TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

Material und Methoden
3.3.2. Chemotaxis-Assay
Um nachzuweisen, dass MIP-3β/CCL19 auch funktionell aktiv im Liquor
cerebrospinalis vorliegt, wurde die chemotaktische Aktivität für mononukleäre Zellen
mit Hilfe eines Migrationsassays unter Verwendung einer Einweg-96-Well-
Chemotaxis Kammer (Chemo TX Disposable Chemotaxis system, NeuroProbe,
Gaithersburg, MD) gemessen. Aus 5 ml peripherem Blut eines gesunden Hundes
wurden mononukleäre Zellen durch Ficoll-Gradienten-Zentrifugation isoliert. Die
Zellzahl wurde bestimmt und der Chemotaxis-Assay durchgeführt.
Durchführungsprotokoll für die Separation mononukleärer Zellen
Periphere mononukleäre Zellen (PMCs) wurden aus fünf Millilitern frischem EDTA-
Blut über Punktion der Vena cephalica eines gesunden Hundes erhalten. Die PMCs
wurden durch Ficoll-Gradienten-Zentrifugation nach einer modifizierten Technik nach
TOTH et al. (1992) getrennt (siehe Anhang).
Durchführung des Chemotaxis-Assays
Für den Chemotaxis-Assay wurden fünfundzwanzig Mikroliter (µl) der vorher auf die
erwünschte Konzentration eingestellten Zellsuspension (50.000 Zellen / 25 µl) direkt
auf die Filteroberfläche der Chemotaxis- Assay Kammer (Chemo TX Disposable
Chemotaxis system, NeuroProbe, Gaithersburg, MD) pipettiert. Die Kammer ist mit
einer hydrophoben Maske um jede Teststelle beschichtet, wodurch die
Zellsuspension auf diese vorgegebenen Teststellen beschränkt bleibt und die
Notwendigkeit für Vertiefungen auf der Filteroberfläche entfallen.
Eine bekannte Verdünnungsreihe der Zellsuspension mit 50.000 Zellen, 25.000
Zellen, 12.500 Zellen, 6.250 Zellen, 3.125 Zellen, 1.563 und 781 Zellen wurde
hergestellt und in eine Reihe der Kavitäten der Chemotaxis-Kammer pipettiert. Diese
Verdünnungsreihe dient als Standard des Chemotaxis-Assays, mit dem die zu
messenden Liquorproben verglichen werden konnten. Der Rest der 96-Well Platte
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