Genetischer Screen nach Thymusmutanten im Zebrafisch (Danio rerio)

Genetischer Screen nach Thymusmutanten im
Zebrafisch (Danio rerio)
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der Naturwissenschaften
an der Universität Konstanz im Fachbereich Biologie
vorgelegt von
Waltraud Wiest
Tag der mündlichen Prüfung: 11.12.2001
Referent: Herr Prof. Dr. Ernesto Bade
Referent: Herr Prof. Dr. Thomas Boehm

Die vorliegende Arbeit entstand im Zeitraum von Juni 1998 bis Juli 2001 in der Abteilung von
Herrn Prof. Dr. Thomas Boehm am Max-Planck-Institut für Immunbiologie, Freiburg.
Mein herzlicher Dank gilt Herrn Prof. Dr. Thomas Boehm, der es mir ermöglicht hat,
vorliegende Arbeit durchzuführen, der mich während dieser Zeit stets bestens betreut hat und
jederzeit ein offenes Ohr für meine Fragen und Anliegen hatte.
Auch Herrn Prof. Dr. Ulrich Krawinkel möchte ich meinen Dank aussprechen, der mich
anfänglich als Doktorvater betreut hat und dessen frühzeitiger Tod in jeder Hinsicht eine große
Lücke hinterlassen hat.
Bei Herrn Prof. Dr. Ernesto Bade möchte ich mich ganz herzlich bedanken, der die Aufgabe des
Doktorvaters übernommen und mich bis zum Ende der Arbeit betreut hat.
Ebenfalls möchte ich mich bei Dr. Matthias Hammerschmidt bedanken, der mir die Arbeit mit
Zebrafischen ermöglicht hat und bei Dr. Thomas Mayr, der mich in die Welt der Zebrafische
eingeführt und mich in meinen anfänglichen Versuchen tatkräftig unterstützt hat.
Ein ganz großes Dankeschön möchte ich an Dr. Michael Schorpp richten, der von Beginn an
mein Ansprechpartner für jegliche Probleme im Labor war, der sich jederzeit für Fragen und
Diskussionen Zeit nahm und der mich mit sehr viel Geduld und Einsatz unterstützte.
Monika Held danke ich für die Hilfe bei histologischen Arbeiten und für die unterhaltsamen
Momente, in denen ihre Erzählungen den Alltag immer wieder erhellten.
Dagmar Diekhoff danke ich für das freundschaftliche Verhältnis im und außerhalb des Labors
und hoffe, dass ich ihr die süddeutsche Sprache und Gebräuche ein wenig näher gebracht habe.
Außerdem danke ich Wiebke Herzog, Carina Kramer, Markus Leicht, Thorsten Nolting, Carolin
Riegger, Elvira Nold, Dr. Claudia Hetzer-Egger, Dr. Martina Jäger, Dr. Alexander Dick,
Dr. Andrea Maul-Pavicic und Dr. Zsolt Lele für die gute Zusammenarbeit, durch die der
Laboralltag zum angenehmen Arbeitsumfeld geworden ist.
Donatus Bönsch danke ich für die liebevolle Pflege der Fische.
Allen anderen Mitarbeitern der Abteilung danke ich für die Hilfsbereitschaft bei zu lösenden
Problemen und für die nette Arbeitsatmosphäre, die sehr zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen
hat.
Nicht zuletzt danke ich meiner Familie und meinen Freunden für die moralische Unterstützung
während dieser Zeit.
Ganz besonders möchte ich mich bei meinem Freund Hubi bedanken, der mir viel Verständnis
entgegen gebracht und mich während dieser Zeit in jeglicher Hinsicht unterstützt hat.

Abkürzungen
A Adenin
Amp Ampicillin
AS Aminosäure
C Cytosin
d T ag
DNA Desoxyribonukleinsäure
G Guanin
h Stunde
ISH in situ Hybridisierung
LG Linkage Group = Kopplungsgruppe
mg Milligramm
min Minute
ml Milliliter
mM Millimolar
pf nach der Befruchtung
RNA Ribonukleinsäure
s Sekunde
TThymin
UV Ultraviolett
ZNS Zentrales Nervensystem
Ala A Alanin
Arg R Arginin
Asn N Asparagin
Asp D Asparaginsäure
Cys C Cystein
Gln Q Glutamin
Glu E Glutaminsäure
Gly G Glycin
His H Histidin
Ile I Isoleucin
Leu L Leucin
Lys K Lysin
Met M Methionin
Phe F Phenylalanin
Pro P Prolin
Ser S Serin
Thr T Threonin
Trp W Tryptophan
Tyr Y Tyrosin
Val V Valin

Teile dieser Arbeit sind nachzulesen in:
_____________________________________________________________________________
Schorpp M., Wiest W., Egger C., Hammerschmidt M., Schlake T., Boehm T. (2000) Genetic
dissection of thymus development. Curr Top Microbiol Immunol 251: 119-124
Posterpräsentation:
_____________________________________________________________________________
Zebrafish development and genetics (2000), Cold Spring Harbor Laboratories, New York.
Waltraud Wiest, Michael Schorpp, Thomas Boehm. A Genetic Screen for Thymus Mutants in
Zebrafish.

