellen
unterscheiden sich jetzt zwischen den wandständigen Granulosazellen (murale
Granulosazellen, MZ), die die Follikelwand auskleiden und den Granulosazellen
des Cumulus oophorus mit den so genannten Kumuluszellen (KZ), die die Eizelle
umgeben (EPPIG1991; 2001). Die MZ, die keinen direkten Kontakt zur Oozyte
haben, besitzen eine niedrigere Proliferationsrate, eine höhere Synthesekapazität
und eine höhere Expression von LH-Rezeptoren (RICHARDS et al. 1976).
Am Ende der Wachstumsphas erreicht der Follikel seine präovulatorische Größe,
die beim Schwein 6-7 mm, Pferd 35-50 mm, Rind 15-20 mm und beim Schaf 8-20
mm beträgt (VAN DEN HURK u. ZHAO 2005). Die Kumuluszellen sezernieren
unter dem Einfluss des FSH/LH-Anstiegs Hyaluronsäure, dadurch werden die
Abstände zwischen den Kumuluszellen erweitert. Die Oozyten und Kumuluszellen
werden in eine muzigene Masse eingebettet und das Follikelvolumen nimmt durch
die erhöhte Produktion von Liquor folliculi zu.
Hydrolytische Enzyme initiieren die Stigma-Bildung und zusammen mit
kontraktilen Mechanismen der Follikelwand erfolgt die Ovulation (ERICKSON
1986).
15

2.2 Signalvermittlung
Literaturübersicht
Für die Entwicklung der Oozyten und den Follikelzellen vom Primordialfollikel bis
zur Ovulation sind koordinierte Regulationsmechanismen in beiden Zelltypen
notwendig. Innerhalb dieser Regulationsvorgänge sollten Keimzellen im Follikel
zusammen mit den somatischen Zellen als funktionale Einheit betrachtet werden,
da sie eng miteinander verbunden und voneinander abhängig sind (BUCCIONE et
al. 1990). Die Interaktion zwischen Oozyten und Follikelzellen erfolgt bidirektional
(EL-FOULY et al. 1970; EPPIG 2001), so dass einerseits das Follikelwachstum,
die Differenzierung und Proliferation der Granulosazellen, die
Steroidhormongenese sowie die Kumuluszellexpansion durch Faktoren der Eizelle
beeinflusst werden. Andererseits werden die Eizellreifung mit ihrem meiotischen
Arrest, die Transkription und somit auch die Entwicklungskompetenz der Oozyte
von den Granulosa- und Kumuluszellen beeinflusst (EPPIG 2001). Abbildung 1
fasst die Aspekte der beidseitigen Kommunikation schematisch zusammen.
Abbildung 1: Bidirektionale Kommunikation der Oozyten mit den Follikelzellen.
Modifiziert nach EPPIG (2001)
16

Literaturübersicht
Die Eizelle selbst ist mit den Kumuluszellen und deren trans-zonalen
zytoplasmatischen Fortsätzen direkt assoziiert. An den Enden dieser
Zytoplasmaausläufer stehen kanalbildende Proteinkomplexe, so genannte gap
junctions, zum Austausch kleiner Moleküle wie z. B. Ionen oder Aminosäuren zur
Verfügung (ALBERTINI et al. 2001). Der Kommunikationsweg über gap junctions
wird ebenfalls zwischen den Kumuluszellen selbst sowie zwischen Kumulus- und
Granulosazellen genutzt (PICTON et al. 1998). Weiterhin gibt es die Möglichkeit
der parakrinen Zellkommunikation über so genannte oocyte-secreted factors.
Diese löslichen parakrinen Faktoren sind an der Regulation bedeutender
Prozesse, wie z. B. Zellproliferation, Signalweiterleitung, Steroidhormon- und
Inhibinsynthese, Apoptose und Kumuluszellexpansion beteiligt (GILCHRIST et al.
2004; 2008).
2.2.1 MAPK (mitogen-activated protein kinase)
Eine Möglichkeit der eukaryotischen Zellen auf ständig wechselnde extrazelluläre
Signale zu reagieren, ist das umfangreiche Netzwerk der intrazellulären
Signalkaskaden, die auch durch gegenseitige Beeinflussung den Zellen
ermöglichen, koordiniert zu reagieren (ROBINSON u. COBB 1997). Dabei
gehören Cytokine und Hormone zu den bedeutendsten Signalmolekülen. Eine
Möglichkeit der Weiterleitung dieser Signalmoleküle innerhalb der Zelle stellt die
Kaskade der Proteinkinasen dar (CAMPBELL et al. 1995). Die Proteinkinasen
übertragen die endständige Phosphatgruppe eines ATP-Moleküls auf die
Hydroxylgruppe der Serin-, Threonin- oder Thyrosinreste spezifischer
Substratproteine. Die Phosphorylierung eines Proteins kann zu dessen Aktivierung
oder auch Inaktivierung führen. Einzelne Proteinkinasen sind oft hintereinander
geschaltet, d. h. sie werden selbst durch Phosphorylierung aktiviert und stellen
das Substrat einer weiteren Proteinkinase dar. Somit werden Signale innerhalb
einer strukturierten und mehrstufigen Proteinkinase-Kaskade transportiert und
17

Literaturübersicht
können bis in den Zellkern gelangen. Einer dieser Singalwege ist die MAPK-
Kaskade. Die MAPK-Signalübermittlung ist in allen eukaryotischen Zellen zu
finden und umfasst mehrere Signalwege. Der Begriff MAPK leitet sich von der
Regulierbarkeit der mitogen wirkenden Liganden ab. Gleichermaßen wird die
MAPK oft als extrazellulär regulierte Kinase (ERK) bezeichnet, jedoch bezeichnet
dieser Begriff eher einen der bisher vier bekannten Subtypengruppen der MAPK.
Diese Familien der Subtypen lauten wie folgt:
ERK extrazellulär regulierte Kinase
(BOULTON et al. 1991)
JNK/SAPK c-Jun N-terminal kinase/stress activated protein kinase
(DÉRIJARD et al., 1994; KYRIAKIS et al. 1994)
p38MAPK p38 mitogen activated protein kinase
BMK Big MAPK
(ROUSE et al. 1994, PEARSON et al. 2001)
(LEE et al. 1995, ZHOU et al. 1995)
In der vorliegenden Arbeit wurde der Schwerpunkt bezüglich der
Proteinkinaseregulation auf die beiden Isoformen MAPK2 (ERK2) und MAPK1
(ERK1) gelegt. Sie werden entsprechend ihres Molekulargewichts auch als
p42MAPK und p44MAPK bezeichnet.
Innerhalb der verschiedenen MAPK-Signalwege konnte allgemein gezeigt werden,
dass immer aufeinander folgend drei hintereinander geschaltete Proteinkinasen
wirksam sind, die sich nacheinander aktivieren. Die MAPK-Kinase-Kinase
(MAPKKK) aktiviert eine dualspezifische MAPK-Kinase (MAPKK), zu denen unter
anderem die verschiedenen Raf-Kinasen (rapidly growing fibrosarcoma-kinase),
Mos-Kinasen (moloney sarcoma oncogene) und MEK-Kinasen (MAPK/ERK-
Kinasen) gehören. Diese MAPKK aktiviert letztendlich die jeweilige MAPK (ERK,
pMAPK) (SEGER u. KREBS 1995).
Die MAPK1/MAPK2-Kaskade wird durch eine Vielzahl von zellspezifischen
Liganden stimuliert, z. B. Wachstumsfaktoren, Cytokine, Neurotransmitter oder
18

Literaturübersicht
Liganden für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR). Die extrazellulären
Stimulatoren werden über Rezeptor-Thyrosinkinasen an das Ras-Protein (rat
sarcoma-Protein) weitergeleitet. Ras-GTP aktiviert Proteinkinasen, die zur bereits
erwähnten Gruppe der MAPKK-Kinasen (Raf/Mos) zählen. Die nachgeschalteten
MAPKK (MEK1,MEK2) werden dadurch an zwei Serin-Resten phosphoryliert.
Anschließend können die nächste Gruppen von Proteinkinasen, die MAPK1 und
MAPK2 am Tyrosin- bzw. Threonin-Rest phosphoryliert werden. In Abbildung 2 ist
der MAPK1/MAPK2-Signalweg zur Übersicht vereinfacht dargestellt.
Abbildung 2: Vereinfachte Darstellung des MAPK-Signalwegs.
MAPK: mitogen activated protein kinase, MAPKK/MEK: MAPK-Kinase, MAPKKK:
MAPK-Kinase-Kinase, Ras: Rat sarcoma, Raf: rapidly growing fibrosarcoma, ERK:
extrazellulär regulierte Kinase
19

Literaturübersicht
Der MAPK1/MAPK2-Signalweg reguliert in verschiedenen Zelltypen
unterschiedliche Mechanismen und übernimmt auch im Follikel wichtige
Funktionen, die Einfluss auf die Qualität und Entwicklung der Eizelle haben. Schon
frühzeitig wurde in vitro in Xenopus-Oozyten durch exogene MAPK-Substrate die
Maturation inhibiert. Die erhöhte Phosphorylierung, also die Aktivierung der MAPK
vor dem GVBD und vor dem Erreichen der Metaphase II konnte
immunhistochemisch nachgewiesen werden (GOTOH et al. 1991;1995).
SANGHERA et al. (1990) wiesen die MAPK-Aktivität in reifenden Eizellen vom
Seeigel nach. Im Unterschied zum Xenopus wurden bei Säugetieren zwei
zeitgleich aktivierte MAPK-Isoformen bekannt, die sich außerdem im
Molekulargewicht zum Xenopus unterschieden .
Während der Eizellreifung ist die MAPK-Kaskade regulatorisch an der
Wiederaufnahme der Meiose, der Organisation der Mikrotubuli im Cytoskelett und
dem Arrest der Oozyte in der Metaphase II beteiligt (SUN et al. 1999). Dabei
unterscheidet sich die zeitliche MAPK-Aktivität zwischen den Spezies und ist
abhängig vom meioseinduzierenden Stimulus. Die spontane Wiederaufnahme der
Meiose erfolgt in Säugeroozyten MAPK-unabhängig, wohingegen sie für den
gonadotropininduzierten GVBD essentiell ist (FAN u. SUN 2004; FAN et al. 2009).
Während In-vitro-Studien unterschied sich die zeitliche Aktivität der MAPK
ebenfalls zwischen den Spezies und war abhängig von den Kulturbedingungen.
Allgemein stieg der Phosphorylierungsgrad um den GVBD an und behielt dieses
erhöhte Aktivitätsniveau bis zum Erreichen der Metaphase II bei. Nach der
Befruchtung der Eizellen bis hin zur Vorkernbildung wurde die MAPK zunehmend
dephosphoryliert und somit inaktiv (FAN u. SUN 2004).
In Eizellen wurde Mos als eine keimzellspezifische Serin/Threonin-Proteinkinase
(MAPKK) ausfindig gemacht, die während der Maturation an der Aktivierung der
MAPK- Phosphorylierungskaskade beteiligt ist (GEBAUER u. RICHTER 1996). SU
et al. (2002) kultivierten KOKs von Mos -/- -Mäusen mit U0126 (1,4-Diamino-2,3-
dicyano-1,4-bis(2-aminophenylthio)butadiene), einem MEK-Inhibitor, und trotz
Stimulation mit FSH, EGF (epidermal growth factor) und 8-Brom-cAMP blieb die
Kumuluszellexpansion aus und die Oozyten erreichten nicht den GVBD. In
20

Literaturübersicht
porzinen KOKs wurde durch Injektion von c-mos-mRNA in die Oozyte die GVBD-
Rate erhöht und die frühzeitige MAPK-Aktivierung festgestellt. Hingegen wurde
durch antisense-c-mos-mRNA-Injektion die Phosphorylierung unterdrückt, jedoch
erfolgte die Wiederaufnahme der Meiose (OHASHI et al. 2003). Somit wurde bei
der Maus (SU et al. 2002; 2003) und auch beim Schwein (OHASHI et al. 2003)
gezeigt, dass die aktive MAPK in den Kumuluszellen und nicht in den Oozyten
essentiell für die Auslösung des GVBD und somit für die Induktion der
Wiederaufnahme der Meiose ist (LIANG et al. 2005; 2007).
Die Phosphorylierung der MAPK in KOKs während der IVM (In-vitro-Maturation) ist
u. a. von den Maturationsbedingungen und der untersuchten Spezies abhängig.
Zum Beispiel geht man in porzinen KOKs von einer deutlich früheren MAPK-
Aktivierung in den Kumuluszellen aus, als in den Oozyten. Während die Eizellen
erst zeitlich nah um den GVBD (INOUE et al. 1995, 1998) die ansteigende MAPK-
Phosphorylierung aufwiesen, konnte dies bei Kumuluszellen schon zum Beginn
der IVM (0-2 h) festgestellt werden (EBELING et al. 2007).
2.2.2 OSFs (oocyte-secreted factors)
Ursprünglich wurde angenommen, dass die somatischen Zellen im Follikel die
stoffwechselinaktive Eizelle mit Nährstoffen versorgen und für die Regulation der
Follikulogenese mit dem Heranreifen der Eizelle verantwortlich sind. Inzwischen
belegen zahlreiche Studien deutlich, dass von der Eizelle sezernierte parakrine
Faktoren, die oocyte-secreted factors (OSFs), an der Regulation zellulärer
Prozesse beteiligt sind.
Bei Säugetieren sind zur Zeit 35 OSFs der TGF-ß-Superfamilie bekannt, von
denen mindestens 9 zur GDF (growth differentiation factor)- und 20 zur
BMP (bone morphogenic protein)-Subfamilie gehören. Weiterhin existieren die
Subfamilien der Activine/Inhibine, der glial cell-derived neurotrophic factors
(GDNF) sowie der Anti-Müller-Hormone (AMH) (KNIGHT u. GLISTER 2006).
21

Literaturübersicht
Soweit bisher bekannt, werden GDF9, BMP15 und BMP6 von der Oozyte selbst
sezerniert, BMP4 und BMP7 gelangen von den Thekazellen zu den Rezeptoren
der Granulosazellen (SHIMASAKI et al. 1999). Von den Granulosazellen aus
erfolgt die Sekretion des BMP2 und BMP5 zu den Thekazellen und den Oozyten.
BMP6 hingegen scheint nicht nur von der Eizelle selbst, sondern auch von den
Granulosazellen sezerniert zu werden. Demnach könnte BMP6 neben GFD9 und
BMP15 als einer der zentralen Regulatoren der Follikelfunktionen betrachtet
werden (KNIGHT u. GLISTER 2006; HUNTER u. PARADIS 2009). Abbildung 3
zeigt eine Möglichkeit der bidirektionalen Kommunikation über OSFs zwischen
Theka- und Granulosazelle sowie zwischen Granulosa- und Eizelle.
Abbildung 3: Bidirektionale Kommunikation der Oozyte (Ooz) mit Kumuluszellen
(KZ), muralen Granulosazellen (MZ) und Thekazellen (TZ) über oocyte-secreted
factors (OSFs). Modifiziert nach KNIGHT u. GLISTER (2006)
Auch in porzinen Follikelzellen sind einige Studien zur Identifikation der OSFs und
ihrer Funktion durchgeführt worden. Die teilweise abweichenden Ergebnisse zu
bisher genannten Untersuchungen zeigen die Bedeutung der Speziesspezifität
22

Literaturübersicht
und verdeutlichen die Komplexität des OSFs-Systems. ZHU et al. (2008) wiesen
BMP6, BMP15 und GDF9 in den Oozyten des Schweins nach, deren mRNA-
Expression während der IVM der KOKs über 44 h abnahm. Zusätzlich stellten sie
eine konstante BMP4-mRNA-Expression während der Kultivierung fest. In
Kumuluszellen hingegen erhöhte sich das BMP4-Expressionslevel und die BMP6-
Expression wurde vermindert. BMP15 wurde in den Kumuluszellen nicht
nachgewiesen. BRANKIN et al. (2005b) detektierten BMP 2- und BMP6-Proteine
in porzinen Granulosa- und Eizellen sowie im Maturationsmedium. PARADIS et al.
(2009) konnten in präovulatorischen Follikelzellen des Schweins eine BMP6-,
GDF9- und eine BMP15-mRNA-Expression in allen Zellen ermitteln, jedoch fehlte
BMP6-mRNA in den Granulosazellen. Nicht nur die speziesspezifischen
Unterschiede in der Sekretion sondern auch die Funktionen der OSFs sind nur
unzureichend geklärt. So zeigte sich zum Beispiel die Bedeutung von BMP6 für
die Fertilität von Mäusen durch eine verringerte Ovulationsrate einhergehend mit
deutlicher Reduktion der Wurfgröße nach einer Deletion im BMP6-Gen (SUGIURA
et al. 2010). SOLLOWAY et al. (1998) hingegen verzeichneten nach einer Null-
Mutation im BMP6-Locus lebensfähige Mäuse ohne einen Einfluss auf die
Fruchtbarkeit. Die Mutation führte lediglich zu einer verzögerten Ovulation und
interessanterweise schien der BMP6-Mangel zu einem kompensatorischen BMP2-
Einfluss zu führen. Das Schaf scheint eine Ausnahme bezüglich der BMP6-
mRNA-Expression darzustellen, da sie lediglich in den Oozyten und nicht in den
Theka- bzw. Granulosazellen nachgewiesen wurde (JUENGEL et al. 2006). Auf
welche Regulationsmechanismen die OSFs im Follikel Einfluss nehmen, ist
ebenfalls Gegenstand aktueller Forschung.
Die bisher am häufigsten untersuchten OSFs sind GDF9 (growth differentiation
factor 9) und BMP15 (bone morphogenic protein 15). Den bedeutenden Einfluss
von GDF9 auf die follikuläre Entwicklung zeigten DONG et al. (1996) an
Mäuseoozyten. Die Deletion im GDF9-Gen führte zur Infertilität, da das Wachstum
des Follikels bereits im Präantralstadium gehemmt wurde. Knock-out-Ratten
wurden ebenfalls infertil und ihre Granulosazellen wiesen in vitro eine gehemmte
23

Literaturübersicht
Progesteron- und Östradiolsekretion auf. Gleichzeitig war die LH-Rezeptorbildung
geschwächt (VITT et al. 2000a;b).
BMP15 wird eine ähnlich bedeutsame Rolle im Bezug auf die Entwicklung des
Follikels und der Eizelle zugesprochen. GALLOWAY et al. (2000) wiesen nach
dem Auslösen einer Punktmutation im BMP15-Gen die Infertilität beim Schaf nach.
GDF9 und BMP15 ähneln sich nicht nur in ihrer Funktion im Säugerovar, sondern
scheinen sich auch gegenseitig zu beeinflussen (KNIGHT u. GLISTER 2006). Die
Immunisierung von Schafen mit GDF9- und BMP15-Peptiden wirkte
ovulationshemmend und führte zu morphologischen Veränderungen im Ovar
(JUENGEL et al. 2002). Mutationen in beiden Genen führten zwar zu einer
erhöhten Ovulationsrate, jedoch phänotypisch zur Sterilität (HANRAHAN et al.
2004). BMP15-Deletionen der Maus haben im Vergleich zu GDF9-Mutationen nur
Subfertilität und geringe histologische Defekte zu Folge. Allerdings nach der
Paarung von GDF9-Mäusen mit BMP15-Knock-out-Mäusen reiften die Oozyten
spontan, aber führten aufgrund fehlerhafter Follikulogenese zur Infertilität (YAN et
al. 2001).
2.3 Steroidhormone im Ovar
Der Vorgang der Follikulogenese und somit das Heranreifen einer
entwicklungskompetenten Eizelle kann als regulatorisches Wechselspiel zwischen
Hypothalamus, Hypophyse und Ovar betrachtet werden. Dabei ist das Ovar nicht
nur hormoneller Befehlsempfänger, sondern steuert durch seine sekretorischen
Produkte des heranreifenden Follikels und des Corpus luteum (Gelbkörper) das
Hypothalamus-Hypophysen-System. Dabei sind GnRH (Gonadotropin-Releasing-
Hormon) aus dem Hypothalamus, FSH und LH aus der Adenohypophyse sowie
die Steroidhormone Östrogen und Progesteron aus dem Ovar die wichtigsten
Hormone, die in einem präzisen Zusammenspiel von positiver und negativer
Wechselwirkung an der Steuerung beteiligt sind. Die ovarielle Steroidproduktion
24

Literaturübersicht
hat bedeutenden Einfluss auf die Entwicklung und Funktionen des Uterus, der
Milchdrüse, des Skeletts und des Gehirns. Außerdem sind die Steroidhormone
lokal am Ovar entscheidend für die Prozesse des Follikelwachstums, der
Eizellreifung und der Ovulation. Dabei gelangen die lipophilen Steroidhormone
durch Diffusion aus dem Blutgefäßsystem in ihre Zielzellen, in denen sie an ihren
Rezeptor binden und einen Steroid-Rezeptor-Komplex bilden. Dieser Komplex
wird direkt in den Zellkern transportiert, in dem der aktive Rezeptor an einer
spezifischen Sequenz der DNA bindet, die er als response element erkennt. Durch
diese Bindung wird der Promotor aktiviert und die Transkription bis hin zur
Proteinbiosynthese aufgenommen.
Während der Follikelphase wird die Hypophyse zur LH- und FSH-Produktion durch
GnRH vom Hypothalamus stimuliert. Das Wachstum des Follikels wird durch FSH
stimuliert und die Zellen der Theca interna beginnen Östrogen, vor allem
Östradiol, zu sezernieren. Durch den wachsenden Follikel steigt im Verlauf die
Östrogenproduktion rasant an und führt zu einer vermehrten GnRH-Produktion im
Hypothalamus. Die Folge ist ein drastischer LH-Anstieg. Inzwischen haben die
oder der Follikel LH-Rezeptoren ausgebildet und können auf das Hormon
reagieren. Nach dem so genannten LH-Peak erfolgt die Ovulation. LH stimuliert
nach der Ovulation die Transformation des zurückgebliebenen Follikelgewebes in
den Gelbkörper. Das Corpus luteum sezerniert jetzt neben dem Östradiol das
graviditätsichernde Progesteron, wobei das Zusammenspiel dieser beiden
Steroidhormone durch ein negatives Feedback die weitere Freisetzung von LH
und FSH aus der Hypophyse hemmt (CAMPBELL 1997).
Zusammenfassend wirken Östradiol und Progesteron als Hauptprodukte der
Ovarien auf die hypothalamisch-hypophysäre Funktionseinheit und auf das
Endometrium. Während der Follikelreifungsphase proliferiert das Endometrium
östrogenabhängig und transformiert in der Corpus-luteum-Phase
progesteronabhängig. Dabei laufen die hormonellen Prozesse zeitlich koordiniert
ab, so dass nach einer erfolgreichen Follikelreifung in der Regel eine
befruchtungsfähige Eizelle ovuliert und für den Fall einer Gravidität die
physiologischen Bedingungen im weiblichen Genitaltrakt geschaffen sind.
25

