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Tierärztliche Hochschule Hannover
Nachweis des Chemokins MIP-3β/CCL19 im Liquor cerebrospinalis und dessen
Beteiligung bei der Einwanderung mononukleärer Zellen in den
Subarachnoidalraum bei Hunden mit entzündlichen und nicht-entzündlichen
neurologischen Erkrankungen
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Janina Bartels
Celle
Hannover 2013

Wissenschaftliche Betreuung:
1. Univ.-Prof. Dr. med. vet. Andrea Tipold, Klinik für Kleintiere
2. Dr. Scott Schatzberg, DVM, PhD, Veterinary Emergency and Specialty Center,
Santa Fe, NM
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Andrea Tipold
2. Gutachter: Univ.- Prof. Dr. med. vet. Andreas Beineke
Tag der mündlichen Prüfung: 29.4.2013

Meinen Eltern

Teile der vorliegenden Dissertation wurden auf folgenden Tagungen vorgestellt:
Bartels, J., Schatzberg, S.J., Darrow, B.G., Bu, L., Carlson, R., Tipold, A.:
MIP-3β/CCL19 ist verantwortlich für die Einwanderung mononukleärer Zellen in den
Subarachnoidalraum bei Hunden.
21. Jahrestagung der Fachgruppe „Innere Medizin und Klinische
Laboratoriumsdiagnostik“, Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft, e.V.
(DVG), München, 01.02.-02.02.2013 (Posterpreis).
Bartels, J., Schatzberg, S.J., Darrow, B.G., Bu, L., Carlson, R., Tipold, A.:
MIP-3β/CCL19 associated with the invasion of mononuclear cells in
neuroinflammatory and non-neuroinflammatory diseases in dogs.
2013 ACVIM Forum, American College of Veterinary Internal Medicine, Seattle,
Washington, U.S.A., 12.6-15.6.2013, oral presentation accepted

Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
Kapitel 1 EINLEITUNG...................................................................................……….7
Kapitel 2 LITERATURÜBERSICHT............................................................………….9
2.1. SRMA.............................................................……………………...…...9
2.1.1. Allgemeiner Überblick...............................................................….....9
2.1.2. Pathogenese............................................................................…....11
2.2. MUO.......................................................…………..............................13
2.2.1. Allgemeiner Überblick ….......................................................……...13
2.2.2. Pathogenese ….........................................................................…..15
2.3. Bandscheibenvorfall.....................................................................…16
2.3.1. Allgemeiner Überblick …........................................................….….16
2.3.2. Pathogenese ……………………….......................................………17
2.4. Chemokin MIP-3β/CCL19..................................................…….……19
Kapitel 3 MATERIAL UND METHODEN …......................................…………….....21
3.1. Patientenmaterial...................................................................……....21
3.2. Material ............................................................................…………...22
3.2.1. Reagenzien und Chemikalien...................................................…...22
3.2.2. Geräte.....................................................................………………...22
3.2.3. Laborbedarf.......................................................................………....23
3.2.4. Puffer und Lösungen ….......................................…….....……….....24
3.2.5. Computer-Software..............................………………………...........24

Inhaltsverzeichnis
3.3. Methode...................................……………………………..................25
3.3.1. ELISA...............................................................…………………......25
3.3.2. Chemotaxis Assay................................................................……....28
3.4. Statistische Auswertung …............................................………......30
Kapitel 4 UNTERSUCHUNG DES CHEMOKINS MIP-3β/CCL19 IN
LIQUORPROBEN VON HUNDEN MIT ENTZÜNDLICHEN UND NICHT-
ENTZÜNDLICHEN ZNS-ERKRANKUNGEN …................………………. 31
Kapitel 5 FALLDARSTELLUNG EINES HUNDES MIT INFEKTIÖS BEDINGTER,
ENTZÜNDLICHER ZNS-ERKRANKUNG …....…..................….......…....59
Kapitel 6 ÜBERGREIFENDE DISKUSSION..........................................…………....86
Kapitel 7 ZUSAMMENFASSUNG..................................................................….…..93
Kapitel 8 SUMMARY......................................................................…………….……96
Kapitel 9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS..................................................………....99
Kapitel 10 LITERATURVERZEICHNIS...........................................………............102
Kapitel 11 ANHANG......................................................................……………...…127
Kapitel 12 DANKSAGUNG..........................................................……………........141

Einleitung
Kapitel 1 Einleitung
Entzündliche, immun mediierte oder infektiöse Erkrankungen des zentralen Nervensystems
(ZNS) werden häufig in der Kleintiermedizin diagnostiziert. Eine Vielzahl von
neurologischen ZNS-Erkrankungen ist beim Hund beschrieben und vermutlich
immun mediiert (DEWEY 2008; TALARICO u. SCHATZBERG 2010; TIPOLD u.
SCHATZBERG 2010).
Eine häufige entzündliche neurologische ZNS-Erkrankung bei Hunden ist die
"Steroid-responsive Meningitis-Arteriitis" (SRMA) (TIPOLD u. JAGGY 1994). Sie ist
auch unter dem Namen "canine juvenile polyarthritis syndrom" (FELSBURG et al.
1992), "Beagle pain syndrom" (HAYES et al. 1989), “Necrotizing Vasculitis“ (SCOTT-
MONCRIEFF et al. 1992), "Corticosteroid-responsive Meningomyelitis” "(IRVING u.
CHRISMAN 1990) bekannt (TIPOLD 1997).
Eine andere Gruppe von neuroinflammatorischen Erkrankungen mit unbekannter
Ätiopathogenese wird als Meningoenzephalomyelitis unbekannten Ursprungs (MUO)
bezeichnet. In dieser Gruppe sind die granulomatöse Meningoenzephalomyelitis,
nekrotisierende Enzephalitiden und andere Enzephalitiden unbekannter Ätiologie
enthalten (TIPOLD 1997; TALARICO u. SCHATZBERG 2010).
Diese immun mediierten Erkrankungen unbekannter Ätiologie müssen von
entzündlichen Erkrankungen unterschieden werden, die durch infektiöse Mikroorganismen
verursacht werden. Diese Mikroorganismen können viralen, mykologischen,
protozoären oder bakteriellen Ursprungs sein (TIPOLD 1997; DEWEY
2008). Es ist wichtig, die entsprechende Ursache zu diagnostizieren, um geeignete
Therapien wählen zu können (DEWEY 2008).
Während immun mediierte Krankheiten immunsuppressive, entzündungshemmende
Medikamente benötigen, würden sie bei Infektionskrankheiten in hohen Dosierungen
kontraindiziert sein (DAY 2008).
Entzündungshemmende Medikamente verändern die Zytokin- und Chemokinkonzentrationen,
die für eine Entzündungsreaktion und deren Folgen verantwortlich
sind. Glukokortikosteroide können zum Beispiel verwendet werden, um eine
unkontrollierte Immunreaktion zu unterdrücken (TIPOLD 1997; DAY 2008).
7

Einleitung
Eine antimikrobielle Therapie ist bei bakteriellen Infektionskrankheiten essenziell, und
angemessene, frühe Anwendungen dieser Therapie sind lebensrettend (TIPOLD
1995; DEWEY 2008).
In der folgenden Studie sollte die Hypothese bewiesen werden, dass das Protein
MIP-3β/CCL19 zumindest teilweise an der Pathogenese der Invasion von mononukleären
Zellen in den Subarachnoidalraum bei Hunden mit entzündlichen und
nicht-entzündlichen ZNS-Erkrankungen beteiligt ist. Die untersuchten Krankheiten
umfassen die Steroid-responsive Meningitis-Arteriitis (SRMA), die Meningoenzephalitis
unbekannter Herkunft (MUO) und Bandscheibenvorfälle (IVDD).
8

Literaturübersicht
Kapitel 2 Literaturübersicht
2.1. SRMA
2.1.1. Allgemeiner Überblick
Die Steroid-responsive Meningitis-Arteriitis (SRMA) des Hundes ist eine weltweit
verbreitete, entzündliche neurologische Erkrankung, bei der Ätiologie und Pathogenese
bislang noch unklar sind (TIPOLD et al. 1995).
SRMA ist die häufigste Meningitis bei Hunden (TIPOLD u. STEIN 2011) und wird
zusammen mit der Granulomatösen Meningoenzephalitis (GME), den protozoären
Infektionen des ZNS und der Staupe am häufigsten als entzündliche Erkrankung des
ZNS diagnostiziert (TIPOLD 1995).
Die histopathologischen Merkmale von SRMA sind charakterisiert durch eine eitrige
Meningitis, wobei die Halswirbelsäule überwiegend betroffen ist. Der entzündliche
Prozess führt zu einer Einwanderung von neutrophilen Granulozyten, Makrophagen,
Plasmazellen und Lymphozyten (TIPOLD u. SCHATZBERG 2010). Zusätzlich
werden in den Meningen Immunglobuline (Ig) wie IgG, IgM und IgA produziert
(TIPOLD et al. 1995).
Außerdem kann eine Arteriitis in den meningealen Gefäßen, besonders in den
zervikalen Rückenmarkshäuten auftreten (TIPOLD u. SCHATZBERG 2010).
SRMA ist überrepräsentiert in Berner Sennenhunden (TIPOLD u. JAGGY 1994), in
den Hunderassen Beagle (FELSBURG et al. 1992; SNYDER et al. 1995), Boxer
(TIPOLD u. JAGGY 1994), Weimaraner und Nova Scotia Duck Tolling Retriever,
welches die Möglichkeit einer genetischen Prädisposition impliziert (TIPOLD u.
SCHATZBERG 2010). Es können jedoch auch andere junge, mittelgroße bis große
Hunde betroffen sein.
Der Beginn der Krankheit tritt in der Regel zwischen dem 6. und 18. Lebensmonat
eines Hundes auf, jedoch ist die Spannbreite dieser Erkrankung größer und liegt
9

Literaturübersicht
zwischen dem 4. Lebensmonat und dem 7. Lebensjahr (CIZINAUSKAS et al. 2000;
TIPOLD 2000; TIPOLD u. SCHATZBERG 2010).
Bei Hunden treten zwei klinische Formen auf, die akute und die chronische Form
(TIPOLD u. JAGGY 1994; TIPOLD u. SCHATZBERG 2010).
Die häufigste Form ist die akute, klassische Präsentation mit Hyperästhesie, Fieber
bis zu 42° C, Apathie und Nackenschmerzen (TIPOLD 1995; TIPOLD u. SCHATZ-
BERG 2010). Die weitere neurologische Untersuchung ist in der Regel unauffällig,
wobei allerdings teilweise Propriozeptionsdefizite vorhanden sein können (TIPOLD
2000; TIPOLD u. SCHATZBERG 2010).
Wenn die Krankheit nicht frühzeitig behandelt wird, kann ein chronisch protrahierter
Krankheitsverlauf beobachtet werden (CIZINAUSKAS et al. 2000; TIPOLD u.
SCHATZBERG 2010).
Eine chronisch-protrahierte Form kann sich aufgrund mehrerer Rezidive der
klassischen Form entwickeln (TIPOLD u. SCHATZBERG 2010). Charakteristisch für
die chronische Manifestation sind neurologische Defizite, welche Gangstörungen wie
Hypermetrie, Paresen, generalisierte Ataxie, Propriozeptionsdefizite und einen
verminderten Drohreflex einschließen (TIPOLD u. JAGGY 1994).
Die Diagnose wird durch die klinische Präsentation, durch ein Blutbild und durch
Liquoruntersuchungen unterstützt (TIPOLD 1997). Bei akuten Erkrankungen ist im
Blutbild eine deutliche neutrophile Leukozytose mit Linksverschiebung zu erwarten
(TIPOLD u. SCHATZBERG 2010). Darüber hinaus kann eine erhöhte alpha2-
Globulinfraktion im Blut gemessen werden (TIPOLD 2000; TIPOLD u. SCHATZ-
BERG 2010). Die Liquoranalyse weist eine neutrophile Pleozytose auf mit bis zu
mehreren tausend neutrophilen Granulozyten pro Mikroliter Liquor cerebrospinalis
(CSF) und einer moderat erhöhten Proteinkonzentration (TIPOLD 1997; TIPOLD
2000; TIPOLD u. SCHATZBERG 2010).
In der chronischen Form ist die Pleozytose des Liquors nicht so ausgeprägt wie in
der akuten Form (TIPOLD 1995). Die Zellen bei der chronischen Form bestehen
vorwiegend aus mononukleären Zellen wie Lymphozyten, Makrophagen und
Monozyten oder aus einer gemischten Pleozytose mit normalem oder leicht
10

Literaturübersicht
erhöhtem Gesamtproteingehalt (TIPOLD u. JAGGY 1994; TIPOLD 1995; TIPOLD
2000; TIPOLD u. SCHATZBERG 2010).
Bei beiden klinischen Formen sind die IgA-Konzentrationen im Serum und Liquor
cerebrospinalis erhöht (FELSBURG et al. 1992; TIPOLD u. JAGGY 1994; TIPOLD
1995).
Die Messung von IgA ist ein wichtiges diagnostisches Hilfsmittel zur Differenzierung
der SRMA von anderen entzündlichen kaninen Meningoenzephalitiden, wobei Werte
auch unter Therapie erhöht bleiben (TIPOLD u. JAGGY 1994).
Andere diagnostische Verfahren wie die Computertomographie oder Magnetresonanztomographie
(MRT) können nützlich sein, in dem sie eine Kontrastverstärkung
der Hirnhäute aufdecken (FUCHS et al. 2000; TIPOLD u. SCHATZBERG 2010) und
andere Differentialdiagnosen ausschließen.
2.1.2. Pathogenese
Eine Fehlregulation des Immunsystems scheint bei der Pathogenese der SRMA eine
entscheidende Rolle zu spielen (TIPOLD 2000; TIPOLD u. SCHATZBERG 2010).
In verschiedenen Studien wurden mikrobiologische Untersuchungen des CSF von
erkrankten Hunden vorgenommen, jedoch blieb auch hier die mikrobiologische
Untersuchung bei allen SRMA Fällen negativ (TIPOLD 2000). Der Nachweis von
aktivierten T-Lymphozyten deutet auf eine Antigenexposition hin, aber bisher konnte
kein entsprechender Auslöser entdeckt werden (TIPOLD u SCHATZBERG 2010).
Das Ansprechen auf eine Glukokortikosteroidtherapie kann ein Indiz für einen
immunpathologischen Mechanismus sein (BURNS et al. 1991; TIPOLD 1997).
Es war möglich, Autoantikörper bei SRMA-Fällen nachzuweisen, jedoch werden
diese Antikörper nicht als die eigentliche Ursache der Krankheit angesehen, sondern
werden als ein Epiphänomen bewertet (SCHULTE et al. 2006; TIPOLD u.
SCHATZBERG 2010).
11

Literaturübersicht
TIPOLD et al. (1995) konnten eine intrathekale IgM- und IgG-Synthese in SRMA-
Hunden nachweisen, welche auf eine spezifische Immunantwort gegen das ZNS
hindeuten.
Die immunologischen Veränderungen in der akuten Form der SRMA zeigen eine
erhöhte Anzahl von zirkulierenden B-Zellen, sowie eine verringerte Anzahl von T-
Zellen im peripheren Blut und Liquor (FELSBURG et al. 1992). Eine Th2-vermittelte
Immunantwort konnte nachgewiesen werden (SCHWARTZ et al. 2008b;
SCHWARTZ et al. 2011). So war zum Beispiel Interleukin 4 (IL-4) in Blut und Liquor
bei Hunden mit der akuten Form der SRMA erhöht, während die auf eine
Th1-Antwort-hinweisenden Zytokinkonzentrationen (IL-2, IFN-γ) niedrig blieben
(SCHWARTZ et al. 2011). Die erhöhte humorale Immunantwort und IgA-Produktion
erfolgt auf Grund der überschießenden Th2 mediierten- Antwort (TIPOLD u.
SCHATZBERG 2010).
BURGENER et al. (1998) konnten eine positive Korrelation zwischen der Interleukin-
8 Konzentration (IL-8) und dem IgA-Gehalt im Liquor cerebrospinalis, sowie der
chemotaktischen Aktivität für Neutrophile identifizieren (TIPOLD u. SCHATZBERG
2010). Eine kontinuierliche Freisetzung von chemotaktischen Faktoren kann die
Pathogenese von Rezidiven erklären (TIPOLD et al.1994).
Die klassische Form der SRMA ist durch eine erhöhte Wanderung von Leukozyten,
hauptsächlich von Neutrophilen, in den Subarachnoidalraum von Hunden
charakterisiert (TIPOLD u. JAGGY 1994).
Es wurde gezeigt, dass Integrine für die Leukozytenmigration in das ZNS relevant
sind. Das Integrin CD11a ist bei Hunden mit SRMA hochreguliert und möglicher
-weise für die Invasion neutrophiler Granulozyten in den Subarachnoidalraum bei
Hunden verantwortlich (SCHWARTZ et al. 2008a; TIPOLD u. SCHATZBERG 2010).
Darüber hinaus kann durch die Produktion von Matrixmetalloproteinasen 2 und 9 die
Basalmembran bei Entzündungen des ZNS abgebaut und die Infiltration von
Neutrophilen in die Hirnhäute unterstützt werden (SCHWARTZ et al. 2008a.;
SCHWARTZ et al. 2010).
MAIOLINI et al`s Studie (2012) unterstützt die Annahme, dass eine Beteiligung von
drei Signalproteinen (IL-6, VEGF, TGF-β1) an der Pathogenese der SRMA und an
12

Literaturübersicht
der Entwicklung einer systemischen Arteriitis mit verantwortlich sind. TGF- β1 und IL-
6 sind möglicherweise bei der Differenzierung von CD4 Vorläuferzellen zu Th17
Lymphozyten beteiligt und führen dadurch zu einer Autoimmunreaktion (MAIOLINI et
al. 2012). Der Mechanismus der Einwanderung dieser mononukleären Zellen in die
Meningen ist bisher nicht bekannt.
2.2. MUO
2.2.1. Allgemeiner Überblick
Es gibt eine weitere Gruppe von neuroinflammatorischen Erkrankungen mit
unbekannter Ätiopathogenese. Diese Erkrankungen werden als Meningoenzephalomyelitiden
unbekannten Ursprungs (MUO) bezeichnet.
Diese Terminologie umfasst die Granulomatöse Meningoenzephalitis (GME),
nekrotisierende Meningo-enzephalitis (NME), nekrotisierende Leukoenzephalitis
(NLE) und andere Enzephalitiden unbekannter Ätiologie (ADAMO et al. 2007;
TALARICO u. SCHATZBERG 2010), bei denen zwar eine Verdachtsdiagnose gestellt
wird, aber histopathologische Untersuchungen ante mortem meist nicht durchgeführt
werden.
Die klinischen Symptome hängen von der Lokalisation der Entzündung und dem
Ausmaß der Entzündung ab. Der Beginn ist in der Regel akut, progressiv im Verlauf
und besitzt oft eine multifokale bis diffuse neuroanatomische Lokalisierung
(TALARICO u. SCHATZBERG 2010). GME kann bei allen Hunderassen auftreten,
wobei Toyrassen und Terrierrassen überrepräsentiert sind (TALARICO u. SCHATZ-
BERG 2010). Das Auftreten klinischer Symptome erfolgt in der Regel im Alter von 6
Monaten bis zu 12 Jahren (MUNANA 1996).
Drei Formen werden unterschieden, und zwar eine disseminierte, okuläre oder fokale
Form (TIPOLD 1997; TALARICO u. SCHATZBERG 2010).
13

Literaturübersicht
NME und NLE werden auch aufgrund ihrer Überschneidungen in der Neuropathologie
zu der nekrotisierenden Enzephalitis (NE) zusammengefasst (TALARICO
u. SCHATZBERG 2010).
Die klinische Symptomatik von NE variiert mit Lage der Läsion und ist gewöhnlich mit
cerebrothalamischen Anzeichen verbunden, obwohl NLE auch zu Hirnstammsymptomen
führen kann (DE LAHUNTA und GLAS 2009, S. 411; TALARICO u.
SCHATZBERG 2010).
Die definitive Diagnose kann nur durch Gehirnbiopsien und histopathologische
Untersuchungen erfolgen (DEWEY 2008; TALARICO u. SCHATZBERG 2010). Jede
Krankheit hat histopathologische Merkmale. GME ist durch eine perivaskuläre nicht
eitrige Granulombildung unter Beteiligung von Monozyten, Lymphozyten und
Plasmazellen charakterisiert (CORDY 1979; TALARICO und SCHATZBERG 2010).
Läsionen werden vor allem in der weißen Substanz gefunden (CORDY 1979;
TALARICO u. SCHATZBERG 2010). Die graue Substanz, die Meningen und der
Plexus chorioideus können ebenfalls betroffen sein (KIPAR et al. 1998).
NME ist histologisch durch eine nicht-eitrige Meningoenzephalitis, vorherrschend im
zerebralen Kortex, mit perivaskulären Infiltrationen von Lymphozyten, Plasmazellen
und Makrophagen charakterisiert. Darüber hinaus treten Nekrose und fokale
Malazien in der grauen Substanz auf (HINRICHS et al. 1996; TALARICO u.
SCHATZBERG 2010).
NLE betrifft überwiegend die periventrikuläre weiße Hirnsubstanz und zeigt große
Nekrosen mit Hohlraumbildung (SUMMERS et al. 1995; TALARICO u.
SCHATZBERG 2010).
Eine ante mortem Diagnose besteht meistens nur aus einer Verdachtsdiagnose, die
aufgrund des Signalements, der neurologischen Präsentation, der Liquoranalysen,
der neuroanatomischen Lokalisierung, und bildgebenden Verfahren, sowie durch den
Ausschluss von Infektionserregern gestellt wird (TIPOLD 1997).
Liquorproben können sehr hilfreich bei der Unterstützung einer Verdachtsdiagnose
sein und können eine erhöhte Anzahl von Entzündungszellen im Liquor aufdecken.
14