Inhaltsverzeichnis
1. ZUSAMMENFASSUNG............................................................................................................ 1
2. EINLEITUNG............................................................................................................................. 3
2.1. DER ZEBRAFISCH ALS VERTEBRATER MODELLORGANISMUS.......................... 3
2.2. MUTAGENESEMÖGLICHKEITEN DES ZEBRAFISCHGENOMS............................... 4
2.3. VERSCHIEDENE MÖGLICHKEITEN ZUR DURCHFÜHRUNG EINES
GENETISCHEN SCREENS............................................................................................... 5
2.4. DAS IMMUNSYSTEM DER TELEOSTIER (ECHTE KNOCHENFISCHE).................. 8
2.5. DER THYMUS UND EIN VERGLEICH DER WICHTIGSTEN ASPEKTE VON
TELEOSTIERN UND SÄUGERN...................................................................................... 9
2.5.1. Die Entwicklung und Lage des Thymus...................................................................... 10
2.5.2. Der Aufbau des Thymus und sein Mikromilieu........................................................... 11
2.5.3. Die Funktion des Thymus als Organ zur T-Zellreifung............................................... 14
2.6. DIE HÄMATOPOESE IN TELEOSTIERN UND DIE WICHTIGSTEN MARKER FÜR
DIE ENTWICKLUNG DER T-ZELLLINIE; SCL, IKAROS, GATA3, RAG-GENE....... 16
3. ZIELE DER ARBEIT................................................................................................................ 21
4. MATERIAL................................................................................................................................ 22
4.1. GERÄTE, MATERIAL, REAGENZIEN............................................................................ 22
4.1.1. Geräte........................................................................................................................... 22
4.1.2. Material........................................................................................................................ 22
4.1.3. Reagenzien................................................................................................................... 23
4.2. MEDIEN, GELE.................................................................................................................. 24
4.2.1. Medien.......................................................................................................................... 24
4.2.2. Gele.............................................................................................................................. 25
4.3. PUFFER, LÖSUNGEN, KITS............................................................................................. 25
4.3.1. Für den Screen.............................................................................................................. 25
4.3.2. Für whole mount in situ Hybridisierung...................................................................... 27
4.3.3. Für die Histologie......................................................................................................... 29
4.3.4. Für die Molekularbiologie............................................................................................ 29
4.3.5. Für Mappinganalysen................................................................................................... 31
4.3.6. Kits............................................................................................................................... 31
4.4. OLIGODESOXYNUKLEOTIDE........................................................................................ 31
4.4.1. Marker für Grobkartierung........................................................................................... 31
4.4.2. Marker für Feinkartierung............................................................................................ 33
4.4.2.1. Kopplungsgruppe 5.............................................................................................. 33
4.4.2.2. Kopplungsgruppe 6.............................................................................................. 33
4.4.2.3. Kopplungsgruppe 8.............................................................................................. 33
4.4.2.4. Kopplungsgruppe 9.............................................................................................. 33
4.4.2.5. Kopplungsgruppe 20............................................................................................ 34
4.4.3. Für Gata3-Sonden-Amplifizierung.............................................................................. 34
4.4.4. Für rag1-Sonden-Amplifizierung................................................................................ 34
4.4.5. Für pim1-Amplifizierung und –Sequenzierung........................................................... 34
4.4.6. Für Cathepsin L-Amplifizierung und –Sequenzierung................................................ 35
I

4.5. VEKTOREN, BAKTERIENSTAMM, FISCHLINIEN...................................................... 35
4.5.1. Vektoren....................................................................................................................... 35
4.5.2. Bakterienstamm............................................................................................................ 35
4.5.3. Fischlinien.................................................................................................................... 35
4.6. ENZYME............................................................................................................................. 35
4.7. VERWENDETE SONDEN................................................................................................. 36
4.7.1. Rag1............................................................................................................................. 36
4.7.2. Gata3............................................................................................................................ 36
4.7.3. Dlx3.............................................................................................................................. 36
4.7.4. SCL............................................................................................................................... 37
4.7.5. Ikaros............................................................................................................................ 37
4.7.6. Pax9a............................................................................................................................ 37
4.8. COMPUTER SOFTWARE.................................................................................................. 37
4.8.1. Für DNA-Sequenzierung und Sequenzanalysen.......................................................... 37
5. METHODEN.............................................................................................................................. 38
5.1. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN................................................................... 38
5.1.1. RNA-Präparation.......................................................................................................... 38
5.1.2. RNA-Messung.............................................................................................................. 38
5.1.3. cDNA-Synthese............................................................................................................ 38
5.1.4. Polymerase Ketten Reaktion (PCR)............................................................................. 39
5.1.5. Agarose-Gelelektrophorese.......................................................................................... 40
5.1.6. PAA-Gelelektrophorese............................................................................................... 41
5.1.7. Elution eines DNA-Fragments aus Agarosegelen........................................................ 41
5.1.8. Isolieren eines DNA-Fragments aus PAA-Gelen......................................................... 41
5.1.9. Aufreinigung eines PCR-Ansatzes............................................................................... 42
5.1.10. DNA-Sequenzierung.................................................................................................. 42
5.1.11. Entfernen von 3´-Überhängen an dsDNA mit T4 DNA-Polymerase........................ 43
5.1.12. Ligation...................................................................................................................... 43
5.1.13. Transformation mittels Elektroporation..................................................................... 44
5.1.14. Übernachtkultur.......................................................................................................... 44
5.1.15. Plasmid-Mini-Präparation.......................................................................................... 45
5.1.16. Midi- und Maxi-Plasmid-Präparation........................................................................ 45
5.1.17. Bakterien-Glycerinstock............................................................................................. 45
5.1.18. DNA-Messung........................................................................................................... 46
5.1.19. Gewinnung eines klonierten Fragments aus einem Vektor........................................ 46
5.1.20. Whole mount in situ Hybridisierung.......................................................................... 46
5.1.20.1. Herstellung von RNAse-freien Lösungen und Materialien............................... 47
5.1.20.2. Plasmidlinearisierung......................................................................................... 47
5.1.20.3. Phenol/Chloroform-Extraktion.......................................................................... 47
5.1.20.4. In vitro Synthese von RNA-Sonden................................................................... 48
5.1.20.5. Proteinase K-Verdau und Nachfixierung........................................................... 48
5.1.20.6. Prähybridisierung und Hybridisierung............................................................... 49
5.1.20.7. Sondenentferung und Waschen der Embryonen................................................ 49
5.1.20.8. Detektion............................................................................................................ 49
5.1.21. Kartierung von mutierten Genen................................................................................ 50
5.1.21.1. DNA-Präparation aus ISH-gefärbten Fischembryonen..................................... 50
5.1.21.2. Herstellung von DNA-Pools für Grobkartierungsanalysen............................... 50
II

5.1.21.3. PCR zur Grobkartierung.................................................................................... 50
5.1.21.4. Einzelembryoanalysen....................................................................................... 51
5.1.21.5. Aufbewahrung von Fischen bis zur späteren DNA-Präparation........................ 51
5.1.21.6. Präparation von genomischer DNA aus adulten Fischen................................... 51
5.1.21.7. “Fin Clips” zur Genotypisierung........................................................................ 52
5.2. METHODEN FÜR DEN SCREEN..................................................................................... 53
5.2.1. Mutagenisierung........................................................................................................... 53
5.2.2. Verpaaren von Fischen................................................................................................. 53
5.2.3. Behandlung der Embryonen bis zur Fixierung bzw. zum adulten Stadium................. 54