2.3.1 Steroidhormonbiosynthese im Ovar
Literaturübersicht
Im Ovar erfolgt die Synthese der Steroide durch das enge Zusammenspiel von
Theka- und Granulosazellen (NAGAHAMA 1997). Die Granulosazellen des
reifenden Follikels exprimieren FSH-Rezeptoren, während die LH-Rezeptoren
initial nur auf den Thekazellen vorhanden sind (LIU et al. 1998). Das aus dem
Hypophysenvorderlappen freigesetzte LH bindet an den Rezeptoren der
Thekazelle und stimuliert die Aufnahme von Cholesterin als unmittelbare Vorstufe
der Steroidhormonbiosynthese. Nach der Synthese der Androgene
(Androstendion, Testosteron und Dehydroepiandrosteron) werden diese in die
benachbarten Granulosazellen transportiert. In diesen Zellen werden die
Androgene zu Östrogenen aromatisiert, nachdem FSH an den Rezeptoren
gebunden wurde. Die Synthese von Androgen in den Thekazellen sowie die
Aromatisierung zu Östrogenen in den Granulosazellen werden durch cAMP
(cyclisches Adenosinmonophosphat) vermittelt. In porzinen Granulosazellen
zeigten SHIMADA und TERADA (2002) die FSH-induzierte LH-
Rezeptorexpression unter der Regulation von cAMP.
Den Beginn und gleichzeitig geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der
Steroidhormongenese stellt der Transport des Cholesterins von der äußeren zur
inneren Mitochondrienmembran dar. Die Regulation erfolgt durch das Enzym
StAR (steroidogenic acute regulatory protein), welches die Fähigkeit zur
Cholesterinbindung aufweist (STOCCO u. CLARK 1996). Die Aktivität von StAR
und somit die Initiierung der Steroidhormongenese im Ovar wurde bereits
mehrfach in porzinen Granulosazellen untersucht. FSH und IGF-1 (Insulin-like
Growth Factor 1) stimulieren cAMP als second messenger-Moleküle, welches
wiederum die PKA (Proteinkinase A) aktiviert (BALASUBRAMANIAN et al. 1997;
PESCADOR et al. 1999; SEKAR et al. 2000). Die PKA phosphoryliert
Aminosäurereste von verschiedenen Proteinen, welche wiederum
Transkriptionsfaktoren unterschiedlicher Zielgene regulieren. Außerdem wird die
Beteiligung der Proteinkinase C (PKC)-abhängigen Signaltransduktion an der
Steroidhormonregulation diskutiert (PESCADOR et al. 1999).
26

Literaturübersicht
An der inneren Mitochondrienmembran wird vom Cholesterin die Seitenkette
zwischen den Kohlenstoffatomen 20 und 22 abgespalten und es entsteht
Pregnenolon. Diesen Schritt metabolisiert die CYP11A1 (P450scc oder side chain
cleavage-enzyme), welche zu der Familie der P450-Enzyme gehört. FLORES et
al. (1999) zeigten auch hier eine Beteiligung der PKC an der cAMP-abhängigen
Aktivität des Enzyms.
Die Utilisierung von Cholesterin zu Pregnenolon stellt den Stoffwechselschritt dar,
bei dem aus dem C27-Substrat ein C21-Steroid entsteht. Vom Pregnenolon
ausgehend gibt es zwei weitere Synthesemöglichkeiten, zum einen den
∆4- Syntheseweg und zum anderen den ∆5-Syntheseweg (s. Abb. 4). Im
∆4- Syntheseweg befindet sich die Doppelbindung im A-Ring zwischen den
Kohlenstoffatomen 4 und 5, während beim ∆5- Syntheseweg diese im B-Ring
zwischen Kohlenstoffatom 5 und 6 lokalisiert ist. Die einzelnen Syntheseschritte, in
denen die C-Atome im Steroidgerüst verringert werden, wird im Folgenden nicht
detailliert betrachtet. Vielmehr werden die Schwerpunkte auf Enzyme bzw.
Steroide, die in dieser Arbeit untersucht werden, gesetzt. Im weiteren
Syntheseverlauf im ∆4-Weg metabolisiert 3ß-HSD (3ß-
Hydroxysteroiddehydrogenase) Pregnenolon zu Progesteron. Während des
∆5- Synthesewegs entsteht jedoch aus Pregnenolon über mehrere
Zwischenstufen das Androstendion. Auch im ∆4- Stoffwechselweg entsteht
letzendlich das C19-Steroid Androstendion sowie das Testosteron. Um aus den
Androgenen Testosteron und Androstendion durch Aromatisierung des A-Ringes
die Östrogene zu synthetisieren, ist das Enzym CYP19A1 (Cytochrom P450-
Aromatase oder P450arom) notwendig. Somit wandelt diese Aromatase unter
anderem Testosteron in 17ß-Östradiol um. CYP19A1 gehört ebenso wie
CYP11A1 zu der Gruppe der P450-Enzyme. Die Aromataseaktivität von CYP19A1
ist bereits in verschiedenen Geweben nachgewiesen und deren Regulation
scheint neben cAMP von vielen weiteren Faktoren abhängig zu sein (PAYNE u.
HALES 2004).
In folgender Abbildung (Abb. 4) ist der Vorgang der Steroidhormonbiogenese
schematisch in vereinfachter Form dargestellt.
27

Literaturübersicht
Abbildung 4: Überblick der Steroidhormonbiosynthese.
StAR: steroidogenic acute regulatory protein, CYP11A1: P450scc oder side chain
cleavage-enzyme, CYP17A1: P450c17, CYP19A1: P450arom oder Cytochrom
P450-Aromatase, 3ß-HSD: 3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase, 17ß-HSD: 17ß-
Hydroxysteroiddehydrogenase, rot markierte Gene und blau markierte Steroide
sind inhaltliche Schwerpunkte dieser Arbeit.
28

2.3.2 Einfluss der MAPK
Literaturübersicht
Innerhalb der Steroidhormongenese wurde die Rolle der MAPK bereits mehrfach
untersucht, jedoch lag dabei der Schwerpunkt der Studien auf den
Granulosazellen. Wurde die Signalkaskade mittels MEK-Inhibitor unterbrochen,
zeigten MOORE et al. (2001), TOSCA et al. (2005), ANDRIC und ASCOLI (2006)
und MIYOSHI et al. (2007) in Granulosazellen der Ratte eine verminderte
Progesteronsekretion. Die Ergebnisse von Untersuchungen mit murinen (SU et al.
2006) und humanen Granulosazellen (DEWI et al. 2002) unterstrichen dies. Bei
den Granulosazellen der Ratte beschrieben die Autoren gleichzeitig eine
gesteigerte Östradiolproduktion. Zum Teil wurde in diesen Studien auch die
mRNA-Expression der steroidalen Enzyme untersucht. Dabei kam es zu einer
gehemmten StAR-, CYP11A1- und 3ßHSD-Expression, jedoch wurde CYP19A1
vermehrt exprimiert. Diese Expressionsmuster korrelierten mit den Ergebnissen
der Hormonsekretion. Lediglich MOORE et al. (2001) konnten keinen Einfluss auf
CYP11A1 durch die Hemmung mit U0126 feststellen. Gegensätzlich zu den
genannten Studien beschrieben SEGER et al. (2001) den MAPK-Signalweg als
Downregulationsmechanismus innerhalb der Steroidhormongenese in
Granuloszellen der Ratte, da die Hemmung zu einer erhöhten
Progesteronsekretion und gesteigerten StAR-Expression führte. Auch TAJIMA et
al. (2005) postulierten den Verlauf der Steroidhormonsynthese in bovinen
Thekazellen als PKA-abhängigen aber MEK-unabhängigen Mechanismus, und
beschrieben die MAPK ebenfalls als Downregulator für die Progesteron- und
Androstendionsynthese. Die meisten Untersuchungen bezüglich der
Steroidhormongenese und ihrer Genregulation wurden mit Granulosazellen
durchgeführt. Eine ebenso bedeutsame Rolle scheinen jedoch auch die
Kumuluszellen zu spielen, die wichtige Funktionen während der Eizellmaturation,
des meiotischen Arrests und der Zytoplasmareifung übernehmen (TANGHE et al.
2002). Hinzu kommt, dass die Kumuluszellen durch einen engeren Kontakt zur
Eizelle gekennzeichnet sind, als die Granulosazellen und somit eine interessante
Untersuchungsgrundlage bezüglich der Steroidhormonsynthese darstellen.
29

2.3.3 Einfluss von BMP6
Literaturübersicht
Da die MAPK-Kaskade an der Regulation der Steroidhormongenese beteiligt zu
sein scheint, stellt sich die Frage, ob und wie die OSFs die Fähigkeit besitzen, auf
diese Regulationsmechanismen Einfluss zu nehmen.
Schon 1970 konnten EL-FOULY et al. zeigen, dass die Entfernung von
Kaninchenoozyten in Granulosazellkulturen zur Luteinisierung führt. Auch
NEKOLA und NALBANDOV (1971) verhinderten in vitro die Luteinisierung von
Granulosazellen der Ratte, indem sie zusammen mit Eizellen kultiviert wurden. Es
wurde demnach frühzeitig erkannt, dass die Eizelle eine frühzeitige Luteinisierung
somatischer Zellen im Follikel verhindert. Es folgten Studien, in denen die damit
verbundene gesteigerte Progesteronsekretion sowie die gehemmte
Östadiolsynthese gezeigt werden sollte. Darüber hinaus wurde begonnen,
eizellspezifische Faktoren als Ursache zu suchen. VANDERHYDEN et al. (1993)
zeigten in murinen Kumuluszellen, aus denen vorher die Oozyten entfernt wurden
(OOX, oocyteectomized complexes), eine erhöhte Progesteron- und verminderte
Östradiolsekretion. Gleichzeitig konditionierten sie das Maturationsmedium mit
Eizellen und zeigten eine Hemmung der Progesteron- und Erhöhung der
Östradiolsynthese in den OOX. 1995 konnten VANDERHYDEN und TONARY den
hemmenden Einfluss von cAMP auf die Progesteronproduktion in Kumuluszellen
der Maus und der Ratte ausfindig machen. Zusätzlich schlussfolgerten sie nach
der Verwendung von Aromatasehemmern während der IVM, dass die OSFs die
Steroidgenese voneinander unabhängig regulieren. Auch beim Schwein zeigten
COSKUN et al. (1995) nach der Entfernung der Oozyte eine signifikant erhöhte
Progesteronkonzentration im Maturationsmedium der OOX. Im Gegensatz zu
bisher genannten Studien erhöhte sich hier gleichzeitig die Östradiolsekretion der
Kumuluszellen. Die Hormonsekretion schien in diesen Untersuchungen ebenfalls
cAMP-abhängig reguliert zu sein. Mit der Verwendung von Heptanol als gap-
junction-Blocker wurde festgestellt, dass die OSFs nicht über diese
Zellkommunikationskanäle in die Kumuluszellen gelangen. LI et al. (2000) legten
ebenfalls Ergebnisse vor, die eine Luteinisierungshemmung der OSFs beim Rind
30

Literaturübersicht
bestätigen. Dafür wurden denudierte Oozyten (von Kumuluszellen befreite
Eizellen) Granulosazellkulturen zugefügt und dies hatte eine Halbierung der
Progesteronkonzentration im Medium zur Folge.
Um die Fragestellung zu beantworten, welche OSFs die Steroidhormonsynthese
regulieren, wurde auch hier am häufigsten der Einfluss von GDF9 und BMP15
untersucht. OTSUKA et al. (2001a;c) führten durch BMP15 eine verminderte FSH-
Rezeptor-mRNA-Expression in Granulosazellen der Ratte herbei und hemmten
dadurch die Progesteronsekretion. Rekombinantes GDF9 in humanen Granulosa-
und Thekazellkulturen bewirkte eine verminderte CYP11A1- und CYP19A1-
Expression (YAMAMOTO et al. 2002). Auf welche Weise die Sekretion der OSFs
auf dem parakrinen Weg reguliert wird, ist überwiegend unklar. Für GDF9 wurde
der SMAD (Small mothers against decapentaplegic)-2/3-Weg und für BMP15 der
SMAD-1/5/8-Weg diskutiert. Da die Rezeptoren für die Mitglieder der TGF-ß-
Superfamilie durch ihre Phosphorylierung nicht nur Proteine der SMAD-Familie
aktivieren können, sondern auch andere Proteinkinasen, scheinen die OSFs u. a.
die Funktionen der Kumuluszellen über den MAPK-Signalweg beeinflussen zu
können (GILCHRIST et al. 2008).
Nach GDF9 und BMP15 soll an dieser Stelle BMP6 als möglicher Einflussfaktor
auf die Regulation der Steroidhormongenese in Betracht gezogen werden. In
einigen Spezies war diese Hypothese bereits Bestandteil von Studien, in denen
auch wiederum hauptsächlich Granulosazellen verwendet wurden. OTSUKA et al.
(2001b) zeigten in Kulturen von Rattengranuloszellen nach Supplementierung der
Medien mit BMP6 ähnliche Ergebnisse wie mit BMP15. Die Progesteronsekretion
wurde gehemmt, ebenso die mRNA-Expression von StAR und CYP11A1. Jedoch
schien sich die Regulation der Steroidhormongenese durch BMP6 von BMP15 zu
unterscheiden, denn die FSH-Rezeptorexpression wurde nicht gehemmt, sondern
die cAMP-Produktion. GLISTER et al. (2004) postulierten, dass BMP6 in bovinen
Antralfollikeln in Granulosazellen und Oozyten exprimiert wird. Die IVM der Zellen
mit BMP6 führte bei dieser Spezies ebenfalls zur verminderten
Progesteronsekretion. Zusätzlich konnte immunochemisch die Aktivierung des
SMAD-1/5/8-Signalweges durch BMP6 gezeigt werden.
31

Literaturübersicht
Innerhalb der porzinen Steroidhormongenese wurde die mRNA-Expression von
StAR und 3ß-HSD mit BMP6 in den Granulosazellen signifikant unterdrückt,
nachdem auch hier eine reduzierte Progesteronproduktion nach 48 h IVM gezeigt
wurde (BRANKIN et al. 2005a).
In den genannten Studien scheint BMP6 regulatorisch auf die cAMP-Synthese zu
wirken und deshalb Einfluss auf die Steroidhormonproduktion zu nehmen. Es
wurde jedoch nicht nur der Einfluss auf cAMP diskutiert, sondern auch mögliche
Regulationen unterhalb des second messenger-Moleküls, direkt an den
Signalkaskaden der Proteinkinasen.
In humanen Brustkrebszellen scheint BMP6 die Apoptose neben dem SMAD-
Signalweg über die p38MAPK als Subtypen der MAPK zu hemmen (DU et al.
2008; VALERA et al. 2010). In Kleinhirnzellen von Ratten wurde die
kaliumvermittelte Apoptose durch BMP6 scheinbar nur über den MEK/ERK-
Signalweg reguliert (BARNEDA-ZAHONERO et al. 2009). In Granulosazellkulturen
der Ratte schrieben die Autoren den direkten Einfluss auf die MAPK dem BMP7
zu, welches die FSH-induzierte MAPK-Phosphorylierung blockiert. BMP6 soll
dabei lediglich gemeinsam mit BMP7 die cAMP-Synthese hemmen (MIYOSHI et
al. 2007).
32

2.4 Zielsetzung der Arbeit
Literaturübersicht
Das Ziel dieser Arbeit war es, neue Kenntnisse über den Zusammenhang der
Steroidhormongenese in porzinen Kumumuluszellen mit MAPK und OSFs zu
gewinnen.
Dafür ergaben sich folgende Fragestellungen:
Welche Mengen an Progesteron und 17ß-Östradiol werden von porzinen KOKs
während der Maturation sezerniert?
Welche Expressionsmuster der mRNA von StAR, CYP11A1, CYP19A1 und 3ß-
HSD existieren in Kumuluszellen während der IVM von KOKs nach verschiedenen
Kultivierungszeiträumen?
Wie reguliert die MAPK die mRNA-Expression steroidaler Enzyme und beinflusst
die Hormonsynthese von Progesteron und 17ß-Estradiol?
Welchen Effekt hat BMP6 als möglicher OSF auf die MAPK-Aktivität?
Ist BMP6 an der Regulation der Steroidhormonsynthese in Kumuluszellen des
Schweins beteiligt?
33

3 Methoden
Methoden
Alle Herstellerangaben der verwendeten Geräte, Materialien, Chemikalien,
Reagenzien sowie Software bzw. Datenbanken des Internets sind im Anhang (9.3)
aufgeführt und werden daher nicht im Text erwähnt. Ausnahmen stellen Methoden
dar, die an anderen Instituten durchgeführt wurden. In diesen Fällen sind die
Angaben im laufenden Text angegeben.
3.1 Isolierung und Klassifizierung der Kumulus-Oozyten-Komplexe
Die Ovarien von präpubertären Schweinen wurden auf den Schlachthöfen in
Hannover und Gleidingen etwa 15-30 min nach der Schlachtung der Tiere
gewonnen. Die Schweine waren zwischen 5-6 Monate alt und wiesen ein
Körpergewicht von 85-100 kg auf. Nach der Abtrennung der makroskopisch
intakten Ovarien ohne Gelbkörper vom Genitaltrakt wurden diese in ca. 37 °C
warmer 0,9%iger NaCl-Lösung in einem Thermosgefäß gesammelt und innerhalb
von ein bis zwei Stunden in das Labor transportiert. Bis zur weiteren Verarbeitung
wurden die Eierstöcke erneut in frischer, 37 °C warmer 0,9%iger NaCl-Lösung
gelagert.
Für die Isolation der Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOKs) wurden intakte Follikel
mit einem Durchmesser von 3-5 mm mit einem sterilen Skalpell aufgeschnitten
und mit 37 °C warmen Spülmedium gespült. Die Spülflüssigkeit wurde in einem
Uhrglas aufgefangen und die darin enthaltenen KOKs unter stereomikroskopischer
Kontrolle (200-400facher Vergrößerung) mit einer ausgezogenen, zuvor
silikonisierten Pasteurpipette entnommen. Anschließend wurden sie in
Petrischalen mit 2 ml Sammelmedium überführt und zweimal gewaschen.
Anhand der Morphologie des Zytoplasmas und der Anzahl von
Kumuluszellschichten wurden die KOKs in Anlehnung an LEIBFRIED und FIRST
(1979) wie folgt klassifiziert.
34

Tabelle 1: Klassifizierung der KOKs.
Kategorie I
Kategorie II
Kategorie III
Kategorie IV
Oozyten, die von einem kompakten, nicht
expandierten Cumulus oophorus mit drei oder
mehr Zellschichten umgeben sind und ein
gleichmäßig granuliertes Zytoplasma
besitzen.
Oozyten mit einem kompakten, nicht
expandierten Cumulus oophorus von weniger
als drei Zellschichten und teilweise
ungleichmäßiger Granulation des
Zytoplasmas
Oozyten, die lediglich von der Corona radiata
umgeben sind.
Oozyten ohne anhaftende Zellschichten an
der Zona pellucida.
Für alle Versuche wurden nur KOKs der Kategorie I und II verwendet.
3.2 Kultivierung der Kumulus-Oozyten-Komplexe
Methoden
Als Basis für die Kultivierung der KOKs diente das Maturationsmedium TCM 199
(tissue culture medium 199 mit Earls’s Salzen und NaHCO3), welches bei 4 – 8 °C
gelagert und nicht länger als drei Wochen verwendet wurde. Vor Versuchsbeginn
wurde dem Medium 2,5 µg/ml porzines FSH; 5,0 µg/ml porzines LH sowie 100 nM
Androstendion frisch hinzugefügt. Die Inkubation der KOKs erfolgte in
Multischalen mit vier Vertiefungen zu Gruppen von 20 KOKs in jeweils 500 µl
Medium in einer 5%igen CO2-Atmosphäre und gesättigter Luftfeuchte bei 39 °C.
Als Kultivierungszeiträume wurden zunächst jeweils 0 h, 5 h, 26 h und 46 h
gewählt. Das beschriebene Medium TCM 199 mit den Hormonen LH, FSH und
Androstendion diente bei allen Versuchen als Basismedium und wird nachfolgend
35

Methoden
in dieser Arbeit als BM bezeichnet. Um den Einfluss der MAPK zu untersuchen,
wurden die KOKs unter den o. g. Bedingungen kultiviert und das BM wurde
zusätzlich mit dem MEK-Inhibitor U0126 (20 µM) versetzt.
Um zu analysieren, in welcher Weise BMP6 die Steroidhormongenese oder die
MAPK-Aktivität beeinflusst, wurde das BM ebenfalls wie oben beschrieben
verwendet, nur dass zusätzlich BMP6 (100 ng/ml) dem Medium zugefügt wurde.
Nach Beenden der Maturationszeit von 26 und 46 h wurden die KOKs für ca. 30
Sekunden in 0,25 %iger Hyaluronidase bei Raumtemperatur inkubiert, um
anschließend die anheftenden Kumuluszellen durch wiederholtes Aufziehen mit
einer ausgezogenen Pasteurpipette mechanisch zu entfernen. Für KOKs direkt
nach Isolation (0 h) und Kultivierung von 5 h wurde das Denudieren ohne die
Inkubation mit Hyaluronidase durchgeführt. Die entfernten Kumuluszellen sowie
die Oozyten wurden nach dreimaligem Waschen in ca. 4 µl proteinfreien PBS
(Dulbecco’s phosphate buffered saline) bei -80 °C in Eppendorfreaktionsgefäßen
gelagert. Die Lagerung des Maturationsmediums erfolgte bei -20 °C.
Verlängerung der Kultivierungszeit
Um den möglichen Einfluss von BMP6 näher zu untersuchen, wurde nach den
ersten Ergebnissen die Kultivierungsdauer der KOKs verlängert und als
zusätzliche Untersuchungszeitpunkte 72 und 94 h gewählt. Die verlängerte
Kultivierung im BM wurde zum Vergleich mit BMP6-kultivierten KOKs ebenfalls
durchgeführt.
3.3 Vitalfärbung der Kumuluszellen
Zusätzlich zur Kernreifungsuntersuchung der Eizellen sollte bei der verlängerten
Kultivierungsdauer gewährleistet sein, dass die Kumuluszellen ebenfalls keine
degenerativen Erscheinungen aufweisen. Deshalb wurden in Vorversuchen
Vitalfärbungen mittels Trypanblau durchgeführt. Der Farbstoff wurde 1:100 in PBS
36

Methoden
verdünnt. Die Kumuluszellen wurden nach der Zentrifugation (300 x g für 2 min) in
10 µl PBS resuspendiert und mit einem Tropfen des verdünnten Farbstoffs
versehen. Anschließend wurden die Zellen lichtmikroskopisch bei 200-400facher
Vergrößerung beurteilt und ausgezählt. Die Zellen, deren Membranintegrität der
Plasmamembran nicht mehr gegeben war, nahmen den blauen Farbstoff auf und
wiesen im Zelleib nur noch einen Zytoplasmarest auf (Abb. 5). Diese
Kumuluszellen konnten als degeneriert eingestuft werden. Vitale Kumuluszellen
hingegen erschienen nicht nur größer, sondern deutlich blasser und unterschieden
sich durch ihre intakte, runde bis ovale Form mit glatter Zellmembran und
erkennbaren Zellkern (Abb. 5).
vitale Kumuluszelle
degenerierte
Kumuluszelle
Abbildung 5: Vitalfärbung der Kumuluszellen mit Trypanblau nach 94 h IVM bei
200facher Vergrößerung.
Insgesamt wurden 314 Zellen ausgezählt und beurteilt. Davon waren 278 (88,5 %)
vital und 36 Zellen (11,5 %) degeneriert. Dieser Vorversuch zusammen mit den
Ergebnissen der Kernreifungsanalyse (s. 4.1) wurde so gewertet, dass die In-vitro-
Bedingungen für die KOKs auch nach 72 bzw. 94 h geeignet sind.
37