Literaturübersicht
Häufig wird eine mononukleäre oder gemischtzellige Pleozytose im Liquor von MUO
Tieren gesehen (TIPOLD 1997; TALARICO u. SCHATZBERG 2010).
Computertomographie (CT) oder die Magnetresonanz-Tomographie (MRT) sind
wertvolle diagnostische Hilfsmittel, um eine Verdachtsdiagnose stellen zu können
(TALARICO u. SCHATZBERG 2010). Abhängig von der jeweiligen Krankheit
offenbart ein MRT Veränderungen in den Meningen, in der grauen und/oder weißen
Substanz und deutet auf einen Entzündungsprozess hin.
2.2.2. Pathogenese
Die Ätiopathogenese ist nicht bekannt. Wie bei der SRMA, gibt es eine
Prädisposition für bestimmte Rassen und ein genetischer Einfluss wird vermutet
(TIPOLD 1997;
BARBER et al. 2011). NME wurde zunächst als “pug dog encephalitis” bezeichnet,
da sie erstmals bei Möpsen beschrieben wurde (KOBAYASHI 1994). Diese Krankheit
ist auch beim Malteser dokumentiert (STALIS 1995). Die starke genetische
Komponente wurde von BARBER et al. (2011) und GREER et al. demonstriert
(GREER et al. 2009; GREER et al. 2010).
Bei Yorkshire Terriern wurde eine nicht-eitrige, nekrotisierende Enzephalitis
beschrieben, die der des Mopses ähnelt, sich jedoch in der Verteilung der Läsionen
unterscheidet (TIPOLD et al. 1993b).
NME betrifft vor allem die graue Substanz, während NLE hauptsächlich die weiße
Substanz beeinflusst. In mehreren Studien wurden Autoantikörper gegen
Hirngewebe bzw. Astrozyten gefunden (UCHIDA et al. 1999; MATSUKI et al. 2004;
SHIBUYA et al. 2007; MATYASH u. KETTENMANN 2010; ZHANG u. BARRES
2010). Allerdings ist auch zu erwähnen, dass ähnliche Antikörper im Liquor von
anderen ZNS-Erkrankungen oder sogar von gesunden Tieren gefunden werden
(SHIBUYA et al. 2007; TODA et al. 2007; TALARICO u. SCHATZBERG 2010).
Derzeit wird vermutet, dass neben genetischen Einflüssen potenzielle infektiöse
15

Literaturübersicht
Auslöser zu einer Immundysregulation führen (TIPOLD 1997; TALARICO u.
SCHATZBERG 2010).
Spezifische Pathogene oder Antigene, die NME, NLE oder GME induzieren können,
wurden untersucht. Aufgrund der neuropathologischen Gemeinsamkeiten wurde eine
starke Virusbeteiligung vermutet, obwohl bisher kein Virus isoliert werden konnte
(HINRICHS et al. 1996; TIPOLD 1997; SCHATZBERG et al. 2005; TALARICO und
SCHATZBERG 2010).
Allerdings werden diese Studien weitergeführt, um potenzielle Antigene zu
identifizieren (SCHATZBERG 2007).
2.3. Bandscheibenvorfälle
2.3.1. Allgemeiner Überblick
Bandscheibenvorfälle (IVDD) gehören zu den degenerativen neurologischen
Erkrankungen und können in zervikale (C), thorakale (T), lumbale (L) oder sakrale
(S) Bandscheibenvorfälle eingeteilt werden (PLATT u. OLBY 2004; LORENZ et al.
2011). IVDD können entweder bei Protrusion des Anulus fibrosus Hansen-Typ 2 oder
bei Extrusion des Nucleus pulposus in den Wirbelkanal Hansen-Typ 1 benannt
werden (LORENZ et al. 2011).
Die Inzidenz von thorakolumbalen IVDD ist höher als von zervikalen oder lumbalen
IVDD (LORENZ et al. 2011).
Basierend auf dem klinischen Schweregrad der Erkrankung können Hunde mit IVDD
in fünf Symptomgruppen eingeteilt werden (SHARP u. WHEELER 2005). Der
neurologische Grad 1 besteht aus Schmerzen ohne neurologische Dysfunktion. Grad
2 wird als geringgradige Parese, Ataxie mit Propriozeptionsdefiziten und erhaltener
Gehfähigkeit präsentiert.
In Grad 3 werden hochgradige Paresen ohne Gehfähigkeit gesehen. Während der
Grad 4 plegische Tiere beschreibt, bei denen Tiefenschmerz noch vorhanden ist,
16

Literaturübersicht
besitzen Patienten mit Grad 5 keinen Tiefenschmerz mehr (SHARP u. WHEELER
2005).
Klinische Symptome variieren nach der neuroanatomischen Lokalisation und dem
Schweregrad des Bandscheibenvorfalls. Der Grad der neurologischen Dysfunktion
beeinflusst die Prognose (PLATT u. OLBY 2004; LORENZ et al. 2011).
Die Verdachtsdiagnose wird anhand des Signalements, der Vorgeschichte, der
neurologischen Untersuchung gestellt und durch Übersichtsröntgenbilder und
Myelographie unterstützt. Erweiterte Bildgebung, wie MRT oder CT, sind besser
geeignet, um die Lage und das Ausmaß der Läsion zu identifizieren (COATES 2004).
2.3.2. Pathogenese
Ein Bandscheibenvorfall „Hansen-Typ 1“ ist eine chondroide Bandscheibendegeneration
mit Herniation des Nucleus pulposus durch den Anulus fibrosus und
Extrusion von Kernmaterial in den Wirbelkanal, welches zu einer
Kompression des Rückenmarks führt (COATES 2004). Diese Form betrifft vor allem
junge chondrodystrophe Hunde im thorakolumbalen Übergang (T12 - L2), wobei
Dackel die größte Inzidenz haben (COATES 2004). Pudel, Beagle oder
Cockerspaniel sind andere chrondrodystrophe Rassen, bei denen Hansen Typ 1
Vorfälle gehäuft auftreten, allerdings kann diese Form auch in einigen großen
Hunderassen wie Deutscher Schäferhund, Dobermann oder Labrador Retriever
vorkommen (LORENZ et al. 2011).
Hansen Typ 2-Vorfälle sind mit einer Protrusion des Anulus fibrosus verbunden.
Dieser Typ ist häufiger bei älteren nicht chondrodystrophen Rassen wie Deutscher
Schäferhund oder Labrador Retriever vorzufinden (LORENZ et al. 2011).
Zusätzlich kann eine dritte Art von traumatischen Bandscheibenextrusionen ohne
vorherige degenerative Veränderungen auftreten und zu Verletzungen des
Rückenmarks ohne Kompression führen (DE LAHUNTA u. GLASS 2009, S. 258-
259).
17

Literaturübersicht
Traumatische Ereignisse und Kompression verursachen direkte Schädigungen des
Rückenmarks (OLBY 2010).
Die anfängliche traumatische Schädigung führt zu Mechanismen, die eine
Sekundärschädigung auslösen (COUGHLAN 1993; KRAUS 1996; JERRAM u.
DEWEY 1999; WEIL et al. 2008), zum Beispiel können reaktive Sauerstoff-Moleküle
zu einer neuronalen Schädigung führen (JERRAM u. DEWEY 1999; OLBY 2010).
Demyelinisierung, Entzündungsreaktionen, fokale Blutungen und Ödem sind die
Folge und resultieren in einer Schwellung des Rückenmarks (BRAUND 1993;
JERRAM u. DEWEY 1999).
Bei Rückenmarksverletzungen (SCI) aufgrund von Bandscheibenvorfällen kann eine
lokale Entzündungsreaktion nachgewiesen werden (SPITZBARTH et al. 2012), wobei
Leukozyteninfiltrate zu einer weiteren Schädigung des Rückenmarks führen.
FLEMING et al. (2009) demonstrierten, dass eine reduzierte Leukozyteninfiltration
nach SCI das Gewebe schützen kann.
In SRUGO et al. `s Studie (2011) wurde nachgewiesen, dass eine Pleozytose des
Liquor cerebrospinalis positiv mit dem Schweregrad der thorakolumbalen Schädigung
des Rückenmarks bei Hunden mit IVDD verbunden ist. Sie fanden heraus,
dass der Anteil der Liquormakrophagen bei den Hunden höher war, die keine Gehfähigkeit
wiedererlangten und auch keinen Tiefenschmerz besaßen (SRUGO et al.
2011). Mechanismen zur Einwanderung dieser mononukleären Zellen sind beim
Hund nicht weiter untersucht.
2.4. Chemokin MIP-3β /CCL19
Chemokine sind wichtige Faktoren für die Zellwanderung und Pathogenese von
Entzündungen im ZNS (DOGAN u. KARPUS 2004). Die meisten Chemokine sind im
entzündeten Gewebe unter pathologischen Bedingungen hochreguliert und
beeinflussen das Migrationsverhalten und die Aktivierung von Immunzellen
(KARPUS u. RANSOHOFF 1998).
18

Literaturübersicht
Sie können Oberflächenmoleküle auf zirkulierenden peripheren Entzündungszellen
hoch regulieren, welche daraufhin effizienter an den Endothelzellen der Blut-Hirn-
Schranke (BBB) anhaften und auf die lokalen Chemokingradienten des ZNS
reagieren können (CONSTANTIN 2008).
Ist die Regulation der Chemokinproduktion gestört, können diese Moleküle Immunzellen
dauerhaft aktivieren und eine chronische Entzündung verursachen
(BAGGIOLINI 1998; LUSTER 1998).
Ein Chemokin, das ebenfalls in die Pathogenese von Entzündungsreaktionen
involviert ist, ist das MIP-3β (Macrophage Inflammatory Protein-3 beta), welches
auch als (CC motif)-Ligand 19 (CCL19) bekannt ist.
Es wird von verschiedenen Zellen, wie zum Beispiel dendritischen Zellen (DC),
Makrophagen und einigen nicht-hematopoetischen Zellen hergestellt (CYSTER
1999). Es bindet an den CCR7 Rezeptor, der auf myeloischen Zellen (KIVISÄKK et
al. 2004), Gedächtnis-T-Zellen, aktivierten B-Zellen und reifen DC exprimiert wird
(SALLUSTO u. LANZAVECCHIA 2000). In Studien von Nagetieren konnte die
Produktion von CCL19 auch mit Astrozyten und Mikroglia in Verbindung gebracht
werden (SERAFINI et al. 2001). Chemokinproduktion erfolgt entweder konstitutiv
oder induziert (KRUMBHOLZ et al. 2007). Eine konstitutive CCL19 Bildung im ZNS
ist möglicherweise für eine schnelle Immunüberwachung notwendig (KRUMBHOLZ
et al. 2007). Bei der Entwicklung von chronischen Entzündungen im ZNS konnte eine
Beteiligung von CCL19 nachgewiesen werden (PASHENKOV et al. 2003). Bei der
Multiplen Sklerose (KRUMBHOLZ et al. 2007) oder der chronisch experimentellen
autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) (SERAFINI et al. 2001) wird CCL19 de novo
exprimiert.
Mikroglia sind Effektorzellen des Immunsystems im ZNS (WILLIAMS et al. 2001), ihr
„Homing“ könnte auch durch CCL19 geregelt sein (KIM et al. 1998). Mikroglia
produziert möglicherweise auch CCL 19, sie ist bei Hunden mit MUO (STEIN 2004)
und Verletzungen des Rückenmarks (BOEKHOFF et al. 2012) aktiviert.
19

Literaturübersicht
Die vorliegende Arbeit ist in zwei Abschnitte gegliedert:
Die erste Studie (MIP-3β/CCL19 associated with the invasion of mononuclear cells in
neuroinflammatory and non-neuroinflammatory diseases in dogs) untersucht, ob das
Protein MIP-3β / CCL19 teilweise an der Pathogenese der Invasion von
mononukleären Zellen in den Subarachnoidalraum von Hunden mit entzündlichen
und nicht-entzündlichen ZNS-Erkrankungen beteiligt ist und ob CCL19 als wertvoller
Biomarker für die Progression von Krankheiten beziehungsweise als prognostischer
Indikator dienen kann.
In der zweiten Studie (Successful medical management of an intra- and extracranial
abscess of a dog secondary to a bite wound) wird der Erfolg einer medikamentellen
Behandlungsstrategie für die Therapie eines Hirnabszesses dargestellt, welcher eine
neuroinflammatorische Erkrankung mit infektiöser Ursache repräsentiert.
20

Material und Methoden
Kapitel 3 Material und Methoden
3.1. Patientenmaterial
In dieser retrospektiven Studie wurden insgesamt 141 Hunde untersucht, die zum
einen in der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule in Hannover
und zum andern im Veterinary Emergency and Specialty Center (VESC) Santa Fe,
NM, USA vorstellig waren.
Von diesen Hunden wurden gepaarte Serum- und Liquorproben entnommen und bei
-20°C aufbewahrt.
Die Patienten wurden insgesamt in vier Hauptgruppen aufgeteilt.
Gruppe 1: 51 Hunde mit Steroid-Responsiver Meningitis-Arteriitis (SRMA)
in der akuten Phase (n=25) und während der Behandlung (n=26)
Gruppe 2: 27 Hunde mit Meningoenzephalomyelitis unbekannten Ursprungs (MUO)
ohne Behandlung (n=16) und mit einer Prednisolonbehandlung (n=11)
Gruppe 3: 36 Hunde mit Bandscheibenvorfällen (IVDD) unterschiedlichen
Schweregrades Grad 2/3 (n=25 ) und Grad 4/5 (n=11)
Gruppe 4: 27 Hunde als Kontrollgruppe mit idiopathischer Epilepsie (IE) (n=21) und
gesunde Hunde (n=6)
Für den Chemotaxis Assay wurden Liquorproben von insgesamt sieben Patienten
untersucht. Drei Patienten mit SRMA, zwei Hunde mit MUO und zwei Liquorproben
von Patienten mit diagnostiziertem Bandscheibenvorfall wurden ausgewertet. Die für
diesen Test benötigten peripheren mononukleären Zellen (PMCs) wurden aus fünf ml
frischem EDTA-Blut isoliert, das über Zephalicavenenpunktion eines gesunden
Hundes entnommen wurde.
21

Material und Methoden
3.2. Material
3.2.1. Reagenzien und Chemikalien
- Histopaque 1,119, (Best.-Nr. 1119-1), Fa. Sigma-Aldrich
- Pancoll human 1,077, (Best.- Nr. P04-060500), Fa. Biotech GmbH
- Trypan- Blau-Lösung 0,4% in PBS, (Best.-Nr. T-6146), Fa. Sigma-Aldrich,
Schnelldorf
- AlamarBlue, Fa. Serotec, Düsseldorf, Deutschland
- kanines MIP-3β/CCL19 ELISA Test-Kit (E90096Ca 96 Tests), USCN Life Science
Inc., Wuhan, PR China
3.2.2. Geräte
- Lichtmikroskop, H 600, Fa. Helmut Hund GmbH, Wetzlar
- Türk- Zählkammer, Fa. Brand, Wertheim
- CO2-Brutschrank, MCO-18AIC (UV), Fa. SANYO Sales und Marketing Europe
GmbH, München
- Reagenzglasschüttler Reax control, Fa. Heidolph, Schwabach
- Reinstwasser-Aufbereitungssystem GenPure, Fa. TKA Thermo Fisher Scientific,
Niederelbert
- Mikrobiologische Sicherheitswerkbank HERAsafeKS, Fa. Thermo Fisher Scientific,
Niederelbert
- Gefrierschrank Premium NoFrost, Fa. Liebherr, Ochsenhausen
- Kühlschrank Comfort, Fa. Liebherr, Ochsenhausen
- Ultraschallbad Ultrasound-7-neutral (Art. 5356), Fa. Roth, Karlsruhe
- Laborwaage LabStyle204, Fa. Mettler Toledo, Giessen
- Magnetrührer mit Heizplatte, Typ MR 3001,Fa. Heidolph, Schwabach
- Magnetrührstäbchen, verschiedene Größen, 90 715, -730, -751, Fa. H+P
Labortechnik, Oberschleißheim
- Plattenrüttler Promax 1020, Fa. Heidolph, Schwabach
22

Material und Methoden
- Tischzentrifuge Rotina 35R, Fa. Hettich, Tuttlingen
- Wasserbad mit Einhängethermostat, Fa. Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach
- Synergy 2 Multi-Detektions-Reader für Mikroplatten, Fa. BioTek Instruments, Bad
Friedrichshall
- Vet-MR Grande 0.25 Tesla field, Fa. Esaote, Italy
3.2.3. Laborbedarf
- EDTA-Röhrchen, 5 mL , Fa. Sarstedt, Nümbrecht
- 96-well Chemotaxis-Kammer (Polycarbonatfilter 5 µm Porengröße, 3.2 mm
Durchmesser, 30 µl well-Größe), Chemo TX Disposable Chemotaxis system,
NeuroProbe, Gaithersburg, MD
- kanines MIP-3β/CCL19 ELISA Test-Kit (E90096Ca 96 Tests), USCN Life Science
Inc., Wuhan, PR China
- Pipettenspitzen: 10 µl (Kristall; Best.-Nr. 702504), Fa. Brand, Wertheim
200 µl (gelb) (Best.-Nr. 613-0240), Fa. VWR, Darmstadt
1000 µl (blau) (Best.-Nr. 2100610), Fa. Ratiolab, Dreieich
- Pipetten Transferpette® einstellbar (0,1-1000 µl), Fa. Brand, Wertheim
- Pipettierhelfer accu-jet® pro, Fa. Brand, Wertheim
- Polystyrolröhrchen 3,5 ml und 5 ml (Art.-Nr. 55.1579 bzw. 55.484.001), Fa.
Sarstedt, Nümbrecht
- Einmalhandschuhe Novaglove® -Latex (Best.-Nr. 905451), Fa. NOBA
Verbandsmittel, Wetter
- Glas-Pasteurpipetten, 150 ml (Best.-Nr. 612-1798), Fa. VWR, Darmstadt
- Mehrfachdispenser Handy-step® (Best.-Nr. 705100), Fa. Brand, Wertheim
- Präzisionsdispenserspitzen 5 ml, 25 ml (Best.-Nr. 702376, 702380), Fa. Brand,
Wertheim
- Eppendorf Safelock-Tubes, 1,5 ml (Best.-Nr. 0030121694), Fa. Eppendorf,
Hamburg
- Bechergläser, Fa. VWR, Darmstadt
23

Material und Methoden
- Polypropylenröhrchen mit Deckel, 2 ml (Art.-Nr. 72.694), Fa. Sarstedt, Nümbrecht
- Polypropylenröhrchen 4 ml (Best.- Nr. 55.532), Fa. Sarstedt, Nümbrecht
- Reagenzröhrchen mit Verschluss, Polypropylen, 15 ml (Best.- Nr. 62.554.001),
Fa. Sarstedt, Nümbrecht
3.2.4. Puffer und Lösungen
- HBSS, Hank`s balancierte Salzlösung (Best.- Nr. H4891), Fa. Sigma-Aldrich,
Deisenhofen Deutschland
- Zellwaschlösung (Best.- Nr. 349524), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
- PBS, Phosphatgepufferte Salzlösung (pH 7,4):
NaCl 137,0 mM
KCl 2,7 mM
Na2HPO4 8,1 mM
KH2PO4 1,5 mM
- Roswell Park Memorial Institute (RPMI)1640 Medium mit L-glutamine, Gibco
Invitrogen GmbH, Karlsruhe
- BSA, bovines Serumalbumin (Best.-Nr. A4503-50G), Fa. Sigma-Aldrich, Steinheim
3.2.5. Computer-Software
- Gen5 Reader Control and Data Analysis Software, Fa. BioTek Instruments, Bad
Friedrichshall
- Statistik Software- R® (R Foundation for Statistical Computing)
24

Material und Methoden
3.3. Methode
3.3.1. ELISA
Das Chemokin MIP-3β/CCL19 wurde mit Hilfe eines Sandwich-ELISAs (Enzyme
linked immunoabsorbent assay) gemessen.
In der Studie wurde ein speziell für das kanine MIP-3β/CCL19 entwickelter ELISA-Kit
verwendet (E90096Ca 96 Tests), welcher nach den Richtlinien des Herstellers
angewandt wurde (USCN Life Science Inc., Wuhan, PR China).
In dem ELISA-Kit ist eine Mikrotiterplatte enthalten, die mit einem monoklonalen
Antikörper spezifisch für das MIP-3β/CCL19 vorbeschichtet ist. Das Funktionsprinzip
des SANDWICH-ELISAs beruht darauf, dass das im Patientenserum oder -liquor
enthaltene MIP-3β/CCL19 an dem monoklonalen Antikörper der Mikrotiterplatte
haftet. An das gebundene Protein kann in einem weiteren Schritt nun ein zweiter
Antikörper binden. Nach Farbreaktion eines Substrates kann die Konzentration des
Chemokins gemessen werden. Zwischen den einzelnen Schritten werden die
überschüssigen Antikörper durch entsprechende Waschvorgänge entfernt.
Liquorproben wurden entweder unverdünnt eingesetzt oder wurden je nach MIP-3β /
CCL19 Ausgangskonzentration mit der Standardverdünnung bis zu einer Konzentration
von 1:13 verdünnt. Die Serumproben wurden für die Untersuchungen des
Proteins mit Hilfe des ELISAs unverdünnt eingesetzt.
Auf jeder 96- well Mikrotiterplatte wurden sieben Kavitäten für die Verdünnungsreihe
des Standards verwendet, eine Kavität wurde für den „Blank“ (Leerwert) und die
restlichen Kavitäten wurden für die Liquor- und Serumproben benutzt (siehe
Anhang).
Vier Liquor- und Serumproben von Hunden mit idiopathischer Epilepsie dienten als
Kontrolle. Eine dieser Proben wurde als Kontrolle auf jeder Mikrotiterplatte in jedem
Experiment mitgeführt. Als positive Kontrolle dienten Liquor- und Serumproben von
Hunden mit entzündlichen Erkrankungen und wurden ebenfalls bei jedem
Experiment in gleicher Konzentration mit untersucht.
25

