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Material und Methoden Nach einer zweistündigen Inkubationszeit (befeuchtete Luft, 37 °C, 5 % CO2 Konzentration; SANYO Sales und Marketing Europe GmbH, München) wurden die Liquor- und Serumproben aus jeder Kavität entfernt. Ein für CCL19 spezifischer Biotin-konjugierter polyklonaler Antikörper (USCN, Life Science Inc., Wuhan, PR China) wurde zu jeder Kavität der Mikrotiterplatte hinzugegeben. Nach einer weiteren einstündigen Inkubationszeit wurden die Kavitäten dreimal mit einer Waschpufferlösung gewaschen (USCN Life Science Inc., Wuhan, PR China). Avidin, an welches eine Meerrettich-Peroxidase konjugiert ist (USCN, Life Science Inc., Wuhan, PR China), wurde zu jeder Vertiefung hinzugegeben und für 30 Minuten bei 37° C inkubiert. Der wie zuvor durchgeführte Waschvorgang wurde insgesamt fünfmal wiederholt. Bei dieser Untersuchung wird anschließend das TMB Substrat hinzugegeben und durch die Peroxidase umgesetzt, so dass eine blaue Farbveränderung entsteht. Durch die Zugabe von Schwefelsäure (USCN, Life Science Inc., Wuhan, PR China) wird die Enzym-Substrat-Reaktion beendet und eine gelbe Farbe entsteht. Die entstandene Farbänderung konnte spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 450nm ± 10nm auf einem Mikroplatten-Reader, welcher mit der Analysesoftware Gen 5 ausgestattet ist, gemessen werden (Synergy2 HT Multimode-Mikroplatten-Reader, BioTek Instruments Inc., Bad Friedrichshall Deutschland). CCL19 Konzentrationen zwischen 15.6 bis 1000 pg/ml können mit dieser Methode nachgewiesen werden. Die Standardkurve (Anhang) wurde mit Hilfe eines lyophilisierten Standard-Reagenz (USCN, Life Science Inc., Wuhan, PR China) des ELISA-Kits erstellt. Die Konzentrationen für die Standardkurve betrugen 1000 pg/ml, 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62.5 pg/ml, 31.2 pg/ml und 15.6 pg/ml. Die minimale nachweisbare Menge des kaninen MIP-3β/CCL19 beträgt 6.5 pg/ml. Alle Messungen der Liquorund Serumuntersuchungen wurden in Duplikaten durchgeführt. Die gemessene OD (optische Dichte) konnte mit Hilfe der Standardkurve, die bei jedem Experiment erstellt wurde, in die Chemokinkonzentration (pg/ml) umgerechnet werden. Somit erlaubt der ELISA eine quantitative Bestimmung des Chemokins MIP-3β/CCL19. 26
Material und Methoden Abb. 1: Prinzip der MIP-3β / CCL19 - Detektion mit Hilfe eines SANDWICH-ELISAs modifiziert nach: BURNS (2010) Testcharakteristika Präzision und Reproduzierbarkeit Die Präzision des MIP-3β/CCL19 ELISAs wird durch die Intra-assay-Varianz und durch die Inter-assay-Varianz dargestellt. Sie geben das Maß der analytischen Streuung an, den Variationskoeffizienten (CV% = SD/mean * 100) (HALWACHS- BAUMANN 2011). Die Intra-assay-Varianz beschreibt die Abweichungen innerhalb des gleichen Messdurchlaufes (HALWACHS-BAUMANN 2011). Die Inter-assay-Varianz gibt die Messabweichung auf unterschiedlichen Mikrotiterplatten derselben Proben an mehreren aufeinanderfolgenden Tagen an (HALWACHS-BAUMANN 2011). Drei Proben mit niedriger, mittlerer und hoher kaniner MIP-3β/CCL19- Konzentration wurden 20 Mal auf einer Mikrotiterplatte getestet, wobei der CV unter 10 % betrug. Drei Proben mit niedriger, mittlerer und hoher kaniner MIP-3β/CCL19 Konzentration wurden auf drei verschiedenen Platten getestet, wobei die Interassay-Varianz CV unter 12 % betrug (USCN LIFE SCIENCE INC. 2011). 27
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