3.4 Beurteilung des Kernreifungsstatus
Methoden
Für alle IVM-Versuche, mit BM, BM+U0126 sowie BM+BMP6 wurde parallel der
Kernreifungsstatus der Oozyten ermittelt. Dafür wurden die Eizellen, wie unter 3.2
beschrieben, nach der jeweiligen Kultivierungszeit denudiert. Ein Deckgläschen
wurde mit einer Paraffin-Vaseline-Mischung (9 Teile Vasline : 1 Teil Paraffin) als
Abstandshalter in jeder Ecke sowie einem 50 µl Tropfen 0,7%iger
Kaliumchloridlösung (KCL) in der Mitte versehen, worin die Eizellen pipettiert
wurden, nachdem sie zweifach in 0,7%iger KCL gewaschen wurden. Der vorher
mittels Ethanol entfettete Objektträger wurde anschließend auf das Deckgläschen
gelegt und konnte unter stereomikroskopischer Kontrolle nach dem Umdrehen des
Präparates festgedrückt werden. Das Oozytenpräparat wurde für mindestens 24 h
in einer Lösung aus Eisessig:Ethanol im Mischungsverhältnis 1:3 fixiert.
Anschließend erfolgte die Färbung mit 2%iger Aceto-Orceinlösung, wobei der
überschüssige Farbstoff mit 25%iger Essigsäure ausgewaschen wurde.
Die Beurteilung des Kernreifungstatus erfolgte mit einem
Phasenkontrastmikroskop (BX 60, Olympus) bei 200 – 400-facher Vergrößerung.
Die Fotodokumentation wurde mit der Software Cell D 2,6 System (Olympus) in
Anlehnung an HUNTER und POLGE (1966) sowie MOTLIK und FULKA (1976)
durchgeführt.
38

Methoden
Tabelle 2: Einteilung der Kernstadien nach HUNTER und POLGE (1966) sowie
MOTLIK und FULKA (1976).
Germinalvesikelstadium
(GV)
GV I
GV II
GV III
GV IV
Die intakte Kernmembran ist deutlich zu erkennen und
umgibt den großen vesikulären Kern vollständig.
Der Nukleolus ist vorhanden. Um das Kernkörperchen
sind ring- oder hufeisenförmige Ansammlungen von
orceinpositiven Material zu erkennen.
Der Nukleolus ist vorhanden. Es sind einige
orceinpositive Bereiche an der Kernmembran zu
erkennen.
Der Nukleolus ist vorhanden. Das Chromatin stellt sich
als fädige bis klumpige Struktur dar.
Der Nukleolus ist nicht mehr vorhanden. Das Chromatin
ist als irreguläres Netzwerk oder als individuell
fadenförmige Bivalente anfärbbar.
Diakinese Die Kernmembran löst sich auf. Die Chromosomen sind
als gut anfärbbare Körper sichtbar.
Metaphase I Der Zellkern ist nicht mehr vorhanden. Die
Chromosomen sind maximal kondensiert und in einem
Cluster in der Äquatorialebene einer bipolaren Spindel
angeordnet.
Anaphase I Die Chromosomen migrieren zu den Polen einer
elongierten Spindel.
Telophase I Die beiden Chromosomengruppen sind auseinander
gewichen und stellen sich als hyperkondensierte
Chromatinaggregate dar. Die meiotische Spindel ist
deutlich zu erkennen.
Metaphase II Die Chromosomen sind auf zwei Cluster verteilt.
Teilweise ist die Membran des ersten Polkörpers
darstellbar. Die Chromosomen der Eizelle sind erneut in
der Äquatorialebene anegordnet.
Befruchtung oder Alterung der Eizelle
Anaphase II Die Chromatiden werden am Centromer getrennt und
wandern zu den Zellpolen.
Der Spindelapparat ist deutlich zu erkennen.
Telophase II Die Chromatidengruppen sind auseinander gewichen
und befinden sich an den Zellpolen.
39

3.5 Bestimmung der Hormonkonzentrationen im Medium
Methoden
Die Hormonsekretion der Kumuluszellen unter den verschiedenen In-vitro-
Bedingungen wurde mittels der Bestimmung der 17ß-Estradiol- und
Progesteronkonzentration im Medium analysiert. Die Messungen mittels
Radioimunoassay (RIA) erfolgten am Leibnitz-Institut für Nutztierbiologie in
Dummerstorf (AG Prof. Dr. W. Kanitz).
Progesteron (P4)- und 17-Estradiol (E2)- Konzentration
Das Verfahren des Radioimunoassays beruht auf einer Antigen-
Antikörperreaktion. Die Trennung der freien und antikörpergebundenen Hormone
erfolgte mittels der Dextran-Aktivkohle-Methode. Die P4-Konzentration wurde
dabei mit einem direkten kompetitiven 3 H-RIA gemessen. Als radioaktives Isotop
zur Markierung und Detektion (Tracer) wurde ein 1,2,6,7- 3 H(N) Progesteron (GE
Healthcare, Freiburg) verwendet. Der Antikörper wurde durch Immunisierung von
Kaninchen mit einem 11-OH-Progesteron-Konjugat erzeugt und chromatografisch
mit einem Titer 1:30.000 aufgereinigt. Die Messansätze wurden zuerst bei 37 °C
für 30 min und anschließend für 2 h bei 4 °C inkubiert. Für die
Konzentrationsermittlung wurde eine Eichkurve im Bereich von 6,25 – 1600 pg/ml
gewählt. Mit Hilfe eines Flüssigszintillationssprektrometers (LSC) mit integriertem
RIA-Auswertprogramm (TriCarb 2900 TR, Perkin-Elmer, Rodgau) erfolgten die
Messungen der Radioaktivität und die Kalkulation der RIA-Qualität sowie der
Standard/Medienkonzentration. Die Variationskoeffizienten betrugen für
VKintra 7,6 % und für VKinter 9,8 %. Die Empfindlichkeit des P4-RIA ist durch
wiederholte Messung des Nullstandards ermittelt wurden und betrug 7 pg/ml.
Die Messung der E2-Konzentration im Medium erfolgte mit einem modifizierten
kompetitiven 3 H-RIA mit 15 µl Medium. Der Antikörper wurde ebenfalls durch
Immunisierung von Kaninchen mit einem Titer 1:70.000 erzeugt und als Tracer
diente ein 2,4,6,7- 3 H Estradiol-17ß (GE Healthcare, Freiburg). Die
Versuchsbedingungen für die Inkubationsschritte, Radioaktivitätsmessung sowie
40

Methoden
Berechnung der Hormonkonzentration erfolgten wie unter oben beschrieben. Die
ermittelte Empfindlichkeit des E2-RIA betrug 3 pg/ml. Als Variationskoeffizienten
ergaben sich für VKintra 6,9 % und für VKinter 9,9 %.
3.6 Molekularbiologische Methoden
3.6.1 RNA-Extraktion
Bei allen Arbeitsschritten wurden die entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen
getroffen, um Verunreinigungen und Kontaminationen der RNA (ribonucleic acid)
mit RNasen oder genomischer DNA (desoxyribonucleic acid) zu vermeiden. Für
die Arbeiten mit RNA wurden grundsätzlich Nitrileinmalhandschuhe,
Pipettenspitzen mit Filter und RNase-freie Materialien verwendet. Alle Lösungen,
Glas- und Reaktionsgefäße wurden für 20 min bei 121 °C und 1,5 bar autoklaviert.
Zur Gewinnung der Gesamt-RNA aus den Kumuluszellproben bzw. aus den
Oozyten von jeweils 20 Kumulus-Oozyten-Komplexen wurde das RNeasy Mini Kit
eingesetzt, wobei die im Handbuch beschriebene Anleitung als Grundlage für die
einzelnen Arbeitschritte diente. Es wurden nur Puffer und Lösungen verwendet,
die im Kit enthalten sind. Die genauen Zusammensetzungen sind nicht bekannt.
Vor jeder RNA-Extraktion wurde eine Lösung aus RLT-Puffer mit
ß-Mercaptoethanol (10 µl ß-ME/1 ml Puffer) frisch hergestellt.
Die zuvor bei -80 °C gelagerten Kumuluszell- bzw. Oozytenpellets wurden jeweils
in 330 µl dieses RLT-Puffers mit ß-Mercaptoethanol resuspendiert und auf DNA-
shredder-Säulen pipettiert und anschließend bei ca. 10.000 x g für 3 min
zentrifugiert. Die Säulen mit der überschüssigen genomischen DNA wurden
verworfen und das Lysat mit 330 µl 70%igem Ethanol versetzt, um die
Vorraussetzung für die Bindung der RNA zu schaffen. Nach dem Mischen durch
mehrfaches Auf- und Abpipettieren wurde das Lysat in 2 ml RNA-Sammelgefäße
überführt und erneut bei ca. 10000 x g für 3 min zentrifugiert. Der Durchlauf wurde
41

Methoden
anschließend verworfen und die RNeasy-Säulen auf 2 ml
Eppendorfreaktionsgefäße ohne Deckel überführt. Die Säulen mit der gebundenen
RNA wurden dann einmal mit 500 µl RW1-Puffer und zweimal mit 500 µl RPE-
Puffer versetzt und nach jedem Schritt für 3 min bei ca. 10000 x g zentrifugiert.
Danach wurden die Säulen in 1,5 ml Eppendorfreaktionsgefäße überführt und mit
jeweils 30 µl RNase-freiem Wasser versetzt. Die Proben kamen danach für 5 min
auf den Rüttler und wurden anschließend ein letztes Mal für 3 min bei 10000 x g
zentrifugiert. Die Säulen wurden verworfen und die extrahierte RNA bei
-80 °C gelagert.
3.6.2 Kontrolle der RNA-Qualität
Um die Nativität der extrahierten RNA zu überprüfen, wurde diese in einem
1%igem denaturierenden Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und auf das
Auftreten der 28S- und 18S-Banden der ribosomalen RNA (rRNA) hin untersucht.
Die Herstellung des Agarosegels ist dem Anhang (9.3) zu entnehmen. Im
Anschluss an die Herstellung des Gels wurden in heißem Zustand 9,6 ml 37%iges
Formaldehyd hinzugefügt und erneut für 30 s aufgekocht. Das Gel wurde in die
Kammer gegossen und polymerisierte innerhalb von 20-30 min. Jeweils 4 µl der
Proben wurden mit 4 µl Ladepuffer versetzt. Als RNA-Größenmarker wurden 2 µl
RNA-Ladder mit 2 µl Ladepuffer verwendet. Die Proben und der Größenmarker
wurden bei 70 °C für 10 min denaturiert und anschließend sofort auf Eis gelagert.
Als Elektrophoresepuffer wurde 1fach MOPS-Lösung (3-(N-morpholino)-
Propansulfonsäure-Lösung) verwendet. Jede Geltasche wurde mit 8 µl
Gesamtvolumen bzw. 4 µl beim Größenmarker gefüllt. Die Elektrophorese lief
konstant für 60 min bei 70 V und 400 mA. Aufgrund der
Ethidiumbromideinlagerungen des Ladepuffers konnte die Auftrennung der RNA in
28S- und 18S-rRNA Untereinheiten unter UV-Licht sichtbar gemacht und
fotodokumentatorisch festgehalten werden.
42

Methoden
Zusätzlich zum denaturierenden Agarosegel wurde die RNA-Qualität
stichprobenartig anhand ihres Degradierungsgrades mittels Agilent 2100
Bioanalyzer (Agilent technologies, Böblingen) beurteilt. Diese Untersuchungen
wurden an der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
(AG Prof. Dr. C. Wrenzycki) durchgeführt.
3.6.3 Bestimmung der RNA-Konzentration
Der Gehalt an Gesamt-RNA wurde für jede Probe photometrisch bestimmt. Vor
jeder Messung wurde das Photometer mit DEPC-H2O geeicht. Jede RNA-Probe
wurde 1:100 mit DEPC-H2O verdünnt und in UV-Einmal-Küvetten mit einer
Zentrumshöhe von 15 mm bei einer Wellenlänge von 260 nm gemessen. Die
RNA-Konzentration wurde anschließend nach dem Lambert-Beer’schen Gesetz
wie folgt berechnet:
cRNA [µg/µl] = A x f
Dabei steht A für Absorption und f ist der Umrechnungsfaktor des Photometers
von 0,4 µg/µl. Eine optische Dichte bei 260 nm (OD260) von 1 entspricht daher
einer RNA-Konzentration von 40 µg/ml. Die RNA-Konzentrationen der Proben
wurden aus dem Mittelwert der Messungen berechnet. Während der Durchführung
wurden die Proben auf Eis gelagert.
3.6.4 Ermittlung PCR-Zyklusanzahl
Um eine semiquantitative Auswertung durchführen zu können, wurde für jedes
Transkript die geeignete Zyklusanzahl der PCR (polymerase chain reaction)
ermittelt. Dafür wurde die Zyklusanzahl gesucht, in der die PCR noch in der
43

Methoden
exponentiellen Anstiegsphase abläuft. Dafür wurde die Anstiegsphase nach 28, 30
und 32 Zyklen für jedes Transkript untersucht und folgende Zykluslängen wurden
festgelegt.
Tabelle 3: Zyklusanzahlen der PCR für die jeweiligen Transkripte.
3.6.5 Allgemeines zur PCR
Transkript
GAPDH
StAR
CYP19A1
CYP19A1
3ß-HSD
BMP6
Zyklusanzahl
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ermöglicht eine rasche und
sequenzspezifische Vervielfältigung definierter DNA-Abschnitte aus
unterschiedlichen Ausgangsmaterialen. Dabei lagern sich spezifische
Oligonucleotidmoleküle am 5’- und 3’-Ende des zu amplifizierenden Bereiches der
doppelsträngigen DNA an. In Anwesenheit von freien Desoxynucleosid-
Triphosphaten (dNTPs) synthetisiert eine DNA-abhängige Polymerase den
jeweiligen Gegenstrang in 5’-3’-Richtung. Jeder PCR-Zyklus besteht aus drei
Schritten. Im ersten Schritt wird die doppelsträngige DNA durch eine
Temperaturerhöhung auf 95 °C denaturiert, dabei werden die
Wasserstoffbrückenbindungen der Basenpaare gelöst und somit liegt die DNA in
zwei Einzelsträngen vor. Im nächsten Schritt binden die Oligonukleotidprimer bei
30
30
30
30
30
32
44

Methoden
einer niedrigeren Temperatur (ca. 50-65 °C) an der DNA-Matrize. Im letzten Schritt
des PCR-Zyklus wird der jeweilige Gegenstrang durch die DNA-Polymerase bei
ca. 72-75 °C synthetisiert.
Eine Möglichkeit zur Analyse der Genexpression besteht in der Untersuchung der
jeweils vorliegenden mRNA (messenger-RNA). Wenn RNA statt DNA als
Ausgangsmaterial für die PCR vorliegt, ist zusätzlich eine Reverse Transkription
(RT), d. h. ein Umschreiben der RNA in cDNA (complementary DNA), vor der PCR
notwendig. Dieser cDNA-Einzelstrang dient als Template (Matrizen-Strang) für die
folgenden Amplifikationszyklen.
In dieser Arbeit wurde das Verfahren der „one-step“ RT-PCR für die
Quantifizierung der mRNA in Kumuluszellen bzw. Oozyten gewählt. Dabei finden
alle Reaktionen in einem PCR-Gefäß statt, d. h. das Risiko der Kontamination wird
durch diese Methode verringert.
Die verwendeten annealing-Temperaturen varierten entsprechend der
Primerkombination, sie ist von der Länge und dem prozentualen G C-Gehalt
(Guanin/Cytosin-Gehalt) der Primer abhängig. Für das Ermitteln der annealing-
Temperatur wurde zunächst der mittlere Schmelzwert (TM-Wert) wie folgt
berechnet und 2 °C unter dem errechneten Wert gewählt:
TM [°C] = 4 · (G+C) + 2 · (A+T)
Aus den Schmelztemperaturen beider Primer wurde anschließend die annealing-
Temperatur wie folgt berechnet:
(TM1 + TM2)
TA [°C] = ——————— - 2 °C
2
TM1 und TM2 stellen hierbei die Schmelztemperaturen der zwei eingesetzten
Primer dar.
45

3.6.6 Durchführung der one-step Reverse Transkriptase-PCR
Methoden
Von folgenden Genen wurde die mRNA aus porzinen Kumuluszellen bzw.
Oozyten mittels RT-PCR im one step-Verfahren quantifiziert. GAPDH
(Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase) wurde dabei als Referenzgen
verwendet.
Tabelle 4: Zielgene mit dazugehörigen Enzymen.
Zielgen
StAR
CYP11A1
CYP19A1
HSD3B1
GAPDH
BMP6
StAR
P450scc
P450arom
3ß-HSD
GAPDH
BMP6
Enzym/Protein
Steroidogenic acute regulatory protein
Cytochrome P450 side-chain-cleavage enzyme
Cytochrom P450 Aromatase
3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase
Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
Bone morphogenic protein 6
Mit Hilfe der Datenbank des NCBI (National Center for Biotechnology Information)
wurden folgende spezifische Primerpaare ermittelt und nach Synthese bei
Eurofins MWG Operon verwendet. Spezifische Primer binden gezielt an der
mRNA. Die cDNA hybridisiert daher mit der ursprünglichen Gesamt-RNA, bevor
der Abbau durch den RNase-Inhibitor erfolgt.
46

47
Tabelle 5: Übersicht der verwendeten spezifischen Primer.
Zielgen /
Accession Nr.
StAR
U53020
CYP11A1
NM214427
CYP19A1
NM214429
3ß-HSD
NM001004049
GAPDH
X94251
BMP6
NM_001168001
Richtung
Sense
Antisense
Sense
Antisense
Sense
Antisense
Sense
Antisense
Sense
Antisense
Sense
Antisense
Primer
5’ – GGAGAGCCGGCAGGAGA - 3’
3’ – CTTCTGCAGGATCTTGATCTTCTTG – 5’
5’ – GTAGCCGCATGGGACACTAT – 3’
3’ – ATTGCAGCATCTTGCTTGTG – 5’
5’ – GCTAATTGCAGCACCAGACA – 3’
3’ – TGTTGGTTCCCTTTTTCACC – 5’
5’ – GCCAGCGTGCCGGTCTTCAT – 3’
3’ – GAATGGGCTCCCCTCCCCGT – 5’
5’ – ATTGCCCTCAACGACCACTT – 3’
3’ – ACATGACGAAGGCAGGTCTCC – 5’
5’ – GCGGCTCAAGACGCACGAGAAA – 3’
3’ – AGCATGAAGAGGGGCGCAGACT – 5’
Position
416-435
599-575
833-852
1148-1129
979-999
1251-1231
515-534
763-744
1-21
286-266
329-350
517-496
Amplikon-
Länge
183 bp
316 bp
273 bp
249 bp
285 bp
189 bp
Methoden

Die Temperaturbedingungen wurden wie folgt gewählt:
92 °C 2 min 1 Zyklus
4 °C 3 min Hinzufügen des RT-Ansatzes
37 °C 40 min 1 Zyklus
80 °C 2 min 1 Zyklus
20 °C 2 min 1 Zyklus
4 °C 2 min Hinzufügen des PCR-Ansatzes
72 °C 30 sec
TA 30 sec
72 °C 30 sec
15 °C 10 min
4 °C ∞
30 bzw. 32 Zyklen (s. 3.6.4)
Folgende Ansätze der PCR wurden vor jedem Versuch angesetzt.
1. Ansatz (Denaturierung): 40 pmol Primer Antisense
2,5 µl Gesamt-RNA
18 µl DEPC-H2O
2. Ansatz (Reverse Transkription) 40 U/µl RNaseOUT
RNAse Inhibitor
200 U/µl Superscript II
Reverse Transkriptase
16 µl RT-Puffer
Jedem Reaktionsgefäß wurde eine ½ Kugel Ampli Wax ® hinzugefügt.
3. Ansatz (PCR) 40 pmol Primer Sense
5 U/µl Taq DNA Polymerase
20 µl PCR-Puffer
37,2 µl DEPC-H2O
Methoden
48

Methoden
Alle Reaktionen der PCR erfolgten im Thermocycler bei genannten
Temperaturbedingungen.
Als Negativkontrollen bei jeder PCR dienten RNA-Proben, denen kein RNase
Inhibitor sowie keine Reverse Transkriptase zugefügt wurden, um die
Verunreinigung der RNA mit genomischer DNA auszuschließen. Weiterhin
durchliefen Negativkontrollen die Reaktion mit allen Ansätzen, aber fehlender RNA
zur Überprüfung auf Reinheit der Reaktionsansätze.
Die RT-PCR für das BMP6 lieferte nach oben genanntem Protokoll unzulängliche
Ergebnisse, daher wurden die Ansätze und Reaktionsbedingungen modifiziert. Es
wurden folgende Änderungen vorgenommen:
Als Template diente cDNA, die durch den Einsatz von random Hexamer-
Oligonukleotiden synthetisiert wurde. Weiterhin wurden die Konzentrationen der
Reagenzien im RT-Ansatz geändert und wie folgt eingesetzt und auf ein
Gesamtvolumen von 30 µl DEPC-H2O aufgefüllt.
5 mM MgCl2
1 x PCR Puffer
1 mM dNTPs
2,5 µM random Hexamer-Oligonukleotide
20 U/µl RNaseOUT RNAse Inhibitor
50 U/µl Superscript II Reverse Transkriptase
2,5 µl Gesamt-RNA
Der PCR-Puffer sowie die MgCl2-Lösung wurde nicht, wie bisher, selbst
hergestellt, sondern von Applied Biosystems bezogen.
49

Die Temperaturbedingungen für die Reverse Transkription lauteten wie folgt:
25 °C 10 min
42 °C 60 min
99 °C 5 min
alle Proben auf Eis 5 min
Methoden
Nach dem Zufügen der ½ Kugel Ampli Wax ® folgte die PCR in bereits
beschriebener Weise. Die Zyklusanzahl für BMP6 wurde auf 32 erhöht (s. Tab. 3).
3.6.7 Agarose-Gelelektrophorese
Für die Herstellung des 1%igen Gels wurde Agarose in 8 ml 1fach TAE (Tris-
Acetat-EDTA) auf 400 ml Reinstwasser unter Hitzezufuhr gelöst. Die PCR-
Produkte wurden anschließend im Gel in einer MultiSUBmini Gelkammer bei
120 V und 400 mA in ca. 50 min elektrophoretisch aufgetrennt. Als Laufpuffer
diente ca. 400 ml 1fach TAE. Zur Größenbestimmung der Amplifikationsprodukte
wurde 3 µl eines 50 bp DNA-Markers verwendet. Als Molekularfarbstoff und zum
gleichzeitigen Erhöhen der spezifischen Dichte wurde jedes PCR-Produkt vor dem
Beladen der Kammern mit 4 µl Orange G versehen. Das Anfärben des
Agarosegels nach der Elektrophorese erfolgte für 15 min in 500 ml
Ethidiumbromidlösung (5 mg/ml). Abschließend wurden die entstandenen Banden
unter UV-Licht sichtbar gemacht und mittels Digitalfotographie dokumentiert.
50

3.6.8 Auswertung der Ergebnisse
Methoden
Die Signale der PCR-Banden der Transkripte wurden visualisiert und digital
dokumentiert. Die Intensität der Banden wurde anschließend mit der Software
ImageQuant TL 7.0 gemessen.
Diese ermittelten Werte für die mRNA-Expressionslevel von StAR, CYP11A1,
CYP19A1, 3ß-HSD und BMP6 wurden zu den dazugehörigen Werten des
housekeeping-Gens GAPDH wie folgt ins Verhältnis gesetzt. Von den
Messergebnissen der GAPDH-Intensität wurde der arithmetische Mittelwert
gebildet und dann für jede Probe durch den exakten Messwert der GAPDH-Bande
dividiert. Der errechnete Wert fungierte als Faktor, mit dem die Messwerte der
PCR-Banden von StAR, CYP11A1, CYP19A1, 3ß-HSD und BMP6 multipliziert
wurden und zum Ergebnis der relativen mRNA-Level führte. Diese
Vorgehensweise ermöglichte es, standardisiert an der Transkription von GAPDH,
die Transkription der gesuchten mRNA als relative mRNA-Level auszudrücken.
Für jedes Gen wurde die PCR mindestens von drei unabhängigen RNA-Proben
der Kumuluszellen bzw. Oozyten von jeweils jedem Kultivierungszeitpunkt
wiederholt.
3.6.9 Identifikation der PCR-Produkte
Die Identität der PCR-Produkte wurde durch Sequenzierungen überprüft, indem
GATC Biotech AG Sequenzanalysen durchgeführt hat. Zur Auswertung der
Sequenzierungsergebnisse diente die Software DNASTAR Lasergene 8 sowie
BioEdit Sequence Alignment Editor version 7.0.9.0.
51