Material und Methoden
Nach einer zweistündigen Inkubationszeit (befeuchtete Luft, 37 °C, 5 % CO2
Konzentration; SANYO Sales und Marketing Europe GmbH, München) wurden die
Liquor- und Serumproben aus jeder Kavität entfernt. Ein für CCL19 spezifischer
Biotin-konjugierter polyklonaler Antikörper (USCN, Life Science Inc., Wuhan, PR
China) wurde zu jeder Kavität der Mikrotiterplatte hinzugegeben. Nach einer weiteren
einstündigen Inkubationszeit wurden die Kavitäten dreimal mit einer
Waschpufferlösung gewaschen (USCN Life Science Inc., Wuhan, PR China). Avidin,
an welches eine Meerrettich-Peroxidase konjugiert ist (USCN, Life Science Inc.,
Wuhan, PR China), wurde zu jeder Vertiefung hinzugegeben und für 30 Minuten bei
37° C inkubiert. Der wie zuvor durchgeführte Waschvorgang wurde insgesamt
fünfmal wiederholt. Bei dieser Untersuchung wird anschließend das TMB Substrat
hinzugegeben und durch die Peroxidase umgesetzt, so dass eine blaue
Farbveränderung entsteht.
Durch die Zugabe von Schwefelsäure (USCN, Life Science Inc., Wuhan, PR China)
wird die Enzym-Substrat-Reaktion beendet und eine gelbe Farbe entsteht. Die
entstandene Farbänderung konnte spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von
450nm ± 10nm auf einem Mikroplatten-Reader, welcher mit der Analysesoftware Gen
5 ausgestattet ist, gemessen werden (Synergy2 HT Multimode-Mikroplatten-Reader,
BioTek Instruments Inc., Bad Friedrichshall Deutschland). CCL19 Konzentrationen
zwischen 15.6 bis 1000 pg/ml können mit dieser Methode nachgewiesen werden.
Die Standardkurve (Anhang) wurde mit Hilfe eines lyophilisierten Standard-Reagenz
(USCN, Life Science Inc., Wuhan, PR China) des ELISA-Kits erstellt. Die
Konzentrationen für die Standardkurve betrugen 1000 pg/ml, 500 pg/ml, 250 pg/ml,
125 pg/ml, 62.5 pg/ml, 31.2 pg/ml und 15.6 pg/ml. Die minimale nachweisbare
Menge des kaninen MIP-3β/CCL19 beträgt 6.5 pg/ml. Alle Messungen der Liquorund
Serumuntersuchungen wurden in Duplikaten durchgeführt. Die gemessene OD
(optische Dichte) konnte mit Hilfe der Standardkurve, die bei jedem Experiment
erstellt wurde, in die Chemokinkonzentration (pg/ml) umgerechnet werden. Somit
erlaubt der ELISA eine quantitative Bestimmung des Chemokins MIP-3β/CCL19.
26

Material und Methoden
Abb. 1: Prinzip der MIP-3β / CCL19 - Detektion mit Hilfe eines SANDWICH-ELISAs
modifiziert nach: BURNS (2010)
Testcharakteristika
Präzision und Reproduzierbarkeit
Die Präzision des MIP-3β/CCL19 ELISAs wird durch die Intra-assay-Varianz und
durch die Inter-assay-Varianz dargestellt. Sie geben das Maß der analytischen
Streuung an, den Variationskoeffizienten (CV% = SD/mean * 100) (HALWACHS-
BAUMANN 2011).
Die Intra-assay-Varianz beschreibt die Abweichungen innerhalb des gleichen
Messdurchlaufes (HALWACHS-BAUMANN 2011). Die Inter-assay-Varianz gibt die
Messabweichung auf unterschiedlichen Mikrotiterplatten derselben Proben an
mehreren aufeinanderfolgenden Tagen an (HALWACHS-BAUMANN 2011).
Drei Proben mit niedriger, mittlerer und hoher kaniner MIP-3β/CCL19- Konzentration
wurden 20 Mal auf einer Mikrotiterplatte getestet, wobei der CV unter 10 % betrug.
Drei Proben mit niedriger, mittlerer und hoher kaniner MIP-3β/CCL19 Konzentration
wurden auf drei verschiedenen Platten getestet, wobei die Interassay-Varianz CV
unter 12 % betrug (USCN LIFE SCIENCE INC. 2011).
27

Material und Methoden
3.3.2. Chemotaxis-Assay
Um nachzuweisen, dass MIP-3β/CCL19 auch funktionell aktiv im Liquor
cerebrospinalis vorliegt, wurde die chemotaktische Aktivität für mononukleäre Zellen
mit Hilfe eines Migrationsassays unter Verwendung einer Einweg-96-Well-
Chemotaxis Kammer (Chemo TX Disposable Chemotaxis system, NeuroProbe,
Gaithersburg, MD) gemessen. Aus 5 ml peripherem Blut eines gesunden Hundes
wurden mononukleäre Zellen durch Ficoll-Gradienten-Zentrifugation isoliert. Die
Zellzahl wurde bestimmt und der Chemotaxis-Assay durchgeführt.
Durchführungsprotokoll für die Separation mononukleärer Zellen
Periphere mononukleäre Zellen (PMCs) wurden aus fünf Millilitern frischem EDTA-
Blut über Punktion der Vena cephalica eines gesunden Hundes erhalten. Die PMCs
wurden durch Ficoll-Gradienten-Zentrifugation nach einer modifizierten Technik nach
TOTH et al. (1992) getrennt (siehe Anhang).
Durchführung des Chemotaxis-Assays
Für den Chemotaxis-Assay wurden fünfundzwanzig Mikroliter (µl) der vorher auf die
erwünschte Konzentration eingestellten Zellsuspension (50.000 Zellen / 25 µl) direkt
auf die Filteroberfläche der Chemotaxis- Assay Kammer (Chemo TX Disposable
Chemotaxis system, NeuroProbe, Gaithersburg, MD) pipettiert. Die Kammer ist mit
einer hydrophoben Maske um jede Teststelle beschichtet, wodurch die
Zellsuspension auf diese vorgegebenen Teststellen beschränkt bleibt und die
Notwendigkeit für Vertiefungen auf der Filteroberfläche entfallen.
Eine bekannte Verdünnungsreihe der Zellsuspension mit 50.000 Zellen, 25.000
Zellen, 12.500 Zellen, 6.250 Zellen, 3.125 Zellen, 1.563 und 781 Zellen wurde
hergestellt und in eine Reihe der Kavitäten der Chemotaxis-Kammer pipettiert. Diese
Verdünnungsreihe dient als Standard des Chemotaxis-Assays, mit dem die zu
messenden Liquorproben verglichen werden konnten. Der Rest der 96-Well Platte
28

Material und Methoden
wurde jeweils mit 29 µl der zu untersuchenden Liquorproben beladen, welche in
Rosewell Park Memorial Institute (RPMI)1640 Medium mit L-glutamine (Gibco®
RPMI Media 1640) und 1 % Bovinen Serum Albumin (BSA) verdünnt wurden. Die zu
untersuchenden Liquorproben stammten von drei unbehandelten Hunden mit SRMA,
zwei Hunden mit einem Bandscheibenvorfall und zwei unbehandelten Hunden mit
vermutlicher MUO.
In zwei Kavitäten der Platte wurde nur Medium pipettiert, um als negative Kontrolle
des Versuches zu dienen.
Die mit der Standardreihe, den Liquorproben, sowie der negativen Kontrolle
beladenen Kammern und die auf der Filteroberfläche zugesetzte Zellsuspension
wurde bei 37°C in befeuchteter Luft mit 5% CO2 in einem Inkubator (SANYO Sales &
Marketing Europe GmbH, München) inkubiert. Die Migrationszeit der Zellsuspension
erfolgte für 30 Minuten, 1 Stunde, 1,5 Stunden und 2 Stunden. Der Filter wurde
entfernt und die Zellen, die durch den Filter in die unteren Kavitäten wanderten,
wurden mit Hilfe des alamarBlue ®-Assays (Serotec, Düsseldorf, Deutschland)
gezählt.
AlamarBlue Reagenz® wurde als 10% des Probenvolumens hinzugegeben,
woraufhin eine 1- bis 3-stündige Inkubation bei 37 °C erfolgte. Resazurin, der
Wirkstoff des alamarBlue ® Reagenz, ist eine blaue nicht-toxische, zellpermeable
Verbindung, die in dieser Form nicht-fluoreszierend ist. Durch Eintritt in das
Zellinnere wird Resazurin durch lebensfähige Zellen zu Resorufin reduziert, welches
eine rote Farbe aufweist und stark fluoreszierend ist. Die resultierende Fluoreszenz
wurde mit Hilfe eines Mikroplatten-Reader mit der Analyse-Software Gen 5
(Synergy2 HT Multimode-Mikroplatten-Reader, BioTek Instruments Inc., Bad
Friedrichshall Deutschland) gemessen und die gewanderte Zellzahl bestimmt.
29

Material und Methoden
3.4. Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der Messwerte und deren graphische Darstellung in
Form von Box-and-Whisker-Plots erfolgte mit Hilfe des Statistikprogramms R-
Software (R Foundation for Statistical Computing).
Der Shapiro- Wilk Test wurde für die Prüfung der Normalverteilung verwendet und
zeigte, dass nicht alle Daten normal verteilt waren.
Daher wurden die nicht-parametrischen Tests, der Kruskal-Wallis-Test und der Mann-
Whitney-Wilcoxon-Test für die Beurteilung statistischer Zusammenhänge verwendet.
Die Korrelation zwischen zwei Variablen wurde mittels Spearman und Kendall
Rangkorrelation getestet. Die statistische Signifikanz wurde bei 5% (p

Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19
Kapitel 4 Untersuchung des Chemokins MIP-3β/CCL19 in Liquorproben von
Hunden mit entzündlichen und nicht-entzündlichen ZNS
Erkrankungen
MIP-3β/CCL19 associated with the invasion of mononuclear cells in
neuroinflammatory and non-neuroinflammatory diseases in dogs
Janina Bartels¹, Scott J. Schatzberg², Brett G. Darrow³, Lijing Bu 4 , Regina Carlson¹,
Andrea Tipold¹*
¹ Department of Small Animal Medicine and Surgery, University of Veterinary Medicine
Hannover, Buenteweg 9, D-30559 Hannover, Germany
² VESC Veterinary Emergency and Specialty Center, 2001 Vivigen Way, Santa Fe,
NM 87505, USA
³ Bremen, Germany
4
Biology Department, University of New Mexico, 1 University Boulevard,
Northeast Albuquerque, NM 87131, USA
* Corresponding author: email: andrea.tipold@tiho-hannover.de (A.Tipold)
31

Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19
Abstract
Background:
Chemokines are important factors in the mechanism of cell migration and
pathogenesis of central nervous system (CNS) inflammatory reactions. MIP-
3β/CCL19 is one chemokine that may play a major role in this context.
Objective: The aim of this study was to prove the hypothesis that MIP-3β/CCL19 is
involved in the pathogenesis of mononuclear cell migration into the subarachnoid
space of dogs with inflammatory and non-inflammatory CNS diseases such as
steroid-responsive meningitis-arteritis (SRMA) and intervertebral disc disease (IVDD)
and may serve as a valuable biomarker for the progression of the diseases.
Material and methods: This retrospective study analyzed a total of 141 dogs.
Experiments were performed on cerebrospinal fluid (CSF) and peripheral blood (PB)
samples of dogs affected with SRMA during the acute phase (n = 25) as well as
during treatment (n = 26). Dogs with SRMA were compared to dogs with presumed
meningoencephalomyelitis of unknown origin (MUO) receiving no therapy (n = 16)
and with patients receiving prednisolone therapy (n= 11).
A control group with normal cell count consisted of dogs with Idiopathic Epilepsy (IE)
(n= 21) and of healthy dogs (n= 6). Additionally, dogs with IVDD of varying severity
(n= 36) were analyzed. Concentration of MIP-3β/CCL19 in the CSF and serum were
determined by a sandwich ELISA. Migration assays were performed on seven
selected CSF samples using a disposable 96-well chemotaxis chamber (untreated
SRMA n = 3 ; untreated MUO n = 2 ; IVDD n = 2).
Results: MIP-3β/CCL19 was detectable in CSF samples of all dogs. Dogs with
untreated SRMA/MUO displayed pronounced MIP-3β/CCL19 elevations compared to
the control group and patients receiving glucocorticosteroid treatment.
CSF cell count of untreated SRMA/MUO patients was significantly positively
correlated with the MIP-3β/CCL19 CSF concentration. IVDD patients also had
elevated CSF MIP-3β/CCL19 concentration compared to controls, but values were
considerably lower than in inflammatory CNS diseases. Selected CSF samples
including inflammatory and non-inflammatory neurologic diseases displayed
32

Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19
chemotactic activity for mononuclear cells in the migration assay, proving that the
measured CSF protein is available in the active form.
Conclusions: The hypothesis was confirmed that MIP-3β/CCL19 is involved in the
pathogenesis of SRMA/MUO, possibly perpetuating an autoimmune reaction.
The marked chemotactic activity for mononuclear cells leads to the assumption that
this chemokine could be associated with the migration of mononuclear cells into the
subarachnoid space of dogs. The elevation of CSF MIP-3β/CCL19 in IVDD suggests
that it also plays a role in the secondary wave in spinal cord injuries (SCI). CSF MIP-
3β/CCL19 concentration may serve as a prognostic indicator in SCI, be a precious
biomarker for developing new treatment schemes and for verifying the success of
treatment.
1. Introduction
In several neurologic diseases a pleocytosis is often detected in the cerebrospinal
fluid (CSF). Lymphocytes and plasma cells have been shown to prevail in the cell
count in viral infections (Wamsley and Alleman 2004), chronic steroid responsive
meningitis-arteritis (SRMA) (Tipold and Jaggy 1994), granulomatous
meningoencephalomyelitis (GME) and in necrotizing encephalitides (NE) (Wamsley
and Alleman 2004; Talarico and Schatzberg 2010). A neutrophilic pleocytosis is
characteristic for bacterial infections and the acute stage of SRMA (Tipold and Jaggy
1994). A mixed cell population can be seen in protozoal diseases, chronic bacterial
infections, necrotic lesions, and in GME (Wamsley and Alleman 2004). In addition to
inflammatory lesions, mild mixed cell pleocytosis can also be seen with situations
such as acute intervertebral disc herniation that results in central nervous system
(CNS) myelomalacia or infarction (Chrisman 1992).
Chemokines are important factors in the mechanism of cell migration and thus play a
relevant role in the pathogenesis of inflammation in the CNS (Dogan and Karpus
2004). They upregulate surface molecules on circulating inflammatory cells in the
periphery which enable them to more efficiently adhere to the endothelial cells of the
blood-brain barrier (BBB) and react to the CNS chemokine gradients (Constantin
33

Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19
2008). One aim of therapeutic research would be to develop specific treatments to
modulate the inflammatory response within the CNS (Bar- Or 2008) in diseases such
as SRMA and meningoencephalitides of unknown origin (MUO), but also the
inflammatory reaction in disc diseases possibly leading to secondary wave injury
(Jeffery 2009; Jeffery et al. 2011; Boekhoff et al. 2012).
One chemokine that could be involved in the pathogenesis of an inflammatory
reaction and is a potent candidate for future modulation is MIP-3β (Macrophage
Inflammatory Protein- 3 beta) also known as (C-C motif) ligand 19 (CCL19).
This protein will be referred to as CCL19 for most of the text of this manuscript but,
these terms may be used interchangeably. CCL19 is constitutively expressed in the
CNS for fast immunosurveillance (Krumbholz et al. 2007) and is produced by
different cells such as dendritic cells (DC), macrophages and some nonhematopoietic
cells (Cyster 1999; Krumbholz et al. 2007). It binds to the CCR7 receptor which is
expressed on myeloid cells (Kivisäkk et al. 2004), mature DC, T cells, as well as
activated B cells (Sallusto and Lanzavecchia 2000; Sallusto et al. 2000; Pashenkov
et al. 2003).
CCL 19 was shown to be probably involved in the development of chronic
inflammation and lymphoid neogenesis guiding B cells and T cells into the target
organ, such as the brain (Pashenkov et al. 2003). It is also expressed de novo in
various neuroinflammatory diseases, for example multiple sclerosis (Krumbholz et al.
2007) or chronic experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) (Serafini et al.
2001; Pashenkov et al. 2003).
Bone- marrow derived microglia or macrophages connect the normal brain with the
immune system (Williams et al. 2001; Krumbholz et al. 2007). Guiding these cells to
the CNS might also be regulated by CCL19, due to its role in attracting macrophage
progenitors (Kim et al. 1998; Krumbholz et al. 2007).
Microglia itself may produce CCL 19 and was shown to be activated in canine
diseases such as MUO (Stein 2004) and spinal cord injury (Boekhoff et al. 2012).
In the current study the hypothesis should be proven that the protein MIP-3β/ CCL19
is at least partly involved in the pathogenesis of the invasion of mononuclear cells
34

Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19
into the subarachnoid space of dogs and could be used as a valuable biomarker for
disease progression. Therefore, three diseases were chosen: steroid-responsive
meningitis-arteritis (SRMA), meningoencephalitis of unknown origin (MUO), and
intervertebral disc disease (IVDD). In SRMA Th2-mediated immune response was
shown (Schwartz et al. 2008b; Schwartz et al. 2011) and a Th17 skewed immune
response may be accountable for maintaining the inflammatory reaction (Maiolini
2012; Waite and Skokos 2012). For comparison, MUO was chosen as a disease
group with a predominantly mononuclear pleocytosis within the CSF (Wamsley and
Alleman 2004; Dewey 2008, Granger et al. 2010) despite the heterogeneity of the
group. Examples of these idiopathic inflammatory disorders of the CNS are NE and
GME, in which a strong genetic component (Barber et al. 2011), occurrence of
autoantibodies (Shibuya at al. 2007) and the distribution of lymphocytes and
macrophages (Park et al. 2012) suggest a strong involvement of mononuclear cells
in the pathogenesis. Therefore, CCL19 should be analyzed to prove its involvement
in the migration of mononuclear cells into the CSF.
A third group was analyzed. In spinal cord injury after intervertebral disc herniation a
local inflammatory reaction was shown (Spitzbarth et al. 2012) and the macrophage
count within the CSF is thought to be positively associated with the degree of spinal
cord damage (Srugo et al. 2011).
In the aforementioned diseases of dogs CCL19 was measured in CSF and serum
samples. With this investigation we seek to understand the role of CCL19 in the
mononuclear migration in CSF and to establish whether this chemokine is generally
associated with CNS inflammation or specific to certain diseases.
2. Materials and methods
Samples from patients and controls
A total of 141 patients were analyzed, which were referred to the Department of
Small Animal Medicine and Surgery, University of Veterinary Medicine Hannover,
35

Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19
Germany and the Veterinary Emergency and Specialty Center (VESC) Santa Fe,
NM, USA (table 1). The studies were performed according to the ethical guidelines of
the University of Veterinary Medicine Hannover.
CSF and serum samples for CCL19 assays were obtained and stored at -20°C.
Blood was collected via cephalic, saphenous or jugular venipuncture into serum
tubes. CSF collection was performed under general anesthesia by cisternal or lumbar
puncture.
SRMA group: Fifty one patients were diagnosed with SRMA by clinical signs,
complete blood and CSF examinations, normal cervical radiographs, elevated IgA
levels in CSF and serum, response to glucocorticosteroid treatment and the absence
of other conditions causing cervical pain.
The SRMA untreated group consisted of 25 patients which received no medication at
the time of sample collection. Nine of these dogs were evaluated separately, five
patients having received onetime pre-treatment with steroids and four patients having
relapsed after stopping previous therapy. CSF and blood findings are summarized in
table 1.
The SRMA treatment group consisted of 26 of the 51 patients receiving more than
one steroid treatment prior to CSF acquisition.
MUO group: CSF was also obtained from 27 patients with presumed MUO. Sixteen
of these patients received no therapy, while 11 patients were already being treated
with prednisolone. The suspected diagnosis was supported by clinical signs, CSF
analysis (predominantly mononuclear pleocytosis) and magnetic resonance imaging
(MRI) findings (T1W with and without contrast medium, T2W and flair sequence). In
ten patients the diagnosis was confirmed by histopathological examination and
included four cases with GME, two with NE and four cases with MUO with a
histopathological pattern not related to GME or NE.
IVDD group: The CSF of 36 patients with intervertebral disc disease were analyzed.
The diagnosis of IVDD was made by clinical signs, CSF analysis, MRI and surgery
36

Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19
findings. Based on the severity of clinical signs the patients were grouped into five
grades (Sharp and Wheeler 2005).
Twenty five patients were combined with the neurologic status grade 2/3 to one
group. The dogs were mild to severely paretic, but capable of spontaneous
movement.
A second group contained 11 patients with the neurologic status grade 4/5, which
were paralytic with or without deep pain sensation.
Control group: CSF samples with normal reference values (less than 5 white blood
cells/µl, cisternal protein less than 25 mg/dl) (Wamsley and Alleman 2004) from 27
dogs were analyzed. Twenty one patients were diagnosed with idiopathic epilepsy
based on clinical signs, blood work, MRI and CSF results and six samples were
obtained from healthy dogs (Animal Experiment number: 33.42502/05-12.05).
Number of patients and their laboratory findings are provided in table 1.
SRMA untreated SRMA treated MUO untreated MUO treated IVDD 2/3 IVDD 4/5 IE/ healthy IE healthy
No. patients 25 (5/4/16) 26 16 11 25 11 27 21 6
CSF cellcount/3μL 528 (200-3800) 1 (0.25-2) 196 (25.8-731.8) 2 (1-3) 1 (1-3) 3 (2.5-4) 1 (0-1) 1 (0-1)
CSF protein mg/dl 28 (20-55) 12 (11-14) 40 (25.3-97.3) 16 (14-20) 19 (15-22) 14 (10.5-16) 12 (10-14) 12 (10-14)
CSF Ig A 1.6 (0.4-2.7) 0.2 (0.09-0.45)
Serum Ig A 184 (106-282) 75.4 (47.9-98.7)
blood leucocytes 20.7 (18-27) 10.9 (9.8-13.9) 10.6 (9.7-13.1) 10 (9.7-12) 8 (7.5-11) 13.2 (8.3-15.7) 10 (9-12) 10 (9-12) 10 (9-12)
*1000 /μL
CSF CCL19 pg/ml 1690 (671.5-3200) 80.5 (68-111.5) 373.5 (174.5-776.8) 91.8 (76.6-95) 108.2 (82-162) 149.2 (97.6-207) 60.7 (51.2-79) 66 (56-87.1) 51.2 (40.1-54.2)
Serum CCL19 pg/ml129.3 (73-198) 84.5(35.5-131.9) 160.6 (79.7-467.9) 51.8 (32.4-190) 146.4 (73-191) 97.6 (47-129.3) 97.8 (64-143) 88.3 (55.8-127) 108.9 (90.4-192)
Table 1. CSF and serum characteristics in patients with IE, neuroinflammatory
disease, IVDD and clinically healthy patients
Abbreviations: SRMA = steroid-responsive meningitis-arteritis; MUO =
meningoencephalomyelitis of unknown origin; IVDD = intervertebral disc disease; IE
= idiopathic epilepsy; No = number; CSF = cerebrospinal fluid; pg = picogram; ml =
milliliter; SRMA untreated: n = 25 total; n = 5 onetime pre-treated; n = 4 relapse; n =
16 untreated. Data are provided as medians (25th- 75th percentiles).
37

Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19
Measurement of CCL19
Concentrations of CCL19 in the CSF and serum were determined by sandwich
ELISA (Enzyme linked immunoabsorbent assay). An ELISA Kit specific for canine
MIP-3β/CCL19 (E90096Ca 96 Tests) was used according to manufacturer’s
instructions (Uscn Life Science Inc., Wuhan, P.R. China). Briefly, the microtiter plate
provided in the ELISA kit has been pre-coated with a monoclonal antibody specific to
MIP-3β/CCL19. CSF samples were used undiluted or were tapered down to a dilution
of 1:13 with the standard diluent depending on the CCL19 output concentration.
Serum samples were used undiluted for the ELISA. Seven wells were prepared for
the dilutions of standard, one well for blank and the rest of the 96 wells were used for
the CSF and serum samples. Four CSF and serum samples of the IE group served
as a control and one of these IE samples was pipetted to the plates in each
experiment. As a positive control served CSF and serum samples of the neuroinflammatory
group and the same sample was used in each experiment at same
dilution.
After a two hours incubation time at 37°C in humidified air with 5% CO2 in an
incubator (SANYO Sales & Marketing Europe GmbH, Munich), the liquid of each well
was removed. A biotin- conjugated polyclonal antibody preparation (Uscn Life
Science Inc., Wuhan, P.R. China) specific for CCL19 was added to each well.
Following a one hour incubation time the wells were washed three times with wash
buffer solution (Uscn Life Science Inc., Wuhan, P.R. China). Avidin conjugated to
horseradish peroxidase (Uscn Life Science Inc., Wuhan, P.R. China) was pipetted to
each well and incubated for 30 minutes at 37° C. The wash process was repeated for
total of five times as conducted before. Subsequently the TMB (3,3´,5,5´-
Tetramethylbenzidine) substrate was pipetted to the plate.
The enzyme-substrate reaction was terminated by the addition of sulphuric acid
solution (Uscn Life Science Inc., Wuhan, P.R. China) and the color change measured
spectrophotometrically at a wavelength of 450nm ± 10nm on a microplate reader
equipped with the analysis software Gen 5 (Synergy2 HT multi-mode microplate
reader, BioTek Instruments Inc., Bad Friedrichshall Germany).
38

Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19
The detection range of this method was 15.6 - 1000 pg/ml. The standard curve was
created by a lyophilized standard reagent (Uscn Life Science Inc., Wuhan, P.R.
China) provided in the ELISA kit. Standard concentrations used for the ELISA were
1000 pg/ml, 500pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62.5 pg/ ml, 31.2 pg/ml, 15.6 pg/ml. The
minimum detectable dose of canine CCL19 is 6.5 pg/ml. All measurements of the
CSF and serum were performed in duplicates, and OD (optical density) were
converted into chemokine concentration (pg/ml) using calibration curves generated in
each experiment.
Chemotaxis Assay
To prove chemotactic activity of measured CSF samples for mononuclear cells and to
give a hint that CSF CCL19 is available in the active form, migration assays were
performed by using a disposable 96-well chemotaxis chamber (Chemo TX
Disposable Chemotaxis system, NeuroProbe, Gaithersburg, MD) with polycarbonate
filters (5 µm pore size, 3.2 mm diameter size, 30 µl well size).
CSF samples of seven patients were examined, three untreated patients diagnosed
with SRMA, two untreated patients with the suspected diagnosis of MUO and two
patients with IVDD.
Peripheral mononuclear cells (PMCs) were separated from five milliliters of fresh
EDTA blood collected via cephalic venipuncture of a healthy dog. PMCs were
separated by Ficoll gradient centrifugation according to the technique described by
Toth et al. 1992. PMCs were washed twice with ten milliliters Hank’s balanced salt
solution (HBSS) (Fa. Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany) and re-suspended in
Cell-Wash fluid (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany).
The cell suspension was stained by trypanblue (0,4% in phosphate buffered saline
(PBS) Fa. Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany) and counted in a TÜRK cell
counting chamber (Fa. Brand, Wertheim, Germany). Twenty five µl of the cell
suspension (50000 cells/ 25 µl) were pipetted directly on the top side of the filter,
which is coated with a hydrophobic mask around each of the test sites. The
39

Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19
hydrophobic mask restricts the cell suspension to these sites, eliminating the need
for upper wells.
A known serial dilution of the cell suspension with 50000 cells, 25000 cells, 12500
cells, 6250 cells, 3125 cells, 1563 cells and 781 cells diluted in medium was pipetted
in one row of wells to serve as a standard with which to compare the readings from
the experimental wells. The rest of the 96 wells were loaded in duplicates with 29 µl
of SRMA (untreated n = 3), IVDD (n = 2) and MUO (untreated n = 2) CSF samples
diluted in Rosewell Park Memorial Institute (RPMI)1640 medium with L-glutamine
(Gibco® RPMI Media 1640) containing 1 % bovine serum albumin (BSA) and a
negative control of pure medium. The loaded chamber with added cell suspension on
the top side of the filter was cultured at 37°C in humidified air with 5% CO2 in an
incubator (SANYO Sales & Marketing Europe GmbH, Munich) while the migration
time for the cell suspension was measured at 30 minutes, 1 hour, 1.5 hours and 2
hours.
The filter was removed and cells that had migrated through the filter to the lower
wells were counted by alamarBlue® assay (Serotec, Düsseldorf, Germany).
AlamarBlue® reagent was added as 10% of the sample volume, followed by 1 to 3
hours incubation at 37ºC. Resazurin, the active ingredient of alamarBlue® reagent, is
a non-toxic, cell permeable compound that is blue in color and virtually nonfluorescent.
Upon entering cells, resazurin is reduced by viable cells to resorufin, a
compound that is red in color and highly fluorescent.
The resulting fluorescence was read on a microplate reader equipped with the
analysis software Gen 5 (Synergy2 HT multi-mode microplate reader, BioTek
Instruments Inc., Bad Friedrichshall Germany).
Statistics
For group comparison the Kruskal-Wallis test and the Mann–Whitney–Wilcoxon tests
were used. Using the Shapiro-Wilk test data were shown to be not normally
distributed. Correlation between two variables were tested by Spearman and Kendall
rank correlation tests. Statistical significance was set at the 5% level (P

Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19
3. Results
MIP-3β/ CCL19 concentration in CSF of the control group (idiopathic epilepsy/
healthy dogs)
CCL19 was measurable in all 21 samples of patients with idiopathic epilepsy and in
the 6 samples from healthy donors (tab. 1). The comparison between IE and healthy
animals showed significant difference (p = 0.0488) which is shown in figure 1.
Although there were significant differences detected between samples from dogs with
IE and from healthy animals, IE is still considered as a control group due to normal
CSF examinations. The median CSF CCL19 content of the control group was 60.7
pg/ml. IE alone had a median CSF CCL19 concentration of 66 pg/ml, while the
healthy dogs had a median CSF CCL19 concentration of 51.2 pg/ml (see tab. 1).
Fig. 1 MIP3β/ CCL19 CSF concentrations of patients with IE and healthy animals
(control group).
Boxes contain values from the 1st to the 3rd quartile, lines inside boxes indicate
median values, endpoints of vertical lines display minimum and maximum values, o
represents the outliers. Asterisks indicate statistically significant differences (* P <
0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.005)
41

Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19
Abbreviations: IE = idiopathic epilepsy; CSF = cerebrospinal fluid; MIP3β =
macrophage inflammatory protein-3β; pg = picogram; ml = milliliter
MIP-3β/ CCL19 CSF concentration in inflammatory diseases
Highly elevated CCL19 concentrations were observed in CSF samples of untreated
SRMA and MUO patients compared to the control group (IE/ healthy)
(p < 0.001; median SRMA: 1690 pg/ml; MUO: 373.5 pg/ml) as shown in figure 2,
figure 3 and table 1. Dogs under therapy had significantly lower CCL19 values
compared to the patients without therapy (p < 0.001). Treated SRMA dogs (p =
0.026) differ significantly from the controls while treated MUO patients did not differ
significantly (p = 0.059). Patients which received one injection with glucocorticosteroids
before initial examination had significantly less CCL19 levels (p =
0.0259) compared to entirely untreated animals. The subgroup of patients having a
relapse did not differ statistically (p = 0.4864) from untreated patients (fig. 2 and fig.
3).
Fig. 2 MIP3β/ CCL19 CSF concentrations of patients with SRMA compared to the
control group.
42

Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19
y- axis: logarithm to base 10 of MIP-3β (pg/ml); x- axis: groups. Boxes contain values
from the 1st to the 3rd quartile, lines inside boxes indicate median values, endpoints
of vertical lines display minimum and maximum values, o represents the outliers.
Asterisks indicate statistically significant differences (* P < 0.05; ** P < 0.01; *** P <
0.005). Abbreviations: SRMA = steroid-responsive meningitis-arteritis; CSF =
cerebrospinal fluid; MIP3β = macrophage inflammatory protein-3β; IE = idiopathic
epilepsy
Fig. 3 MIP3β/ CCL19 CSF concentrations of patients with MUO compared to the
control group.
y- axis: logarithm to base 10 of MIP3β (pg/ml); x- axis: groups
Boxes contain values from the 1st to the 3rd quartile, lines inside boxes indicate
median values, endpoints of vertical lines display minimum and maximum values, o
represents the outliers. Asterisks indicate statistically significant differences (* P <
0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.005). Abbreviations: MUO = meningoencephalomyelitis of
unknown origin; CSF = cerebrospinal fluid; MIP3β = macrophage inflammatory
protein-3β; IE = idiopathic epilepsy
43

Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19
Further evaluations of inflammatory diseases
The CSF CCL19 concentrations of both untreated SRMA and untreated MUO
patients were significantly correlated with the CSF cell count (SRMA r = 0.82, p <
0.001; MUO r = 0.59, p = 0.018).
SRMA and MUO patients under glucocorticosteroid treatment displayed no
correlation between CSF cell count and CCL19 concentration as indicated by the
results of Spearman and Kendall`s rank test (Spearman: SRMA r = 0.27, p = 0.19;
MUO r = 0.53, p = 0.091).
The CSF CCL19 and serum CCL19 concentrations did not correlate with each other
showing that CSF elevation is not only due to BBB disruption (Spearman: SRMA
untreated r = 0.099, p = 0.64; MUO untreated r = 0.33, p = 0.22).
Total protein levels within the CSF from untreated SRMA dogs had a weak correlation
with CSF CCL 19 concentrations using Spearman rank test (r = 0.39, p = 0.055), the
Kendall rank test was additionally calculated because of the occurrence of outliers
and revealed a significant correlation (tau = 0.33, p = 0.022).
Dogs with MUO that did not receive therapy had no strong correlation between
CCL19 CSF and CSF protein concentration (Spearman: r = 0.49, p = 0.057; Kendall:
tau = 0.33, p = 0.079).
MIP-3β/ CCL19 CSF concentration in intervertebral disc disease.
CSF CCL19 concentrations of IVDD are significantly elevated compared to the
control group (p < 0.005) as illustrated in the Box-and-Whisker Plots in figure 4. The
median concentration of the protein in the IVDD grade 2/3 group was 108.2 pg/ml
while grades 4/5 had a higher median of 149.2 pg/ml compared to the controls with a
median concentration of 60 pg/ml (see tab. 1). The concentrations between the two
IVDD groups did not differ significantly (p = 0.26). In comparison to the median
CCL19 concentrations from untreated inflammatory neurologic diseases (SRMA:
1690 pg/ml/ MUO: 373.5pg/ml) the elevations were mild (see fig.3 and fig. 4).
44

Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19
Fig. 4 MIP3β/ CCL19 CSF concentration of IVDD compared to the control group.
Boxes contain values from the 1st to the 3rd quartile, lines inside boxes indicate
median values, endpoints of vertical lines display minimum and maximum values, o
represents the outliers.
Asterisks indicate statistically significant differences (* P < 0.05; ** P < 0.01; *** P <
0.005). Abbreviations: IVDD = intervertebral disc disease; CSF = cerebrospinal fluid;
MIP3b = macrophage inflammatory protein-3β, IE = idiopathic epilepsy.
Further evaluations of IVDD
Correlating CSF CCL19 concentrations to CSF cell count the data did not show
significant correlation in the IVDD group (Spearman: IVDD group 2/3 r = 0.05, p =
0.81; IVDD group 4/5 r 0.097, p = 0.78). CCL19 CSF concentration and CCL19
serum concentration were significantly correlated within IVDD group 2/3 (r = 0.44, p =
0.025) while IVDD group 4/5 had no significant correlation (r = 0.54, p = 0.094).
45

Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19
Chemotactic activity of selected CSF samples for mononuclear cells
Chemotactic activity of CSF samples could be proven for mononuclear cells. CSF of
neuroinflammatory diseases including SRMA and MUO showed pronounced activity
as illustrated in figure 5.
The SRMA samples with a mean concentration of 3892.33 pg/ml CCL19 attracted
24083 cells and the MUO samples with a mean concentration of 3622 pg/ml CCL19
attracted 23876 cells after a two hours period, which was clearly stronger than the
controls (medium 10785 cells).
The CSF samples of dogs with IVDD with a much lower mean CCL19 concentration
of 208.5 pg/ml compared to neuroinflammatory diseases also had a strong impact on
migration and on average 17235 cells moved to the lower chamber after a 2 hour
incubation time (see fig. 5).
Fig. 5 Chemotaxis assay for mononuclear cells from CSF samples of SRMA, MUO,
IVDD, medium as a negative control. Vertical lines indicate standard deviation
Abbreviations: SRMA = steroid responsive meningitis-arteritis; MUO =
meningoencephalomyelitis of unknown origin; IVDD = intervertebral disc disease;
CSF = cerebrospinal fluid; pg = picogram; ml = milliliter.
46

Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19
4. Discussion:
The results of this study support the hypothesis that the protein MIP-3β/CCL19 is
involved in the pathogenesis of the migration of mononuclear cells into the
subarachnoid space of dogs with inflammatory CNS diseases and non-inflammatory
diseases such as intervertebral disc disease (IVDD).
CSF levels of the chemokine MIP-3β/CCL19 were analyzed in dogs afflicted with
SRMA, an inflammatory CNS disease, and compared to other neuroinflammatory
diseases (MUO), traumatic IVDD, non-inflammatory CNS disease, and normal
unafflicted animals.
CCL19 was detectable in healthy dogs and in patients with idiopathic epilepsy, a noninflammatory
neurologic disease, which is in agreement with the results of other
studies (Krumbholz et al. 2007; Pashenkov et al. 2003) in that CCL19 is constitutively
expressed in the CNS and linked to the physiological immunosurveillance
(Krumbholz et al. 2007). However, CCL19 was markedly upregulated in both neuroinflammatory
diseases (NID) SRMA and MUO (fig. 1 and 2).
Thus, CCL19 might be partly involved in the pathogenesis of CNS inflammation and
in the migration of inflammatory cells into the subarachnoid space. Krumbholz at al.
(2007) and Pashenkov at al. (2003) observed a CSF CCL19 elevation in NID of
human patients. The higher concentration of the chemokine in SRMA is consistent
with the fact that SRMA CSF has an increased neutrophilic inflammatory response.
Earlier observations have shown that CCL19 is also produced by neutrophils (Scapini
et al. 2001). The elevated chemokine concentration might maintain the inflammatory
response and later transfer to an autoimmune reaction attracting certain lymphocyte
subsets.
Additionally, a disrupted blood brain barrier is consistent with a strong inflammatory
response and could support the explanation for much higher CCL19 data. However,
CCL19 levels were higher in CSF samples compared to serum concentrations in
neuroinflammatory diseases suggesting intrathecal production rather than passive
transfer through a disrupted blood brain barrier.
47

Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19
Results of Pelletier et al.’s study (2010) revealed that a novel chemokine-dependent
reciprocal cross-talk between neutrophils and Th17 cells exists. Activated neutrophils
induced chemotaxis of Th17 cells and in turn activated Th17 cells could attract
neutrophils (Pelletier et al. 2010).
An uncontrolled IL-23–IL-17 pathway could maintain a chronic inflammatory
response and lead to persistent immunopathology (Waite and Skokos 2012).
Investigating this relationship and uncovering other similar pathways could be vital to
our understanding of the pathogenesis of chronic inflammatory diseases.
Observations from Maiolini (2012) give a strong hint, that the immunpathology of
SRMA is maintained by a Th17 response (Maiolini 2012).
Neutrophils can release a number of chemokines including CCL19, which can
specifically induce chemotaxis of dendritic cells (DC) and trigger rapid integrindependent
adhesion of CCR7-expressing lymphocytes (Scapini 2001). The
neutrophil`s capability of CCL19 production might be important in guiding these cells
to the inflamed sites and contributing to the regulation of the immune response .
It has been shown previously that CCR7 ligands like CCL19 have a function in
stimulating DCs for IL-23 production and generation of pathogenic Th17 cells in EAE
induction (Kuwabara et al. 2009).
The intrathecally produced CCL19 might not only play a role in inducing autoimmune
diseases but also in maintaining chronic forms through recruitment of antigen
presenting cells and lymphocytes, resulting in perpetual antigenic stimulation
(Columba- Cabezas et al. 2003).
The strong correlation between intrathecal CCL19 and the CSF cell count suggest an
important role in recruiting immune cells to the CNS. Additionally, SRMA and MUO
patients receiving glucocorticosteroids had significantly less CCL19 concentrations,
showing that steroids have a strong impact in reducing the inflammatory pathway.
Krumbholz et al.`s study did not reveal that MS patients receiving treatment differ
from untreated patients (Krumbholz et al. 2007). The fact that the chemokine
concentration in this study is altered in dogs with treatment suggests that treatments
are directed at different pathways and that the pathogenesis of SRMA and MS are
48

Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19
different. Glucocorticosteroids are shown to reduce the invasion of neutrophils
(Cizinauskas et al. 2000) and may alter the production of chemokines in dogs.
Relapsing SRMA also displayed elevated chemokine concentrations. This finding
suggests the potential utility of this protein to serve as a valuable biomarker for the
progression of the diseases, for developing new treatment schemes in inflammatory
diseases and to indicate the success of treatment.
The elevation of MIP-3β/CCL19 in IVDD CSF indicates a process of a secondary
inflammatory response within the CNS (Stys 2004). Gray and white matter are
affected by trauma, especially white matter damage is observed (Levine et al. 2006;
Spitzbarth et al. 2011) caused by apoptosis, necrosis, and inflammation. Increased
inflammatory cytokines in patients with chronic spinal cord injury after trauma
suggest an altered immunological activation.
A study by Srugo et al. (2011) suggested CSF pleocytosis is positively associated
with the severity of thoracolumbar spinal cord damage in dogs with IVDD. They found
that the percentage of CSF macrophages can be used as a prognostic indicator for
regaining ambulation in dogs that have lost deep pain sensation (Srugo et al. 2011).
In the current study the question was addressed, if CCL19 could also play an
important role for the migration of mononuclear cells and the inflammatory
pathogenesis in IVDD.
A modest correlation of CSF to serum CCL19 in IVDD group 2/3 suggest that CSF
CCL19 is derived by leakage via extracellular pathways from the circulation and not
solely from intrathecal production in this group of patients. However, no correlation
was found in IVDD group 4/5 and some samples showed much higher CSF values
suggesting possible intrathecal production. A set of chemokines is intrathecally
produced in CNS diseases leading to an inflammatory response.
The fact that CCL19 is significantly elevated but, did not correlate with CSF cell count
in either IVDD group suggests that CCL19 is not solely responsible for the
recruitment of cells but, may play a part in the pathogenesis of IVDD inflammation.
The performed chemotaxis assay from CSF samples attracted mononuclear cells.
CSF of neuro-inflammatory diseases showed strong chemotactic activity in
comparison to the controls. Even CSF samples of dogs with IVDD with a much lower
49

Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19
mean CCL 19 concentration showed a pronounced impact on cell migration, which
indicates the presents of a functional chemotactic protein. This function of CCL19
might play an important role in secondary damages in spinal cord injuries (SCI).
A study from Pineau and Lacroix (2007) on rodent models revealed that cytokine
production is time dependent. CNS resident cells, including neurons, synthesized
cytokines (IL-1, TNF, IL-6, and leukemia inhibitory factor) between 3 and 24 hours
post SCI and some infiltrating leukocytes were responsible for the cytokine
production 12 hours after the trauma. This would suggest that neural cells are
responsible for the initial inflammatory response following SCI but, the recruitment of
additional immune cells is responsible for the maintenance of inflammation (Pineau
and Lacroix 2007). Additional studies would be necessary to determine the time at
which CCL19 becomes a major inflammatory mediator.
Kwon et al. observed in his study that IL-6, IL-8, MCP-1, tau, S100b and glial fibrillary
acidic protein (GFAP) were elevated depending on severity of the initial injury.
Evaluating this group of inflammatory cytokines a biochemical model was developed
enabling to predict the ASIA (American Spinal Injury Association) grade in 89% of
their subjects. It was found that the pattern of protein expression within the CSF over
the first few days following injury were strong indicators of neurologic outcome and
thus, are now a focus of therapeutic research for SCI (Kwon et al. 2010).
Using CCL19 CSF concentration as a prognostic marker could be also a precious
tool in the research of SCI in dogs, which should be followed up in further studies.
In conclusion CCL19 may play an important role in the pathogenesis of SRMA/ MUO,
possibly perpetuating an autoimmune reaction and may also be involved with the
secondary wave of spinal cord injuries (SCI) in IVDD. The marked chemotactic
activity for mononuclear cells leads to the assumption that this chemokine could be
associated with the migration of mononuclear cells into the subarachnoid space of
dogs. CCL19 concentration therefore, may serve as a prognostic indicator in SCI, be
a precious biomarker for developing new treatment schemes and for verifying the
success of treatment.
50

Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19
5. References
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Falldarstellung
Kapitel 5 Falldarstellung eines Hundes mit infektiös bedingter, entzündlicher
ZNS Erkrankung
Case report: Successful medical management of an intra- and extracranial
abscess of a dog secondary to a bite wound
Janina Bartels¹*, Brett Darrow², Shannon P. Holmes³, Scott J. Schatzberg 4 ,
¹ Department of Small Animal Medicine and Surgery, University of Veterinary Medicine
Hannover, Buenteweg 9, D-30559 Hannover, Germany
² Bremen, Germany
³ College of Veterinary Medicine University of Georgia
4
VESC Veterinary Emergency and Specialty Center, 2001 Vivigen Way, Santa Fe,
NM 87505, USA
Corresponding author: email: janina_bartels@hotmail.de; phone: +49-5143-6330;
fax: +4951436330 (J. Bartels)
59