5.2.4. Verhindern der Pigmentierung von Fischembryonen.................................................. 54
5.2.5. Fixierung von Fischembryonen.................................................................................... 54
5.2.6. Dechorionieren von Embryonen.................................................................................. 55
5.2.7. Testen der Mutanten auf Temperatursensitivität (TS)................................................. 55
5.2.8. Hodenpräparation und Spermienisolierung.................................................................. 55
5.2.9. Herstellung von UV-inaktivierten Spermien................................................................ 56
5.2.10. Gewinnung von Fischeiern durch “squeezen” von Weibchen................................... 56
5.2.11. Generierung von haploiden Zygoten.......................................................................... 56
5.2.12. Gynogenese und French Press-Anwendung............................................................... 56
5.3. METHODEN DER HISTOLOGIE...................................................................................... 57
5.3.1. Einbettung von in situ gefärbten Fischen in Paraffin................................................... 57
5.3.2. Einbettung von Fischembryonen in Paraffin................................................................ 58
5.3.3. Herstellung von Paraffinschnitten................................................................................ 58
5.3.4. Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung............................................................................... 58
5.3.5. Fuchsin-Färbung.......................................................................................................... 59
5.3.6. Alcianblau-Knorpelanfärbung am ganzen Embryo..................................................... 59
5.4. FISCHHALTUNG............................................................................................................... 60
5.5. SONSTIGES........................................................................................................................ 60
6. ERGEBNISSE............................................................................................................................. 61
6.1. THYMUSSCREEN.............................................................................................................. 61
6.1.1. Rescreen....................................................................................................................... 63
6.1.2. Verifizierung................................................................................................................ 63
6.2. ISOLIERTE THYMUSMUTANTEN................................................................................. 65
6.3. TEST DER MUTANTEN AUF TEMPERATURSENSITIVITÄT.................................... 67
6.4. GENAUERE ANALYSE DER THYMI IN WT- UND MUTANTENEMBRYONEN..... 69
6.4.1. Kontrolle der rag1-Färbung......................................................................................... 69
6.4.2. Gewebeanalyse von ungefärbten WT- und Mutantenembryonen................................ 70
6.4.2.1. Briesle.................................................................................................................. 71
6.4.2.2. Minibries.............................................................................................................. 72
6.4.2.3. Briessche.............................................................................................................. 73
6.5. KOMPLEMENTATIONSANALYSE................................................................................. 74
6.6. CHARAKTERISIERUNG DER ERHALTENEN MUTANTEN....................................... 75
6.6.1. Thymusentwicklung..................................................................................................... 76
6.6.1.1. Pax9a................................................................................................................... 76
6.6.1.2. Gata3.................................................................................................................... 77
6.6.2. T-Zellentwicklung........................................................................................................ 78
6.6.2.1. SCL...................................................................................................................... 78
6.6.2.2. Ikaros................................................................................................................... 79
III

6.6.2.2.1. Briesle.......................................................................................................... 79
6.6.2.2.2. Minibries...................................................................................................... 82
6.6.2.2.3. Briessche...................................................................................................... 83
6.6.2.3. Gata3.................................................................................................................... 84
6.6.2.3.1. Briesle.......................................................................................................... 84
6.6.2.3.2. Minibries...................................................................................................... 85
6.6.2.3.3. Briessche...................................................................................................... 86
6.6.3. Pharynxmorphologie.................................................................................................... 86
6.6.3.1. Dlx3...................................................................................................................... 86
6.6.3.2. Alcianblau............................................................................................................ 87
6.6.4. Zusammenfassung der Charakterisierung der Mutanten.............................................. 88
6.7. KINETISCHE STUDIEN MIT DER BRIESLE-MUTANTE............................................. 91
6.8. MAPPING, DAS KARTIEREN VON GENEN.................................................................. 92
6.8.1. Grobkartierung durch Poolanalyse............................................................................... 93
6.8.1.1. Briesle.................................................................................................................. 94
6.8.1.2. Minibries.............................................................................................................. 95
6.8.1.3. Briessche.............................................................................................................. 96
6.8.2. Feinkartierung.............................................................................................................. 96
6.8.2.1. Briesle.................................................................................................................. 96
6.8.2.2. Minibries.............................................................................................................. 97
6.8.3. Einzelembryoanalysen................................................................................................. 98
6.8.3.1. Briesle.................................................................................................................. 100
6.8.3.2. Minibries.............................................................................................................. 101
6.8.4. Haplotypanalyse........................................................................................................... 101
6.8.4.1. Briesle.................................................................................................................. 102
6.8.4.2. Minibries.............................................................................................................. 102
6.9. ZUSAMMENFASSUNG DER MAPPINGERGEBNISSE................................................. 103
6.10. KANDIDATENGENANALYSE....................................................................................... 104
6.10.1. Cathepsin L, das Kandidatengen der Briesle-Mutante............................................... 104
6.10.2. Pim1, das Kandidatengen der Minibries-Mutante...................................................... 106
6.11. ÜBERLEBENSFÄHIGKEIT VON HOMOZYGOTEN MUTANTENFISCHEN........... 108
6.11.1. Briesle........................................................................................................................ 108
6.11.2. Minibries.................................................................................................................... 108
7. DISKUSSION............................................................................................................................. 109
7.1. THYMUSSCREEN.............................................................................................................. 109
7.2. CHARAKTERISIERUNG DER MUTANTEN.................................................................. 112
7.3. KARTIERUNG.................................................................................................................... 118
7.4. SCHLUSSBETRACHTUNG............................................................................................... 123
8. LITERATURVERZEICHNIS.................................................................................................. 124
9. ANHANG.................................................................................................................................... 134
9.1. cDNA-Sequenz des Zebrafisch-pim1-Gens......................................................................... 134
9.2. Aminosäuresequenz des Zebrafisch-pim1-Gens.................................................................. 135
9.3. cDNA-Sequenz des Zebrafisch-Cathepsin L-Gens.............................................................. 136
IV

1. Zusammenfassung
_____________________________________________________________________________
1. Zusammenfassung
Die Thymus-Organogenese ist ein Prozess, welcher von mehreren Faktoren abhängig ist und der
die Entstehung eines wichtigen Teils des Immunsystems der Vertebraten bewirkt. Der derzeitige
Wissensstand der Vertebraten-Thymusentwicklung während der Embryogenese ist noch immer
unvollständig und ist deshalb auf neue Erkenntnisse angewiesen.
Trotz neuerer Entdeckungen, die in der Maus gemacht werden konnten, sind die genetischen
Prozesse, die die frühen Stadien der Thymus-Organogenese definieren, noch wenig verstanden.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein genetischer Screen nach Thymusmutanten im Zebrafisch
durchgeführt, um Gene zu identifizieren, die für die Thymusentwicklung von Bedeutung sind.
Da das adaptive Immunsystem der Teleostier mit dem der Säuger größtenteils vergleichbar ist
und wichtige Gene im Laufe der Evolution konserviert wurden, sind Erkenntnisse, die am
Zebrafischsystem gemacht werden, weitestgehend auf Säuger übertragbar. Dieser Aspekt spricht
für die Durchführung eines genetischen Screens am Zebrafisch-Vertebratenmodell, das, im
Vergleich zur Maus, viele Vorteile mit sich bringt und mit dem ein Organ-Screen sehr viel
einfacher und effizienter durchgeführt werden kann.
Für den Screen wurden ENU-mutagenisierte Fische verwendet, bei denen ungerichtete
Punktmutationen ins Genom induziert worden sind. Um Thymusmutanten zu isolieren, wurden
whole mount in situ Hybridisierungen mit einer rag1-AS-Sonde an gynogenetisch diploiden F2-
Gelegen durchgeführt. Damit konnten T-Zellen detektiert und somit auf indirekte Weise
Thymusdefekte identifiziert werden.