3.7 Analyse der MAPK-Phosphorylierung
Methoden
Für diesen Versuchsteil wurden Kumuluszellproben verwendet, die jeweils nach
genanntem IVM- und Versuchsschema von 20 KOKs gewonnen und gelagert
wurden (s. 3.1 u. 3.2). Demnach standen für diesen proteinchemischen
Untersuchungsteil Kumuluszellproben aus der IVM im BM, BM+U0126 sowie
BM+BMP6 zur Verfügung.
3.7.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die Proben wurden auf Eis aufgetaut und in 30 µl 2,5 fachen Ladepuffer (Laemmli-
Autragspuffer) aufgenommen. Nach gründlichem Vortexen wurden die Proben für
5 min bei 95 °C aufgekocht. Anschließend folgte ein einminütiger
Zentrifugationsschritt bei 13.000 x g. Die Auftrennung der Proteine erfolgte in
einem vertikalen Polyacrylamidgel, welches sich aus einem 10,5%igem Trenngel
und einem vorgeschalteten 4,5%igem Sammelgel zusammensetzte. Im Gel wurde
die Polymerisation durch APS (Ammoniumperoxosulfat) als Radikalbildner und
TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin) als Katalysator eingeleitet. Die
Auftrennung der Proteine erfolgt dabei anhand der Molekülgröße mittels SDS
(Natriumdodecylsulfat). Dadurch denaturierten die Proteine und erhielten eine
negative Ladung durch Anlagerung der SDS-Sulfatgruppen. Die Elektrophorese
erfolgte für ca. 20 min bei 100 V in einem Tris-, SDS- und Glycin-haltigem
Elektrodenlaufpuffer bis sich die gebildete Lauffront kontinuierlich darstellte und
das Sammelgel passiert hatte. Dann wurde die Spannung für ca. 55 min auf 200 V
erhöht bis die Lauffront das Elektrophoresegel verlassen hatte. Zur späteren
Beurteilung der Proteingröße wurde parallel ein farbiger Größenmarker
(Prestained Proteinstandard Fermentas, 72 kDa rot) geladen, der neben der
Lauffront durch die Farbgebung zur Orientierung während des Elektrophoreselaufs
diente.
52

3.7.2 Immunoblot
Methoden
Nach der gelektrophoretischen Auftrennung der Proteine erfolgte mittels Blotting
ein Proteintransfer entlang eines elektrochemischen Gradienten auf eine 6 x 8 cm
große proteinbindende Nitrocellulosemembran, wodurch die Proteine
anschließend für die Immunodetektion zur Verfügung standen. In der horizontalen
Blottingkammer befanden sich jeweils drei Lagen in Glycin-, Tris-, SDS- und
Methanolhaltigem Blottingpuffer getauchtes Filterpapier, auf die die Membran,
anschließend das Gel und abschließend erneut drei Lagen Filterpapier gebracht
wurden. Die negative geladenen Proteine wandern während des
Blottingverfahrens zur Anode und bleiben aufgrund hydrophober
Wechselwirkungen an der Membranoberfläche haften. Der Proteintransfer erfolgte
bei 2 mA/cm 2 für 120 min. Zur Überprüfung des erfolgreichen Protein- und
Standardtransfers auf die Membran erfolgte eine Ponceau S-Färbung für ca.
1 min.
Mit Hilfe spezifischer Antikörper (s. 9.2) wurden die Membranen zuerst auf die
Anwesenheit der phosphorylierten MAPK und im nächsten Versuch auf die des
α-Tubulins als Auftagskontrolle untersucht. Bevor eine Bindung mit Antikörpern
herbeigeführt wurde, erfolgte eine Inkubation der Membranen in einer
Blockierungslösung über Nacht im Kühlschrank, damit freie Bindungstellen mit
einem für den Antikörper nicht erkennbares Protein abgesättigt sind. Nach der
Blockierung erfolgten mehrere Waschschritte in TBS/Tween 1 %. Die Inkubation
der Membranen mit einem antigenspezifischen Primärantikörper erfolgte über
Nacht bei Raumtemperatur. Am nächsten Tag folgten erneut drei Waschschritte,
damit die schwächer haftenden, unspezifisch gebundenen Antikörpermoleküle von
der Membran entfernt werden konnten. Der Sekundärantikörper, der ein mit
Meerettich-Peroxidase (HRPO) gekoppelter Antikörper ist und gegen das Fc-
Fragment des Primärantikörpers gerichtet ist, wurde für 1 h bei RT auf die
Membran gebracht. Das Enzym Peroxidase, welches an den Sekundärantikörper
gekoppelt ist, spaltet H2O2-Radikale ab, sodass Luminol oxidiert wird.
Anschließend erfolgten erneut fünf Waschschritte in TBS/Tween 1 %. Dann wurde
53

Methoden
die Membran in einer Folientasche mit dem Chemilumineszenzsubstrat
SuperSignal ® West Dura Extended Duration blasenfrei eingeschweißt und für 5
min inkubiert. Die Membran wurde in eine Röntgenkasette gelegt und bei Rotlicht
unter einen auf die Größe zugeschnittenen Röntgenfilm gebracht. Die Dauer der
Exposition wurde dem jeweiligen Ergebnis angepasst. Nach der Exposition
wurden die Filme entsprechend den Herstellerangaben der Entwicklungs- bzw.
Fixierungslösungen behandelt.
Um die gleiche Membran für eine weitere Proteinanalyse verwenden zu können,
wurde die Antikörper durch mehrere Waschschritte mit TBS/Tween 1 %
gewaschen. Anschließend wurde sie bei Raumtemperatur für 2 h im Stripping-
Reagenz aufbewahrt. Die nächste Chemilumineszenz wurde wie oben
beschrieben durchgeführt.
3.7.3 Auswertung der Chemilumineszenz
Von den Membranen wurden die Banden der Anti-pMAPK- und Anti-α-Tubulin-
Signale visualisiert und eingescannt. Anschließend wurde die Intensität dieser
Banden mittels der Software ImageQuant TL 7.0 gemessen.
Die Messwerte des Tubulins dienten für jede Probe als Referenz, indem von
jedem Versuch aus diesen Messwerten der arithmethische Mittelwert gebildet
wurde und jeweils durch den exakten Messwert der α-Tubulinbande dividiert
wurde. Dieser errechnete Wert diente als Faktor, mit dem die Werte der Banden
der aktivierten MAPK-Isoform (42 kDa) multipliziert wurden. Diese Ergebnisse
werden in dieser Arbeit als relative Intensität bzw. Dichte der Phosphorylierung der
MAPK gewertet und bezeichnet.
54

3.8 Zusammenfassung des Versuchdesigns
Methoden
Die folgende Abbildung (Abb. 6) stellt einen Überblick der durchgeführten
Versuche dieser Arbeit dar. Dargestellt ist die Isolation der KOKs mit der
jeweiligen In-vitro-Maturation (IVM) mit den dazugehörigen
Kultivierungszeitpunkten für BM, BM+U0126 und BM+BMP6. Für alle
Kultivierungsmethoden wurde der Kernreifungsstatus der Oozyten analysiert. Mit
den Kumuluszellen wurden proteinchemische Analysen zur Phosphorylierung der
MAPK mittels Immunoblot und Chemilumineszenz durchgeführt. Die mRNA-
Expression der Gene der Steroidhormonbiosynthese wurde ebenfalls von
Kumuluszellen aus allen Kultivierungsmethoden untersucht und mittels RT-PCR
durchgeführt. Zusätzlich wurde das mRNA-Expressionsmuster von BMP6 in
Kumuluszellen und Eizellen analysiert. Die Progesteron- und 17ß-
Estradiolsekretion der KOKs wurde ebenso in allen Kultivierungsmedien mittels
Radioimmunoassay gemessen.
55

Abbildung 6: Schema des Versuchsdesigns. KZ: Kumuluszellen
Methoden
56

3.9 Statistische Auswertung
Methoden
Für die Verteilung der Kernreifungsstadien (s. 4.1) wurden alle Zeitpunkte mittels
χ 2 -Test miteinander verglichen. Durchschnittlich wurden ca. 100 Eizellen für jeden
Versuchsansatz und jeden Zeitpunkt ausgewertet. Dafür wurde die Software
SigmaStat 3.5 (Sysstat Software Inc., Erkrath) benutzt. Die genauen Anzahlen der
beurteilten Eizellen sind Tab. 6 zu entnehmen.
Für die Hormonanalysen, die Ergebnisse der RT-PCR sowie der
Phosphorylierungsgrade der MAPK wurden alle Werte mit Hilfe des Kolmogorov-
Smirnov-Tests auf Normalverteilung mittels Software SigmaStat 3.5 geprüft.
Anschließend wurden die Daten mittels Varianzanalyse ausgewertet.
Die Hormonwerte, die relative Dichte der PCR-Transkripte sowie die relativen
Phosphorylierungsgrade der MAPK wurden zum Vergleich des Kultivierungsverlaufs
mit dem Ryan-Einot-Gabriel-Welsch Multiple Range Test nach Tukey verglichen. Um
den Einfluss des Kultivierungsansatzes zu jedem Zeitpunkt zu untersuchen, wurde
der Tukey’s Studentized Range Test (HSD-Test) angewendet.
Jeder Versuch der Hormonmessung wurde viermal, jede PCR und jeder SDS-
Gelektrophorese mit dazugehöriger Chemilumineszens dreimal als unabhängige
Versuche wiederholt. Die Varianzanalysen wurden mit der Software SAS 9.1 (SAS
Institute Inc., Cary, NC, USA) durchgeführt.
57

4 Ergebnisse
4.1 Kernreifungsraten
Ergebnisse
In diesem Versuchsteil wurden die Kernstadien der Oozyten in den drei
Versuchsansätzen (BM, BM+U0126 sowie BM+BMP6) ermittelt. Insgesamt
wurden 1973 Eizellen klassifiziert, wovon die Anzahlen der beurteilten Zellen nach
den jeweiligen Kultivierungszeiten (0, 5, 26, 46, 72 und 94 h) Tab. 6 zu entnehmen
sind.
Tabelle 6: Anzahl der anhand des Chromatinstatus beurteilten Oozyten.
Maturationszeit
0 h
5 h
26 h
46 h
72 h
94 h
BM BM+U0126 BM+BMP6
117
137
146
138
119
98
120
115
131
189
-
-
4.1.1 Einfluss von U0126 auf die Kernreifung der Oozyten
117
119
125
113
98
91
Für diesen Versuchsteil wurden jeweils die Kernreifungsergebnisse zum Zeitpunkt
0, nach 5, 26 und 46 h IVM miteinander verglichen. Die detaillierten Ergebnisse
sind den Tab. 9 (s. 9.5) zu entnehmen. Als degenerierte Oozyten wurden
diejenigen bezeichnet, die eine ungeordnete Chromatinverteilung im Ooplasma
oder irreguläre, hyperkondensierte Chromatincluster aufwiesen. Eizellen, in deren
Ooplasma keine orceinpositiven Strukturen nachgewiesen werden konnten,
wurden gleichfalls als degeneriert eingeordnet. Die Oozyten, deren
58

Ergebnisse
Kernreifungsstatus als Germinalvesikel-Stadium I, II, III oder IV identifiziert werden
konnte, wurden für die Auswertung als GV-Stadium zusammengefasst. Für die
folgende grafisch dargestellte Auswertung (Abb. 7) wurden die Eizellen, die nach
dem GVBD die Chromatincluster der Diakinese (Di), Metaphase I (MI) bzw.
Anaphase I (AI) aufwiesen, ebenfalls zusammengefasst. Die Oozyten in der
Anaphase II (AII) und Teleophase II (TII) wurden ebenfalls gemeinsam gruppiert.
Kernreifungsstadium (%)
100
80
60
40
20
0
a a a a b a c a
0
+ U0126
5 26 46
GV Di/MI/AI/TI MII deg.
IVM (h)
Abbildung 7: Anteil (%) der Kernstadien nach 0, 5, 26 und 46 h IVM im BM
verglichen mit U0126 supplementiertem BM. Säulen mit unterschiedlichen
Buchstaben unterscheiden sich signifikant mit p

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Ergebnisse
Meiose fort, nach 46 h hatten 87,0 % die Metaphase II erreicht und das erste
Polkörperchen ausgeschleust. Zu allen Kultivierungszeitpunkten wiesen jeweils
unter 2 % der Eizellen degenerative Veränderungen auf.
4.1.2 Einfluss von BMP6 auf die Kernreifung der Oozyten
Für diese Untersuchung wurden die Kernreifungsstadien von Eizellen nach 0, 5,
26, 46, 72 und 94stündiger IVM im BM und BMP6 supplementiertem BM
untersucht und miteinander verglichen. Die detaillierten Ergebnisse sind Tab. 10
(s. 9.5) zu entnehmen. Die Verfahrensweise des Gruppierens der Meiosestadien
für die vergleichende Auswertung ist beibehalten worden.
Kernreifungsstadium (%)
a a a a b b c c d d d d
0 5 26 46 72 94 IVM (h)
GV
Di/MI/AI/TI
+ BMP6
AII/TII
deg.
Abbildung 8: Anteil (%) der Kernstadien nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h IVM im BM
verglichen mit BMP6 supplementiertem BM. Säulen mit unterschiedlichen
Buchstaben unterscheiden sich signifikant, p

Ergebnisse
In beiden Versuchsansätzen haben ca. 70% der Oozyten nach 26 h die Meiose
wieder aufgenommen, über 80 % erreichten nach 46 h das Stadium der
Metaphase II. Nach 72 und 94 h haben ca. 15 % die Meiose bis zur Ana- bzw.
Telophase II fortgesetzt. Während der gesamten IVM mit BMP6 zeigten sich
gegenüber der Maturation im BM nur geringfügige Unterschiede in der
Kernreifung, die zu keinem Zeitpunkt eine Signifikanz aufwiesen.
4.2 Kumuluszellexpansion im BM, BM+U0126 und im BM+BMP6
Die folgende Abbildung (Abb. 9) soll einen vergleichenden Überblick über die
Morpholgie der KOKs geben, mit dem Ziel, die Kumuluszellexpansion nach den
verschiedenen IVM-Zeiten qualitativ zu beurteilen. Nach 5 h Kultivierung der KOKs
zeigte sich in allen Medien kein Unterschied bezüglich der qualitativen Beurteilung
des Kumuluszellverbandes, die Zellen lagen als kompakte Zellmasse um die
Eizelle herum und zeigten nur teilweise eine geringfügige Auflockerung am
äußeren Rand des Cumulus oophorus. Nach 26 h konnte nach der Kultivierung im
BM und im BM+BMP6 eine deutliche Zunahme der Auflockerung der äußeren
Kumuluszellen beobachtet werden, die Corona radiata lag weiterhin als dichte
Zellschicht vor. Nach der IVM mit U0126 blieb diese Expansion der Kumuluszellen
aus. Nach 46 h konnte bei KOKs aus dem BM und BM+BMP6 eine vollständige
Auflockerung des Cumulus oophorus einschließlich der corona radiata festgestellt
werden. Mit U0126 hingegen war nur teilweise eine geringgradige Lockerung der
äußeren Zellen des Kumuluszellverbandes aufgefallen. Die KOKs lagen als dichte
Gruppe mit direktem Zellkontakt vor. Nach Verlängerung der Kultivierungszeit auf
72 bzw. 94 h konnte der fortschreitende Prozess der Kumuluszellauflockerung
beobachtet werden. Weiterhin kam es zu einer clusterartigen Anordnung einzelner
Kumuluszellgruppen. Beim Vergleich der IVM-Ansätze BM mit BM+BMP6 konnte
diesbezüglich kein Unterschied festgestellt werden.
61

62
0 h 5 h 26 h 46 h 72 h 94 h IVM
BM+ U0126
Abbildung 9: Stereomikroskopische Übersicht der KOKs nach IVM im BM, BM+U0126, BM+BMP6
nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h, 22,5-90fache Vergrößerung
BM
BM+BMP6
Ergebnisse

4.3 Hormonanalysen im Medium
4.3.1 17ß-Estradiolkonzentrationen (E2)
Ergebnisse
Die detaillierten Messwerte der E2-Konzentrationen sind Tab. 12 (s. 9.5) zu
entnehmen. Für die Auswertung (Abb. 10a+b) wurden jeweils die Hormonwerte
nach IVM im BM mit denen aus dem BM+U0126 und BM+BMP6 verglichen. Die
statistischen Untersuchungen beziehen sich zum Einen auf die Unterschiede in
dem jeweiligen Kultivierungsansatz und zum Anderen auf die Einflüsse der
Zusätze U0126 und BMP6 innerhalb der Zeitpunkte.
E2 im BM und der Einfluss von U0126
Während der Kultivierung im BM sezernierten die KOKs nach 5 h unter 2 ng/ml
17ß-Estradiol, nach 26 h zeigte sich eine signifikant erhöhte Hormonkonzentration,
die nach 46 h signifikant gehemmt wurde (p

17ß-Estradiol (ng/ml)
17ß-Estradiol (ng/ml)
14
12
10
8
6
4
2
0
14
12
10
8
6
4
2
0
a
a
Abbildung 10a
Abbildung 10b
BM
BM+BMP6
a
BM
BM+U0126
a
a
a
a
b
a
0 5 26 46
b
c
Ergebnisse
0 5 26 46 72 94 IVM (h)
Abbildungen 10a+b: E2-Werte in ng/ml im BM verglichen mit BM+U0126 nach 0, 5,
26 und 46 h (Abb. 10a) und verglichen mit BM+BMP6 nach 0, 5, 26, 46, 72 und
94 h (Abb. 10b). Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante
Unterschiede (p

4.3.2 Progesteronkonzentrationen (P4)
Ergebnisse
Die Ergebnisse der Konzentrationsmessungen von P4 im Medium nach der
jeweiligen Kultivierungszeit der KOKs sind Tab. 11 (s. 9.5) zu entnehmen. Für die
Auswertung (Abb. 11a+b) wurden jeweils die Hormonwerte nach IVM im BM mit
denen aus dem BM+U0126 und BM+BMP6 verglichen. Die statistischen
Untersuchen beziehen sich zum Einen auf die Unterschiede in dem jeweiligen
Kultivierungsansatz und zum Anderen auf die Einflüsse der Zusätze U0126 und
BMP6 innerhalb der Zeitpunkte.
P4 im BM und der Einfluss von U0126
Zunächst zeigten die Konzentrationsbestimmungen im BM eine geringe P4-
Sekretion (

3000
2500
2000
1500
BM
BM+BMP6
Ergebnisse
Die Ergebnisse der Untersuchungen auf Einflüsse durch U0126 und BMP6 auf die
P4-Konzentration sind in den folgenden Abbildungen dargestellt.
Progesteron (ng/ml)
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Abbildung 11a
Progesteron (ng/ml)
3500
1000
BM
BM+U0126
a a a a
0 5 26 46
500
0
a a
0
a a
5
a a
26 46 72 94 IVM (h)
Abbildung 11b
b
a
a
a
b
b
b
c
a
IVM (h)
Abbildungen 11a + b: P4-Werte in ng/ml im BM verglichen mit BM+U0126 (Abb.
11a) nach 0, 5, 26 und 46 h bzw. verglichen mit BM+BMP6 nach 0, 5, 26, 46, 72
und 94 h (Abb. 11b). Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante
Unterschiede (p

Ergebnisse
Während der IVM der KOKs konnte durch den MEK-Inhibitor U0126 die
Progesteronsekretion nach 46 h unterdückt werden. Eine Wirkung von BMP6 auf
die P4-Produktion blieb aus, lediglich nach 72 h zeigte sich eine erhöhte P4-
Konzentration im Medium.
4.4 RNA
4.4.1 RNA-Integrität
Die RNA-Qualität wurde anhand der 28S-RNA (5,0 kb) und der 18S-RNA (1,9 kb)
mittels denaturierender Gelelektrophorese beurteilt. Für weitere Untersuchungen
wurden nur Proben verwendet, bei denen das Vorhandensein beider
Untereinheiten nachgewiesen wurde. Außerdem wurden die Proben nicht weiter
verwendet, wenn sich eine Degradierung der RNA durch RNasen als breiter
„Schmier“ im kurzen Fragmentbereich darstellte oder genomische DNA als
Banden nahe der Auftragstelle auftraten. In Abbildung 12 ist ein Beispiel für intakte
RNA nach der Extraktion dargestellt.
Abbildung 12: Denaturierendes Agarosegel einer RNA-Extraktion von
Kumuluszellen nach IVM (0, 5, 26 und 46 h). Die 28S- und 18S-RNA-Banden sind
deutlich und mit gutem Kontrast ausgeprägt, es ist keine genomische DNA oder
degradierte RNA vorhanden, die extrahierte RNA ist intakt und von guter Qualität.
67

Ergebnisse
Zusätzlich wurde zur Überprüfung des Systems die RNA-Qualität stichprobenartig
untersucht, indem der Degradierungsgrad der RNA mit dem Agilent Bioanalyzer
2100 analysiert wurde.
Es wurde nur extrahierte RNA verwendet, die eine RIN (RNA integrity number)
von mindestens 7,5 aufwies und keine RNase-Degradierung zeigte. In Abbildung
13 ist ein Beispiel einer intakten RNA-Probe mittels Elektropherogramm
dargestellt.
Ladder
Abbildung 13: Elektropherogramm einer intakten Gesamt-RNA-Probe. Der linke
Peak stellt den Ladder dar, die Integrität der 18S-und 28S-RNA werden durch die
folgenden (gekennzeichneten) Peaks angezeigt.
4.4.2 RNA-Konzentration
18S
RIN: 9,2
In der vorliegenden Arbeit wurden die mRNA-Konzentrationen bestimmt, um
anschließend die geeignete Konzentration von mRNA für die Reverse
Transkription-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) zu ermitteln. Die Mittelwerte
der Gesamt-RNA Konzentrationen für jeweils 20 Oozyten betrug 11,67 µg/ml und
28S
68

Ergebnisse
für die dazugehörigen Kumuluszellverbände 82,42 µg/ml. Folgende RNA-Mengen
wurden in der RT-PCR eingesetzt.
Tabelle 7: Für die RT-PCR eingesetzte Gesamt-RNA-Mengen der beiden
Zelltypen (Kumuluszellen und Oozyten).
Zelltyp
Kumuluszellen
Oozyten
4.4.3 Identifikation der PCR-Produkte
Transkripte
GAPDH, StAR, CYP11A1,
CYP19A1, 3ß-HSD, BMP6
BMP6
cRNA in µg
Um eine semiquantitative Auswertung der mRNA-Level der zu untersuchenden
Gene durchführen zu können, muss die Spezifität der Primer und der PCR-
Amplifikate sicher gestellt sein. Dafür wurden 20 ng/µl PCR-Produkt an GATC
Biotech AG (Konstanz) versendet, dort aufgereinigt und einer Single Read
Sequenzanalyse unterzogen.
Nach der Sequenzierung der PCR-Produkte für GAPDH, StAR, CYP11A1,
CYP19A1, 3ß-HSD und BMP6 wurde ein Vergleich mit den jeweiligen in der
BLAST-Datenbank (NCBI) veröffentlichten kodierenden Gensequenzen
durchgeführt. Dieser Vergleich zeigte 98-100%ige Übereinstimmungen für die
gesuchten Gene. Die Abbildung 14 zeigt ein Sequenzierungsbeispiel mit guter
Qualität des PCR-Produktes und 98%iger Übereinstimmung mit der
veröffentlichten Gensequenz.
0,2
0,05
69