Falldarstellung
Abstract
Companion animals are often presented to veterinary hospitals as emergencies
following a traumatic event and, these patients are commonly associated with severe
neurological signs.
The following case report describes the clinical approach and successful medical
management of a dog bite injury to the head that developed into a brain abscess
(BA).
A nine year and eight month old female spayed pug dog was presented on
emergency after sustaining a dog bite to the head. Clinical signs consisted of a
puncture wound on the left side of the head and a mandibular symphyseal fracture.
The first neurological examination disclosed generalized ataxia, proprioception
deficits of both left limbs, and a horizontal nystagmus. After initial improvement
following empiric emergency treatment, the dog was re-presented and transferred to
the Neurology Specialty Service due to worsening of clinical signs which included
rotary nystagmus, a left head tilt and falling to the left. A central vestibular syndrome
was diagnosed with neuroanatomical localization to the left brainstem and both intraand
extracranial abscessation were disclosed on MRI imaging.
The dog was successfully treated solely with medical management. With careful
consideration of antibiotics and adjunctive medication selection, we were able to
achieve a successful outcome in this BA case and no surgical intervention was
needed.
Introduction
Traumatic events leading to neurological signs are a common finding in the
emergency clinical setting as the result of bite wounds, car accidents and other
traumatic injuries. As a result, one infrequent, though significant, sequela following
these events is the formation of an intra- or extracranial abscess. In humans they are
often polymicrobial in origin with the etiological agents depending on the entry point
of infection (Mathisen and Johnson 1997). Brain abscesses (BA) are life- threatening
infections which consist of localized areas of suppuration within an afflicted region of
60

Falldarstellung
the central nervous system (CNS). Therefore, early recognition, diagnosis, and
management of this condition are critical.
The most common sequela of brain abscesses documented in animals or humans
are intracranial pressure elevation, aggressive headache, nausea, convulsions,
behavior alterations and disorientation (King 2010; Lorenz et al. 2011). The clinical
signs vary with location and distribution. They are reported to be associated with
forebrain, brainstem or multifocal distribution (Constanzo et al. 2011). A definitive
diagnosis is made using advanced imaging such as computed tomography (CT) or
magnetic resonance imaging (MRI) in conjunction with fine needle aspiration and
microbial culture. Historically, BA have presented major therapeutic challenges in
which a combination of both surgical and medical intervention have yielded better
outcomes and are considered to be the gold standard of treatment in humans (Kao et
al. 2003; Hakan et al. 2006). There are few cases of BAs reported in veterinary
medical literature. In some of these cases, a combination of surgery and antibiotics
was successfully used in animals afflicted with a BA due to bite wounds (Bilderback
and Faissler 2009; Constanzo et al. 2011).
Case summary
A nine year and eight month old female spayed pug dog was presented to her
veterinarian following a dog attack where she sustained a bite wound to her head.
The dog had a history of hypothyroidism and Addisons disease for which she
received levothyroxin sodium 0.2 mg (0.017mg/kg, PO, q12 hrs), prednisolone 1.25
mg (0.11mg/kg, PO) every other day, and desoxycorticosterone pivalate injection
(DOCP) 25.5 mg (2.2 mg/kg, subcutanous SQ) every 28 days as treatment. The last
DOCP injection was given seven days before presentation. At presentation, the
referring veterinarian noted ataxia, proprioception deficits on the left side, horizontal
nystagmus, and a puncture wound on the left side of the head. Additionally, oral
hemorrhage was seen and palpation of the mandible was suggestive of a jaw
fracture. The dog was then referred to the Veterinary Emergency and Specialty
Center (VESC).
61

Falldarstellung
On presentation to the VESC Emergency Service the dog was quiet but, responsive
with a body condition score of 7/9 weighing 11.6 kg. In addition to the aforementioned
clinical signs noted by the referring veterinarian, a mandibular symphyseal fracture
with no other palpable skull fractures was disclosed. Surgery to wire the intermandibular
symphysis back to alignment was planned. Despite a mildly elevated
heart rate of 150, vital parameters were within normal limits. Pre-operative blood
work revealed hypophosphatemia 2.1 mg/dL (2.5-5.0 mg/dL), hyponatremia 140.7
mmol/L (143.0-153.0 mmol/L), hypokalemia 3.57 mmol/L (3.7-5.9 mmol/L) and an
elevated BUN 23 mg/dL (7-21 mg/dL). Prior to surgery the dog received a 50 ml
bolus of lactated ringer‘s solution (LRS) with added potassium chloride over 10
minutes, a fentanyl bolus 0.7 ml (0.06 ml/kg, intravenous IV) 35 mcg (3 mcg/kg),
ampicillin sodium/sulbactam 346 mg (29.8mg/kg, IV, q 8 hrs), and cefazolin sodium
260 mg (22.4 mg/kg, SQ, once). She was maintained on a 30 ml/h LRS and fentanyl
constant rate infusion (CRI) with 15.5 ml/L fentanyl (2 mcg/kg/h). The pug was
anesthetized with 4.6 ml (0.4 ml/kg, IV) propofol to effect and a 50 mcg fentanyl bolus
(4.3 mcg/kg, IV). Anesthesia was maintained with isoflurane gas. The mandibular
symphyseal separation was stabilized with a single 18 gauge intermandibular
cerclage wire. Additionally, the dog received a cefovecin sodium injection (8 mg/kg,
SQ, once) and a fentanyl patch 25 mcg post surgery. Prednisolone 5 mg (0.43 mg/kg,
PO) was given once a day. The dog remained stable with no seizure activities and
the vestibular signs seen at initial presentation resolved post-operatively.
Four days following surgery the dog was re-presented to the VESC Neurology
Service for an acute onset of vestibular signs. On examination severe vestibular
ataxia, rotary nystagmus, left head tilt and falling to the left were seen. Proprioception
could not be elicited due to severity of vestibular signs. The mentation was normal
except for increased anxiety. The pug was hospitalized. An isotonic solution of
balanced electrolytes (Normosol- R) at a rate of 60 ml/h (5.17 ml/kg/h), mannitol
3000 mg (258.6 mg/kg, IV, once over 20 minutes), ondansetron 2.5 mg (0.22 mg/kg,
IV, q 8 hrs), meclizine 25 mg (2.2 mg/kg, PO, q 12 hrs), tramadol hydrochloride 37.5
mg (3.2 mg/kg, PO, q 8 hrs) and famotidine 6 mg (0.5 mg/kg, IV, q 12 hrs) were
given. Metoclopramide HCL (2mg/kg/day) was later added to the fluids which were
62

Falldarstellung
set at a rate of 49 ml/h (4.2 ml/kg/hr). Prednisolone was increased to 5 mg (0.43
mg/kg, PO, q 12 hrs) to better cope with the stress of illness in the face of
hypoadrenocorticism. Clinical signs improved dramatically within three hours of
presentation and the onset of treatment. The head tilt and nystagmus resolved.
Proprioception was delayed to absent in the left hind limb. However, ataxia and wide
circling to the left were still apparent. The clinical signs were considered to be caused
by a left central vestibular system disease, although multifocal disease could not be
excluded.
Differential diagnoses included trauma with CNS damage subsequent to fracture
and/or edema, secondary bacterial meningoencephalitis, intracranial abscess,
hemorrhage, or neoplasia. Given the history that this dog was attacked and
sustained head trauma caused by a bite wound, the most likely differential diagnosis
was a brain abscess. MRI was strongly recommended and scheduled for the next
day. Clinical signs worsened over night and a change in behavior was seen.
The MRI was performed under general anesthesia with a Vet-MR Grande 0.25 Tesla
field (Esaote, Italy). The animal was pre-oxygenated before receiving anesthesia and
pre-medicated with glycopyrrolate 0.12 mg (0.01mg/kg, SQ) due to a heart rate of 72/
min. The pug was also pre-medicated with fentanyl 33 mcg (2.8mcg/kg, IV) and
midazolam 2.2 mg (0.18mg/kg, IV), induced with etomidate 22 mg (1.89mg/kg, IV)
and maintained with isoflurane. The cerclage wire anchoring the mandibular fracture
together was removed and the MRI sequences T1 weighted (W), T2W, T2 FLAIR
(fluid attenuated inversion recovery), T2*W, T1W/+contrast performed. The dog
received 110 ml/h (10ml/kg/h) of an isotonic solution of balanced electrolytes
(Normosol R) which was reduced to 28 ml/h (2.5ml/kg/h) following the procedure.
T2W and FLAIR MRI showed an intra- and extraaxial heterogeneously hyperintense
lesion affecting the left cerebral hemisphere, extending through the frontal, temporoparietal
and occipital lobes, and diffusely within the overlying temporal muscle.
Multiple sequences disclosed a fracture of the temporal bone with extensive high
signal lesion within and outside the calvaria. At the level of the skull fracture, the
hyperintensity was located within the superficial left cerebrocortical grey matter as
well as the corona radiata and deeper white matter including the left internal capsule
63

Falldarstellung
of the left temporo- parietal lobe. The images also showed that the lesion caused a
moderate left to right mass affect with compression of the thalamus and left lateral
ventricle at the level of the hippocampus and rostral midbrain. There was also mild
compression of the left rostral colliculus of the midbrain consistent with herniation.
The high signal within the temporal lobe extended rostrally and caudally into the
white matter tracts into the frontal, parietal and occipital lobes consistent with
vasogenic edema. The T2W high signal lesion was hypointense to the brain
parenchyma on T1W imaging and had a faint intramedullary rim enhancement
pattern after gadolinium (0.1mmol/kg, IV) administration. There was also diffuse
enhancement of the deep planes of the temporal muscle. On T2* (GRE) imaging a
hypointense triangular lesion within the brain consistent with hemorrhage was
detected in the region of the skull fracture.
Fig. 1
Fig. 2
64

Falldarstellung
Fig. 3
Fig. 1, Fig. 2 and Fig. 3: T2W weighted magnetic resonance imaging; intra- and
extraaxial heterogeneous hyperintense lesion affecting the left cerebral hemisphere,
extending through the frontal, temporo-parietal and occipital lobes, and diffusely
within the overlying temporal muscle.
Fig. 4 Fig. 5
65

Falldarstellung
Fig. 6
Fig. 4, Fig. 5 and Fig. 6: MRI, T1W weighted after administration of contrastmedium,
hypointense lesion to the brain parenchyma with a faint intramedullary rim
enhancement pattern after gadolinium (0.1mmol/kg, IV) administration.
In summary, MRI disclosed a large extra- and intracranial abscess affecting the left
cerebral hemisphere and left rostral brainstem. A fracture of the left temporal bone at
the level of the thalamus and rostral to the temporomandibular joint was identified.
Abscessation was present within cerebral edema tracking rostrally and caudally
through the brain in association with mild intraparenchymal hemorrhage at the level
of the fracture.
Following MRI, aspiration of the extracranial abscess was performed and samples
were submitted for cytology, aerobic and anaerobic culture (Antech Diagnostics,
Irvine, CA). No anaerobic or aerobic bacteria were isolated from the sample using
direct plating media and broth culture. The cytological findings revealed a moderate
granulomatous inflammation and necrosis, which were most consistent with a chronic
inflammatory response or sterile tissue necrosis. Due to the cellular degeneration
66

Falldarstellung
present, the evaluation was interpreted with caution as the lack of a visible infectious
agent does not rule out a low level of septic etiology.
Despite negative bacterial cultures, an aggressive treatment of antibiotics was
initiated including enrofloxacin 113 mg (10mg/kg, IV, q12 hrs), cefazolin sodium 250
mg (21.6mg/kg, IV, q 8 hrs) and clindamycin phosphate 226 mg (19.5mg/kg, IV, q 12
hrs). Due to the development of coughing, there was a concern for aspiration
pneumonia and cefazolin was replaced by ampicillin sodium/sulbactam sodium
250 mg (21.6mg/kg, IV, q 8 hrs). Additionally, famotidine 5.6 mg (0.5mg/kg, IV, q 12
hrs) and dexamethason sodium phosphate 0.71 mg (0.06mg/kg, IV, once) were
administered.
To relieve potential nausea associated with vestibular disease, maropitant citrate 11
mg (0.1mg/kg, SQ, q 24 hrs) and metoclopramide added to isotonic fluids with
balanced electrolytes (Normosol-R) (1.5 mg/kg/day) were administered. The dog also
continued to receive tramadol 25 mcg (2.2mg/kg, PO, q 12 hrs), prednisolone
(5 mg PO, q 12 hrs), and levothyroxin sodium 0.2 mg (0.017mg/kg, PO, q 24 hrs).
Five days following the diagnosis of intra- and extracranial abscessation,
considerable improvement of neurological signs was noted. The dog continued to
walk with a mild vestibular ataxia but, her head tilt had resolved and her postural
reactions had normalized.
With markedly improvement of the dog`s attitude and mentation, surgery to facilitate
the drainage of the abscess was not performed. Twelve days after her initial
presentation and hospitalization, the pug was sent home on enrofloxacin 90 mg
(7.8mg/kg, PO) once a day, clindamycin 175 mg (15mg/kg, PO) twice a day and
amoxicillin/clavulanic acid 250 mg (21.5mg/kg, PO) twice a day. Enrofloxacin and
clindamycin were continued for four months while amoxicillin/clavulanic acid was
discontinued after two weeks. Prednisolone (5 mg once daily for one month) was
given to control the underlying Addisons disease. Levothyroxin sodium 0.2 mg
(0.017mg/kg, PO, q12 hrs) medication was continued as previously prescribed.
The dog had a control examination one week after discharge from the hospital. She
was bright, alert and responsive and her neurologic exam disclosed only subtle
67

Falldarstellung
nondescript ataxia when running quickly. She continuously improved over the course
of treatment without surgical intervention.
Discussion
Intracranial abscesses can arise as a result of local extension of contiguous infection
such as otitis or maxillary tooth root abscess, from direct implantation through trauma
such as bite wounds or foreign body penetration (Kastenbauer et al. 2004; Vite
2005). They can also be the result of hematogenous spread from distant foci of
infection (Kent 2006). In humans the route of the infection has a major influence on
the specific organisms causing the formation of a BA allowing doctors to predict the
microbial agents involved and help to guide empiric therapies (Mathisen and Johnson
1997).
The etiology of CNS abscesses are usually of bacterial origin. In general, aerobic
bacteria such as Streptococcus spp and Staphylococcus spp may be more frequently
identified than anaerobic bacteria as causes of CNS infections in dogs and cats (Kent
2006; Vite 2005). S. aureus is a common pathogen recovered from post-traumatic
brain abscesses in human medicine cases (Mathisen and Johnson 1997; Lu et al.
2002). However, anaerobic bacteria such as Fusobacterium spp, Peptostreptococcus
spp, Bacteroides spp, Actinomyces spp, and Eubacterium spp are also known to
cause brain abscesses in animals (Vite 2005).
The blood brain barrier (BBB) and absence of lymphatic system in the CNS normally
prohibit microbial invasion and provide limited isolation of the CNS (Zachary 2006;
Tipold 1997).
Once the BBB is penetrated by an infectious agent, the immunologically privileged
nature of the CNS is an advantage to the invading organism and is a disadvantage to
the host (Dewey 2008). Immune privilege in the physiological microenvironment of
the CNS is promoted by anatomical structures, as just described, and physiological
protective mechanisms of lacking pro-inflammatory cytokines or production of antiinflammatory
cytokines by resident CNS cells (Fabry et al. 2008). The CNS is poorly
equipped with immunologically active cells which provides a good environment for
68

Falldarstellung
bacterial growth (Dewey 2008). Systemic immune cells are able to penetrate an
intact BBB and enter the perivascular and subarachnoid spaces, and can serve as a
protective immunologic surveillance of the CNS (Zachary 2006). A complex system
of chemokine and cytokine gradients interact with leukocytes of the systemic immune
system to direct physiologic and pathologic leukocyte trafficking and cellular
migration of the CNS (Zachary 2006). However, as a result of the physiological and
anatomic barriers, a response from the systemic immune system may occur well after
an infection has been established (Dewey 2008). Additionally, in immune
compromised dogs, BA may be more likely to develop (Smith et al. 2007). Once
inflammation is underway, a disruption in the BBB resulting in hemorrhage and
edema may occur (Zachary 2006).
Life threatening neurologic dysfunction can be a sequela of bacterial brain infections.
Clinical signs depend on the area of CNS involved and may be focal or multifocal
with signs associated with meningitis (Lorenz et al. 2011). Neurological signs are
usually acute, progressive in nature, and unilaterally localized (Tipold 1997). Cerebral
abscesses are destructive, and cause progressive focal neurological deficits due to
development of a mass effect and capsulated accumulation of purulent material
within the CNS. In addition to focal signs, they may cause generalized neurological
deterioration due to increased intracranial pressure or as the result of the
involvement of bacterial toxins (Dewey 2008). Animals with a forebrain lesion may be
presented with seizures, behavior changes and hyperesthesia (Tipold 1997).
Brainstem abscesses can lead to severe neurologic complications due to their
anatomic location and the interference with vital centers. In humans abscesses tend
to elongate in the brainstem instead of expanding laterally. Therefore, the clinical
findings may be confusing (Kastenbauer et al. 2004). With brainstem involvement,
changes in mentation, gait abnormalities, proprioception deficits, and cranial nerve
deficits may occur. Additionally, vestibular syndrome may be seen (Tipold 1997).
Clinical signs of central vestibular syndrome consist of vestibular ataxia to rolling in
one direction, nystagmus, abnormal head posture, nausea and vomiting, altered
mental status, cerebellar signs, and evidence of ipsilateral hemiparesis and postural
reaction deficits as seen in the case presented here (Munana 2004).
69

Falldarstellung
Antemortem diagnosis of brain abscesses is challenging. The clinical history may
lead the clinician in the direction of abscessation but, due to focal or multifocal
presentation with elevated ICP (intracranial pressure), clinical signs vary and the
majority of signs are non-specific (King 2010). Blood cell count and clinical chemistry
may also be non-specific and can demonstrate normal values, especially with
encapsulated brain abscesses (Vite 2005). However, these diagnostics may disclose
extraneural infections causing hematogenous spread. In cases of traumatic events,
radiographs can verify bone fractures (Tipold 1997).
Definitive diagnosis of BA can be supported by MRI or CT imaging (Runge et al.
1996; Klopp et al. 2000). MRI is more sensitive than CT scans and may be
advantageous in identifying early stages of BA (King 2010; Mathisen and Johnson
1997). Differential diagnoses of BA include other infectious and non-infectious
encephalitides, primary and metastatic brain tumors, infarction, hematoma and
granuloma (Bilderback and Faissler 2009; Constanzo et al. 2011). In day one to three
of BA formation (early cerebritis) BA appear hypointense on T1 weighted sequences
and hyperintense on T2 weighted imaging as well as FLAIR images. After day three
(late cerebritis) ring enhancement may be seen and present as a thin-walled rim of
isointense to hyperintense signal on T1 weighted imaging and hypointense on T2
weighted imaging and FLAIR precontrast images. Mature abscesses present on T1
weighted imaging as hypointense with a round and well-demarcated appearance with
hypointense edema in surrounding parenchyma. In T2 weighted and FLAIR images,
the necrotic material appears hyperintense. In contrast enhancement imaging with IV
gadolinium, BAs present with ring enhancement while they show restricted diffusion
on diffusion-weighted imaging (DWI) (Mathisen and Johnson 1997; Constanzo et al.
2011). Therefore neuroimaging such as MRI is superior in detecting early BA and
differentiating it from other neurological diseases (Lu et al. 2006; Constanzo et al.,
2011).
A bacterial or fungal culture can give a definitive diagnosis and elucidate involved
organisms, but due to the lack of positive results, it should be interpreted cautiously
(Kao et al. 2003; Constanzo 2011). CSF evaluation is not always indicated due to the
70

Falldarstellung
high risk of brain herniation and may be of little value in excluding an abscess from
the differential diagnosis (Vite 2005; Kent 2006; Bilderback and Faissler 2009).
The management of BA is not well described and only limited information on
treatment strategies is available in veterinary medicine. However, in human medicine,
surgical intervention in combination with antimicrobial therapy has the highest rate of
success (Kao et al 2003; Hakan et al. 2006; Lu et al. 2006). The decision to
undertake surgical intervention in human medicine depends on the initial size of
abscess. Abscesses smaller than 1.7 cm have been successfully treated with
antibiotics alone, while surgical intervention is recommended when the size is larger
than 4.2 cm (Rosenblum et al. 1980; Boom et al. 1985).
There are a few cases reported in veterinary medical literature describing the
success of surgical and antimicrobial combination therapy in animals afflicted with BA
due to bite wounds (Bilderback and Faissler 2009; Constanzo et al. 2011). Surgical
intervention can be done with either complete resection of the abscess or CT- guided
aspiration via burr hole. It is strongly recommended to submit abscess samples for
culture and antibiotic susceptibility. Based on these results an appropriate antibiotic
therapy should be started.
Antibiotic therapy for treatment of intracranial abscessation provides unique
challenges that must be considered in selecting appropriate medications, timing, and
route of administration. It is preferred to select medications that are able to penetrate
the BBB and blood-cerebrospinal fluid-barrier (B-CSF-B), to attain adequate levels in
the CNS and have a bactericidal effect given the limited host immune response in the
CNS (Kent 2006). In patients with BA, treatment is further complicated due to the
limited penetration of antimicrobials into the abscess capsule. Factors that become
very important in deciding which medications to use in CNS disease include
molecular size, polarity, lipid solubility and plasma protein binding fraction. These
factors determine the bioavailability for antibiotics within the CNS (Maddison et al.
2008).
71