Im Screen der vorliegenden Arbeit konnten die drei Mutanten briesle, minibries und briessche
isoliert werden, deren Phänotyp sich bei normaler Aufzuchttemperatur von 28,5°C jeweils in
einer schwächeren rag1-Färbung ausprägt.
Anhand weiterer in situ Hybridisierungen mit spezifischen Markern und mit Methoden der
Histologie wurden die Mutanten bezüglich der Ursache des Phänotyps charakterisiert. Dabei
wurden die Aspekte der Entwicklung des Schlundendoderms, der T-Zellentwicklung, der
Entwicklung der Neuralleistenzellen und der Skelettbildung näher untersucht.
Die Ergebnisse der Charakterisierung zeigen, dass die hypomorphen Phänotypen der drei
Mutanten mit einer geringeren Anzahl an T-Zellen im Thymus als in normalen Fischen
einhergehen.
Aufgrund der Ergebnisse kann auch ausgeschlossen werden, dass bei den Mutanten eine Störung
der frühen Hämatopoese, der frühen Endodermentwicklung und der Skelettbildung im
Kopfbereich eine Entwicklung des Thymus behindert.
Anhand der Temperatursensitivität der briesle-Mutante konnte für diese die weitere Aussage
getroffen werden, dass die Auswirkung der Mutation das Entwicklungsstadium der
T-Lymphozyten nach der Ikaros-Expression und vor der Gata3-Expression betreffen muss und
es sich aller Wahrscheinlichkeit nach um einen intrinsischen lymphoiden Defekt handelt. Die
1

1. Zusammenfassung
_____________________________________________________________________________
Ikaros-positiven Prothymozyten können zwar noch in den Thymus einwandern, jedoch erreichen
sie die späteren Entwicklungsstadien aufgrund fehlender Gata3-Expression nicht mehr.
Der weitere Fortgang der Arbeit bestand darin, über die genetische Kartierung anhand von Poolund
Einzelembryoanalysen die Mutationen einer Kopplungsgruppe (LG) zuzuordnen und den
Bereich, in welchem die Mutationen liegen, so eng begrenzt wie möglich zu bestimmen.
Durch Komplementationsanalysen konnte schon zuvor weitestgehend ausgeschlossen werden,
dass die Mutationen der drei Mutanten gleiche Gene betreffen.
Die Kopplungsanalysen zeigten, dass sich die Mutation der briesle-Mutante auf LG5 in einem
eingegrenzten Bereich von 9,2 cM und die Mutation von minibries auf LG8 in einem Bereich
von 16,5 cM befindet. Die Bestimmung der Kopplungsgruppe der briessche-Mutante war nicht
möglich und muss noch durch weitere Analysen fortgesetzt werden.
Anhand der Ergebnisse der Kopplungsanalysen konnte die Überlebensfähigkeit von
Mutantenembryonen der briesle- und minibries-Mutante überprüft werden. Dabei zeigte sich,
dass die Mutation von briesle zu Letalität führt und die Mutation von minibries hingegen keine
große Auswirkungen auf die Überlebensfähigkeit der Mutanten besitzt.
Aufgrund der Kartierungsergebnisse konnte für beide Mutanten je ein Kandidatengen ermittelt
werden. Für briesle das Gen Cathepsin L und für minibries das Gen pim1.
Beide Gene befinden sich in der Nähe der bestimmbaren Positionen für die Mutationen und es
wäre vorstellbar, dass eine Mutation in diesen Genen zu Phänotypen führen könnten, wie sie in
vorliegender Arbeit gefunden wurden. Beide Gene wurden aus Mutanten-DNA genomisch
amplifiziert und die Sequenz der Exons und der Exon-Intron-Grenzen überprüft.
Das Cathepsin L-Gen der briesle-Mutante konnte, bis auf Exon 7 und kleine Bereiche in den
Exons 4 und 5, erfolgreich amplifiziert und sequenziert werden. Dabei ergaben sich keine
Basenaustausche im Vergleich zur Referenz-Sequenz und keine Veränderungen der Exon-Intron-
Grenzen.
Die genomische Sequenzierung von pim1 zeigte keine Basenveränderungen der Exon-Intron-
Grenzen. In Exon 4 ergab sich ein Aminosäure-Austausch, der jedoch sehr wahrscheinlich nicht
als Ursache für die Entstehung eines hypomorphen Phänotyps in Frage kommt.
Die letztendliche Identifizierung der veränderten Gene, die in den Mutanten briesle, minibries
und briessche zu einem Thymusmutantenphänotyp geführt haben, steht somit noch an.
Mit der Durchführung dieses Pilotscreens konnte gezeigt werden, dass der Thymus als Organ zur
genetischen Analyse zugänglich ist und es konnte dadurch die Grundlage für einen Large-Scale-
Screen nach Thymusmutanten geschaffen werden. Die Identifizierung der Gene der Mutanten in
vorliegener Arbeit und die Analyse der weiteren Mutanten wird in Zukunft mithelfen, die
genetischen Programme in der Thymusorganogenese aufzuklären.
2

2. Einleitung
_____________________________________________________________________________
2. Einleitung
2.1. Der Zebrafisch als vertebrater Modellorganismus
In den letzten Jahren entwickelte sich der Zebrafisch, Danio rerio, zu einem beliebten
vertebraten Modellorganismus für genetische und entwicklungsbiologische Fragestellungen
(Driever et al. 1994; Mullins et al. 1994).
Der Zebrafisch wird den echten Knochenfischen (Teleostier) zugeordnet, die den
Knochenfischen (Osteichthyes) angehören, die ihrerseits den Kiefermündern (Gnathostomata)
zugeordnet werden.
Die Durchführung eines genetischen Screens mit dem Zebrafisch zur Identifizierung für die
Entwicklung und Differenzierung wichtiger Gene bringt viele Vorteile mit sich, die bereits in
Studien zur frühen Vertebratenentwicklung offenbar wurden (Driever et al. 1994; Haffter et al.
1996; Kimmel et al. 1989). Diese sollen hier näher erläutert werden.
Zebrafische sind mit 3-4 cm Körperlänge sehr klein und erreichen die Geschlechtsreife nach
3 Monaten. Die erwachsenen Fische können in großer Zahl auf kleinem Raum, bis zu 80 Fische
in 12 l Wasser, gehalten werden (Mullins et al. 1994; Brand et al. 1995). Das Weibchen kann
wöchentlich verpaart werden und dabei jeweils hunderte von Eiern legen. Diese hohe Anzahl an
Nachkommen erleichtert die Durchführung genetischer Analysen sehr.