Ergebnisse
Abbildung 14: Sequenzierergebnis für den Sense Read von BMP6 (GATC Biotech
AG). Der Datenabgleich zeigte eine 98%ige Übereinstimmung der in NCBI
veröffentlichten Datenbank (NM_001168001.1, bone morphogenetic protein 6 [sus
scrofa]).
4.5 RT-PCR
Die Messergebnisse wurden, wie unter 3.6.8 beschrieben, ermittelt und anhand
der Transkriptions-Level von GAPDH standardisiert. Abbildung 15 zeigt eine
repräsentative Gelelektrophorese im 1%igen Agarosegel des housekeeping-Gens
GAPDH mit Ethidiumbromid markierten Banden unter UV-Licht.
Abbildung 15: Gelelektrophorese einer RT-PCR von GAPDH als house-keeping-
Gen. Als Proben dienten Kumuluszellen von KOKs nach Kultivierung von 0, 5, 26,
46, 72 und 94 h im BM. RNA-Proben, die Expressionsmuster in dieser Qualität
beim GAPDH zeigten, wurden für die weiteren RT-PCR-Analysen in dieser Arbeit
verwendet.
70

Ergebnisse
Im Folgenden werden die Ergebnisse der RT-PCR der mRNA der steroidalen
Gene grafisch dargestellt. Dabei wurden jeweils die Transkriptions-Level der
mRNA nach Kultivierung im BM mit BM+U0126 und mit BM+BMP6 verglichen. Die
statistischen Untersuchen beziehen sich zum Einen auf die Unterschiede im
zeitlichen Verlauf des jeweiligen Kultivierungsansatzes. Zum Anderen wurden die
Einflüsse der Zusätze U0126 und BMP6 untersucht, indem jeweils die Ergebnisse
nach gleicher Kultivierungszeit miteinander verglichen wurden.
4.5.1 StAR
Die Expressionsmuster der mRNA von StAR, welches Cholesterin von der inneren
zur äußeren mitochondrialen Membran transportiert, zeigten in allen
Kultivierungsansätzen einen kontinuierlichen Anstieg der Expression mit Zunahme
der Kultivierungszeit.
Im BM nahm die relative mRNA-Dichte der Kumuluszellen nach 26 h signifikant zu
und blieb bis zum Ende der IVM auf diesem erhöhten Niveau ohne weitere
statistische Relevanz. Beim Vergleich mit dem mit U0126 supplemetiertem
Medium zeigte sich zu keinem der Untersuchungszeitpunkte ein Unterschied.
Gleichermaßen konnte kein signifikanter Einfluss durch den Zusatz von BMP6 im
Medium nachgewiesen werden.
Zunächst ist jeweils ein exemplarisches 1%iges Agarosegel für jeden
Kultivierungsansatz nach Ethidiumbromidfärbung der RT-PCR-Produkte
dargestellt (Abb. 16), die der folgenden Auswertung zu Grunde lag.
71

elative Dichte x 10 3
300
250
200
150
100
50
0
Ergebnisse
Abbildung 16: 1%ige Agarosegele der gefärbten PCR-Transkripte von StAR in
Kumuluszellen aus den jeweiligen Kultivierungsansätzen BM, BM+U0126 und
BM+BMP 6 mit dazugehörigen Kultivierungszeiten.
Für die folgende Auswertung wurden jeweils die relativen Dichten der mRNA nach
IVM im BM mit denen aus dem BM+U0126 (Abb. 17) und BM+BMP6 (Abb. 18)
verglichen. Die statistische Auswertung bezieht sich auf die Unterschiede in dem
jeweiligen Kultivierungsansatz und auf die Einflüsse der Zusätze U0126 und
BMP6 innerhalb der Zeitpunkte.
a
BM
BM+U0126
a
a
a
0 5 26 46 IVM (h)
b
b b b
Abbildung 17: Relative Dichte der mRNA-Expression von StAR in Kumuluszellen
nach IVM der KOKs im BM verglichen mit BM+U0126 über 0, 5, 26 und 46 h.
Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede (p

elative Dichte x 10 3
300
250
200
150
100
50
0
a
BM
BM+BMP6
a
a a
b
b
bcd
Ergebnisse
0 5 26 46 72 94 IVM (h)
Abbildung 18: Relative Dichte der mRNA-Expression von StAR in Kumuluszellen
nach IVM der KOKs im BM verglichen mit BM+BMP6 über 0, 5, 26, 46, 72 und 94
h. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede innerhalb
des Ansatzes hin (p

350
300
250
200
150
100
50
0
Ergebnisse
konnte die Expression von CYP11A1-mRNA durch BMP6 signifikant gesteigert
werden (p

elative Dichte x 10 3
500
400
300
200
100
0
a
BM
BM+BMP6
a
a
b
a
b
0 5 26 46 72 94
a
b
a
b
a
Ergebnisse
b
IVM (h)
Abbildung 21: Relative Dichte der mRNA-Expression von CYP11A1 in
Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit BM+BMP6 über 0, 5, 26,
46, 72 und 94 h. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante
Unterschiede innerhalb des Ansatzes hin (p

Ergebnisse
Abbildung 22: 1%ige Agarosegele der gefärbten PCR-Transkripte von 3ß-HSD in
Kumuluszellen aus den jeweiligen Kultivierungsansätzen BM, BM+U0126 und
BM+BMP6 mit dazugehörigen Kultivierungszeiten.
relative Dichte x 10 3
300
250
200
150
100
50
0
a
0
BM
BM+U0126
a
5
a a
5
a
a
b
26 46
a
IVM (h)
Abbildung 23: Relative Dichte der mRNA-Expression von 3ß-HSD in
Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit BM+U0126 über 0, 5, 26
und 46 h. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede
innerhalb des Ansatzes hin (p

elative Dichte x 10 3
400
350
300
250
200
150
100
50
0
a
a
BM
BM+BMP6
a
a
a
ab
Ergebnisse
0 5 26 46 72 94 IVM (h)
Abbildung 24: Relative Dichte der mRNA-Expression von 3ß-HSD in
Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit BM+BMP6 über 0, 5, 26,
46, 72 und 94 h. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante
Unterschiede innerhalb des Ansatzes hin (p

Ergebnisse
der IVM nach 94 h wieder auf das 0 h-Niveau abzusinken. Es folgen Abbildungen
der Bandenmuster der RT-PCR (Abb. 25) und anschließend die Darstellung der
Ergebnisse (Abb. 26 u. 27).
Abbildung 25: 1%ige Agarosegele der gefärbten PCR-Transkripte von CYP19A1
in Kumuluszellen aus den jeweiligen Kultivierungsansätzen BM, BM+U0126 und
BM+BMP 6 mit dazugehörigen Kultivierungszeiten.
relative Dichte x 10 3
140
120
100
80
60
40
20
0
a
BM
BM+U0126
a
b
ab
0 5 26 46
a
c
b
a
bc
b
IVM (h)
Abbildung 26: Relative Dichte der mRNA-Expression von CYP19A1 in
Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit BM+U0126 über 0, 5, 26
und 46 h. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede
innerhalb des Ansatzes hin (p

elative Dichte x 10 3
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
a
BM
a
b
a
a
BM+BMP6
b
Ergebnisse
0 5 26 46 72 94 IVM (h)
Abbildung 27: Relative Dichte der mRNA-Expression von CYP19A1 in
Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit BM+BMP6 über 0, 5, 26,
46, 72 und 94 h. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante
Unterschiede innerhalb des Ansatzes hin (p

160
140
120
100
80
60
40
20
0
ac
b
0 5 26 46 IVM (h)
a
c
Ergebnisse
Abbildung 28: 1%ige Agarosegele der gefärbten PCR-Transkripte von BMP6 in
Kumuluszellen und Oozyten aus dem Kultivierungsansatz BM mit dazugehörigen
Kultivierungszeiten.
relative Dichte x 10 3
80
60
40
20
0
a
b
0 5 26 46 IVM (h)
Abbildung 29a (Kumuluszellen) Abbildung 29b (Oozyten)
relative Dichte x 10 3
Abbildung 29a+b: Relative Dichte der mRNA-Expression von BMP6 in
Kumuluszellen (a) und Oozyten (b) nach IVM der KOKs im BM nach 0, 5, 26 und
46 h. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede innerhalb
des Ansatzes hin (p

4.6 MAPK-Phosphorylierung in Kumuluszellen
Ergebnisse
Um einen möglichen Einfluss durch den MEK-Inhibitor U0126 oder durch BMP6
auf die Phosphorylierung der MAPK in den Kumuluszellen ermitteln zu können,
wurde das Phosphorylierungsmuster für die Kultivierungsansätze BM, BM+U0126
und BM+BMP6 untersucht. Dabei wurden, wie in Abbildung 6 beschrieben, die
Zeitpunkte 0, 5, 26 und 46 h der IVM gewählt. Für die Maturation mit BMP6 wurde
zusätzlich die Kultivierungszeit erhöht und Intensität der MAPK-Phosphorylierung
zu den Zeitpunkten 72 und 94 h analysiert.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein Antikörper verwendet, der beide Isoformen
der MAPK (MAPK 1 44 kDA, MAPK 2 42 kDa) erkennt. Für die Analyse der
relativen Dichte und somit der Analyse des Phosphorylierungsgrades wurden die
Ergebnisse der aktivierten MAPK 2 ausgewertet.
4.6.1 MAPK-Aktivität im BM und der Einfluss von U0126
Der Phosphorylierungsgrad der MAPK in porzinen Kumuluszellen war schon zum
Zeitpunkt 0 h relativ hoch und erreichte bereits nach 5 h sein Aktivitätsmaximum.
Im weiteren Verlauf der IVM sank die Aktivität und zum Ende der IVM nach 46 h
lag die MAPK fast vollständig dephosphoryliert vor.
Durch Zugabe des MEK-Inhibitors zum Kultivierungsmedium sollte eine Hemmung
der MAPK erzielt werden. Anhand der Ergebnisse wurde deutlich, dass die MAPK
in den ersten 5 Stunden fast vollständig desphoshoryliert vorlag, erst nach 26 h
konnte ein statistisch nicht relevanter Anstieg ermittelt werden. Nach 46 h
intensivierte sich der Phosphorylierungsgrad und erreicht signifikant die maximale
Aktivität der Untersuchungszeiträume.
Mit dem MEK-Inhibitor U0126 wurde die Aktivität der MAPK in den Kumuluszellen
innerhalb der ersten Hälfte der IVM (bis 26 h) gehemmt. Die Ergebnisse sind in
folgender Abbildung 31 dargestellt sowie zuvor jeweils ein repräsentativer
Westernblot nach der entsprechenden Kultivierungsmethode (Abb. 30).
81

Ergebnisse
Abbildung 30: Westernblots mit aufgetrennter p42- und p44-MAPK von
Kumuluszellen nach IVM im BM (links) und im BM+U0126 (rechts) nach 0, 5, 26
und 46 h.
relative Dichte x 10 3
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
a
BM
BM+U0126
b
a a
0 5 26 46 IVM (h)
Abbildung 31: Relative Dichte der MAPK-Phosphorylierung in Kumuluszellen nach
IVM der KOKs im Medium BM verglichen mit BM+U0126 nach 0, 5, 26 und 46 h.
Dargestellt sind die Mittelwerte ( x ) zu jedem Zeitpunkt mit angegebener
empirischer Standardabweichung (SD). Unterschiedliche Kleinbuchstaben über
den Säulen weisen auf signifikante Unterschiede innerhalb des Ansatzes hin
(p

4.6.2 Einfluss von BMP 6 auf die MAPK-Aktivität
Ergebnisse
Während der Kultivierung der KOKs mit dem Zusatz von BMP6 ließ sich ein
ähnlicher Verlauf der MAPK-Aktivität wie nach der Basiskultivierung erkennen.
Innerhalb der ersten Stunden bis zum Zeitpunkt 5 h erreichte die MAPK ihr
Aktivitätsmaximum, welches im weiteren Verlauf kontinuierlich abnahm. Auch
nach verlängerter Kultivierungszeit sank die Aktivität weiterhin ab, so dass am
Ende der IVM (94 h) die MAPK wie zum Zeitpunkt 0 h phosphoryliert vorlag.
Im Vergleich des Phosphorylierungsgrades der MAPK zwischen BM und BM mit
BMP6 konnte zu jedem Zeitpunkt durch BMP6 eine Erhöhung der Aktvität erzielt
werden, die sich jedoch nicht statistisch relevant auswirkte. Außerdem zeigte sich
tendenziell eine langsamere Abnahme der Aktivität der MAPK unter dem Einfluss
von BMP6. Es folgt eine Darstellung der Ergebnisse nach einem exemplarischen
Westernblot der Kumuluszellen nach IVM mit BMP6 (Abb. 32 u. 33).
Abbildung 32: Westernblots mit aufgetrennter p42- und p44-MAPK von
Kumulsuzellen nach IVM im BM+BMP6 nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h.
83

elative Dichte x 10 3
Ergebnisse
Abbildung 33: Relative Dichte der MAPK-Phosphorylierung in Kumuluszellen nach
IVM der KOKs im Medium BM verglichen mit BM+BMP6 nach 0, 5, 26 und 46 h
bzw. 72 und 94 h. Dargestellt sind die Mittelwerte ( x ) zu jedem Zeitpunkt mit
angegebener empirischer Standardabweichung (SD). Unterschiedliche
Kleinbuchstaben über den Säulen weisen auf signifikante Unterschiede innerhalb
des Ansatzes hin (p

5 Diskussion
Diskussion
Ziel dieser vorliegenden Arbeit war es, die Synthese der steroidalen Hormone in
den Kumuluszellen des Schweins näher zu untersuchen. Die Steroidgenese ist
von verschiedenen Regulationsmechanismen abhängig und beruht unter anderem
auf der bidirektionalen Kommunikation der Oozyte mit den sie umgebenden
Follikelzellen. Einer der signalvermittelnden Mechanismen innerhalb der Zelle
stellt die MAPK-Kaskade dar. Daher wurde in dieser Studie untersucht, ob diese
Proteinkinase-Kaskade einen Einfluss auf die Produktion von Progesteron und
17ß-Östradiol, verbunden mit der mRNA-Expression der dafür notwendigen
steroidalen Gene, hat.
Die Existenz von Faktoren, die vermutlich von der Eizelle selbst sezerniert
werden, führte in den letzten Jahren zu umfangreichen Untersuchungen bezüglich
des Einflusses dieser löslichen Faktoren auf die Follikelzellfunktionen. In dieser
Studie sollte BMP6 als ein möglicher OSF näher in seiner Funktion untersucht
werden. Dabei wurde analysiert, ob BMP6 auf die Steroidhormonproduktion wirkt
und ob diese MAPK-vermittelt abläuft.
5.1 Einfluss auf die Kernreifung
Im ersten Versuchsteil der vorliegenden Arbeit wurde der Kernreifungstatus der
Oozyten für jedes Kultivierungsmedium (BM, BM+U0126 und BM+BMP6) zu
jedem der Untersuchungszeitpunkte bestimmt. Während der Basiskultivierung
verblieben in den ersten 5 h über 95 % der Eizellen im GV-Stadium und zum Ende
der IVM (nach 46 h) hatte die Mehrheit (87 %) das befruchtungsfähige Stadium
der Metaphase II erreicht.
Wurde die MAPK-Kaskade mittels U0126 in den KOKs während der Kultivierung
gehemmt, konnte die Wiederaufnahme der Meiose vollständig verhindert werden.
Zu jedem Untersuchungszeitpunkt verblieben über 90 % der Eizellen im GV-
85

Diskussion
Stadium. Vor einigen Jahren wurde die enorme Bedeutung der MAPK für die
Maturation der Eizellen herausgestellt und gezeigt, dass ihre Aktivierung in den
Kumuluszellen und nicht in den Oozyten essentiell für den GVBD ist (SU et al.
2002, 2003; OHASHI et al. 2003). In der vorliegenden Studie wurde der
Hemmstoff U0126 dem gesamten Medium zugefügt, um die MAPK in den
Kumuluszellen zu inhibieren. Durch die dauerhafte Supplementation des Mediums
ist jedoch gleichzeitig von einer Hemmung der MAPK-Aktivität in den Eizellen
auszugehen. Anhand der Kernreifungsergebnisse (s. 4.1) und der fehlenden
Expansion des Cumulus oophorus (s. 4.2) über die gesamten
Kultivierungszeiträume mit U0126 können frühere Ergebnisse bestätigt werden
(KRISCHEK u. MEINECKE 2001; MEINECKE u. KRISCHEK 2002; EBELING et
al. 2007). Es gibt Resultate in Studien, die einen höheren Anteil an Eizellen
aufweisen, die trotz MAPK-Inhibition den GVBD durchlaufen. FAN et al. (2003)
zeigten bei gleicher U0126-Konzentration im Medium wie in dieser vorliegenden
Arbeit eine GVBD-Rate von 26,7 % (n=301). KAGII und Mitarbeiter (2000)
ermittelten sogar 41,5 % (n=212) Eizellen mit erfolgreichem GVBD mit einer
fünffach höheren Dosierung von U0126, als in den genannten Studien. Als
Ursache für die deutlichere Hemmung der Meiose in dieser Arbeit kommt die
Selektion der KOKs anhand der stereomikroskopisch erfassbaren Morphologie
des cumulus oophorus in Frage, da dieses Kriterium zu einem gewissen Teil der
subjektiven Einschätzung des Betrachters unterliegt. Die experimentellen
Bedingungen der Studien unterscheiden sich zusätzlich in der Zusammensetzung
des Sammelmediums der KOKs. In der vorliegenden Arbeit wurde bereits das
Sammelmedium der KOKs mit dem MEK-Inhibitor supplementiert. Da die MAPK
bereits nach halbstündiger Kultivierung der KOKs in den Kumuluszellen vermehrt
aktiviert vorliegt (EBELING et al. 2007), ist davon auszugehen, dass die spätere
Hemmung im Kultivierungsmedium der genannten Studien zum Teil eine
Initiierung der Meiose in den Oozyten zulässt.
Nach der Supplementation des Mediums mit BMP6 ergaben sich
Kernreifungsstadien, die denen der Eizellen der Basismaturation glichen. Zu
keinem der Kultivierungszeitpunkte wurde ein signifikanter Unterschied
86

Diskussion
festgestellt. Für die MAPK und das BMP6 wurde bisher vermutet, dass sie
ähnliche oder gleiche Effekte an der Oozyte hervorrufen, da die Hemmung der
MAPK in Granulosazellen zur Luteinisierungshemmung führte (MOORE et al.
2001; DEWI et al. 2002; TOSCA et al. 2005; SU et al. 2006; MIYOSHI et al. 2007)
und auch für das BMP6 ein Antiluteinisierungseffekt postuliert wurde (GLISTER et
al. 2004; BRANKIN et al. 2005a; MIYOSHI et al. 2007; OTSUKA et al. 2001b;
JUENGEL et al. 2006), wäre in den vorliegenden Eizellreifungsexperimenten auch
ein meioseinhibierender Einfluss auf die Kernreifung durch das zugesetzte BMP6
zu erwarten gewesen, denn eine Luteinisierungshemmung geht mit einer
Meiosehemmung einher. Soweit bisher bekannt, liegen keine weiteren
Kernreifungsanalysen von Oozyten nach BMP6-Supplementation vor, so dass ein
Vergleich nicht möglich ist. Die verlängerte Kultivierungszeit mit BMP6 (72 und
94 h) hatte ebenfalls keinen Einfluss auf den Kernreifungsstatus.
Auch die lichtmikroskopische Beurteilung der Kumuluszellexpansion im KOK-
Verband ließ keine Unterschiede im Vergleich mit den KOKs im BM erkennen,
d. h. der Cumulus oophorus einschließlich der Corona radiata war zum Ende der
IVM vollständig und gleichmäßig aufgelockert (s. 4.2).
ZHU et al. (2008) konnten mRNA von BMP6 in porzinen Oozyten und
Kumuluszellen nachweisen, die während eines Kultivierungszeitraumes von 44 h
stetig abnahm, wobei die Expression der BMP-Rezeptoren BMPRIA und BMPRIB
konstant blieb. Das Expressionsmuster der BMP6-mRNA glich dem der
vorliegenden Arbeit. Wenn exogen zugeführtes BMP6 einen Einfluss auf die
Kernreifung hätte, wäre dieser in der ersten Hälfte der IVM zu erwarten, da die
BMP6 Konzentration in einer Höhe im Medium vorlag, wie sie die Eizellen zu
diesem Zeitpunkt noch nicht hätten sezernieren können.
87

5.2 Zelleigenes BMP6 in den KOKs
Diskussion
Bevor in dieser Arbeit der Einfluss von BMP6 untersucht wurde, welches während
der IVM durch Supplementation des Mediums den KOKs zur Verfügung stand,
erfolgte die Analyse der zelleigenen mRNA-Expression dieses Proteins. Deshalb
wurden die Expressions-Level zum Einen in den Oozyten und zum Anderen in den
Kumuluszellen ermittelt. In beiden Zelltypen wurde BMP6-mRNA identifiziert und
gleichzeitig ein ähnliches Expressionsmuster festgestellt, bezogen auf den
zeitlichen Verlauf während der IVM. Es zeigte sich eine signifikante Steigerung der
mRNA-Expression zu Beginn der Kultivierung zwischen 0 und 5 h, die nach 26
und 46 h abnahm. Die Intensität der PCR-Transkripte zeigten in beiden Zelltypen
ähnliche Messwerte. Dabei muss jedoch berücksichtigt werden, dass für die RT-
PCR aus beiden Zelltypen unterschiedliche RNA-Mengen zur Verfügung standen.
Die RNA-Extraktion erfolgte jeweils aus 20 Oozyten und aus den dazugehörigen
Kumuluszellen (ca. 10.000 Zellen). Anhand der gemessenen RNA-
Konzentrationen wurde von den Kumuluszellen die 4fache Menge an Gesamt-
RNA (0,2 µg) für die RT-PCR eingesetzt. Wenn dieser Sachverhalt auf die BMP6-
mRNA-Expressionsergebnisse bezogen wird, kann von einer deutlich höheren
Menge an BMP6-mRNA in den Eizellen als in den Kumuluszellen ausgegangen
werden.
ZHU et al. (2008) ermittelten ebenfalls Expressionsmuster von BMP6, die
zwischen Ei- und Kumuluszellen im zeitlichen Verlauf kaum Unterschiede
aufwiesen. Es wurde eine maximale mRNA-Expression zum Zeitpunkt 0 h in
beiden Zelltypen ermittelt, die im Verlauf der Kultivierung kontinuierlich abnahm.
Im Unterschied dazu wurde in der eigenen Arbeit nach 5 h IVM die BMP6-mRNA
maximal exprimiert und nahm erst dann stetig ab. Diese differenten
Beobachtungen sind vermutlich dadurch zu erklären, dass sich zu Beginn der IVM
der Kernreifungsstatus der Oozyten unterschieden hat. Obwohl ZHU et al. (2008)
in ihren Untersuchungen Eizellen aus derselben Follikeldurchmesserklasse
(3-5 mm) wie in den vorliegenden Experimenten verwendeten, weisen eingehende
Studien auf die Heterogenität des Chromatinkondensationsgrades von Eizellen
88