Falldarstellung
In an intact B-CSF-B and BBB, large, complex molecules have limited penetrance
while during inflammatory conditions entry may be enhanced. For example betalactam
antibiotics are ionized at normal pH. An inflammatory process promotes an
acidic enviroment which increases the plasma- CSF pH gradient and molecules can
cross membrane barriers efficiently (Maddison et al 2008) to reach therapeutic levels
within the CNS. Bypassing the B-CSF-B and BBB to deliver drugs directly to the CSF
with an external ventricular drain has been considered in human medicine cases.
Raza et al. (2005) reports that insertion of an external ventricular drain (EVD) solely
for antibiotic therapy might be justified in cases where the organisms are sensitive
only to antibiotics with poor CNS penetration, an increase in the antibiotic dose is
precluded by its toxicity, or where IV therapy alone has not been clinically effective
(Raza et al. 2005). However, this procedure is not commonly performed in veterinary
medicine. Intraventricular injection of β-lactam antibiotics is not indicated in spite of
their poor CSF penetration due to the pro-convulsive activity of this antibiotic class,
but systemic dose of β-lactam antibiotics can be increased to ensure higher CSF
concentrations (Nau et al. 2010).
Several studies with animal meningitis models have demonstrated the effectiveness
of using systemic ampicillin with the addition of sulbactam or other β-lactamase
inhibitors (Jimenez-Mejias 1997; Cawley et al. 2002).
In this case study, ampicillin with sulbactam was also used effectively in a
concentration of 22 mg/kg IV every 6 hours. It was continued in the form of
amoxicillin clavulanic acid (21.5mg/kg, PO, q 12 hrs) for two weeks. Third- and
fourth-generation cephalosporins are better able to penetrate the BBB and can
achieve good therapeutic concentration (Tessier et al. 2010). Their spectrum varies.
Third generation cephalosporins such as cefovecin have a decreased gram positive
and increased gram- negative activity (Maddison et al. 2008). Cefovecin is reported
to be effective against Staphylococcus intermedius, β-hemolytic streptococci and
Pasteurella multocida (Maddison et al. 2008). Additionally. cefovecin appears
effective against anaerobes (Ramsey 2008).
72

Falldarstellung
However, at the initial presentation to the VESC, the animal received one injection of
cefovecin sodium (8 mg/kg, SQ, once) but, clinically worsened over the next four
days and needed subsequent therapies.
Lipid solubility is also important for drug delivery to the CNS. Lipophilic drugs, such
as enrofloxacin, are better able to penetrate the CNS (Maddison et al 2008) and can
achieve higher concentrations. However, fluoroquinolones also have to be used with
caution due to their central nervous system toxicity with higher doses (Brown 1996).
Metronidazole is also highly lipophilic and achieves excellent penetration of tissues,
including the CNS and abscesses (Maddison et al, 2008).
Fluoroquinolones are of great value for the treatment of CNS infections caused by
gram-negative aerobic bacilli but, depending on the agent chosen, they have limited
value for treatment of gram positive bacteria. Because of their relatively high CNS
toxicity and ability to penetrate the CNS in the absence of meningeal inflammation, a
strong increase of their systemic dose as with β-lactam antibiotics is not
recommended (Nau et al. 2010). The patient presented in this case was treated with
enrofloxacin (10mg/kg, IV, q 12 hrs) and continued to receive oral enrofloxacin
(8mg/kg, PO, q 24 hrs) for four months. The dog did not develop seizures.
Another consideration in CSF bioavailability of antibiotics is the plasma protein
binding. In the presence of an intact barrier, only the plasma fraction unbound can
freely penetrate. The majority of fluoroquinolone molecules are unbound to plasma
proteins. Conversely, macrolides and lincosamides such as clindamycin are highly
bound to plasma proteins and therefore relative CNS concentrations are low (20% of
plasma concentration) (Maddison et al 2008). However, these medications can still
be clinically effective (Maddison et al 2008). Although the penetration of clindamycin
into the CNS is considered poor, it can reach therapeutic CSF concentrations after a
single injection of high-dose clindamycin even without meningeal inflammation (Gatti
et al. 1998). Clindamycin is active against gram- positive cocci including penicillin
resistant staphylococci, anaerobes and mycoplasma (Ramsey 2008). In this patient
clindamycin phosphate was administered at (19.5mg/kg, IV, q 12 hrs) during the
hospitalization period and continued at home (15mg/kg, PO, q 12 hrs) for four
months.
73

Falldarstellung
Besides the previous considerations of molecular size, lipophilicity, and plasma
protein binding in choosing an appropriate medication, the degree of inflammation
should also be taken into account.
The majority of drugs are removed from the CSF compartment by energydependent,
active mechanisms and different medications have variable affinity to
these transport systems. The specific transport systems may be inhibited during
meningitis (Spector and Lorenzo 1974) and drugs reach a higher concentration within
the CNS.
Broad-spectrum antibiotic coverage should be implemented where cultures cannot
be obtained or the culture remains negative despite strong suspicion of bacterial
participation. Previous reports recommend IV broad-spectrum antibiotics such as
ampicillin (5 - 22 mg/kg, IV, q 6 hrs) in combination with chloramphenicol (10 - 15
mg/kg, PO, q 6 hrs) or metronidazole (10 - 15 mg/kg, PO, q 8 hrs) (Fenner 1998; Vite
2005). Chloramphenicol was the BA standard therapy because of its broad
antimicrobial spectrum and effective blood- brain- barrier (BBB) penetration.
However, it`s lack of bactericidal activity and side effects, make it less attractive for
first-line therapy. More recent recommendations incorporate third generation
cephalosporins for gram- negative and gram- positive bacteria, metronidazole for
anaerobes, and ampicillin for additional gram- positive coverage (Kent 2006;
Bilderback and Faissler 2009).
In addition to antimicrobials, medication for decreasing intracranial pressure (ICP)
and edema should be included in the treatment plan. Mannitol is an important part in
the medical management of elevated ICP (Plumb 1999). In this study, it was
administered at a dosage of 258.6 mg/kg IV once. As an osmotic diuretic it shifts
water from intracellular and interstitial spaces into the vasculature reducing the ICP
and edema (Plumb 1999). Furthermore, it is considered a free radical scavenger
which can reduce inflammatory by-products leading to a better recovery in ischemic
brain conditions (Marcoux and Choi 2002).
74

Falldarstellung
Adjunctive glucocorticosteroid agents for the treatment of BA or meningitis are still
controversial (Tipold 1997; Han et al. 2004). Their use may lead to a reduced
permeability at the BBB for certain antimicrobials and immune cells leading to
decreased clearance of bacteria from the CNS (Tessier and Scheld 2010).
Corticosteroids may also reduce the penetration and decrease the bactericidal
activity of some antimicrobials, such as vancomycin, in experimental meningitis
(Andes and Craig 1999). Glucocorticosteroids have immunsuppressive effects that
alter the immunological defense system which should be taken into consideration
(Plumb 1999). However, glucocorticosteroids are indicated to reduce brain swelling
and decrease the inflammation caused by proinflammatory bacterial products.
These products induce the production of cytokines and chemokines by CNS cells
inducing leukocyte chemotaxis to the infection focus and facilitate inflammation
resulting in further edema and vasculitis (Sellner et al., 2010). Studies in humans
have demonstrated a beneficial role for the early use of anti-inflammatory doses of
glucocorticosteroids to reduce inflammation and brain edema during bacterial
meningitis (Paris et al. 1994; de Gans and van de Beek 2002).
Patients with raised intracranial pressure, neurological deterioration and lifethreatening
complications, such as imminent cerebral herniation, generally had a
significant improvement in outcome (Jafari and Cracken 1994; de Gans and van de
Beek 2002). High dosage of IV glucocorticosteroids such as methylprednisolone
should be avoided in patients with head trauma due to a higher mortality as Edwards
et al`s study (2005) revealed. One dexamethasone sodium phosphate injection was
given 0.71 mg (0.06mg/kg, IV) once to this patient. While hospitalized, she was
administered prednisolone tablets 5 mg (0.43 mg/kg, PO) twice a day.
Though not previously indicated in the treatment of BA, glucocorticosteroid therapy
was continued at home once a day for one month to control the underlying Addisons
disease. This raises the question, if this additional prednisolone therapy played a role
in the successful outcome in the medical therapy of this brain abscess patient. This
would be similar to the study of Sagmanli et al. (1991), which demonstrated a better
outcome using an antimicrobial therapy combined with dexamethasone medication in
experimentally induced anaerobic BA.
75

Falldarstellung
This case provides the report of a BA in a dog due to a bite wound that was
successfully treated solely with medical management. It is invaluable to provide an
early and accurate diagnosis and initiate an appropriate treatment plan. With a wellconsidered
selection of antibiotics and adjunctive medications, we were able to
achieve a successful outcome in this BA case.
Medications
Soloxin® 0.2mg; Virbac Corporation, P.O. Box 162059, Fort Worth, TX, 76161
Delta-Cortef® prednisone tablets 2.5mg, Upjohn
Percorten-V® 25mg/ml; Novartis
Lactated Ringer`s solution®; Baxter Healthcare Corporation
Innovar- vet®; Schering- Plough
Unasyn®; Pfizer
Cefazolin- sodium®; Apothecon
PropoFlo®; Abbott Animal Health
Isoflurane®; Abbott
Convenia®; Pfizer Animal Health; New York, NY, 10017
Duragesic®; Janssen Pharmaceutica
Normosol- R® (Electrolytes per 1000 mL: Sodium 140 mEq; potassium 5 mEq;
magnesium 3 mEq; chloride 98 mEq; acetate 27 mEq; gluconate 23 mEq.) Abbott
Animal Health; Illinois, IL, 60064-6375
Mannitol Injection 20% (200mg/ml); Hospira; Ilinois, IL
Zofran®; GlaxoSmithKline
Antivert®, Roerig
Tramadol tablets 50mg; Amneal
Pepcid®I.V; Merck
Reglan®; Robins
Robinul®; Robins
Magnevist®; Bayer Health Care
76

Falldarstellung
Versed®; Roche
Etomidate Injection®; Sagent Pharmaceuticals Schaumburg, IL 60195 (USA)
Baytril Injection®; Bayer Health Care
Zolicef®; Apothecon
Clindamycin Injection®; Hospira, Inc., Lake Forest, IL 60045 USA
Unasyn®; Pfizer
Azium SP®; Schering- Plough Animal Health
Cerenia®; Pfizer Animal Health
BaytrilTablets® ; Bayer Health Care
Antirobe Capsules®; Upjohn
ClavamoxTablets®; Pfizer Animal Health
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Übergreifende Diskussion
Kapitel 6 Übergreifende Diskussion
Entzündliche Erkrankungen des ZNS können entweder durch eine immun mediierte
Reaktion oder durch ein infektiöses Agens entstehen, welches die Blut- Hirn-
Schranke (BBB) überwinden und in das ZNS eindringen konnte.
Unabhängig von der Ätiologie der entzündlichen ZNS-Erkrankungen, spielen
Signalmoleküle für die Pathogenese der Entzündung im ZNS eine wichtige Rolle
(DOGAN u. KARPUS 2004).
Zu diesen Signalmolekülen gehören Chemokine, welche chemotaktische Zytokine
sind, die bei dem Mechanismus der Zelleinwanderung in das ZNS als relevant gelten
(DOGAN u. KARPUS 2004).
Chemokine werden entweder konstitutiv exprimiert und regulieren die Zellwanderung
unter physiologischen Bedingungen oder werden induziert exprimiert (MANTOVANI
1999; KRUMBHOLZ et al. 2007) als Reaktion auf bestimmte Auslöser wie bakterielle,
virale oder protozoäre Mikroorganismen und durch Signale, die zu einer Ausschüttung
pro-inflammatorischer Zytokine und zu einer Hochregulierung von
Chemokinen führen (BAUMGÄRTNER u. GRUBER 2010).
Die meisten Chemokine sind im entzündeten Gewebe unter pathologischen
Bedingungen aufreguliert und führen zu einer Aktivierung von zahlreichen Immunzellen
(KARPUS u. RANSOHOFF 1998; DOGAN u. KARPUS 2004).
Sie können wiederum Oberflächenmoleküle auf zirkulierenden peripheren
Entzündungszellen aufregulieren, welche daraufhin effizienter an den Endothelzellen
der BBB anhaften und auf die lokalen Chemokingradienten des ZNS reagieren
können (CONSTANTIN 2008).
Durch diesen Mechanismus wandern immer mehr Leukozyten in das ZNS ein, deren
Zelltyp abhängig von dem vorhandenen Antigen ist (TIPOLD 1997).
Ist die Regulation der Chemokinproduktion gestört, können diese Moleküle
Immunzellen dauerhaft aktivieren und eine chronische Entzündung verursachen
(BAGGIOLINI 1998; LUSTER 1998).
Das Chemokin MIP-3β/CCL19 ist ein Protein, das ebenfalls an der Pathogenese von
Entzündungsreaktionen beteiligt ist. Es wird von verschiedenen Zellen im
86

Übergreifende Diskussion
Organismus synthetisiert (SERAFINI et al. 2001).
KRUMBHOLZ et al. (2007) konnten darstellen, dass bei Menschen eine konstitutive
MIP-3β/CCL19 Bildung im ZNS erfolgt und diese möglicherweise für eine schnelle
Immunüberwachung verantwortlich ist (KRUMBHOLZ et al. 2007).
In der vorliegenden Arbeit wurde ebenfalls nachgewiesen, dass CCL19 in den
negativen Kontrolltieren, die aus gesunden Patienten, sowie aus Patienten mit
idiopathischer Epilepsie (IE) bestanden, konstitutiv synthetisiert wird.
In Liquorproben erkrankter Hunde war die MIP-3β/CCL19 Konzentration deutlich
erhöht. Wir vermuten daher, dass das Protein MIP-3β/CCL19 an der Pathogenese
der Migration von mononukleären Zellen in das ZNS von Hunden mit entzündlichen
und nicht- entzündlichen ZNS- Erkrankungen wie der SRMA, MUO und
Bandscheibenvorfällen beteiligt ist.
Es wurden signifikant erhöhte MIP-3β/CCL19 Liquorkonzentrationen bei Tieren mit
entzündlichen ZNS-Erkrankungen (SRMA/MUO) im Vergleich zu der Kontrollgruppe
(gesunde/IE) nachgewiesen (p < 0.001; median MIP-3β/CCL19 Konzentration
SRMA: 1690 pg/ml; MUO: 373.5 pg/ml). Ebenfalls konnte dargestellt werden, dass
die MIP-3β/CCL19 Liquorkonzentrationen der SRMA und MUO signifikant mit der
Liquorzellzahl korrelierten (SRMA r = 0.82, p < 0.001; MUO r = 0.59, p = 0.018).
Aufgrund der höheren MIP-3β/CCL19 Liquorkonzentrationen im Vergleich zur
Serumkonzentration kann von einer intrathekalen Synthese aus- gegangen werden.
Die erhöhte intrathekale Chemokinsynthese deutet somit darauf hin, dass MIP-
3β/CCL19 bei der Pathogenese der untersuchten Erkrankungen relevant ist und zu
einer Migration von Entzündungszellen in den Subarachnoidal- raum führt. Die etwas
höheren MIP-3β/ CCL19 Liquorkonzentrationen von Hunden mit SRMA im Vergleich
zu Humanpatienten mit neuroinflammatorischen Erkrankungen wie der Multiplen
Sklerose (KRUMBHOLZ et al. 2007), lässt sich mit der aus überwiegend neutrophilen
Granulozyten bestehenden Entzündungsreaktion der akuten SRMA-Form erklären.
SCAPINI et al. (2001) konnte darstellen, dass MIP-3β/CCL19 ebenfalls von
neutrophilen Granulozyten produziert wird. Diese erhöhte Chemokinkonzentration
erhält möglicherweise die Entzündungsreaktion aufrecht und führt im Verlauf der
Erkrankung zu einer Autoimmunreaktion, bei der bestimmte Lymphozyten angezogen
87

Übergreifende Diskussion
werden. MIP-3β/ CCL19 kann zu einer Chemotaxis von reifen und unreifen
dendritischen Zellen, sowie auch zu einer Integrin-abhängigen Adhäsion von CCR7
exprimierenden Lymphozyten führen (SCAPINI et al. 2001) und dadurch wichtig für
die Regulation der Immunantwort sein.
Ergebnisse von PELLETIER et al. (2010) zeigten, dass ein Chemokin-abhängiger,
gegenseitiger Austausch zwischen Neutrophilen und Th17 Zellen existiert. Aktivierte
Neutrophile induzieren chemotaktische Aktivität für Th17-Zellen und im Gegenzug
ziehen aktivierte Th17 Zellen dann direkt Neutrophile an.
Es konnte auch bereits gezeigt werden, dass MIP-3β/CCL19 DC stimuliert IL-23 zu
produzieren und eine pathogene Th17 Zellproduktion in EAE induziert (KUWABARA
et al. 2009).
Ein unkontrollierter IL-23- IL-17 Pfad könnte für die Aufrechterhaltung von chronisch
entzündlichen Erkrankungen verantwortlich sein (WAITE u. SKOKOS 2011).
MAIOLINI et al`s Studie (2012) gibt einen starken Hinweis darauf, dass auch die
Pathogenese der SRMA durch eine Th17 Antwort aufrecht erhalten wird.
Die intrathekal- produzierte MIP-3β/CCL19 -Konzentration ist daher möglicherweise
nicht nur bei der Induktion einer Autoimmunkrankheit relevant, sondern auch bei der
Aufrechterhaltung chronischer Formen durch die Rekrutierung von Antigenpräsentierenden
Zellen und Lymphozyten, was zu einer kontinuierlichen lokalen
Antigenstimulation führt (COLUMBA- CABEZAS et al. 2003).
Im durchgeführten Chemotaxis Assay konnte eine starke chemotaktische Aktivität für
mononukleäre Zellen durch Liquorproben von Hunden mit immun mediierten
neuroinflammatorischen Erkrankungen (SRMA/MUO) dargestellt werden.
Das Chemokin MIP-3β/CCL19 scheint ebenfalls bei der Immunantwort auf infektiöse
Erreger eine wichtige Rolle zu spielen. AKAHOSHI et al. (2003) konnten nachweisen,
dass MIP-3β/CCL19 von humanen peripheren neutrophilen Granulozyten gebildet
wird als eine Antwort auf gram-negative oder gram-positive Bakterien (AKAHOSHI et
al. 2003).
Durchdringt ein Pathogen die BBB, wird die Kaskade einer Entzündung ausgelöst
und es wandern immer mehr Leukozyten in das ZNS ein, wobei in bakteriellen
Infektionen eine neutrophile Pleozytose vorherrschend ist (TIPOLD 1997).
88

Übergreifende Diskussion
Neutrophile können auf einen mikrobiellen Stimulus chemotaktische Proteine wie das
MIP-3β/CCL19 synthetisieren und dadurch mit einer gewissen Zeitverzögerung auch
zu einer Migration der T-Lymphozyten und DC zu dem Entzündungsherd führen
(AKAOSHI et al. 2003).
In seltenen Fällen kann es im ZNS auch zu einer lokalen Akkumulation von
neutrophilen Granulozyten kommen, welche von einer Kapsel abgegrenzt werden
und somit ein destruktiver Hirnabszess entsteht (LORENZ et al. 2011).
Möglicherweise hat das Chemokin MIP-3β/CCL19 zum Teil auch eine Beteiligung an
dieser Pathogenese und weitere Untersuchungen wären für die Darstellung dieses
Zusammenhangs notwendig.
Es ist wichtig, die entsprechende Ursache zu diagnostizieren und zwischen
entzündlichen, infektiösen oder immun mediierten Erkrankungen zu unterscheiden,
um geeignete Therapien wählen zu können, wie dies im zweiten Teil dieser Arbeit
beschrieben wird.
Während bei bakteriellen Infektionskrankheiten Antibiotika eingesetzt werden
müssen, sind bei immun mediierten Krankheiten immunsuppressive, entzündungshemmende
Medikamente wichtig (PLUMB 1999). Immunsuppressive Medikamente
verändern die Zytokin- und Chemokinkonzentrationen, die für eine Entzündungsreaktion
und deren Folgen verantwortlich sind. Glukokortikosteroide können zum
Beispiel verwendet werden, um eine unkontrollierte Immunreaktion zu unterdrücken
(PLUMB 1999).
In der vorliegenden Studie besaßen Hunde mit SRMA und MUO, die
Glukokortikosteroide als Behandlung erhielten, signifikant niedrigere MIP-3β/CCL19
Liquorkonzentrationen im Vergleich zu unbehandelten Tieren (p < 0.001).
Glukokortikosteroide können die Einwanderung neutrophiler Granulozyten bei
Hunden mit SRMA reduzieren (CIZINAUSKAS et al. 2000) und beeinflussen
wahrscheinlich die Chemokinproduktion und somit auch die Entzündungsreaktion bei
Hunden.
Bei infektiösen neuroinflammatorischen Erkrankungen wie dem Hirnabszess sind
neben der Auswahl von Breitspektrumantibiotika mit einer hohen Bioverfügbarkeit im
89

Übergreifende Diskussion
ZNS, möglicherweise auch entzündungshemmende Medikamente für die Therapie
relevant. Der Einsatz von Glukokortikosteroiden bei Hirnabszessen oder infektiösen
Meningitiden wird kontrovers diskutiert (TIPOLD 1997). Jedoch besitzen Glukokortikosteroide
in entzündungshemmender Konzentration auch einen positiven Effekt
auf das ZNS. Durch Glukokortikosteroide werden Hirnödeme und die Ausschüttung
von pro-inflammatorischen bakteriellen Produkten und somit auch die Zytokin- und
Chemokinkonzentration vermindert, die normalerweise durch die Kaskade der
Entzündungsreaktion zu weiteren Schäden im ZNS führen (PARIS et al. 1994;
SELLNER et al. 2010).
In den durchgeführten Untersuchungen konnten, wie bereits für die neuroinflammatorischen
ZNS-Erkrankungen beschrieben, im Liquor cerebrospinalis von
Hunden mit Bandscheibenvorfällen im Vergleich zu der negativen Kontrollgruppe
ebenfalls signifikant erhöhte MIP-3β/CCL19 -Konzentrationen gefunden werden
(p < 0.005).
Diese Erhöhung des Chemokins induziert einen sekundären Entzündungsprozess im
ZNS, welcher eine wichtige Rolle bei der Sekundärschädigung des Rückenmarks
spielt. PINEAU und LACROIX (2007) konnten nach einem initalen Rückenmarkstrauma
eine zeitabhängige Zytokinproduktion feststellen, wobei die Rekrutierung
weiterer Immunzellen für eine Aufrechterhaltung des Entzündungsprozesses
verantwortlich ist (PINEAU u. LACROIX 2007). KWON et al. (2010) stellten fest, dass
bestimmte Zytokine abhängig vom Schweregrad der Rückenmarksschädigung
exprimiert werden und als mögliche prognostische Indikatoren genutzt werden
können.
In Rückenmarksverletzungen ist die Pleozytose im CSF positiv assoziiert mit dem
Schweregrad der Rückenmarksschädigung und der Anteil der Liquormakrophagen
kann als Indikator für die Prognose des klinischen Verlaufes verwendet werden
(SRUGO et al. 2011).
In der vorliegenden Studie konnte nachgewiesen werden, dass Liquorproben mit
erhöhten MIP-3β/CCL19 Konzentrationen im Chemotaxis Assay chemotaktische
Aktivität für mononukleäre Zellen besaßen und daher möglicherweise auch bei
90