Die Eier der Fische können extern befruchtet werden, wodurch Eingriffe an den Keimzellen vor
der Befruchtung oder direkt danach möglich sind. Die Embryonen entwickeln sich schnell und
synchron, sie sind relativ groß und sind bis zum Einsetzen der Pigmentierung am Tag 1.5 (d.1.5)
durchsichtig. Diese Transparenz ermöglicht einerseits die genaue mikroskopische Betrachtung
der Embryo- und Organogenese am lebenden Embryo, andererseits können Zellstrukturen und
Organe mittels geeigneter Methoden am ganzen Embryo sichtbar gemacht werden (Mullins et al.
1994).
Die Eigenschaften des Zebrafischsystems erlauben es, genetische Experimente für die
Entdeckung neuer Gene durchzuführen, die in anderen Vertebraten, wie z. B. der Maus, nicht
möglich sind (Driever et al. 1994). Zum Beispiel können mit ihm rezessiv vererbte Merkmale
einfach und zeitsparend untersucht werden, indem zur Generierung des Phänotyps, im Vergleich
zum klassischen Zwei-Generationen-Screen, eine Generation übersprungen werden kann
(s. Abb. 2.1.).
Zebrafische und Säuger haben wichtige Gene, die für Organentwicklung und Funktion
notwendig sind sehr wahrscheinlich weitestgehend gemeinsam, so dass die Entdeckung neuer
Gene im Zebrafisch auch im Säugersystem nutzbringend angewandt werden kann (Yan et al.
1998; Kimmel et al. 1989).
3

2. Einleitung
_____________________________________________________________________________
2.2. Mutagenesemöglichkeiten des Zebrafischgenoms
Der erste wichtige Aspekt bei der Mutagenese eines Zebrafischgenoms ist die Auswahl des
Stadiums der Keimbahnzellen, in denen die Mutagenese stattfinden soll. Die Mutagenese von
postmeiotischen Keimzellen, wie Spermatozyten und Spermien oder von Embryonen im
Blastodermstadium ist sehr effizient, jedoch entwickeln sich die Fische zu genetischen
Mosaiken. Dieser Zustand erschwert das Wiederauffinden des mutanten Phänotyps in späteren
Generationen, da er nur in einem geringen Prozentsatz der Embryonen eines Geleges auftaucht
(Driever et al. 1994).
Im Gegensatz dazu erhält man für eine induzierte Mutation nicht-mosaike heterozygote
Nachkommen, wenn die Mutagenese an prämeiotischen Keimzellen, den proliferierenden
Spermatogonien, durchgeführt wird. Dies bedeutet, dass die Mutation nach Mendel segregiert
und dass im Falle einer rezessiven Mutation beim Kreuzen der F2-Nachkommen in einem Zwei-
Generationen-Screen jede 4. Kreuzung zum Erscheinen des Mutantenphänotyps führt
(s. Abb. 2.1.) (Driever et al. 1994).
Für die Mutagenese eines Zebrafischgenoms stehen mehrere Möglichkeiten zur Auswahl, um
Veränderungen der DNA zu erzeugen.
Bei der Insertionsmutagenese können durch die Infektion von Zebrafischembryonen im
Blastulastadium mit einem retroviralen Vektor Keimbahnveränderungen durch provirale
Insertionen erzeugt werden (Burns et al. 1993; Lin et al. 1994; Gaiano et al. 1996b), die
anschließend durch Sequenzierung der flankierenden Bereiche der integrierten DNA identifiziert
werden können. Diese Form der Mutagenese konnte schon erfolgreich bei der Maus angewendet
werden (Meisler 1992), jedoch ist die Mutageneseeffizienz beim Zebrafisch im Vergleich zu
anderen Mutagenen sehr gering (Ando et al. 1998).
Kleinere Deletionen im Zebrafischgenom können durch die Behandlung von Spermien mit 4,5,8-
Trimethylpsoralen (TMP) und UV-Strahlen erzeugt werden. Wird TMP durch UV-Strahlen
aktiviert, geht es kovalente Bindungen mit Pyrimidinresten der DNA-Doppelhelix ein, was zu
einem Cross-linking der DNA führt (Cimino et al. 1985). Bei der anschließenden Reparatur
entstehen kleinere Deletionen in der genomischen DNA. Diese Art von Mutagenese konnte
schon bei E.coli (Sladek et al. 1989) und C.elegans (Yandell et al. 1994) erfolgreich
durchgeführt werden.
Große Deletionen können im Zebrafischorganismus durch die Einwirkung von gamma-Strahlen
auf reife Keimzellen erzeugt werden. Sie induzieren Doppelstrangbrüche und führen zu
Deletionen von großen Bereichen der Chromosomen oder zu Chromosomrearrangements, was
jedoch eine erhöhte Sterblichkeit der Fische zur Folge haben kann (Chackrabarti et al. 1983).
Für die Generierung von zufällig verteilten Punktmutationen im Zebrafischgenom sind N-ethyl-
N-nitrosoharnstoff (ENU) und Ethylmethansulfonat (EMS) effiziente Mutagene.
Beide Substanzen sind fähig, Spermien und Spermatozoen zu mutagenisieren, wobei lediglich
ENU prämeiotische Keimzellen, die Spermatogonien, effizient mutagenisieren kann. Dies
konnte ebenfalls schon in Drosophila und in der Maus gezeigt werden (Solnica-Krezel et al.
1994).
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2. Einleitung
_____________________________________________________________________________
ENU und EMS besitzen unterschiedliche Mutagenesemechanismen. ENU ethyliert vorwiegend
das O 6 des Guanin, wohingegen EMS das N 7 des Guanin ethyliert. Die Alkylierung des N 7 im
Guanin scheint jedoch mit höherer Effizienz durch DNA-Reparaturmechanismen zu reparieren
zu sein als die Alkylierung des O 6 des Guanins. Spermien besitzen keine DNA-
Reparaturmechanismen, was eine Erklärung für die erhöhte Mutageneserate von EMS in
postmeiotischen Entwicklungsstadien der Spermatogenese im Vergleich zu prämeiotischen
Stadien sein kann. Es ist daher denkbar, dass die meisten EMS-induzierten Punktmutationen in
den Spermatogonien repariert werden und nur die selten auftretenden Deletionen erhalten
bleiben. Im Gegensatz dazu werden die ENU-induzierten Punktmutationen in den
Spermatogonien nicht repariert (Mullins et al. 1994).
Dies führt zu einer grossen Anzahl an nicht-mosaiken Nachkommen der ENU-mutagenisierten
Männchen, wohingegen EMS-behandelte Männchen eine hohe Anzahl an mosaiken
Nachkommen erzeugen (Solnica-Krezel et al. 1994). Der Grund dafür ist, dass die nicht
reparierten EMS-induzierten Mutationen in Spermien nach der Befruchtung im Embryo repariert
werden können und dadurch mosaike Individuen entstehen. Die ENU-induzierten Mutationen in
den Spermatogonien hingegen können nicht repariert werden, was zu nicht-mosaiken
Nachkommen führt.