Diskussion
aus gleich großen Follikeln hin. MOOR und DAI (2001) verglichen porzine
Oozyten im Dictyotän-Stadium und bezogen sich dabei auf Ergebnisse von
MOTLIK und FULKA (1976) sowie FUNAHASHI et al. (1997) und stellten
Differenzen innerhalb des Chromatinstatus der Oozyten fest. MOTLIK und FULKA
(1976) fanden bei 93 % (145/156) der Eizellen von adulten Schweinen nach
Zyklus-Synchronisation ein GV I-Stadium. Im Gegensatz dazu stellten
FUNAHASHI et al. (1997) bei Oozyten (n=72), die aus Schlachthofovarien
gewonnen wurden, lediglich bei 30 % ein intaktes GV I-Stadium fest. Der
überwiegende Teil der Oozyten (45 %) befand sich zum Zeitpunkt der Isolierung
aus den 3-5 mm großen Follikeln bereits im GV II-Stadium. Diese Beobachtungen
belegen die große Heterogenität der GV-Stadien, die bereits zu Beginn der IVM in
der selektierten Eizellgruppe vorhanden sein kann. Innerhalb der eigenen
Untersuchungen wiesen 78,6 % (n=117) der Oozyten ein GV I-Stadium auf.
Wenn man die stärkere Expression der BMP6-mRNA der Eizelle im Gegensatz
zur Kumuluszelle betrachtet, kann man auf eine vermehrte Sekretion des Proteins
der Oozyte schließen. Es stellt sich die Frage, durch welche Signalübertragung
diese Sekretion vermittelt wird. Da die MAPK in den Eizellen erst deutlich später
als in den Kumuluszellen aktiv wird (EBELING et al. 2007), kann spekuliert
werden, dass die BMP6-Sekretion durch die Oozyten selbst nicht MAPK-vermittelt
abläuft oder dass die Sekretion durch den aktivierten MAPK-Signalweg der
Kumuluszellen reguliert wird. Bisherige Untersuchungen lassen diese Frage offen,
da aufgrund der Ergebnisse von einer Beteiligung verschiedener Signalwege an
der BMP-Sekretion ausgegangen werden kann. INAGAKI et al. (2006) vermuteten
eine Beteiligung von BMP6 an der SMAD-Kaskade, jedoch mit zusätzlichem
Einfluss auf den MAPK-Signalweg in humanen Nebennierenzellen. Im Gegensatz
zu MIYOSHI et al. (2007) konnten BARNEDA-ZAHONERO et al. (2009) bei
Rattenkleinhirnzellen die MAPK-Kaskade als Regulator der BMP6-Aktivität
nachweisen. Die vorliegende Studie lässt die Frage unbeantwortet, welche
Signalvermittlung für die BMP6-Sekretion in den Eizellen verantwortlich ist, da der
Schwerpunkt der BMP6-Aktivität auf den Kumuluszellen lag. Jedoch kann eine
Beteiligung der MAPK in der Oozyte nicht ausgeschlossen werden.
89

5.3 Steroidhormongenese
5.3.1 Einfluss der MAPK
Diskussion
Die Hemmung der MAPK durch U0126 führte dazu, dass nach 46 h IVM die
Verringerung der E2-Sekretion verhindert wurde. Die P4-Produktion konnte durch
den MEK-Inhibitor in allen Untersuchuchungszeitpunkten am Ende der IVM nach
46 h (p

Diskussion
umfassend geklärt und führten in verschiedenen Untersuchungen zu
unterschiedlichen Ergebnissen. Die eigenen Arbeiten sollten zur Klärung dieses
Sachverhalts beitragen und umfassten daher Versuche zur Ermittlung des mRNA-
Expressionsverhaltens der Gene StAR, CYP11A1, CYP19A1 und 3ß-HSD. Da der
MAPK-Signalweg Einfluss auf die Synthese von E2 und P4 nimmt, sollte die
Hemmung des Signalweges zur Veränderung der Expression der genannten Gene
führen.
In der vorliegenden Studie führte die Hemmung der MAPK zu keinem Einfluss
bezüglich der mRNA-Expression von StAR und CYP11A1. Die Expression von
CYP19A1, welches unter anderem an der Synthese von Testosteron zu E2
beteiligt ist, konnte jedoch durch die MAPK-Inhibierung nach 26 und 46 h
signifikant gesteigert werden. Dieses Ergebnis unterstreicht die Resultate der
vorliegenden E2-Messungen im Medium. Die E2-Werte wiesen zwar erst zum
Zeitpunkt 46 h einen signifikanten Anstieg auf, jedoch ist dies mit dem Zeitfaktor
von der mRNA-Expression bis zur Produktsekretion zu erklären. Hinzu kommt,
dass die Hormonergebnisse nach 26 h eine große Standardabweichung
aufwiesen und die Streuung der Messwerte eine beginnende Synthesesteigerung
nicht ausschließen.
Ein ebenso deutliches Ergebnis zeigte sich bezüglich der 3ß-HSD-Expression. Die
MAPK-Inhibierung führte zu jedem Zeitpunkt zu einer signifikanten Unterdrückung
der mRNA-Expression. Auch hier korreliert das Expressionsverhalten von 3ß-HSD
mit den gesenkten P4-Werten nach der Verwendung von U0126.
Die eigenen Resultate der Steroidhormonanalyse und der Expressionsmuster der
mRNA der steroidalen Gene zeigten, dass der Wechsel von der Östradiol- zur
Progesterondominanz in den Kumuluszellen durch die Enzyme CYP19A1 und 3ß-
HSD, also in den finalen Syntheseschritten, reguliert wird. Auch wenn in dieser
Studie bestätigt werden konnte, dass die Regulation der steroidalen
Hormonsekretion MAPK-vermittelt abläuft, unterscheiden sich die Ergebnisse der
transkriptionellen Genaktivität der steroidalen Enzyme zu anderen Studien. So
kamen SU et al. (2006) und MOORE et al. (2001) zu dem gleichen Ergebnis, dass
die MAPK die P4-Produktion steigert und die E2-Sekretion vermindert, jedoch
91

Diskussion
schien in diesen Arbeiten die MAPK bereits die transkriptionelle Regulation von
StAR zu beinflussen. Der MEK-Inhibitor U0126 führte in beiden Studien zu einer
gehemmten Expression der mRNA dieses Enzyms. SU et al. (2006) erweitern die
Hypothese durch die Downregulation der mRNA von CYP11A1. Der fehlende
Einfluss der MAPK-Hemmung auf StAR und CYP11A1 in der eigenen Studie lässt
eine Beteiligung verschiedener Signalmoleküle sowie den darauf folgenden
Signalkaskaden vermuten. Eine intrazelluläre Beteilung der PKC wurde bereits
diskutiert (FIEDLER et al. 1999; FLORES et al. 1999; PESCADOR et al. 1999).
Weiterhin liegt die Vermutung nahe, dass verschiedene Stimuli zur Initiierung der
Steroidhormonsynthese in Frage kommen. Dabei wurden unter anderem
Synergismen zwischen hormonellen Komponenten wie LH, FSH, Insulin und
verschiedenen Wachstumsfaktoren diskutiert (SEKAR et al. 2000;
BALASUBRAMANIAN et al. 1997). Während der Maturation der KOKs in der
vorliegenden Studie wurden die Medien von Beginn an mit konstanter
Hormonkonzentration von LH, FSH und Insulin versehen. Die zugefügte
Proteinkomponente FKS beinhaltet Wachstumsfaktoren, die nicht definiert sind
und somit neben den Hormonen einen möglichen Einflussfaktor darstellen.
Da 3ß-HSD in vielfältigen Geweben enzymatisch aktiv zu sein scheint und in
mehreren Isoformen vorkommt (DEMOURA et al. 1997; LAVOIE und KING 2009),
sind vermutlich mehrere Signalmoleküle an der Regulation beteiligt. Aufgrund der
eigenen Ergebnisse kann davon ausgegangen werden, dass die Synthese von
Pregnenolon zu Progesteron durch 3ß-HSD in den Kumuluszellen MAPK-
vermittelt stattfindet, da deren Inaktivierung zur unterdrückten mRNA-Expression
mit gleichzeitig gehemmter P4-Sekretion führte.
Um eine erfolgreiche 17ß-Estradiol-Synthese zu gewährleisten, wird unter
anderem das Substrat Androstendion benötigt. Dieses Androgen wird jedoch nur
in den Thekazellen und nicht in den Granulosa- bzw. Kumuluszellen synthetisiert
(DAVISON u. BELL 2006; JAMNONGJIT u. HAMMES 2006). Da in den eigenen
Studien ausschließlich KOKs, also keine Thekazellen, kultiviert wurden, wurde das
Medium zusätzlich mit Androstendion supplementiert. Diese Gegebenheit könnte
die Ursache für den Einfluss der gehemmten MAPK zu einem relativ späten
92

Diskussion
Zeitpunkt der Steroidgenese sein, da durch die konstante Zufuhr des
Androstendions die Möglichkeit einer Beeinflussung in den vorherigen
Syntheseschritten ausbleibt. So zeigte sich unter dem U0126-Einfluss eine
gesteigerte CYP19A1-mRNA-Expression nach 26 und 46 h verbunden mit einer
erhöhten E2-Produktion.
Die Unterschiede oder auch Parallelen zwischen Granulosa- und Kumuluszellen
stellen bezüglich der Steroidgenese die interessanteste Diskussionsgrundlage dar.
SU et al. (2006) waren eine der wenigen Arbeitsgruppen, die KOKs und
Granulosazellen bezüglich ihrer steroidalen Hormonsynthese untersuchten. Dabei
verglichen sie die mRNA-Expression von StAR, CYP11A1 und CYP19A1 in den
verschiedenen Zelltypen und konnten keine bedeutenden Unterschiede
feststellen. Die mRNA-Level der StAR- und CYP11A1-Expression stiegen nach
48 h rasant auf ihr Maximum an. Diese Ergebnisse erscheinen zunächst
abweichend zur vorliegenden Arbeit. Es muss jedoch bedacht werden, dass der
Studie die Spezies Maus als Grundlage diente. Murine Eizellen reifen deutlich
schneller als z. B. porzine Oozyten, und erreichen bereits nach ca. 16 h IVM das
befuchtungsfähige Stadium der M II (SCHROEDER u. EPPIG 1984; HASHIMOTO
u. KISHIMOTO 1988). Die Kernreifungsergebnisse porziner Oozyten (4.1) wiesen
erst nach 46 h einen Anteil von 87 % der Zellen in der M II auf. Somit laufen
Vorgänge der steroidalen Genregulation zur Luteinisierung in murinen Zellen
ebenfalls schneller ab und führen zum rasanten P4-Anstieg. Die mRNA-Expression
von CYP19A1 scheint sich zwischen Kumuluszellen der Maus und des Schweins
nicht zu unterscheiden, ebenso wie die Tatsache, dass die MAPK an der
Regulation der Transkription beteiligt ist. SU und Mitarbeiter (2006) zeigten ein
ansteigendes Expressionslevel zwischen 4-8 h IVM passend zu dem signifikanten
Anstieg nach 5 h IVM in der eigenen Arbeit.
Auch wenn SU et al. (2006) in ihren Ergebnissen nur geringe Unterschiede
zwischen muralen Granuloszellen und Kumuluszellen zeigen konnten, sollte der
direktere Kontakt der Kumuluszellen mit der Eizelle gegenüber den
Granulosazellen mit größerem Abstand zur Oozyte in Betracht gezogen werden.
Dadurch stehen die Kumuluszellen durch bidirektionale Kommunikation direkt
93

Diskussion
unter den Einflüssen der Oozyte, die unter anderem über die OSFs ablaufen.
Unter diesen Einflüssen werden in den Kumuluszellen z. B. Vorgänge wie
Proliferation (GILCHRIST et al. 2001; GILCHRIST et al. 2003; GILCHRIST et al.
2004; GILCHRIST et al. 2006; GILCHRIST et al. 2008; GILCHRIST et al. 2011; LI
et al. 2000), Luteinisierung (EPPIG et al. 1997) und Expansion (BUCCIONE et al.
1990; VANDERHYDEN et al. 1990) über GDF9, BMP15 und andere OSFs
reguliert. Weiterhin zeigen Kumuluszellen funktionelle Unterschiede gegenüber
muralen Granuloszellen, in dem sie andere Genepressionsmuster im zellulären
Stoffwechsel aufweisen (EPPIG et al. 2005) und durch eine höhere
Proliferationsrate gekennzeichnet sind (EPPIG 2001). Ebenso wurden
Unterschiede in der Fähigkeit der Steroidhormonsynthese unter dem Einfluss der
OSFs postuliert (VANDERHYDEN u. TONARY 1995). In der Abhängigkeit von
vorhandenen LH-Rezeptoren produzieren Kumuluszellen zunächst nur E2 und kein
P4. Während der IVM porziner KOKs nach FSH-Stimulation konnte eine
gesteigerte mRNA-Expression verschiedener Isoformen des LH-Rezeptors nach
12 h Kultivierung (SHIMADA et al. 2003) und mit rasantem Anstieg nach 20 h
(OZAWA et al. 2008) bebachtet werden, wobei der Stimulus zur Rezeptorbildung
cAMP-abhängig vermittelt wird (PROCHÁZKA et al. 2009). Erst wenn genügend
LH-Rezeptoren vorhanden sind, ist LH in der Lage, die P4-Synthese einschließlich
der P4-Rezeptorbildung zu induzieren (SHIMADA u. TERADA 2002) und die
CYP19A1-mRNA-Expression zu drosseln (FITZPATRICK et al. 1997, RICHARDS
1994).
Der luteinierungshemmende Einfluss der MAPK in KOKs bleibt auch nach der
vorliegenden Studie unbestritten, jedoch kann dieser Einfluss nicht allein auf die
Kumuluszellen fokussiert werden. Da die Kultivierungen mit KOKs als
Zellverbände durchgeführt wurden und somit die Phosphorylierung der MAPK in
beiden Zelltypen verhindert wurde, muss der gehemmte Einfluss in den Oozyten
berücksichtigt werden. Dies könnte bedeuten, dass die durch U0126 gehemmte
MAPK in den Kumuluszellen die Wiederaufnahme der Meiose in den Eizellen
verhindert wird. Dies führt dazu, dass der Einfluss der Eizelle mit ihrer OSF-
Sekretion auf die Kumuluszellen fehlt und dies eine veränderte
94

Diskussion
Steroidhormonsynthese zur Folge hat. Dafür ist es notwendig, die Wirkungsweisen
der verschiedenen OSFs auf die Steroidhormonsynthese näher zu untersuchen,
wobei die möglichen Veränderungen während der Eizellreifung einen wichtigen
Aspekt darstellen sollten.
Zusammenfassend wurde in der vorliegenden experimentellen Studie gezeigt,
dass die MAPK-Kaskade an der Synthese der steroidalen Hormone in porzinen
Kumuluszellen beteiligt ist. Durch die MAPK scheint die enzymatische Aktivität von
CYP19A1 gehemmt und von 3ß-HSD gesteigert zu werden. Diese transkriptionelle
Regulation erklärt den Wechsel von der E2- zur P4-Dominanz. Die MAPK kann
somit als Luteinisierungsfaktor betrachtet werden.
5.3.2 Einfluss des BMP6
Beim Vergleich der Hormonkonzentrationen von E2 und P4 der KOKs mit dem
Zusatz von BMP6 während der IVM mit denen nach der Basiskultivierung ergaben
sich in den ursprünglich gewählten Kultivierungszeitpunkten 0, 5, 26 und 46 h
keine Unterschiede. Analog dazu wiesen die mRNA-Expressionsmuster der
steroidalen Gene keine Veränderung auf. Lediglich zum Zeitpunkt 46 h wurde die
CYP11A1-Expression gesteigert. CYP19A1-mRNA wurde zum Zeitpunkt 0 h
vermehrt exprimiert, dabei kann jedoch nicht von einem Einfluss des BMP6
ausgegangen werden. Dieser Zeitpunkt repräsentiert die Kumuluszellen aus dem
KOK-Verband nach direkter Isolation aus den Follikeln, ohne das eine Kultivierung
erfolgte. In anderen Studien mit Granulosazellen (Rind: GLISTER et al. 2004;
Schwein: BRANKIN et al. 2005a; MIYOSHI et al. 2007; Ratte: OTSUKA et al.
2001b; Schaf: JUENGEL et al. 2006) wurde die Luteinisierungshemmung durch
exogenes BMP6 anhand der verringerten P4-Sekretion und teilweise durch die
verminderte mRNA-Expression von StAR, 3ß-HSD oder CYP11A1 demonstriert.
BRANKIN et al. (2005b) zeigten die antiluteale Wirkung des BMP6 in Thekazellen,
wohingegen GLISTER et al. (2005) nur einen moderaten Effekt in der gleichen
95

Diskussion
Zellart festellten. Der fehlende Einfluss des BMP6 in der eigenen Arbeit führte zu
der Hypothese, dass der luteinsierungshemmende Effekt dieses Faktors zu einem
späteren Zeitpunkt einsetzen könnte. Dafür wurden die Kultivierungszeiträume
verlängert und als Zeitpunkte 72 und 94 h gewählt. Die Hormonmessungen
ergaben zwar eine erhöhe P4-Konzentration nach 72 h, die jedoch nach 94 h IVM
absank. Auch im Expressionsverhalten der mRNA von StAR, CYP11A1 und
CYP19A1 konnten keine Unterschiede gezeigt werden. Lediglich 3ß-HSD wurde
nach 94 h weniger exprimiert, wobei sich aber eine hohe Standardabweichung
darstellte. Die verlängerte Kultivierungszeit mit BMP6 führte in den eigenen
Experimenten zu keiner bedeutenden Veränderung der Steroidhormonsynthese.
Dieser fehlende luteinisierungshemmende Effekt des BMP6 in den Kumuluszellen
lässt sich durch den Unterschied des Zelltyps erklären. Kumuluszellen
unterscheiden sich durch ihren direkten Kontakt zur Eizelle zu den
Granulosazellen und werden dadurch von den sezernierten Faktoren, den OSFs,
der Oozyte intensiver beeinflusst (EPPIG et al. 1997; EPPIG 2001). Die
Unterschiede der beiden Zelltypen werden in ihren Funktionen deutlich. Die
Granulosazellen sind charakterisiert durch eine niedrigere Proliferationsrate, eine
höhere Synthesekapazität und eine höhere Expression von LH-Rezeptoren
(RICHARDS et al. 1976; RICHARDS 1994). Beide Zelltypen sind von ausreichend
FSH abhängig sind, um LH-Rezeptoren zu exprimieren (SHIMADA u. TERADA
2002).
Während der IVM der KOKs produzieren Granulosazellen P4, Kumuluszellen
hingegen synthetisieren E2. In den genannten Studien, in denen die P4-Produktion
durch exogenes BMP6 gesenkt wurde, verwendete man teilweise
Granulosazellkulturen, in denen eine Langzeitkultivierung zur Monolayerbildung
notwendig war. Das bedeutet, diesen adhärenten Zellen fehlt während der realtiv
langen Kultivierung die antiluteinisierende Wirkung der Oozyte, so dass die P4-
Produktion schon verstärkt stattfinden konnte, bevor exogenes BMP6 oder die
Eizellen Einfluss nehmen konnten. Die Studie von SU und Mitarbeitern (2006)
unterstreicht diese Hypothese, da die Kumuluszellen, die zusammen mit Oozyten
kultiviert wurden, lange nach dem Erreichen der Metaphase II eine verstärkte
96

Diskussion
StAR- und CYP11A1-Expression aufwiesen. Die vorliegende Arbeit zeigte, dass
trotz verlängerter Kultivierungszeit der KOKs BMP6 nicht antiluteinisierend wirkte,
wobei eine der Ursachen die permanente Anwesenheit der Eizellen sein könnte.
Neueste Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe belegten, dass eine Kultvierung
von porzinen Kumuluszellkomlpexen ohne Oozyten zu einer verminderten E2-
Sekretion nach 26 und 46 h führte. Nachdem den Kumuluszellen BMP6 zugefügt
wurde, sezernierten die Zellkomplexe E2 in gleicher Höhe wie KOKs. BMP6 gleicht
demnach teilweise den Effekt der Eizelle aus, in dem die vorzeitige Luteinisierung
über den E2- und nicht über den P4-Weg verhindert wird (EBELING et al. 2011).
Auch in dieser Studie unterstreicht der fehlende Einfluss bezüglich der P4-
Synthese die genannte Hypothese der verstärkten P4-Produktion in Langzeit-
Granulosazellkulturen.
Aus den eigenen Befunden geht hervor, dass die zelleigene BMP6-Synthese in
der Eizelle zum Ende der IVM nach 46 h abnimmt. Jedoch kann vermutet werden,
dass BMP6 und andere OSFs in vivo in der Follikelflüssigkeit oder in vitro
zusätzlich im FKS während der Maturation präsent und antiluteal wirksam sind.
VANDERHYDEN und MACDONALD (1998) gehen davon aus, dass Follikelzellen
ihre Sensitivität gegenüber den OSFs ändern und dadurch die Steroidgenese
regulieren, indem die Zellen P4 sezernieren.
Hinzu kommt vermutlich eine speziesspezifische Expression der OSFs
einschließlich des BMP6 in den verschiedenen Follikelzellen. PARADIS et al.
(2009) wiesen BMP6-mRNA in porzinen Granulosa-, Theka- und Eizellen nach,
wohingegen JUENGEL et al. (2006) lediglich die Expression in den Oozyten des
Schafes zeigten.
Es ist bisher unzureichend geklärt, welche parakrinen Faktoren der Eizellen an der
Steroidhormongenese beteiligt sind. Es kann jedoch von einem komplexen
Netzwerk aus Regulationsmechanismen ausgegangen werden, in dem eine
gegenseitige Beeinflussung der verschiedenen OSFs vermutet werden kann.
SOLLOWAY et al. (1998) postulierten bereits eine Kompensation durch BMP2 auf
einen BMP6-Mangel.
97

5.3.3 BMP6 und der MAPK-Signalweg
Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurde die MAPK-Phosphorylierung in porzinen
Kumuluszellen untersucht, nachdem die KOKs im BM kultiviert wurden. Die
Versuche wurden ebenfalls durchgeführt, nachdem die MAPK mittels MEK-
Inhibitor U0126 gehemmt wurde. Um zu analysieren, ob BMP6 einen Einfluss auf
die MAPK-Aktivität hat, erfolgte die Bestimmung des Phosphorylierungsgrades der
MAPK in den Kumuluszellen nach Kultivierung mit BMP6.
Nach der Basiskultivierung war die MAPK in den ersten Stunden der IVM vermehrt
aktiviert und wies zum Untersuchungszeitpunkt 5 h ihr Maximum auf. Im weiteren
Verlauf und bis zum Ende der IVM nach 46 h nahm die MAPK-Aktivität stetig ab.
Durch die Inhibierung mit U0126 wurde die MAPK-Phosphorylierung in der ersten
Hälfte der IVM (bis 26 h) vollständig verhindert und zwischen 26 und 46 h
verzögert aktiviert. In vorherigen Studien unserer Arbeitsgruppe wurde gezeigt,
dass die MAPK in den Oozyten deutlich später
(26 h), zum Zeitpunkt um den GVBD herum, aktiviert wird und ihr Maximum erst
zum Ende der IVM, zum Zeitpunkt der Metaphase II, erreicht (EBELING et al.
2007).
Somit konnten die zahlreichen Studien zusammen mit den vorliegenden
Ergebnissen der Kernreifungsanalysen (4.1.1) sowie mit der Analyse der MAPK-
Phosphorylierung (4.6.1) die essentielle Bedeutung der MAPK in den
Kumuluszellen für die Auslösung des GVBD bestätigt werden (Fan u. SUN 2004,
SU et al. 2002, 2003; OHASHI et al. 2003, INOUE et al. 1995, 1998).
Während der Kultivierung der KOKs mit exogenem BMP6 wurde in allen
Untersuchungszeitpunkten eine geringe Erhöhung des Phosphorylierungsgrades
der MAPK ermittelt, die jedoch ohne statistische Relevanz blieb. Die Hemmung
der MAPK scheint jedoch in anderen Studien die gleiche Wirkung wie BMP6
innerhalb der Steroidhormonsynthese zu haben, zum Einen die E2-Synthese zu
steigern und zum Anderen die P4-Produktion zu hemmen (MOORE et al. 2001;
TOSCA et al. 2005; SU et al. 2006; MIYOSHI et al. 2007).
98