Übergreifende Diskussion
Rückenmarksschäden eine wichtige Rolle bei der Einwanderung mononukleärer
Zellen in das ZNS und der Pathogenese der Entzündungsreaktion spielt. In der
Gruppe der Bandscheibenvorfälle korrelierte die Liquorzellzahl nicht mit den MIP-
3β/CCL19-Konzentrationen, was vermuten lässt, dass MIP-3β/CCL19 bei
Bandscheibenvorfällen nicht alleine für die Einwanderung von Entzündungszellen in
das ZNS verantwortlich ist.
Es ist anzunehmen, dass MIP-3β/CCL19 möglicherweise als ein prognostischer
Biomarker genutzt werden kann und eventuell für neue Therapieansätze von
Bedeutung ist.
In der vorliegenden zweiten Studie, welche eine infektiöse bakterielle ZNS-
Erkrankung darstellt, ist neben der erwähnten anti-inflammatorischen Therapie eine
entsprechende antimikrobielle Therapie unerlässlich (MADDISON et al. 2008).
Antibiotikatherapien zur Behandlung von intrakraniellen Infektionen stellen eine
besondere Herausforderung dar. Es sollten bevorzugt Medikamente angewandt
werden, die in der Lage sind, die Blut-Hirn- Schranke (BBB) und Blut-Liquor-
Schranke zu durchdringen, um angemessene Konzentrationen im ZNS zu erzielen.
Angesichts der begrenzten Immunantwort im ZNS, sollten die Medikamente auch
eine bakterizide Wirkung besitzen (KENT 2006).
Bei dem vorliegenden Patienten mit einem Hirnabszess (BA) wurde die Behandlung
noch weiter erschwert, aufgrund der begrenzten Penetration von antimikrobiellen
Medikamenten in die Abszesskapsel. Zu den Faktoren für die Auswahl des
geeigneten Medikaments für bakterielle ZNS-Erkrankungen, gehören Molekülgröße,
Polarität, Lipidlöslichkeit und Plasmaproteinbindung. Diese Faktoren bestimmen die
Bioverfügbarkeit für Antibiotika im ZNS (MADDISON et al. 2008).
Es sollte immer von infektiösem Material eine kulturelle Untersuchung mit
Antibiogramm durchgeführt und basierend auf diesen Ergebnissen eine
entsprechende sensitive antibiotische Therapie begonnen werden (MADDISON et al.
2008; VITE 2005).
91

Übergreifende Diskussion
In Fällen, in denen keine kulturelle Untersuchung durchgeführt werden kann oder die
Kultur negativ verbleibt, obwohl ein starker Verdacht auf eine bakterielle Beteiligung
besteht, sollten Breitspektrum-Antibiotika verabreicht werden (VITE 2005).
Frühere Berichte empfehlen intravenöse (IV) Breitspektrum-Antibiotika wie Ampicillin
(5 - 22 mg/kg, IV, q 6 hrs) in Kombination mit Chloramphenicol (10 - 15 mg/kg, per os
(PO) q 6 hrs) oder Metronidazol (10 - 15 mg/kg, PO , q 8 hrs) (FENNER 1998; VITE
2005).
Neuere Empfehlungen beinhalten Cephalosporine der dritten Generation für gramnegative
und gram-positive Bakterien, Metronidazol für Anaerobier und Ampicillin als
zusätzliche grampositive Abdeckung (BILDERBACK u. FAISSLER 2009; KENT
2006). Eine Kombination aus Enrofloxacin (10 mg/kg, IV, q 12 hrs), Clindamycin
phosphate (19.5 mg/kg, IV, q 12 hrs) und Cefazolin sodium (21.6 mg / kg, IV, q 8 hrs),
welches anschließend zu Ampicillin sodium/sulbactam sodium (21.6 mg/kg, IV, q 8
hrs) gewechselt wurde, konnte in dieser Studie als erfolgreiche Therapie angewandt
werden. Der Hund wurde zu Hause mit Enrofloxacin (7.8 mg/kg, PO, q 24 hrs) und
Clindamycin (15 mg/kg, PO, q 12 hrs) für vier Monate und Amoxicillin/clavulansäure
(21.5 mg/kg, PO, q 12 hrs) für zwei Wochen weiterbehandelt. Diese medikamentöse
Behandlungsstrategie konnte zu einem erfolgreichen klinischen Verlauf ohne
chirurgische Intervention führen.
92

Zusammenfassung
Kapitel 7 Zusammenfassung
Janina Bartels: Nachweis des Chemokins MIP-3β/CCL19 im Liquor cerebrospinalis
und dessen Beteiligung bei der Einwanderung mononukleärer Zellen
in den Subarachnoidalraum bei Hunden mit entzündlichen und nichtentzündlichen
neurologischen Erkrankungen.
Chemokine sind wichtige Faktoren für die Zellwanderung und Pathogenese von Entzündungen
im zentralen Nervensystem (ZNS). Sie können im Gewebe unter pathologischen
Bedingungen hochreguliert sein und durch lokale Chemokin-gradienten
das Migrationsverhalten, sowie die Aktivierung von Immunzellen beeinflussen.
Die erste Studie dieser Arbeit befasste sich mit dem Nachweis des Chemokins
MIP-3β (Macrophage Inflammatory Protein-3 beta)/ CCL19 in Liquor cerebrospinalis
(CSF) und Serumproben von Hunden mit entzündlichen und nicht-entzündlichen
Erkrankungen des Zentralnervensystems (ZNS). Die Hypothese sollte bestätigt
werden, dass MIP-3ß/CCL19 im CSF bei ausgewählten neurologischen
Erkrankungen erhöht ist und an der Pathogenese der Invasion von mononukleären
Zellen in den Subarachnoidalraum beteiligt ist. Die Messung des Chemokins MIP-
3β/CCL19 in 141 gepaarten Serum- und CSF Proben von Hunden erfolgte mit Hilfe
eines ELISAs.
Die Messergebnisse zeigten, dass in CSF Proben erkrankter Hunde die MIP-
3β/CCL19 Konzentrationen deutlich höhere Werte aufwiesen. MIP-3β/CCL19 CSF-
Konzentrationen waren bei Tieren mit Steroid-responsiver Meningitis-Arteriitis
(SRMA) und Meningoenzephalomyelitis unbekannten Ursprungs (MUO) signifikant
erhöht im Vergleich zur Kontrollgruppe, die aus gesunden Hunden und Patienten mit
idiopathischer Epilepsie bestand (p < 0.001; median CCL19 Konzentration SRMA:
1690 pg/ml; MUO: 373.5 pg/ml). Ebenfalls konnte dargestellt werden, dass die MIP-
3β/CCL19 CSF-Konzentrationen bei Hunden mit SRMA und MUO signifikant mit der
Liquorzellzahl korrelierten (SRMA r = 0.82, p < 0.001; MUO
r = 0.59, p = 0.018). Aufgrund der höheren MIP-3β/CCL19 Liquorkonzentrationen im
Vergleich zur Serumkonzentration kann von einer intrathekalen Synthese
93

Zusammenfassung
ausgegangen werden. Die erhöhte intrathekale Chemokinsynthese deutet darauf hin,
dass MIP-3β/CCL19 bei der Pathogenese der untersuchten Erkrankungen relevant
ist und möglicherweise eine Entzündungsreaktion aufrecht erhält. Eine Behandlung
mit Glukokortikosteroiden reduzierte die MIP-3β/CCL19 Chemokinkonzentrationen im
CSF bei Hunden mit SRMA und MUO im Vergleich zu unbehandelten Tieren
signifikant (p < 0.001).
Es konnte auch eine chemotaktische Aktivität für mononukleäre Zellen durch
Liquorproben von Hunden mit immun mediierten neuroinflammatorischen
Erkrankungen im durchgeführten Chemotaxis Assay dargestellt werden.
Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, dass das Chemokin MIP-3β/CCL19 in
einer aktiven Form vorliegt und bei der Migration von Entzündungszellen in den
Subarachnoidalraum eine Rolle spielt.
Bei den untersuchten Hunden mit Bandscheibenvorfällen im Vergleich zur
Kontrollgruppe konnten im CSF ebenfalls signifikant erhöhte MIP-3β/CCL19-
Konzentrationen gefunden werden (p < 0.005). Diese Erhöhung des Chemokins kann
für den sekundären Entzündungsprozess im ZNS verantwortlich sein, welcher eine
wichtige Rolle bei der Sekundärschädigung des Rückenmarks spielt. Der
Chemotaxis Assay konnte zeigen, dass CSF Proben von Hunden mit Bandscheibenvorfällen
auch chemotaktische Aktivität für mononukleäre Zellen aufweisen. Da
jedoch bei diesen CSF-Proben die Zellzahl nicht mit der MIP-3β/CCL19-
Konzentrationen korrelierte, wird vermutet, dass MIP-3β/CCL19 bei Bandscheibenvorfällen
nicht alleine für die Einwanderung von mononukleären Zellen in das ZNS
verantwortlich ist.
In der zweiten Studie konnte die erfolgreiche medikamentöse Behandlungsstrategie
für die Therapie eines Hirnabszesses dargestellt werden, welcher eine neuroinflammatorische
Erkrankung mit infektiöser Ursache repräsentiert.
Es ist essentiell zwischen entzündlichen, infektiösen oder immun mediierten
Erkrankungen zu unterscheiden, um die entsprechenden Therapien wählen zu
können. Bei einem bakteriell bedingten Hirnabszess ohne eindeutige Identifizierung
des mikrobiellen Agens müssen Antibiotika eingesetzt werden, die ein breites
Spektrum und ebenfalls eine gute biologische Verfügbarkeit im ZNS besitzen.
94

Zusammenfassung
In dieser Studie konnte eine Kombination aus Enrofloxacin (10 mg/kg, IV, q 12 hrs),
Clindamycin phosphate (19.5 mg/kg, IV, q 12 hrs) und Cefazolin sodium (21.6mg/kg,
IV, q 8 hrs), welches während der Behandlung zu Ampicillin sodium/sulbactam
sodium (21.6 mg/kg, IV, q 8 hrs) gewechselt wurde, zu einem erfolgreichen klinischen
Verlauf ohne chirurgische Intervention führen. Der Hund wurde zu Hause mit
Enrofloxacin (7.8 mg/kg, PO, q 24 hrs) und Clindamycin (15 mg/kg, PO, q 12 hrs) für
vier Monate und Amoxicillin/clavulansäure (21.5 mg/kg, PO, q 12 hrs) für zwei
Wochen weiterbehandelt. In dem vorliegenden Fall wurden zusätzlich zu den Breitspektrumantibiotika
auch entzündungshemmende Medikamente eingesetzt.
In der ersten Studie konnte die Hypothese bestätigt werden, dass das Chemokin
MIP-3β/CCL19 eine Rolle in der Pathogenese der SRMA und MUO spielt und
vermutlich bei der Sekundärschädigung von Rückenmarksverletzungen beteiligt ist.
Das Chemokin MIP-3β/CCL19 kann vermutlich für die bessere Beurteilung der
Prognose, sowie auch als wichtiger Biomarker für die Entwicklung neuer
Behandlungsstrategien verwendet werden.
95

Summary
Kapitel 8 Summary
Janina Bartels: Detection of the Chemokine MIP-3β/CCL19 in cerebrospinal fluid
and its association with the invasion of mononuclear cells in
neuroinflammatory and non-neuroinflammatory diseases in dogs.
Chemokines are important factors for the cell migration and pathogenesis of
inflammatory reactions in the central nervous system (CNS). They can be upregulated
in tissues under pathologic conditions. Certain chemokine gradients can
influence the cell migration and lead to the activation of immune cells. The first
aspect of this study covered the quantification of chemokine MIP-3β (macrophage
inflammatory protein-3 beta)/CCL19 concentrations in the cerebrospinal fluid (CSF)
and serum samples in dogs with inflammatory and non-inflammatory diseases of the
central nervous system (CNS).
The second aspect of this study addressed the determination of the chemotactic
activity of mononuclear cells induced by CSF containing elevated MIP-3β/CCL19
concentrations. The hypothesis should be proven that MIP-3β/CCL19 concentrations
are increased in CSF samples of selected neurological diseases and that higher
concentrations of MIP-3β/CCL19 within the CNS induce mononuclear cell migration.
MIP-3β/CCL19 concentration measurements were performed using a commercially
available ELISA in 141 paired serum and CSF samples of dogs. Elevated MIP-
3β/CCL19 values could be measured in CSF samples of dogs with inflammatory and
non- inflammatory neurological diseases. MIP-3β/CCL19 CSF concentrations in dogs
with steroid-responsive meningitis-arteritis (SRMA) and meningoencephalitides of
unknown origin (MUO) were significantly higher compared to the control group
consisting of healthy dogs and patients with idiopathic epilepsy (p < 0.001 ; median
CCL19 concentration SRMA: 1690 pg / ml; MUO: 373.5 pg / ml).
Additionally, a significant correlation between MIP-3β/CCL19 CSF concentrations
and CSF cell count in dogs affected with SRMA and MUO (SRMA r = 0.82, p

Summary
Increased intrathecal chemokine synthesis suggests that MIP-3β/CCL19 may play an
important role in the pathogenesis and maintenance of an inflammatory reaction.
Glucocorticosteroid administration significantly decreased the MIP-3β/CCL19
chemokine concentrations in CSF samples of dogs affected with SRMA and MUO
compared to untreated patients (p < 0.001).
Chemotactic assay results revealed that chemotactic activity for mononuclear cells
was induced by CSF samples with elevated levels of MIP-3β/CCL19 of dogs with
immune mediated neuroinflammatory diseases suggesting that MIP-3β/CCL19 is
present in an active form within the CSF and that increased MIP-3β/CCL19 CSF
concentrations have an effect on the migration of inflammatory cells into the
subarachnoid space.
Patients with intervertebral disc disease (IVDD) showed significantly elevated MIP-
3β/CCL19 CSF concentrations (p < 0.005) compared to controls. This chemokine
elevation may be responsible for the secondary wave of inflammatory reactions in the
CNS playing an important role in the secondary damage of spinal cord injuries (SCI).
Furthermore, the chemotaxis assay also demonstrated that CSF samples of dogs
with IVDD had chemotactic activity for mononuclear cells. However, in these CSF
samples the total white blood cell count was not correlated with the MIP-3β/CCL19
concentrations as shown previously with SRMA and MUO. Therefore, it is assumed
that MIP-3β/CCL19 is not solely responsible for the migration of mononuclear cells
into the subarachnoid space of dogs with IVDD.
The second study presents a successful medical management of a brain abscess,
which represents a neuroinflammatory disease caused by an infectious agent. It is
essential to distinguish between inflammatory, infectious or immune-mediated
diseases, in order to select appropriate therapies.
In bacterial brain abscesses without clear identification of the microbial agent, broad
spectrum antibiotics with high CSF bioavailability should be used. In this study, a
combination of enrofloxacin (10 mg/kg, IV, q 12 hrs), clindamycin phosphate (19.5
mg /kg, IV, q 12hrs) and cefazolin sodium (21.6 mg/kg, IV, q 8 hrs), which was later
changed to ampicillin sodium / sulbactam sodium (21.6 mg/kg, IV, q 8 hrs), lead to a
successful clinical outcome without surgical intervention.
97

Summary
The dog was maintained at home on enrofloxacin (7.8 mg/kg, PO q 24 hrs) and
clindamycin (15 mg/kg, PO, q 12 hrs) for four months, and amoxicillin/clavulanic acid
(21.5 mg/kg, PO, q 12 hrs) for two weeks. In the presented case, anti-inflammatory
drugs were used in addition to the broad-spectrum antibiotics.
The first study could confirm the hypothesis that the chemokine MIP-3β/CCL19 plays
a role in the pathogenesis of SRMA and MUO and is involved in the secondary injury
of SCI. Therefore, the chemokine MIP-3β/CCL19 may become a useful biomarker in
detecting and determining the extent of disease, estimating prognosis and
developing new treatment strategies.
98

Abkürzungsverzeichnis
Kapitel 9 Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
Art.-Nr. Artikelnummer
BA Hirnabszessen
BBB Blut-Hirn-Schranke
Best.-Nr. Bestellnummer
BSA Bovines Serum Albumin
bzw beziehungsweise
C zervikal
°C Grad Celsius
CCL19 Chemokin Cysteine Ligand
CCR7 C-C Chemokin Rezeptor
CNS Central nervous system
CSF Cerebrospinal fluid, Liquor cerebrospinalis
CT Computertomographie
CV Coefficient of variation, Variationskoeffizient (%)
DC Dendritische Zellen
EAE autoimmunen Enzephalomyelitis
EDTA-Blut Blut in Ethylene-diamine-tetraacetic acid- beschichteten Röhrchen
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
et al. und andere
Fa. Firma
FLAIR “fluid attenuated inversion recovery” Sequenz
g Erdbeschleunigung, Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/sek2)
g Gramm
GFAP Gliafaserproteine
GME Granulomatöse Meningoenzephalitis
HBSS Hanks balancierte Salzlösung
hrs Stunde
99

Abkürzungsverzeichnis
IE idiopathische Epilepsie
IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
IV intravenös
IVDD Intervertebral disk disease, Bandscheibenvorfall
kg Kilogramm
log Logarithmus
µl Mikroliter
mg Milligramm
MIP-3β Makrophagen inflammatorisches Protein-3β
ml Milliliter
MRI Magnetic Resonance Imaging
MRT Magnetresonanztomographie
MUO Meningoenzephalomyelitiden unbekannten Ursprungs
NME nekrotisierende Meningoenzephalitis
NLE nekrotisierende Leukoenzephalitis
ng Nanogramm
n Nummer
OD optische Dichte
p Signifikanzwert
PBS Phosphate-Buffered Saline, phosphatgepufferte Salzlösung
PMC periphere mononukleäre Zellen
pg Picogramm
PO per os
q 8 hours alle 8 Stunden
RPMI Rosewell Park Memorial Institute
S sakral
SCI Spinal cord injury
SD Standard deviation
sek. Sekunde
100

Abkürzungsverzeichnis
SRMA
Std.
T
T2W
Tab.
TMB
TGF
VESC
z.B.
ZNS
Steroid-responsive Meningitis-Arteriitis bzw. steril-eitrige Meningitis-
Arteriitis
Standard
thorakal
T2-weighted, T2-gewichtete MRT Sequenz
Tabelle
Substrat (3,3´,5,5´-Tetramethylbenzidine)
Transforming growth factor
Veterinary Emergency and Specialty Center
zum Beispiel
Zentrales Nervensystem
101

Literaturverzeichnis
Kapitel 10 Literaturverzeichnis
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126

Anhang
Kapitel 12 Anhang
Materialvorbereitung des ELISA Kits
Das Chemokin MIP3-b/CCL19 wurde mit Hilfe eines Sandwich-ELISAs (Enzyme
linked immunoabsorbent assay) untersucht. Die Messungen wurden mit einem
speziell für das kanine MIP3b/CCL19 entwickeltem ELISA-Kit (E90096Ca 96 Tests,
USCN Life Science Inc., Wuhan, PR China) nach Herstellerangaben durchgeführt
(USCN Life Science Inc. 2011).
A: Vorbereitung Standard:
Der Standard muss 15 Minuten vor dem Assay nach folgenden Schritten vorbereitet
werden:
1. Materialien auf Raumtemperatur bringen bis höchstens auf 18-25°C.
2. Der lyophilisierte Standard wird mit 1ml Standardverdünnung vorbereitet, wobei
nur leicht geschüttelt werden darf, um ein Schäumen zu vermeiden. Anschließend
wird die Lösung 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen.
3. Der Standard besitzt eine CCL19 Konzentration von 2000 pg/ml, welche für die
Standardverdünnungsreihe weiter verdünnt wird. Die höchste verwendete
Standardkonzentration im Assay beträgt 1000 pg/ml.
4. Sieben Röhrchen werden mit 0,5 ml Standardverdünnungsmittel und 500 µl
der Standardausgangskonzentration vorbereitet, die dann schrittweise weiter
verdünnt wird. Die Konzentrationen des CCL19 in den 7 Röhrchen entsprechen
1000 pg/ml, 500pg/ ml, 250pg/ ml, 125pg/ ml, 62.5 pg/ml, 31,2 pg/ ml und die
niedrigste Konzentration entspricht 15.6pg/ ml.
127

Anhang
5. Das 8. Röhrchen enthält nur die Standardverdünnung 0 pg/ml und wird als
„Blank“ (Leerwert) bezeichnet.
B: Vorbereitung Verdünnungsmittel A und Verdünnungsmittel B:
Das Verdünnungsmittel A wird für die Herstellung des Nachweisreagenz A,
welches ein biotylierter anti- CCL19-Antikörper ist, benötigt. Das
Verdünnungsmittel B wird für die Herstellung des Nachweisreagenz B
vorbereitet, welches eine an Avidin konjugierte Meerrettich- Peroxidase ist.
6 ml Assay Verdünnungsmittel A beziehungsweise Verdünnungsmittel B
(2faches Konzentrat) werden mit 6 ml destilliertem Wasser verdünnt, wodurch
das für den Reagenten A und den Reagenten B zu verwendende
Verdünnungsmittel A und Verdünnungsmittel B entsteht. Dieses darf nicht
wieder eingefroren werden.
C: Vorbereitung Nachweisreagenz A und Nachweisreagenz B:
Der biotylierter anti- CCL19-Antikörper (Nachweisreagenz A) und die an Avidin
konjugierte Meerrettich- Peroxidase (Nachweisreagenz B) werden nach
Herstellerangaben vorbereitet. Die Reagenzien müssen vor der Benutzung
kurz zentrifugiert werden.
Anschließend wird der jeweilige Reagent A oder B mit dem entsprechenden
Verdünnungsmittel 1:100 verdünnt.
D: Vorbereitung Waschlösung:
Die im ELISA Kit vorhandene 20 ml Waschlösung (30faches Konzentrat) wird
mit 580 ml destilliertem Wasser verdünnt, um 600 ml Waschlösung zu
erhalten.
128