ENU bewirkt im Zebrafischgenom von den oben beschriebenen getesteten Mutagenen bei der
Erzeugung von wiederauffindbaren Punktmutationen die größte Mutageneseeffizienz (Solnica-
Krezel et al. 1994). Die chemische Mutagenese des Zebrafischgenoms mit ENU wurde erstmals
in den Laboratorien von Christiane Nüsslein-Volhard (Mullins et al. 1994) und Wolfgang
Driever (Driever et al. 1996) in umfangreichen genomweiten Screens erfolgreich etabliert und
durchgeführt.
Die Mutagenisierung der Fische für den Screen der vorliegenden Arbeit wurde aufgrund der
beschriebenen Vorteile und der bereits erfolgreichen Anwendung in Screens anderer
Arbeitsgruppen mit ENU durchgeführt.
2.3. Verschiedene Möglichkeiten zur Durchführung eines
genetischen Screens
Die Diploidie des Zebrafischgenoms, wie auch der Maus, bringt ein zeitraubendes Problem für
genetische Analysen mit sich. Nachdem ein heterozygoter F1-Träger erzeugt worden ist, muss
die F2-Generation bis zur Geschlechtsreife mehrere Monate gehalten werden, um dann die
Geschwister der F2-Generation untereinander zu kreuzen. Dadurch erhält man homozygote Tiere
in der F3-Generation, die den Phänotyp einer rezessiven Mutation zum Vorschein bringen.
Dieses Vorgehen entspricht dem klassischen Zwei-Generationen-Screen, welcher jedoch viel
Platz benötigt, um die große Anzahl an F2-Familien unterzubringen (Driever et al. 1994).
5

2. Einleitung
_____________________________________________________________________________
F0 ➤ W ➤ M
6
ENU-
Mutagenisierung
F1 ➤ ➤ ➤ ➤ ➤ W ➤ W ➤ W ➤ W
+/-1 +/-2 +/-3 +/-4 +/-5 +/-6 +/-7 +/-8
➤ WT +
haploid
Gynogenese s.Abb.2.2.
F2 ➤ ➤ ➤ ➤ ➤ ➤ ➤ ➤ diploid
+/+ +/-2 +/+ +/-2 -6/-6 +/+ -6/-6 +/+
F3 ➤ ➤ ➤ ➤ ➤ ➤ ➤ ➤
+/+ -2/-2 +/-2 +/-2 -2/-2 +/-2 +/+ +/-2
25% Phänotyp
bis 50 % Phänotyp
Zwei-Generationen-Screen Gynogenese-Screen
Abb. 2.1.
Schematischer Vergleich eines Zwei-Generationen-Screens mit einem Gynogensescreen.
F0-F3: F0-F3-Generation, M: Männchen, W: Weibchen, WT: Wildtyp, : Ei, : Zygote, : UV-inaktiviertes
Spermium, +: WT, -: Mutation, : +/+, : +/-, : -/-
Beim Fisch können alternative Methoden angewendet werden, um dieses Problem zu umgehen.
Es kann eine haploide oder eine gynogenetisch diploide Entwicklung eines Zebrafischembryos
erzeugt werden. Dadurch kann eine Generation übersprungen werden, um normal
entwicklungsfähige Embryonen zu erzeugen, die gleichzeitig den Phänotyp einer rezessiven
Mutation aufweisen (Streisinger et al. 1981). Dieser Vorgang wird in Abb. 2.1. verdeutlicht.
Haploide Embryonen werden durch externe Befruchtung von Eiern mit UV-inaktivierten
Spermien hergestellt. Die UV-Behandlung zerstört die DNA der Spermien, so dass eine Eizelle
zwar noch aktiviert werden kann, sie aber keinen haploiden Chromosomensatz vom Spermium

2. Einleitung
_____________________________________________________________________________
erhält. Diese haploide Embryonen entwickeln noch die Grundstruktur des Körpers, besitzen
jedoch gravierende Defekte, wie einen kurzen Schwanz, ein deformiertes Notochord und Ödeme.
Sie sterben schon sehr früh nach etwa vier Tagen, da die späteren Entwicklungsprogramme
gestört sind. Haploide Embryonen sind dadurch nur für Screens nach Defekten im Körperbau in
frühen Entwicklungsstadien, jedoch nicht für detailliertere Screens oder für Screens in späteren
Entwicklungsstadien geeignet (Driever et al. 1994).
Um gynogenetisch diploide Tiere zu erhalten, werden entweder durch Hitze- oder
Druckeinwirkung aus haploiden Zygoten lebensfähige homozygote diploide Embryonen erzeugt,
in dem die Aufteilung der duplizierten Chromosomen auf zwei Zellen verhindert wird. Dadurch
wird eine Zelle mit zwei identischen Chromosomensätzen produziert (Streisinger et al. 1981).
Dies wird schematisch in Abb. 2.2. veranschaulicht.
1. meiotische
Teilung
Befruchtung
II II
II II
II II
II II
II II
2. meiotische EP
Teilung
1. Zellzyklus
I I I
I I I I
II
II II II II
1. embryonale
Zellteilung HS
I I I I I I I I I I
diploid haploid gynogenetisch diploid
Abb. 2.2.
Vergleichende Darstellung der Generierung eines diploiden mit der eines haploiden Embryos und der Induktion von
gynogenetisch diploiden Embryonen mittels Druck(EP)- oder Hitzeeinwirkung(HS).
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2. Einleitung
_____________________________________________________________________________
Für die Gynogenese durch Hitzeschock (HS) werden die Embryonen 10 min vor der Metaphase
der ersten Zellteilung (13 min nach der Befruchtung (pf)) für 2 min einer erhöhten Temperatur
von 41,4°C ausgesetzt, so dass die erste mitotische Teilung unterbunden wird.
Bei der Early Pressure-Methode (EP) wird die Anaphase der zweiten meiotischen Teilung
unterdrückt, indem die Zygoten direkt nach der Befruchtung für 6 min hohem hydrostatischen
Druck von 3,5 bar ausgesetzt werden. Die Chromosomen werden noch getrennt, die Teilung der
Chromatiden wird jedoch unterbunden, da die Einwirkung des Drucks eine Dissoziierung der
Mikrotubuli-Untereinheiten bewirkt (Streisinger et al. 1981).
Bis zu 50% der Embryonen eines gynogenetisch diploiden Geleges zeigen den
Mutantenphänotyp. Je näher sich die Mutation am Zentromer befindet, desto geringer ist die
Wahrscheinlichkeit eines Crossing-overs und desto mehr Embryonen zeigen den Phänotyp.