Diskussion
Auch wenn in verschiedenen Zellarten die MAPK-Beteiligung an der BMP6-
Aktivität gezeigt wurde (Nebeniere: INAGAKI et al. 2006; Kleinhirn: BARNEDA-
ZAHONERO et al. 2009), sollten mögliche Interaktionen der verschiedenen
Signalkaskaden in Betracht gezogen werden. Oft wird die Beteiligung des SMAD-
1/5-8-Signalweges postuliert (GLISTER et al. 2004; HUSSEIN et al. 2005).
KRAUNZ et al. (2005) vermuten neben der Aktivierung gleichzeitig eine
Deaktivierung des SMAD-Signalweges durch die Ras/MAP-Kinase in
Lungenkrebszellen. Am Eisenstoffwechsel der Maus scheint ebenfalls ein BMP6-
regulierter SMAD-Weg beteiligt zu sein (CORRADINI et al. 2011). Weiterhin spielt
scheinbar die p38MAPK-signalvermittelte Aktivierung in Brustkrebszellen eine
Rolle (DU et al. 2008; VALERA et al. 2010). Ein zellartspezifischer Einfluss auf die
Interaktion der signalvermittelnden Mechanismen lässt sich zusätzlich vermuten.
Anhand den Ergebnisse der vorliegenden In-vitro-Studie liegt die Vermutung nahe,
dass BMP6 keinen Einfluss auf die MAPK-vermittelte Regulation der
Steroidhormongenese in porzinen Kumuluszellen hat. Jüngste Ergebnisse unserer
Arbeitsgruppe zeigten, dass die Oozyte an der MAPK-Regulation in den
Kumuluszellen beteiligt ist, da die Phosphorylierung nach 46 h in kultivierten
Kumuluszellen ohne Oozyten höher war, als in Kumuluszellen die im Verband mit
Eizellen kultiviert wurden. Dieser Einfluss war jedoch BMP6-unabhängig
(EBELING et al. 2011).
Nach der Auswertung der vorliegenden Ergebnisse und der neuesten Studie von
EBELING et al. (2011) kommt BMP6 nach wie vor als möglicher OSF in Frage, der
an der Verhinderung der vorzeitigen Luteinisierung beteiligt ist. Der Einfluss der
BMP6-Aktivität auf die Steroidhormonsynthese scheint nicht MAPK-vermittelt
abzulaufen und muss als komplexes Zusammenspiel mit anderen OSFs betrachtet
werden.
99

5.4 Methodische Aspekte
Diskussion
In-vitro-Studien benötigen stets eine kritische Betrachtung der
Kultivierungsbedingungen. In der vorliegenden Arbeit wurde das Medium (TCM
199) der KOKs mit Hormonen wie LH, FSH und Androstendion supplementiert und
enthielten als Proteinkomponente 20 % Fetales Kälberserum (FKS). Die
Kernreifungsergebnisse (4.1) sowie die Vitalfärbung der Kumuluszellen (3.3)
wiesen auf gute Reifungsbedingungen hin und lassen eine ausreichende
Versorgung der Zellen zum Wachstum und zur Ernährung schließen. Die
Proteinkomponente FKS ist jedoch in ihrer Zusammensetzung nicht genau
definiert. Sie enthält zahlreiche Wachstumsfaktoren und hormonelle
Komponenten, die den Versuchsverlauf zusätzlich beeinflussen. Deshalb wurden
in allen Versuchsteilen jeweils Bestimmungen bzw. Messungen mit Proben zum
Zeitpunkt 0 h durchgeführt. Das heißt, die Hormonmessungen erfolgten in Medien
ohne kultivierte KOKs und die proteinchemischen Analsyen wurden mit
Kumuluszellen nach direkter Isolation der KOKs aus den Follikeln durchgeführt.
Ebenso wurde die mRNA von Zellen, die nicht kultiviert wurden, amplifiziert. Somit
lagen von jedem Versuch Ausgangsergebnisse vor, die eine quantitative Analyse
nach 5, 26, 46, 72 bzw. 94 h erlaubte.
In zahlreichen aktuellen Studien, in denen quantitative Analysen zur
Genexpression die experimentelle Grundlage darstellen, wird die Methode der
real-time PCR angewendet. Im Gegensatz zur RT-PCR bietet diese
kostenintensivere Technik Vorteile in der Dynamik und Präzision der Messungen
und liefert in kürzester Zeit Ergebnisse. Bei der Durchführung der RT-PCR gibt es
mögliche Schwankungsbreiten beim Zufügen von z. B. Puffern in die
Reaktionsgemische oder beim Auftragen der Reaktionsprodukte auf das
Agarosegel. Es bleibt jedoch unbestritten, dass in beiden Methoden
gleichermaßen ein Maß an Geschicklichkeit und Erfahrung notwendig ist. In dieser
Arbeit wurden alle RT-PCR-Analysen unter gleichbleibenden Bedingungen von
einer Person durchgeführt, um diese Variable möglichst gering zu halten. GÁL et
al. (2006) verglichen Ergebnisse beider PCR-Varianten und stellten heraus, dass
100

Diskussion
vielmehr die biologischen Unterschiede in den templates als in die PCR-Methodik
selbst zu unterschiedlichen Resultaten führen. Die Wissenschaftler betrachten die
real-time PCR als eine bevorzugte Methode für Analysen von äußerst kleinen
Proben, z. B. einzelne Eizellen oder Präimplantationsembryonen. Die RNA-
Konzentrationen der Proben in der vorliegenden Studie waren auf Grund der
Zellmengen (20 Oozyten und die dazugehörigen Kumuluszellverbände) eher als
hoch zu bewerten.
Die Methode der real-time PCR liefert als Ergebnisse exakte Angaben über die
Transkriptmengen, wohingegen die Produkte der RT-PCR mittels Software
anhand ihrer relativen Dichte mengenanalytisch ermittelt werden. In der
vorliegenden Arbeit wurden Analysen zum Verlauf der mRNA-Expression über
verschiedene Kultivierungszeiträume durchgeführt, so dass die semi-quantitative
Auswertung der PCR-Transkripten genügend Aussagekraft hatte und eine exakte
Messung der Transkriptmenge nicht nötig war.
Einen wichtigen methodischen Aspekt zur Bewertung der Ergebnisse stellen die
unterschiedlichen Darstellungs- und Auswertungsweisen der PCR-Ergebnisse in
zahlreichen Studien dar. Laut BUSTIN (2010) und BUSTIN et al. (2009) existieren
erhebliche Mängel in der Darstellung der experimentellen Details in den
Publikationen, die zu falschen Interpretationen der Ergebnisse führen. Die
Forscher fordern standardisierte Richtlinien, die dem Leser ermöglichen,
Ergebnisse kritscher zu bewerten und Experimente zu reproduzieren.
5.5 Ausblick
Aufgrund des fehlenden Einflusses von BMP6 auf die Steroidhormongenese in
porzinen Kumuluszellen und die scheinbar nicht MAPK-vermittelte Aktivität dieses
Proteins wurden verschiedene Gründe diskutiert. Aus den Aspekten der
Diskussion ergeben sich einige neue Arbeitshypothesen.
101

Diskussion
Zunächst sollte die zelleigene BMP6-Sekretion detaillierter untersucht und
quantifiziert werden. Es konnte BMP6-mRNA in beiden Zelltypen (Oozyten und
Kumulszellen) nachgewiesen werden, jedoch bleibt ungeklärt, ob dieser Faktor
ausschließlich von den Eizellen sezerniert wird. Demnach sollte eine Bestimmung
dieses Proteins im Maturationsmedium erfolgen, in denen Eizellen und
Kumuluszellen getrennt voneinander kultiviert werden. Dabei muss berücksichtigt
werden, dass Follikelfüssigkeit oder andere Proteinkomponenten z. B. FKS diesen
Faktor neben anderen OSFs enthalten kann.
Weiterhin wirft trotz zahlreicher Studien das komplexe System der OSFs viele
Fragen auf. Es ist nicht geklärt, welche der Faktoren an der Steroidhormongenese
beteiligt sind. In der vorliegenden Arbeit wurden die Kumuluszellen unter
permanenter Anwesenheit der Eizellen kultiviert, so dass andere von der Eizelle
sezernierte Faktoren Einfluss auf die Steroidhormonsynthese gehabt haben
könnten und das exogen zugeführte BMP6 keine Auswirkung hatte. Es sind
demnach Untersuchungen nötig, in denen mögliche kompensatorische Einflüsse
durch andere OSFs aufgezeigt werden.
Die vorliegenden Ergebnisse führen zu dem Schluss, dass die MAPK-Aktivität
nicht durch BMP6 reguliert oder beeinflusst wird. Jedoch sollten diese Resultate
nicht als ausreichend bewertet werden. Es wäre sinnvoll, die MAPK selektiv in
beiden Zelltypen (Eizelle und Kumuluszellen) zu hemmen und beide Zellarten
getrennt und unter dem Einfluss von BMP6 zu kultivieren. Dadurch wäre
ausgeschlossen, dass die MAPK-Phosphorylierung der einen Zellart die der
anderen beeinflusst und ein möglicher regulatorischer Einfluss des BMP6 wäre
erkennbar.
Zusätzlich sollten andere Signalübertragungswege wie z. B. der SMAD-Weg als
Untersuchungsgrundlage dienen, da Studien dessen Beteiligung an zellulären
Prozessen in verschieden Spezies gezeigt haben. Ebenso sind Interaktionen der
unterschiedlichen Signalübertragungswege wahrscheinlich.
102

6 Zusammenfassung
Dagmar Töpfer
Zusammenfassung
Die Abhängigkeit der Steroidhormonsynthese in porzinen Kumuluszellen
von der MAPK (mitogen-activated protein kinase) und dem BMP6 (bone
morphogenetic protein 6)
Steroidhormone im Follikel sind essentiell für die optimale Entwicklung von
befruchtungsfähigen Eizellen. Einen der wichtigsten Signaltransduktionswege
während der Eizellreifung stellt die MAPK-Kaskade (mitogen-activated protein
kinase-Kaskade) dar. In der vorliegenden In-vitro-Studie wurde untersucht,
welchen Einfluss die MAPK auf die Steroidhormonsynthese in porzinen
Kumuluszellen hat. Dafür wurden Kumulus-Oozyten-Komplexe aus Ovarien von
Schlachtschweinen isoliert und über verschiedene Zeiträume in einem
Basismedium kultiviert. Um die sezernierten Steroidhormone quantitativ zu
charakterisieren, wurden mittels Radioimmunoassay die 17ß-Estradiol (E2)- und
Progesteron (P4)-Konzentrationen ermittelt. Neben diesen beiden
Steroidhormonen erfolgte die Analyse der mRNA-Expressionsmuster
ausgewählter Enzyme des Steroidhormon-Biosynthesewegs in den Kumuluszellen
mit Hilfe der RT-PCR (Reverse Transkriptase-polymerase chain reaction). Mittels
Immunoblot wurde der Phosphorylierungsgrad der MAPK in den Kumuluszellen
untersucht.
Um den Einfluss der MAPK auf die Steroidhormonsynthese zu charakterisieren,
wurde dem Basismedium der MEK-Inhibitor U0126 zugefügt und dadurch die
Aktivierung der MAPK verhindert. Dadurch konnte zunächst die Hemmung der
Wiederaufnahme der Meiose in den Oozyten und das Ausbleiben der Expansion
des cumulus oophorus gezeigt und damit frühere Experimentalstudien
reproduziert werden. Die Hormonanalysen nach der Hemmung der MAPK zeigten
eine deutliche P4-Hemmung mit einhergehender gesteigerter E2-Sekretion am
103

Zusammenfassung
Ende der IVM nach 46 h. Der Transport von Cholesterin zur inneren
Mitochochondrien-membran und die folgende Synthese zu Pregnenolon wird
vermutlich nicht von der MAPK beeinflusst, da das Expressionverhalten von StAR
(steroidogenic acute regulatory protein) und CYP11A1 (P450scc oder side chain
cleavage-enzyme) keine Veränderungen aufwies. Vielmehr konnte gezeigt
werden, dass die MAPK wesentlich an der Steigerung der CYP19A1 (Cytochrom
P450-Aromatase)-
und Reduktion der 3ß-HSD (3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase)-Expression
regulatorisch beteiligt ist und auf diesem Weg den Wechsel von der Östradiol- zur
Progesterondominanz steuert.
Von der Eizelle sezernierte Faktoren (oocyte secreted factors, OSFs) sind an
wichtigen zellulären Prozessen im Follikel beteiligt. Unter anderem wurde von
einem OSF, dem BMP6 (bone morphogenetic protein 6), die mögliche
luteinisierungshemmende Wirkung, ähnlich wie die der deaktivierten MAPK,
postuliert. Bisherige Untersuchungen wurden überwiegend mit
Granulosazellkulturen durchgeführt. Daher wurde in der vorliegenden Studie
analysiert, ob durch zugeführtes BMP6 ein Einfluss auf die Steroidhormongenese
in Kumuluszellen hervorgerufen werden kann. Gleichzeitig wurde anhand des
Phosphorylierungsgrades untersucht, ob die BMP6-Aktivität über den MAPK-
Signalweg vermittelt wird. Die mRNA von BMP6 konnte sowohl in Oozyten, als
auch in Kumuluszellen nachgewiesen werden. Die Kernreifung der Eizellen und
die Kumuluszellexpansion zeigten durch die Zugabe von BMP6 zum
Maturationsmedium keine Veränderungen. Die Hormonanalysen und RT-PCR-
Ergebnisse der steroidalen Enzyme ließen gleichermaßen erkennen, dass mit
dem vorliegenden Versuchsdesign ein BMP6-Einfluss ausblieb. Die MAPK-
Aktivität in den Kumuluszellen wurde ebenfalls nicht beeinflusst.
BMP6 kommt nach wie vor als potentieller OSF in Frage, wobei die Aktiviät dieses
Proteins in porzinen Kumuluszellen MAPK-unabhängig reguliert zu sein scheint.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bieten vielfältige Untersuchungsansätze,
da die Frage nach einer möglichen luteinisierungshemmenden Wirkung noch nicht
abschließend beantwortet werden kann. Hinzu kommt, dass trotz zahlreicher
104

Zusammenfassung
Resultate aus Studien über OSFs die Funktionen und Regulationsmechanismen
nach wie vor unklar sind und weiteren Forschungsbedarf darstellen.
105

7 Summary
Dagmar Töpfer
Summary
The dependence of the steroid hormone synthesis in porcine cumulus cells
of the MAPK (mitogen-activated protein kinase) activation and BMP6 (bone
morphogenetic protein 6)
Steroid hormones in the follicle are essential for follicular development and
successful fertilization. One of the most important signal transduction pathways
during oocyte maturation is the MAPK cascade (mitogen-activated protein kinase).
Therefore, the influence of MAPK inhibition on steroid hormone synthesis in
cumulus cells during in vitro maturation (IVM) was examined.
Porcine cumulus oocyte complexes were isolated from ovaries of slaughtered pigs
and matured in vitro with and without the MAPK inhibitor U0126 for various
periods. To characterise the hormone secretion of the cumulus cells, the
concentrations of 17ß-estradiol (E2) and progesterone (P4) were determined by
radioimmunoassays. In addition, the mRNA expression of selected steroidogenic
enzymes were analysed by RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain
reaction). Furthermore, MAPK activation was examined using an immunoblot.
During the overall culture period, U0126 caused a complete inhibition of nuclear
maturation as well as no cumulus expansion occurred. Under the influence of the
inhibitor the P4 secretion was nearly completely inhibited and the E2 secretion
increased progressively until the end of IVM. The transport of cholesterol to the
inner mitochondrial membrane and the following synthesis of pregnenolone is not
affected by the MAPK inhibition, because the expression of StAR (steroidogenic
acute regulatory protein) and CYP11A1 (side-chain cleavage enzyme) showed no
differences. However, MAPK inhibition increased the mRNA levels of CYP19A1
(cytochrome P450 aromatase) and reduced the mRNA expression of 3ß-HSD (3ß-
106

Summary
hydroxysteroid-dehydrogenase). It could be hypothesized that MAPK activation
participates in the physiological alteration from initial E2 synthesis to dominant P4
production of porcine cumulus cells.
Oocyte secreted factors (OSFs) are involved in important cellular processes in the
follicle. Bone morphogenetic protein 6 (BMP6) seems to be one of these factors.
The effect of BMP6 has been examined only in granulosa cell cultures and there
BMP6 prevents progesterone dominance similar as MAPK inhibition. Therefore, in
the present study the role of BMP6 as a potential OSF on steroidogenesis in
cumulus cells was analysed.
Expression of BMP6-mRNA could be demonstrated in oocytes and cumulus cells
at all sampling times. The nuclear maturation of oocytes and the cumulus cell
expansion showed no changes after BMP6 was added to the medium. The
hormone analysis and RT-PCR results of steroid enzymes did not change under
the influence of BMP6 as well. The MAPK activity in cumulus cells was also not
affected.
In the present study, BMP6 supplementation did not caused effects like described
in granulosa cell cultures. This seems to be depended on the different degrees of
luteinisation. In granulosa cell cultures, the cells synthesise considerably more
progesterone than cumulus cells during IVM of cumulus oocyte complexes.
Nevertheless, BMP6 is still a possible oocyte secreted factor, which is not
mediated by the MAPK cascade in porcine cumulus cells. The question of an
antiluteal effect of BMP6 could not yet be answered, but the results of this study
lead to new investigations. Moreover, the functions and regulations of OSFs need
to be examined more intensively.
107

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VANDERHYDEN, B.C., J.N. COHEN u. P. MORLEY (1993):
Mouse oocytes regulate granulosa cell steroidogenesis.
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Mouse oocytes regulate granulosa cell steroidogenesis throughout follicular
development.
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and mural granulosa cells by a factor(s) secreted by the oocyte.
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stimulating hormone-induced differentiation of cultured granulosa cells from small
antral and preovulatory rat follicles.
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In vivo treatment with GDF-9 stimulates primordial and primary follicle progression
and theca cell Marker CYP17 in ovaries of immature rats.
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Expression of bone morphogenetic proteins and receptors in porcine cumulusoocyte
complexes during in vitro maturation.
Anim. Reprod. Sci. 104, 275-283
123

9 Anhang
9.1 Abkürzungsverzeichnis
A Anaphase
Abb. Abbildung
APS Ammoniumpersulfat
AK Antikörper
Aqua dest. Aqua destillata
Aqua bidest. Aqua bidestillata
3ß-HSD 3beta-Hydroxysteroiddehydrogenase
BSA bovines Serumalbumin
BM Basismedium (hier TCM 199)
BMP bone morphogenic protein
BMK big MAPK
bp Basenpaar
°C Grad Celsius
CaCl2
Calciumchlorid
cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat
cDNA complementary DNA
cGMP cyclisches Guanosinmonophosphat
cm Zentimeter
CO2
Kohlendioxid
CYP Cytochrom P450
Di Diakinese
deg. degeneriert
DEPC Diethylpyrocarbonat
DMSO Dimethylsulfoxid
dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat
DNA desoxyribonucleic acid
DPBS DulbeKumuluszelleno’s phosphate buffered saline
DTT Dithiothreitol
eCG equines Choriongonadotropin
EDTA Ethylendiamintetraazetat-Dinatriumsalz
EGF epidermal growth factor
ERK extrazellulär regulierte Proteinkinase
et al. et alii
E2
17ß-Estradiol
FSH follikelstimulierendes Hormon
FKS fetales Kälberserum
g Gramm
GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
GC Guanin Cytosin
GDF9 growth differentiation factor 9
Anhang
124

GDNF cell-derived neurotrophic factors
GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung
GV Germinalvesikel
GVBD germinal vesicle breakdown
h hour
hCG humanes Choriongonadotropin
HCl Salzsäure
HRPO horse radish peroxidase (Merettichperoxidase)
IGF Insulin-like growth factor
IVF In-vitro-Fertilisation
IVM In-vitro-Maturation
JNK c-Jun N-terminal kinase
kb Kilobase
KCL Kaliumchlorid
kDa Kilodalton
kg Kilogramm
KOK Kumulus-Oozyten-Komplex
KZ Kumuluszellen
l Liter
LH luteinisierendes Hormon
m milli (x10 -3 )
M Metaphase
mA Milliamper
MAPK mitogen activated protein kinase
MAPKK MAPK-Kinase
MEK MAP/ERK Kinasen
mg Milligramm (x10 -3 Gramm)
MgCl2
Magnesiumchlorid
min Minute
ml Milliliter (x10 -3 Liter)
mRNA messenger-RNA
Mos moloney sarcoma oncogene
MOPS 3-(N-morpholino)-Propansulfonsäure
µ mikro (10 -6 )
µl Mikroliter (10 -6 Liter)
µm Mikrometer (10 -6 Meter)
NaCl Natriumchlorid
NaHCO3 Natriumhydrogencarbonat
OD Optische Dichte
o. g. oben genannt
OOX oocyte ectomized complexes
OSF oocyt- secreted factor
PBS phosphate buffered solution
PCR polymerase chain reaction
ph potentia hydrogenii
PK Polkörper
Anhang
125

PKA Proteinkinase A
PKC Proteinkinase C
pMAPK phosphorylierte MAPK
p-value probability für Überschreitungswahrscheinlichkeit
p38MAPK p38 mitogen acrivated protein kinase
P4
Progesteron
Raf rapidly growing fibrosarcoma-kinase
RIA Radioimmunoassay
RIN RNA integrity number
RNA ribonucleic acid
rRNA ribosomale RNA
RT Reverse Transkriptase
SAPK Stress Activated Protein Kinase
SD Standardwabweichung
s Sekunde
SDS Sodium-Dodecyl-Sulfat
SMAD small mothers against decapentaplegic
StAR steroidogenic acute regulatory protein
Tab. Tabelle
TAE Tris-Acetat-EDTA
TCM tissue culture medium
T Telpohase
TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin
TGFß transforming growth factor beta
mittlerer Schmelzwert
TM
TA
annealing Temperatur
Anhang
Tris Tris(hydroxylmethyl)-aminoethan
u. a. unter anderem
UV ultraviolett
U0126 1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(2- aminophenylthio)butadiene
w/v weight/volume
V Volt
vgl. vergleiche
VK Vorkern
v/v volume/volume
x Mittelwert
z. B. zum Beispiel
126

9.2 Verwendete Chemikalien und Reagenzien mit Bezugsquellen
Anhang
Soweit nicht anders angegeben, befinden sich die Firmensitze in Deutschland und
werden daher nur mit ihrer Ortsangabe aufgeführt.
Acrylamidmix Rotiphorese® Gel 40, Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Acrylamid 40 % Bio-Rad Laboratories GmbH, München
APS AppliChem GmbH, Darmstadt
ß-Mercaptoethanol Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Bis Acrylamid 2 % Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Bromphenolblau Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
BSA Serva Elektrophoresis GmbH, Heidelberg
DMSO Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Eisessig Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Essigsäure Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Ethidiumbromid Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Ethanol 99,9 % Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Formaldehyd 37% Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Glycerin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
HCl Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Hyaluronidase Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
KCl Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
MgCl2 Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Kodak GBX Fixierer Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Kodak GBX Entwickler Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
MOPS/EDTA 10x Buffer Merck KGaA, Darmstadt
NaCl Merck KGaA, Darmstadt
NaHCO3 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Natriumpyruvat Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Orange G Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
127

Orcein Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Paraplast ® plus Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Reinstwasser Millipore GmbH, Schwalbach
TAE 50x Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
TEMED Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Tris/HCl Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Tris HCl Buffer 0,5 M Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Tris HCl Buffer 1,5 M Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Triton X-100 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Vaseline ® Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Hormone und Zusätze für die Zellkultur
Androstendion Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
BMP6 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Dulbecco’s Phosphate
Buffered Saline (DPBS) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
FKS Biochrom AG, Berlin
FSH Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Insulin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
L-Glutamin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Anhang
LH National Hormone & Peptide Program, Torrance, USA
TCM 199 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
U0126 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
128