Anhang
E: TMB Substrat:
Das benötigte TMB (3,3´,5,5´-Tetramethylbenzidine) Substrat wird mit einer
sterilen Pipette in ein vorgegebenes Gefäß gefüllt.
F: Vorbereitung Mikrotiterplatte:
1.standard 1.standard
2.standard 2.standard
3.standard 3.standard
4.standard 4.standard
5.standard 5.standard
6.standard 6.standard
7.standard 7.standard
8. blank 8. blank
7 Vertiefungen werden in Duplikaten für die Standardverdünnungsreihe mit
jeweils 100 µl verwendet, welche CCL19 Konzentrationen von 1000 pg/ml,
500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62.5 pg/ml, 31.2 pg/ml und 15.6 pg/ml
aufweisen.
In die 8. Vertiefung wird die reine Standardverdünnung pipettiert, welches als
„Blank“ (Leerwert) bezeichnet wird.
In die restlichen Vertiefungen werden jeweils 100 µl der zu untersuchenden
Serum- und Liquorproben pipettiert, wobei die Liquorproben je nach CCL19
Ausgangskonzentration mit der Standardverdünnung bis zu einer
Konzentration von 1:13 verdünnt und Serumproben unverdünnt eingesetzt
werden.
129

Anhang
Durchführungsprotokoll des ELISAs
1. Die Mikrotiterplatte , welche mit einem monoklonalen Antikörper speziell für
CCL19 vorbeschichtet ist, wird wie vorher beschrieben, mit der
Standardverdünnungsreihe, dem „Blank“ und den zu untersuchenden Serumund
Liquorproben beschickt und anschließend mit einer Abklebefolie bedeckt.
2. Die Mikrotiterplatte wird mit den entsprechenden Reagenzien, welche die
Standardverdünnungsreihe, de „Blank“ und den zu untersuchenden Serum-
und Liquorproben umfasst, für zwei Stunden bei 37°C im Inkubator inkubiert.
3. Anschließend werden die Reagenzien entfernt.
4. 100 µl des biotylierten polyklonalen anti- CCL19- Antikörper (Nachweisreagent
A) werden in alle Kavitäten der Mikrotiterplatte pipettiert und abgedeckt.
5. Die Mikrotiterplatte wird mit dem polyklonalen anti- CCL19- Antikörper
(Nachweisreagent A) für eine Stunde bei 37°C im Inkubator inkubiert.
6. Die Flüssigkeit wird anschließend entfernt und dreimal mit 350 µl der
Waschlösung gewaschen, wobei die Waschlösung jeweils ein bis zwei
Minuten einwirken kann.
7. 100 µl, der an Avidin konjugierten Meerrettich-Peroxidase (Nachweisreagent
B), werden in alle Kavitäten der Mikrotiterplatte pipettiert und abgedeckt.
8. Die Mikrotiterplatte wird mit dem bereits gebundenen polyklonalen anti-
CCL19- Antikörper (Nachweisreagent A) und der an Avidin konjugierten
Meerrettich- Peroxidase (Nachweisreagent B) für 30 Minuten bei 37°C im
Inkubator inkubiert.
130

Anhang
9. Die Flüssigkeit, welche aus der übergebliebenen Avidin konjugierten
Meerrettich- Peroxidase (Nachweisreagent B) besteht, wird anschließend
entfernt und fünfmal mit 350 µl der Waschlösung gewaschen.
10. Es wird in jede Kavität 90 µl Substratlösung (TMB-Substrat) hinzugefügt und
die Mikrotiterplatte erneut mit einer Abklebefolie bedeckt. Die Platte mit dem
Substrat wird für 15-25 Minuten bei 37°C inkubiert bis durch die
Substratreaktion eine konzentrationsabhängige blaue Verfärbung eintritt.
Dabei darf die Reaktion nicht länger als 30 Minuten erfolgen und muss
lichtgeschützt sein.
11. Von der Stopplösung (Schwefelsäure) werden 50 µl in alle Kavitäten pipettiert,
wobei sich, die durch das TMB- Substrat entstandene blaue
Farbveränderung, nun durch die Schwefelsäure gelb verfärbt wird und die
Enzym- Substrat Reaktion beendet wird.
12. Die CCL19 konzentrationsabhängige Verfärbung der Flüssigkeit in der
Mikrotiterplatte wird bei 450nm ± 10nm im Mikroplatten- Reader gemessen.
131

Anhang
Curve
4,000
3,500
3,000
2,500
450
2,000
1,500
1,000
0,500
0,000
1 10 100 1000 10000
Abb. 2: Standardkurve mit sigmoidalem Verlauf (CCL19-Konzentrationen zwischen
15.6 -1000 pg/ml auf der x-Achse; Optische Dichte auf der y-Achse, welche
mit Hilfe des Synergy 2 Multi-Detektions-Reader Fa. BioTek Instruments,
Bad Friedrichshall und der Gen5 Reader Control and Data Analysis
Software Fa. BioTek Instruments, Bad Friedrichshall in die MIP3b/CCL19
Konzentration umgerechnet wurde).
Chemotaxis Assay
Durchführungsprotokoll für die Separation mononukleärer Zellen
1. Alle Reagenzien werden auf Raumtemperatur gebracht.
2. Die 5 ml EDTA- Blut werden mit demselben Volumen Phosphat-gepufferte-
Salzlösung (PBS) in einem 15 ml Röhrchen verdünnt.
3. In einem weiteren 15 ml Röhrchen wird 2 ml Histopaque 1,119 pipettiert und
darüber vorsichtig 2 ml Pancoll 1,077 geschichtet.
132

Anhang
4. Anschließend wird das verdünnte Blut vorsichtig auf den Dichtegradienten
pipettiert, wobei die Oberflächen stabil bleiben müssen.
5. Das Röhrchen wird nun bei 400 g für 30 Minuten bei Raumtemperatur
zentrifugiert, so dass durch den Dichtegradienten verschiedene Schichten im
Röhrchen zu sehen sind. Die erste transparente Schicht enthält Plasma und
Thrombozyten und kann verworfen werden. Die Interphase zwischen der
Plasmaschicht und Pancollschicht 1,077 enthält die mononukleären Zellen und wird
für die weitere Durchführung verwendet.
6. Die mononukleäre Zellsuspension wird mit 10 ml HBSS verdünnt und bei 170 g
für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert.
7. Der Überstand wird abdekantiert und das Pellet in der verbliebenen Flüssigkeit
resuspendiert.
8. In einem zweiten Waschschritt wird die mononukleäre Zellsuspension erneut mit
10 ml HBSS verdünnt und diesmal bei 250 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur
zentrifugiert.
9. In einem dritten Waschschritt wird die mononukleäre Zellsuspension noch einmal
mit 10 ml HBSS verdünnt und bei 170 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur
zentrifugiert.
10. Der Überstand wird abpipettiert und das Pellet in 500 µl Zellwaschlösung (Becton
Dickinson, Heidelberg, Deutschland) resuspendiert.
133

Anhang
Bestimmung der Zellzahl
10 µl der mononukleären Zellsuspension werden mit 90 µl Trypanblau (0,4% in
phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Fa. Sigma-Aldrich, Schnelldorf,
Deutschland) vermischt, um die ungefärbten vitalen Zellen in einer TÜRK-
Zählkammer (Fa. Brand, Wertheim, Deutschland) zählen und auf die benötigte
Zellkonzentration einstellen zu können. Dabei wird 10 µl der gefärbten
Zellsuspension in die TÜRK- Zählkammer pipettiert. Die ungefärbten, vitalen
mononukleären Zellen werden in drei Feldern gezählt, die jeweils 0,1 mm³ groß sind.
Die durchschnittliche Zellzahl wird mit 100.000 multipliziert, um die Zellzahl in 1
Milliliter Suspension zu erhalten.
Abb. 3: TÜRK-Zählkammer (Urban u. Fischer Verlag 2003, Roche Lexikon Medizin,
5. Auflage [internet: URL: http://www.tk.de/rochelexikon/pics/p39580.002-1.html],
übernommen von N. HENNING 1966: Klinische Laboratoriumsdiagnostik, 3.Auflage,
Verlag Urban und Schwarzenberg, München).
134

Anhang
1. Anzahl der Hunde, Diagnose, Liquor- und Blutwerte und MIP-3β/CCL19-
Messwerte der 51 Hunde mit SRMA aus der Studie „Untersuchung des
Chemokins MIP-3β/CCL19 in Liquorproben von Hunden mit entzündlichen und
nicht-entzündlichen ZNS Erkrankungen“.
Lfd.
Nr.
Vorstellung
Therapie CSF Neutrophile Lymphozyten Monozyten CSF IgA CSF IgA serum Blut CSF Serum
Leukozyten CSF CSF CSF Protein
Leukozyten CCL19 CCL19
Diagnose
/3µl % % % mg/dl µg/ml µg/ml 10³/µl pg/ml pg/ml
1 SRMA C einmalig 140 90 3 17 25 4.7 129 8.9 144 155.7
2 SRMA C einmalig 14 91 0 9 13 0.15 306 21.03 132 54.9
3 SRMA C einmalig 20 93 1 6 10 1.8 163 15 340 114.8
4 SRMA C einmalig 88 92 0 8 21 0.69 146 18 271.45 19.1
5 SRMA C einmalig 900 75 1 24 28 0.9 30 36 1010.25 0
6 SRMA C 6560 62 3 35 110 2.7 272 18.79 4600 856.78
7 SRMA R 416 64 22 14 40 3.8 326 20.4 1881.303 474.57
8 SRMA C 14500 91 2 6 137 2.55 409 32.54 3200 521.7
9 SRMA C 200 84 8 8 23.9 0.2 93 30.3 290.38 129.3
10 SRMA C 3216 95 1 4 0 0.4 82 13.85 3761.17 131.34
11 SRMA C 275 80 5 15 30 0.5 143 20.5 1601.27 151.39
12 SRMA C 9000 81 0 19 107 1.5 106 24.4 3404.5 197.4
13 SRMA C 1370 79 1 20 43 1.65 511.7 25 2284.55 823.9
14 SRMA C 5300 77 22 1 186 1.7 200 26 2712.7 53.817
15 SRMA C 32 90 0 10 14 0.16 282 28 671.5 84.7
16 SRMA C 540 70 2 28 32 1.1 210 27 3683.66 73
17 SRMA C 528 78 5 17 54 1.6 106 16 703 77.7
18 SRMA C 13 50 34 16 19 3.2 144.6 19 112 198
19 SRMA C 475 92 5 3 22.13 0.3 102 17 999 531
20 SRMA R 336 65 0 35 23 0.2 82.6 16.5 3397.7 64.5
21 SRMA R 4680 66 0 34 55 2.87 549 19.5 2706 75
22 SRMA C 3800 94 6 0 13 2.7 205 20.7 5745 60.9
23 SRMA C 6848 91 1 9 131 3.1 184 30 2850 138
24 SRMA R 1800 88 1 11 65 1.9 204 29 1690 73
25 SRMA C 230 70 20 10 20 0.32 560 27 1233.65 235.1
SRMA: Steroid-responsive meningitis-arteritis, CSF: Liquor cerebrospinalis, C:
Erstvorstellung, R: Rezidiv, T: Therapie mit Glukokortikosteroiden, Lfd. Nr.: laufende
Nummer; CCL19: Marophagen inflammatorisches Protein-3β
135

Anhang
Lfd.
Vorstellung
Leukozyten CSF CSF CSF Protein
Leukozyten CCL19 CCL19
Nr. Diagnose
Therapie CSF Neutrophile Lymphozyten Monozyten CSF IgA CSF IgA serum Blut CSF Serum
/3µl % % % mg/dl µg/ml µg/ml 10³/µl pg/ml pg/ml
26 SRMA T Therapie 0 14 23 159 10 135.5 112
27 SRMA T Therapie 2 12 0.35 67.8 12 131.1 116.6
28 SRMA T Therapie 1 16 3.9 308 12 187 0
29 SRMA T Therapie 2 14 2.6 85 7 0 115.6
30 SRMA T Therapie 1 10 0.42 175 14 74.6 537.7
31 SRMA T Therapie 2 11 0.32 306 10 55 35
32 SRMA T Therapie 1 12 0.09 56.8 16 289.8 137
33 SRMA T Therapie 1 15.8 0.122 45 10 99.7 182.1
34 SRMA T Therapie 1 12 0.26 37 10 79.6 54.9
35 SRMA T Therapie 0 11 0.2 29 11 66.3 90.1
36 SRMA T Therapie 2 12 0.1 130 11 40.1 19.4
37 SRMA T Therapie 4 14 0.57 87 10 75 145.6
38 SRMA T Therapie 0 12 0.2 70 10 49.4 13.8
39 SRMA T Therapie 2 17 0.97 67 12 121.7 97
40 SRMA T Therapie 16 16 0.46 75 17 137.5 78.8
41 SRMA T Therapie 2 15.5 0.09 170 16 81.6 32.5
42 SRMA T Therapie 2 13 0.056 62 19 115.4 55.3
43 SRMA T Therapie 2 7 0.033 31 8 97.6 41.2
44 SRMA T Therapie 0 9.95 0.4 102 14 73.9 33.4
45 SRMA T Therapie 1 11 0.48 43.4 10 67.2 37
46 SRMA T Therapie 0 11 0.2 82.6 8 70.4 58
47 SRMA T Therapie 2 9 0.06 88.9 12 81.4 177
48 SRMA T Therapie 1 10 0.09 75.7 17 88.1 111.4
49 SRMA T Therapie 3 13 0.05 45.05 11 84.5 251
50 SRMA T Therapie 0 13 0.05 81 10 28.7 16.8
51 SRMA T Therapie 0 10 0.06 30 19 72.6 379.8
SRMA: Steroid-responsive meningitis-arteritis, CSF: Liquor cerebrospinalis, C:
Erstvorstellung, R: rezidiv, T: Therapie mit Glukokortikosteroiden, Lfd. Nr.: laufende
Nummer; CCL19: Marophagen inflammatorisches Protein-3β
136

Anhang
2. Anzahl der Hunde, Diagnose, Liquor- und Blutwerte und MIP-3β/CCL19-
Messwerte der 27 Hunde mit MUO aus der Studie „Untersuchung des
Chemokins MIP-3β/CCL19 in Liquorproben von Hunden mit
entzündlichen und nicht-entzündlichen ZNS Erkrankungen“
Lfd.
Nr.
Vorstellung
Therapie CSF Neutrophile Lymphozyten Monozyten CSF IgA CSF IgA Serum Blut CSF Serum
Leukozyten CSF CSF CSF Protein
Leukozyten CCL19 CCL19
Diagnose
/3µl % % % mg/dl µg/ml µg/ml 10³/µl pg/ml pg/ml
1 MUO C 0 15 12 170 577
2 MUO C 29 33 11 771 121
3 MUO C 16 26 10 126 854.9
4 MUO C 4 30 13.58 107.3 551.4
5 MUO C 1 16 7.47 227.8 44.6
6 MUO C 721 193 10 400 80
7 MUO C 764 110 14 1298 125
8 MUO C 156 52 11 110.22 132.6
9 MUO C 1520 390 7.4 2372 371.5
10 MUO C 152 80 7 545 757
11 MUO C 224 23 9.99 794 45.5
12 MUO C 1136 398 13.3 519 0
13 MUO C 600 36 13 206 188.6
14 MUO C 908 93 10.2 347 78.9
15 MUO C 416 44 6.61 1142 232
16 MUO C 168 21 18.95 176 440
17 MUO T Therapie 2 16 12 1 51.8
18 MUO T Therapie 0 14 11.8 18.6 38.4
19 MUO T Therapie 3 43 8.5 140.4 17.4
20 MUO T Therapie 2 16 13 91.8 50.4
21 MUO T Therapie 8 12.4 9.5 92.5 199.7
22 MUO T Therapie 0 14 10 76.9 26.4
23 MUO T Therapie 0 13 10 76.3 7.6
24 MUO T Therapie 4 22 14 86 197.6
25 MUO T Therapie 2 20 9.2 261 148.2
26 MUO T Therapie 3 30 10 185 190
27 MUO T Therapie 16 20 16 95 274
MUO: Meningoenzephalomyelitiden unbekannten Ursprungs, CSF: Liquor
cerebrospinalis, T: Therapie mit Glukokortikosteroiden, Lfd.Nr.: laufende Nummer,
CCL19: Makrophagen inflammatorisches Protein-3β
137

Anhang
3. Anzahl der Hunde, Diagnose, Liquor- und Blutwerte und MIP-3β/CCL19-
Messwerte der 36 Hunde mit IVDD aus der Studie „Untersuchung des
Chemokins MIP-3β/CCL19 in Liquorproben von Hunden mit
entzündlichen und nicht-entzündlichen ZNS Erkrankungen“
Lfd.
Nr.
Diagnose Grad Vorstellung
Leukozyten
CSF
/3µl
Protein Leukozyten
CCL19
CSF Blut CCL19 CSF Serum
mg/dl 10³/µl pg/ml pg/ml
1 IVDD 2 chronisch 4 16 7 108.2 68.1
2 IVDD 2 chronisch 2 15 21 121.1 0
3 IVDD 2 chronisch 4 22 15 166.5 1457.22
4 IVDD 3 akut 0 36 7 214.8 72
5 IVDD 2 subakut 0 23 8 52.9 0
6 IVDD 2 chronisch 1 14 10 130.1 162.7
7 IVDD 2 akut 4 17 8 90.2 148
8 IVDD 3 akut 1 10 8 197.3 304.8
9 IVDD 2 akut 1 21 10 162.1 146.4
10 IVDD 2 subakut 2 17 7 36.8 64.8
11 IVDD 2 chronisch 1 15 11 52.2 84.5
12 IVDD 3 subakut 1 12 9 163.4 922.9
13 IVDD 2 chronisch 2 23 8 74.2 556
14 IVDD 2 chronisch 3 15 8 87.97 75.6
15 IVDD 2 chronisch 1 21 8 89.6 162.1
16 IVDD 2 chronisch 0 22 15 164.7 191
17 IVDD 2 chronisch 0 20 10 115.4 886.2
18 IVDD 2 chronisch 0 13 5 82 77.4
19 IVDD 2 akut 1 26 12 129.5 113.4
20 IVDD 2 subakut 3 25 6 56.3 93.4
21 IVDD 3 akut 8 19 14 158 162
22 IVDD 2 akut 1 21 7 88.9 73.2
23 IVDD 3 subakut 0 16 10 82 201
24 IVDD 2 subakut 3 19 7 350 157
25 IVDD 2 chronisch 1 16 12 72 63.3
IVDD: Intervertebral disc disease, CSF: Liquor cerebrospinalis, Lfd. Nr.: laufende
Nummer, CCL19: Marophagen inflammatorisches Protein-3β
138

Anhang
Lfd.
Nr.
Diagnose
Grad
Vorstellung
Leukozyten
CSF
/3µl
Protein Leukozyten CCL19 CCL19
CSF Blut CSF Serum
mg/dl 10³/µl pg/ml pg/ml
26 IVDD 4 akut 4 14 7 347.4 129.7
27 IVDD 4 akut 20 16 14 210.6 111.4
28 IVDD 4 akut 3 19 16 102 679.6
29 IVDD 4 akut 0 16 8 149.2 128.9
30 IVDD 4 akut 3 13 13 93.1 64.1
31 IVDD 5 akut 3 16 10 203.6 157.7
32 IVDD 5 subakut 4 19 29 45 30
33 IVDD 4 akut 6 10 16 40 0
34 IVDD 4 akut 4 10 9 149.3 90
35 IVDD 4 akut 2 11 17 491.79 97.6
36 IVDD 4 chronisch 0 9 7 125 10.8
IVDD: Intervertebral disc disease, CSF: Liquor cerebrospinalis, Lfd. Nr.: laufende
Nummer, CCL19: Marophagen inflammatorisches Protein-3β
139

Anhang
4. Anzahl der Hunde, Diagnose, Liquor- und Blutwerte und MIP-3β/CCL19-
Messwerte der 21 Hunde mit idiopathischer Epilepsie (IE) und 6 gesunde aus
der Studie „Untersuchung des Chemokins MIP-3β/CCL19 in Liquorproben von
Hunden mit entzündlichen und nicht-entzündlichen ZNS Erkrankungen“
Lfd.
Nr.
Vorstellung
Therapie CSF Neutrophile Lymphozyten Monozyten CSF IgA CSF IgA Serum Blut CSF Serum
Leukozyten CSF CSF CSF Protein
Leukozyten CCL19 CCL19
Diagnose
/3µl % % % mg/dl µg/ml µg/ml 10³/µl pg/ml pg/ml
1 IE 1 11 9 52.7 22.9
2 IE 0 9 12 56.5 93.6
3 IE 1 7 23 125 103.5
4 IE 1 14 11 73.7 873.9
5 IE 0 10 10 138.7 197.3
6 IE 0 14 14 62.4 102
7 IE 2 12 10 126 316
8 IE 1 13 10 77 313
9 IE 2 10 7 68 83
10 IE 1 15 10 80.9 32.6
11 IE 0 14 9 60.7 43.2
12 IE 3 14 8 23.2 72.4
13 IE 1 23 10 22.9 118.4
14 IE 2 15 16 56.8 69.8
15 IE 0 11 8 11.8 33.9
16 IE 0 6 9 66 108.6
17 IE 0 12 9 108.4 150.9
18 IE 3 9 12 45 37.4
19 IE 1 19 23 87.1 24.6
20 IE 0 10 11 56 60
21 IE 0 14 10 135.5 63.5
22 Gesund 68.2 115.7
23 Gesund 52.4 286.2
24 Gesund 50 218
25 Gesund 54.8 86.5
26 Gesund 21.5 102.2
27 Gesund 36.8 65.9
IE: idiopathische Epilepsie, CSF: Liquor cerebrospinalis, CCL19: Makrophagen
inflammatorisches Protein-3β, Lfd. Nr.: laufende Nummer
140

Danksagung
Kapitel 13 Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. Tipold für die Möglichkeit, diese
interessante Studie durchführen zu dürfen. Es war eine wunderschöne Zeit und ich
danke Frau Prof. Tipold herzlichst für die ausgezeichnete Unterstützung. Es ist
bewundernswert, mit welcher freundlichen, liebenswürdigen und unermüdlichen
Hilfe Prof. Dr. Tipold mich betreute.
Der Tierärztlichen Hochschule danke ich sehr für Bereitstellung der Forschungs-
möglichkeiten und der guten Ausbildung.
Für die einmalige und schöne Zeit im Labor und in der Kleintierklinik möchte ich mich
bei Regina Carlson und der Arbeitsgruppe Neurologie bedanken.
Ein ganz besonderer Dank geht auch an meine Mutter Christiane von Maske-Bartels,
die mich in jeder Situation tatkräftig und liebevoll unterstützte.
Auch möchte ich meinem Vater Klaus- Dieter Bartels und Dietmar Mückstein danken.
Zuletzt möchte ich mich bei Brett G. Darrow bedanken für die außergewöhnliche und
unvergessliche Hilfe!
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