Diese Methoden erleichtern wesentlich die Erfassung von Mutationen in genetischen Large-
Scale-Screens, wie bereits in anderen Screens gezeigt wurde (Trede et al. 1998).
Da die Schädigung der Embryonen bei der Gynogenese durch Druckeinwirkung mit 10-20%
sehr gering ist und sich der Mutantenphänotyp bei bis zu 50% der Embryonen zeigt, wurde diese
Methode in vorliegender Arbeit angewendet.
2.4. Das Immunsystem der Teleostier (echte Knochenfische)
Das Immunsystem der Teleostier ist bis heute sehr wenig erforscht. Was bisher durch die
Verknüpfung von immunologisch relevanten in vitro-Systemen, Zellisolierungstechniken und die
Entwicklung von verschiedenen klonalen Leukozytenlinien nachgewiesen werden konnte, zeigt,
dass die Teleostier alle primären Eigenschaften eines adaptiven Immunsystems aufweisen. Sie
besitzen Immunglobulin(Ig)gene, welche von B-Zellen (Warr 1995) und T-Zell-
Rezeptor(TCR)gene (Partula et al. 1995), welche von T-Zellen exprimiert werden (Ellsaesser et
al. 1988), natürliche Killer (NK)-Zellen, dendritische Zellen (DZ) und Makrophagen (Miller et
al. 1998).
In vitro Zellkultursysteme von Leukozyten konnten bisher nur von sehr wenigen Teleostiern
erfolgreich entwickelt werden. Zu den drei wichtigsten hierfür zählen der Karpfen (Cyprinus
carpio), die Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) und vor allem der Channel Catfish
(Ictalurus punctatus). Bei letzterem konnten die größten Erfolge erzielt werden und somit ist der
Channel Catfish zu einem der wichtigsten Teleostier geworden, um die Immunantwort und die
funktionelle und molekulare Charakterisierung von Immunzellen in dieser Tiergruppe zu
untersuchen (Miller et al. 1998).
Um eine spezifische Immunantwort auf T-Zell-abhängige Antigene zu erhalten, werden im
Channel Catfish B-Zellen, T-Zellen und Makrophagen benötigt (Miller et al. 1985). Alle drei
Zelltypen können als Stimulatoren der MLR (mixed lymphocyte reaction) fungieren, wo
hingegen nur die T-Zellen fähig sind, in der MLR zu reagieren. Bei der MLR untersucht man, ob
Lymphozyten auf eine allogene Stimulierung hin proliferieren (Miller et al. 1986).
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2. Einleitung
_____________________________________________________________________________
Die Antigenantwort der T-Zellen und die MLR-Reaktivität sind in Teleostiern hoch
temperaturabhängige Prozesse (Bly et al. 1992; Vallejo et al. 1992). Einige der von N.W. Miller
isolierten T-Zell-Linien aus peripherem Blut des Channel Catfish produzieren IL-2 und IL-4
ähnliche Faktoren, die unter anderem die Proliferation von B-Zellen bewirken. Diese Faktoren
weisen keine Kreuzreaktion unter verschiedenen Spezies auf (Trede et al. 1998).
In allen Teleostiern ist der Thymus das erste Organ, das von Lymphozyten besiedelt wird
(Chilmonczyk et al. 1992), gefolgt von der Niere und der Milz (Hansen et al. 1998).
Thymus und Niere sind die primären Lymphorgane im erwachsenen Teleost, wobei der Thymus
analog zum Säuger für die T-Zellentwicklung und die Niere im Vergleich zum Knochenmark
und der Milz des Säugers für die B-Zellentwicklung zuständig sind (Willett et al. 1999). In der
Milz des Teleost sind bedeutend weniger Ig-positive Zellen vorhanden als in der Niere. Sie trägt
wenig zur B-Zellentwicklung bei (Zapata et al. 1996).
Die Niere erscheint erstmals 48 Stunden nach der Befruchtung (hpf) als ein Paar von
Vornierengängen entlang des larvalen Schwanzes, eng assoziiert mit der Schwanzvene, wo sie
ihre Filtrationsarbeit beginnt (Drummond et al. 1998). Nach 96 hpf erscheinen dort erste
hämatopoetische Zellen, wie Erythroblasten, Myeloblasten und heterophile Myelozyten. Nach
drei Wochen pf ist der Pronephros größer geworden und es sind erste lymphoide Zellen zu
erkennen (Willett et al. 1999).
Die ausgebildete Niere in erwachsenen Teleostiern besteht aus zwei anatomisch
unterschiedlichen Teilen: der vorderen Kopfniere, dem Pronephros, und der mittleren und
hinteren Rumpfniere, dem Mesonephros. Dieser führt Filtrationsaktivität und Hämatopoese
gleichermaßen aus, wohingegen der Pronephros seine ursprüngliche Nierenfunktion nicht mehr
ausübt, sondern nur noch für die Hämatopoese zuständig ist (Zapata et al. 1996).
2.5. Der Thymus und ein Vergleich der wichtigsten Aspekte von
Teleostiern und Säugern
In Säugern wie auch in Teleostiern ist der Thymus ein wichtiges Organ des Immunsystems,
welches in allen Vertebraten während der Entwicklung als erstes von lymphoiden Vorläufern
besiedelt wird. T-Zellvorläufer wandern zur Reifung in den Thymus, wo sie proliferieren und
dabei eine Reihe von Differenzierungsstadien durchlaufen. Während der Entwicklung der
Thymozyten erfolgen die Genrekombinationen, aus denen der T-Zell-Rezeptor hervorgeht, sowie
die positive und die negative Selektion. Diese Prozesse sind von Wechselwirkungen der
heranreifenden Zellen mit den Zellen des Mikromilieus im Thymus abhängig.
Die primitivsten lebenden Vertebraten, die kieferlosen Wirbeltiere (Agnatha), wie Schleimfische
und Neunaugen besitzen noch keinen Thymus (Ardavin et al. 1988). Höherentwickelte
Vertebraten jedoch besitzen eine funktionelle Thymusdrüse, wobei die Chondrichthyes die ersten
Vertebraten mit einem histologisch identifizierbaren Thymus sind (Trede et al. 1998).
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2. Einleitung
_____________________________________________________________________________
Im Zebrafisch konnte der Thymus erstmals 1997 mittels in situ Hybridisierung (ISH) mit einer
rag1-Sonde als bilaterales Organ auf Höhe des 3. Kiemenbogens nachgewiesen werden (Willett
et al. 1997).