Antikörper Chemilumineszenz
Anti-pMAPK Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
(Verdünnung 1:4000)
Anti-alpha-Tubulin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
(Verdünnung 1:2000)
HRPO-anti-mouse Santa Cruz Biotechnologies, Heidelberg
(Verdünnung 1:5000)
Poteinstandard SDS-Gelelektrophorese
Prestained Proteinstandard 72 kDa rot Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
Substrat für die Chemilumineszenz zur Detektion
SuperSignal® West
Dura Extended
Duration Substrate Thermo Fisher Scientific, Bonn
Nitrocellulosemembran Immunoblot
Hybond-ECL GE Healthcare, Freiburg
Gel-Blotting-Papier Schleicher & Schuell, Dassel
Autoradiographiefilm
Kodak X-Omat AR Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
(18x24 cm)
Reagenzien für die RNA-Extraktion, die Rerverse Transkription und die PCR
Agarose Invitrogen GmbH, Karlsruhe
Ampliwax ® PCR Gem 50 Applied Biosystems GmbH, Darmstadt
DEPC-H2O Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
DNA-Ladder 50 bp New England Biolabs GmbH, Frankfurt a. M.
dNTP-Set Invitrogen GmbH, Karlsruhe
Anhang
129

DTT Invitrogen GmbH, Karlsruhe
Primer Eurofins MWG Operon, Ebersberg
RNA-Ladder RiboRuler TM Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
(High Range)
RNA Loading Buffer Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
RNase OUT TM Invitrogen GmbH, Karlsruhe
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden
Superscript TM Invitrogen GmbH, Karlsruhe
Taq-DNA Polymerase NatuTec GmbH Frankfurt a. M.
9.3 Zusammensetzung von Medien, Lösungen, Puffern und Gelen
Spülmedium zur Gewinnung der KOKS
NaCl 0,9 %
FKS (hitzeinaktiviert) 1,0 %
Sammelmedium KOKs
DPBS 9,65 g
CaCl2
0,1 g
Gentamycin (50 mg/ml) 1,0 ml
ad 1000 ml Reinstwasser
steril filtrieren
FKS (hitzeinaktiviert) 10,0 %
Lagerung bei 4 °C
Maturationsmedium KOKs (Basismedium)
Insulin 20,0 µg/ml
L-Glutamin 80,0 mg/ml
Gentamycin 50,0 µg/ml
FCS (hitzeinaktiviert) 20 % (v/v)
ad 50 ml TCM 199 with Earle’s Salts and NaHCO3
steril filtrieren
Lagerung maximal 3 Wochen bei 4 °C
Anhang
130

FSH * 2,5 µg/ml
LH * 5,0 µg/ml
Androstendion * 100,0 µM
* vor dem Versuchsbeginn hinzufügen
Hyaluronidase (0,25 %)
Hyaluronidase 0,25 g
ad 100 ml Reinstwasser
steril filtrieren
aliquotieren und bei -20 °C lagern
Färbelösung für Oozyten
Orcein 5,0 g
Eisessig 150,0 ml
aufkochen lassen
ad 100 ml kochendes Reinstwasser
filtrieren und abgedunkelt bei RT lagern
Agarosegel (1%)
Agarose 8,0 g
TAE 50fach 8,0 ml
ad 400 ml Reinstwasser
aufkochen lassen bis Lösung klar
Lagerung im Wasserbad bei 52-56 ° C
denaturierendes Agarosegel
Agarose 0,6 ml
MOPS 10fach 6,0 ml
ad 44 ml DEPC
aufkochen
Formaldehyd (37 %) 9,6 ml
nochmals kurz aufkochen
Ethidiumbromid-Färbelösung
Stammlösung 10,0 mg/ml
Lagerung dunkel bei 4 °C
Stammlösung 250,0 µl
ad 500 ml TAE1fach
Lagerung bei RT für maximal 4 Wochen
Anhang
131

Orange G (0,25 %)
Orange G (1 %) 2,5 ml
Glycerin 3,0 ml
Reinstwasser 4,5 ml
aliquotieren, Lagerung bei 4 °C
RT-Puffer
Tris/HCl pH 8,3 125,0 mM
KCl 187,5 mM
MgCl2
7,5 mM
DTT 25,0 mM
dNTPs
aliquotieren, Lagerung bei -20 °C
1,25 mM
PCR-Puffer
Tris/HCl 25,0 mM
KCl 100,0 mM
MgCl2
6,5 mM
dNTPs 1,25 mM
Triton X-100 0,5 %
BSA
aliquotieren, Lagerung bei -20°C
0,1 %
Blockierungslösung
TBS
Tween 0,1 %
Teleost-Gelatine 5,0 %
Blottingpuffer
Glycin 0,038 M
Tris 0,048 M
SDS 0,0375 %
Methanol 20,0 %
ad Aqua dest.
Anhang
132

Elektrodenlaufpuffer (10fach konzentriert, pH 8,8)
Tris 25,0 mM
Glycin 192,0 mM
SDS (w/v) 0,1 %
ad Aqua dest.
PBS (Phosphat buffered saline)
Na2HPO4
9,10 mM
KH2PO4
2,71 mM
NaCl 154,0 mM
ad Aqua dest.
pH 7,4
TBS (Tris buffered saline)
Tris 500,0 mM
NaCl 1,5 M
ad Aqua dest.
pH 7,5
Shifting Acrylamid/Bis-Lösung (für Trennungsgel)
Acrylamid 40% 74,25 ml
Bis Acrylamid 2% 15,0 ml
ad Aqua dest. 10,75 ml
Sammelgel SDS-Polyacrylamidgel
H2O 2,1 ml
30 % Acrylamid mix 0,5 ml
1,0 M Tris (pH 6,8) 0,38 ml
10 % SDS 0,03 ml
10 % APS 0,03 ml
TEMED 3,0 µl
vor dem Hinzufügen des APS Lösung für ca. 3 min ins Ultraschallbad
Trenngel (10,5 %) SDS-Polyacrylamidgel
1,5 M Tris pH 8,8 2,5 ml
Shifting Acrylamid 3,5 ml
10 % SDS 100,0 µl
Aqua dest. 3,8 ml
TEMED 6,3 µl
Anhang
133

10 % APS 63,0 µl
vor dem Hinzufügen des APS Lösung für ca. 3 min ins Ultraschallbad
Ponceau S-Lösung
Ponceau S 0,5 %
Essigsäure 1,0 %
Stripping-Reagenz
2ß-Mercaptoethanol 100,0 mM
SDS 2,0 %
Tris-HCl 62,5 mM
ad Aqua dest.
pH 6,7
1fach Laemmli-Auftragspuffer (nach Laemmli 1970)
Tris/HCl (pH 6,8) 50,0 mM
Glycerin 10,0 %
SDS 2,0 %
1 Spatelspitze Bromphenolblau
ad Aqua dest.
Anhang
134

9.4 Geräte und Verbrauchsmaterialien
Anhang
Brutschrank Cytoperm Heraeus, Osterode, Deutschland
Blotgerät Fastblot B64 Biometra GmbH, Göttingen
Elektrophoresekammer Mini Protean II Bio-Rad Laboratories, München
Geldokumentation Gel IX Imager Intas Science Imaging Instruments
GmbH, Göttingen
Heiztisch Bachhofer GmbH, Reutlingen
MINI-Vortex V1 G.Kisker GbR, Steinfurt
Multischalen Nunclon TM Nunc GmbH & Co. KG, Roskilde,
Dänemark
MultiSUBmini Gelkammer G.Kisker GbR, Steinfurt
Pasteurpipetten Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Petrischalen TC Dish Nunc GmbH & Co. KG, Roskilde
Phasenkontrastmikroskop BX60 Olympus Deutschland GmbH,
Hamburg
Pipetten Eppendorf AG, Hamburg
Eppendorf Research
2,5; 10; 100; 1000 µl
Pipettenspitzen Eppendorf AG, Hamburg
Power Pac P25 Biometra GmbH, Göttingen
Power Pac 300 Bio-Rad Laboratories GmbH,
München
Reinraumwerkbank AURA HZ 48 Nunc GmbH & Co. KG, Roskilde,
Dänemark
Spritzenfilter 0,2 µm Millipore GmbH, Schwalbach
Spectrophotometer Genova MK3 HLL Landgraf Laborsysteme
GmbH, Langenhagen
135

Anhang
Stereomikroskop SZH-ILLD Olympus Deutschland GmbH,
Hamburg
Thermocycler Biometra GmbH, Göttingen
TProfessional Basic
Thermomixer Eppendorf AG, Hamburg
Tubes 0,2; 0,5; 1,5 ml Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
UV-Einmalküvetten Brand GmbH & Co KG, Wertheim
12,5 x 12,5 x 45 mm
Ultraschallbad Sonorex TK40 Bandelin electronic GmbH & Co
KG, Berlin
Wasserbad 3042 Köttermann GmbH & Co. KG,
Uetze/Hänigsen
Zentrifuge Biofuge Fresco Heraeus, Osterode
Software
Intas Imaging Bildaufnahme Software Intas Science Imaging Instruments
GmbH, Göttingen,
Cell D 2,6 System Olympus GmbH, Hamburg
Soft Imaging Solutions
ImageQuant TL 7.0 GE Healthcare, Freiburg
SAS 9.1 SAS Institute Inc., Cary, NC, USA
SigmaStat 3.5 Sysstat Software Inc., Erkrath
DNASTAR Lasergene 8
www.gatc-biotech.com/de/bioinformatik/dnastar-software.html
BioEdit Sequence Alignment Editor version 7.0.9.0
www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html
136

137
Tabelle 8: Chromatinstatus von Eizellen nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94stündiger IVM im BM.
IVM
0 h
5 h
26 h
46 h
72 h
94 h
n
115
131
39
14
1
0
GV
%
98,3
95,6
26,7
10,1
0,8
0
n
0
3
102
0
3
1
Di/MI
%
0
2,2
69,9
0
2,5
1,1
n
0
1
0
2
0
0
AI/TI
%
0
0,7
0
1,4
0
0
GV: Germinalvesikelstadium, Di/MI: Diakinese/Metaphase I, AI/TI: Anaphase I/Telophase I, MII: Metaphase II; AII/TII: Anaphase II/
Telophase II; deg. : degeneriert
n
0
0
5
120
87
60
MII
%
0
0
3,4
87,0
73,1
67,4
n
0
0
0
0
20
14
AII/TII
%
0
0
0
0
16,8
15,7
n
2
2
0
2
8
14
deg.
%
1,7
1,5
0
1,4
15,7
6,7
n
117
137
146
138
119
89
Summe
%
100
100
100
100
100
100
9.5 Tabellen zum Ergebnisteil
Anhang

138
Tabelle 9: Chromatinstatus von Eizellen nach 0, 5, 26 und 46stündiger IVM im BM+U0126.
IVM
0 h
5 h
26 h
46 h
n
115
110
122
177
GV
%
95,8
95,7
93,1
93,7
n
0
1
3
4
Di/MI
%
0
0,9
2,3
2,1
GV: Germinalvesikelstadium, Di/MI: Diakinese/Metaphase I, AI/TI: Anaphase I/Telophase I, MII: Metaphase II;
AII/TII: Anaphase II/Telophase II; deg. : degeneriert
n
0
0
0
1
AI/TI
%
0
0
0
0,5
n
0
1
1
1
MII
%
0
0,9
0,8
0,5
n
5
3
5
6
deg.
%
4,2
2,6
3,8
3,2
n
120
115
131
189
Summe
%
100
100
100
100
Anhang

139
Tabelle 10: Chromatinstatus von Eizellen nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94stündiger IVM im BM+BMP6.
IVM
0 h
5 h
26 h
46 h
72 h
94 h
n
115
118
18
7
7
2
GV
%
98,3
99,2
14,4
6,2
7,1
2,2
n
0
0
102
4
2
4
Di/MI
%
0
0
81,6
3,5
2,0
4,4
n
0
0
1
0
1
0
AI/TI
%
0
0
0,8
0
1,0
0
n
0
0
0
97
48
50
MII
%
0
0
0
85,1
49,0
54,9
n
0
0
0
0
34
25
AII/TII
%
0
0
0
0
34,7
27,5
n
2
1
4
5
6
10
deg.
%
1,7
0,8
3,2
4,4
6,1
11,0
n
117
119
125
113
98
91
Summe
GV: Germinalvesikelstadium, Di/MI: Diakinese/Metaphase I, AI/TI: Anaphase I/Telophase I, MII: Metaphase II; AII/TII: Anaphase
II/Telophase II; deg. : degeneriert
%
100
100
100
100
100
100
Anhang

Anhang
Tabelle 11: Progesteronkonzentration (ng/ml) in unterschiedlichen Medien.
Angegeben sind Mittelwerte ( x ) und Standardabweichungen (SD) nach IVM der
KOKs im BM, im BM+U0126 und BM+BMP6 für 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h. Jede
Kultivierung im betreffenden Medium wurde für jede Maturationszeit mind. viermal
wiederholt.
Maturationszeit
BM BM+U0126 BM+BMP6
x SD x SD x SD
0 h 16,0 2,0 15,0 1,4 0 -
5 h 3,8 7,5 0 0 0 -
26 h 61,0 19,4 19,8 6,9 110,0 46,0
46 h 565,5 155,9 39,0 36,2 542,0 192,0
72 h 848,3 74,8 - - 1547,3 309,3
94 h 2404,3 691,0 - - 1839,0 231,4
Tabelle 12: 17ß-Estradiolkonzentration (ng/ml) in unterschiedlichen Medien.
Angegeben sind Mittelwerte ( x ) und Standardabweichungen (SD) nach IVM der
KOKs im BM, im BM+U0126 und BM+BMP6 für 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h. Jede
Kultivierung im betreffenden Medium wurde für jede Maturationszeit mind. viermal
wiederholt.
Maturationszeit
BM BM+U0126 BM+BMP6
x SD x SD x SD
0 h 0,4 0,1 0,5 0,1 0,3 0,1
5 h 1,6 0,2 1,4 0,4 1,1 0,4
26 h 9,1 2,3 6,5 2,8 5,8 1,8
46 h 5,3 1,2 10,3 1,9 6,5 2,0
72 h 11,2 1,6 - - 12,1 1,2
94 h 12,0 0,4 - - 9,8 2,5
Tabelle 13: mRNA-Expression nach RT-PCR von StAR in Kumuluszellen.
Angegeben sind Mittelwerte ( x ) und Standardabweichungen (SD) der relativen
Dichte der Transkripte aus mind. drei unabhängigen Versuchen zu jedem
Zeitpunkt nach IVM der KOKs im BM, im BM+U0126 und BM+BMP6 für 0, 5, 26,
46, 72 und 94 h.
Maturationszeit
BM BM+U0126 BM+BMP6
x SD x SD x SD
0 h 11,9 6,6 19,2 4,4 4,4 2,5
5 h 33,9 15,8 53,1 5,5 7,8 1,3
26 h 117,4 35,6 166,6 56,9 79,6 15,3
46 h 176,6 38,5 147,5 73,1 175,0 20,3
72 h 172,2 13,7 - - 182,3 36,7
94 h 216,5 22,9 - - 169,5 2,3
140

Anhang
Tabelle 14: mRNA-Expression nach RT-PCR von CYP11A1 in Kumuluszellen.
Angegeben sind Mittelwerte ( x ) und Standardabweichungen (SD) der relativen
Dichte der Transkripte aus mind. drei unabhängigen Versuchen zu jedem
Zeitpunkt nach IVM der KOKs im BM, im BM+U0126 und BM+BMP6 für 0, 5, 26,
46, 72 und 94 h.
Maturationszeit
BM BM+U0126 BM+BMP6
x SD x SD x SD
0 h 148,6 15,5 106,8 8,2 105,5 66,0
5 h 227,3 55,1 228,6 30,5 322,0 119,6
26 h 191,0 68,2 220,4 28,2 270,7 89,3
46 h 180,3 35,8 200,2 40,9 305,3 62,0
72 h 248,4 62,9 - - 270,6 60,1
94 h 269,17 69,3 - - 211,7 43,6
Tabelle 15: mRNA-Expression nach RT-PCR von CYP19A1 in Kumuluszellen.
Angegeben sind Mittelwerte ( x ) und Standardabweichungen (SD) der relativen
Dichte der Transkripte aus mind. drei unabhängigen Versuchen zu jedem
Zeitpunkt nach IVM der KOKs im BM, im BM+U0126 und BM+BMP6 für 0, 5, 26,
46, 72 und 94 h.
Maturationszeit
BM BM+U0126 BM+BMP6
x SD x SD x SD
0 h 41,7 14,8 37,3 7,6 82,4 13,8
5 h 106,5 35,8 55,7 15,0 74,6 12,7
26 h 32,4 14,3 100,7 25,5 39,1 20,8
46 h 28,1 5,1 69,4 13,1 54,3 27,1
72 h 100,5 60,3 - - 116,2 12,3
94 h 46,9 23,4 - - 72,6 19,8
Tabelle 16: mRNA-Expression nach RT-PCR von 3ß-HSD in Kumuluszellen.
Angegeben sind Mittelwerte ( x ) und Standardabweichungen (SD) der relativen
Dichte der Transkripte aus mind. drei unabhängigen Versuchen zu jedem
Zeitpunkt nach IVM der KOKs im BM, im BM+U0126 und BM+BMP6 für 0, 5, 26,
46, 72 und 94 h.
Maturationszeit
BM BM+U0126 BM+BMP6
x SD x SD x SD
0 h 61,5 17,3 21,7 10,1 45,6 8,0
5 h 85,4 18,1 23,8 9,6 104,5 67,8
26 h 126,3 37,8 43,5 25,1 176,7 64,7
46 h 224,5 59,0 49,5 29,2 291,1 44,6
72 h 152,6 40,4 - - 129,3 52,0
94 h 218,1 43,9 - - 94,4 69,7
141

Anhang
Tabelle 17: mRNA-Expression nach RT-PCR von BMP6 in Kumuluszellen.
Angegeben sind Mittelwerte ( x ) und Standardabweichungen (SD) der relativen
Dichte der Transkripte aus mind. drei unabhängigen Versuchen zu jedem
Zeitpunkt nach IVM der KOKs im BM für 0, 5, 26 und 46 h.
Maturationszeit
x
BM
SD
0 h 68,7 14,9
5 h 119,1 20,6
26 h 79,4 10,0
46 h 52,3 9,9
Tabelle 18: mRNA-Expression nach RT-PCR von BMP6 in Oozyten.
Angegeben sind Mittelwerte ( x ) und Standardabweichungen (SD) der relativen
Dichte der Transkripte aus mind. drei unabhängigen Versuchen zu jedem
Zeitpunkt nach IVM der KOKs im BM für 0, 5, 26 und 46 h.
Maturationszeit
x
BM
SD
0 h 60,0 13,5
5 h 93,7 10,2
26 h 59,6 3,6
46 h 52,2 4,1
Tabelle 19: MAPK-Phosphorylierung in Kumuluszellen.
Angegeben sind die Mittelwerte ( x ) und Standardabweichungen (SD) der relativen
Dichte nach IVM der KOKs für 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h im BM, BM+U0126 und
BM+BMP6 aus mind. drei unabhängigen Versuchen zu jedem Zeitpunkt
Maturationszeit
BM BM+U0126 BM+BMP6
x SD x SD x SD
0 h 120,8 65,39 2,8 1,41 117,72 74,47
5 h 319,93 76 3,6 1,59 343,2 118,46
26 h 191,47 74,29 76,3 64,4 318,18 54,7
46 h 41,93 66,58 226,47 37,64 194,04 87,75
72 h - - - - 145,27 103,75
94 h - - - - 128,17 48,65
142

Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht in:
Zeitschriften:
Veröffentlichungen
EBELING, S.; D. TÖPFER u. B. MEINECKE (2011):
Steroidogenesis and the influence of MAPK activity during in vitro maturation of
porcine cumulus oocyte complexes.
Reprod Dom Anim 46 (3), 513-519
EBELING, S.; D. TÖPFER, J. M. WEITZEL u. B. MEINECKE (2011):
Bone morphogenetic protein-6 (BMP-6): mRNA expression and effect on
steroidogenesis during in vitro maturation of porcine cumulus oocyte complexes.
Reprod Fert Dev, published online 22. September 2011
Vorträge:
TÖPFER, D., S. EBELING u. B. MEINECKE (2010):
Influence of mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity on progesterone and
17ß-estradiol secretion of porcine cumulus cells.
43 rd Annual Conference of Physiology and Pathology of Reproduction, 35 th Mutual
Conference on Veterinary and Human Reproductive Medicine, München, 2010
Reprod. Domest. Anim. 45(Suppl.1), 54
EBELING, S.; D. TÖPFER, J. M. WEITZEL u. B. MEINECKE (2011):
Influence of BMP-6 as potential oocyte secreted factor on steroid hormone
synthesis of porcine cumulus cells during in vitro maturation.
44 rd Annual Conference of Physiology and Pathology of Reproduction, 36 th Mutual
Conference on Veterinary and Human Reproductive Medicine, Hannover, 2011
Reprod. Domest. Anim. 46(Suppl.1), 12
Posterpräsentation:
Influence of MAPK activity on steroidogenesis in porcine cumulus cells.
44 rd Annual Conference of Physiology and Pathology of Reproduction, 36 th Mutual
Conference on Veterinary and Human Reproductive Medicine, Hannover, 2011
Reprod. Domest. Anim. 46(Suppl.1), 43
143

Danksagung
Mit der Fertigstellung der Dissertationsschrift ist es spätestens jetzt an der Zeit, nochmals
all denen zu danken, die mich begleitet und unterstützt haben.
Danke…
… an erster Stelle an Herrn Prof. Dr. Burkhard Meinecke für das Ermöglichen meiner
Doktorarbeit, für das Thema und für die fachliche Betreuung. Seine Freundlichkeit, sein
Humor und sein Wissen waren stets Motivation für mich!
… an Prof. Dr. Bernd Schröder für seine Bereitschaft, als Zweitgutachter zu fungieren!
… an Dr. Silja Ebeling für die gesamte Zeit der Betreuung, wertvolle Ratschläge und stets
geschätzte Anregungen. Für ihren weiteren beruflichen Weg wünsche ich ihr viel Erfolg!
… vor allem Edita Podhajsky für ihre ständige Bereitschaft, alle großen und kleinen
Probleme aus der Welt zu schaffen! Neben ihrer riesigen Hilfsbereitschaft war sie nicht
nur dienstlich eine Bereicherung während der ganzen Zeit!
… Monika Labsch für die tolle Zusammenarbeit im Team und die vielen Momente, in
denen nur Humor geholfen hat!
… den Schlachthöfen Gleidingen und Hannover für die unzähligen Stunden zum
Sammeln der Ovarien!
… der AG Prof. Dr. Paul Becher mit Steffi Gilgenbach und Sophia Austermann-Busch für
das Einweihen in die Geheimnisse der PCR!
… Prof. Dr. Christine Wrenzycki und Sandra Wilkening für die „Bioanalyzer-
Unterstützung“ und für die wertvollen Ratschläge rund um die RNA!
… den Kolleginnen und Kollegen der Station 25 des Agnes-Karll-Krankenhauses für ihre
flexible Dienstplangestaltung während des Studiums und der Promotionszeit!
… Ali, Caro, Claudia, Constanze, Hartmut, Jenny und Vivian für die krisensichere
Freundschaft und vor allem Marina, die während der ganzen Zeit meine Höhen und Tiefen
in vollem Umfang miterleben musste und mir stets bewusst gemacht hat, wie wichtig ein
Leben neben der Doktorarbeit ist!
… an Stephan, dafür dass er meine teilweise gestresste Laune ertragen hat und einfach
dafür, das es ihn gibt!
… auf eine besondere Weise an meine Familie und vor allem meiner Mutter Erika Töpfer
für das fortwährende Vertrauen, die seelische und moralische Unterstützung nicht nur
während der Doktorarbeit!
144