2.5.1. Die Entwicklung und Lage des Thymus
In allen Vertebraten entwickelt sich das Thymusepithel aus dem Komplex der dritten
Schlundtasche und der zugehörigen dritten Kiemenspalte. Die korrekte Interaktion dieser
Ephithelschichten ist Voraussetzung für eine normale Thymusentwicklung. Als ersten
morphologisch definierten Schritt in der Thymusentwicklung bilden diese epithelialen Gewebe
zunächst die alymphoide Thymusanlage. In diese wandern später in der Entwicklung Zellen
hämatopoetischen Ursprungs, wie Thymozytenvorläufer, dendritische Zellen und Makrophagen
vom Knochenmark her ein (Janeway et al. 1999).
Ob die Zellen des Thymusepithels aus ektodermalem und endodermalem Schlundgewebe
entstehen oder ob sie nur endodermalen Ursprungs sind, ist bisher noch unklar (Manley 2000).
Ein typischer Marker für das Schlundendoderm ist pax9, das schon unter anderem in Mensch,
Maus, Hühnchen, Zebrafisch und Drosophila identifiziert werden konnte (Ogasawara et al.
1999). Die pax-Gene sind Mitglieder einer großen Überfamilie von Entwicklungskontrollgenen
(Nornes et al. 1996). Pax9 wird in dem endodermalen Epithel der Schlundtaschen exprimiert,
welche den Thymus, die Nebenschilddrüsen und die Ultimobranchialkörperchen bilden (Peters et
al. 1998).
Bei Säugern sind die Epithelien des Thymusprimordiums mit verbindendem Gewebe umgeben
und durch Septa unterteilt, beides entwickelt sich aus mesenchymalen Zellen der Neuralleiste
(Matsunaga et al. 2001). Die Zellen der Neuralleiste wandern ventral, um die Knorpel der
Kiemenbögen, die Kapsel des Thymus aus Fibroblasten, die sensorischen Neurone und die
Pigmentzellen zu bilden (Piotrowski et al. 2000).
Ein Marker der Zellen der Neuralleiste ist der Transkriptionsfaktor dlx3 (distal-less homolog),
der außer im Knorpel der Kiemenbögen noch in anderen Geweben wie in Epidermiszellen,
Haarfollikeln, Ohr- und Riechplakode, Plazenta und weiteren Geweben exprimiert wird (Beanan
et al. 2000). Die Besiedelung des Thymus von Zellen, die von der Neuralleiste stammen, findet
vor dem Einwadern von Zellen aus hämatopoetischen Regionen statt.
Das Erscheinen der lymphozytenfreien Thymusanlage, dem Primordium, kann in Teleostiern
licht- und elektronenmikroskopisch bei 24 bis 52 hpf als kleiner Auswuchs des Schlundepithels
in Form eines zweilagigen Epithels mit einer umgebenden Basalmembran beobachtet werden
(Fishelson et al. 1995). Beim Zebrafisch zeigen histologische Untersuchungen das
Vorhandensein von Thymusgewebe des Thymusprimordiums ab 54 hpf (Willett et al. 1999). Zu
diesem Zeitpunkt der Entwicklung sind die bilateralen Thymi mit dem Schlundendoderm
verbunden und befinden sich oberhalb dieses Endoderms, dort wo sich die dritte und vierte
Kiemenausstülpung bilden (Trede et al. 1998).
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2. Einleitung
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Nach 65 hpf ist das Thymusprimordium des Zebrafisches etwas größer und es können im
Elektronenmikroskop (EM) die ersten lymphoiden Zellen, unreife Lymphoblasten, detektiert
werden. Lymphoide Vorläufer können das frühe Thymusprimordium zwar kolonisieren, jedoch
können sie sich erst zu immunokompetenten Zellen entwickeln, wenn das Stroma zum
Mikromilieu gereift ist. Nach 72 hpf sind noch immer wenige Lymphozyten vorhanden, jedoch
sind die Verbindungen zwischen den Epithelzellen schon sehr gereift. Die Lymphozyten und die
Epithelzellen differenzieren und reifen in einem Zeitraum von 3 Wochen (Willett et al.1999).
Der Thymus in adulten Teleostiern besteht aus zwei bilateralen Drüsen, die noch eng mit dem
Epithel der Kiementaschen verbunden sind und sich lateral-ventral zu den Ohrkapseln, auf Höhe
des 3. Kiemenbogens, wo auch das Thymusprimordium seinen Ursprung hat, befinden. Der
Thymus von anderen Fischarten hingegen wandert mehr zentral (Trede et al. 1998).
Auch bei Säugern entwickelt sich der Thymus aus zwei bilateralen Epithelialstrukturen, den
Thymusprimordien, die sich aus dem 3. Kiemenkomplex bilden (Cordier et al. 1980). Diese
bleiben jedoch nicht an der ursprünglichen Position, sondern kapseln sich ab, nachdem Zellen
von der Neuralleiste und hämatopoetische Zellen vom Dottersack in die Primordien
eingewandert sind, und wandern entlang der ventralen Mittellinie der Schlundregion in medialer,
ventraler und caudaler Bewegung. Die beiden Thymuslappen treffen sich in der Mittellinie und
bilden ein zweilappiges Organ im vorderen Mediastenum oberhalb des Herzens (Williams et al.
1989; Manley et al. 1998).
2.5.2. Der Aufbau des Thymus und sein Mikromilieu
Der Thymus der Säugetiere besteht aus zwei symmetrischen Lappen, die von einer
Gewebekapsel umgeben sind. Diese dringt wiederholt ins Epithel ein und unterteilt so die zwei
Lappen in Läppchen.
Mikroskopisch können zwei Hauptschichten des Thymusgewebes unterschieden werden, die
äußere Cortex- (mit der subkapsulären Zone) und die innere Medulla-Region.
Die Cortex-Region besteht hauptsächlich aus Epithelzellen, welche MHCI- und MHCII-
Moleküle auf ihrer Oberfläche exprimieren und aus einem großen Anteil an Lymphozyten, die in
engem Kontakt mit den Epithelzellen stehen. Diese sind im äußeren Cortexbereich
doppelnegativ und besitzen somit keine CD4 und CD8 Oberflächenmoleküle und im inneren
Cortexbereich doppelpositiv, wo sie die beiden Corezeptoren CD4 und CD8 auf ihrer Oberfläche
exprimieren.
In der Medulla-Region befinden sich vor allem Epithelzellen und im Vergleich zum Cortex
relativ wenige T-Zellen. Diese sind alle einfach positiv entweder für CD4 oder CD8 und für den
Austritt aus dem Thymus bereit (Picker et al. 1993).
Die dendritischen Zellen sind besonders zahlreich im Übergang zwischen Cortex und Medulla,
die Makrophagen sind hingegen über Cortex und Medulla verteilt.
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2. Einleitung
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Die Gesamtheit aller Zellen und Gewebe, welche die Entwicklung und Differenzierung der
T-Lymphozyten im Thymus unterstützt, sind die sog. Stromazellen. Diese sind unterschiedlicher
Herkunft. Cortex und Medulla sind epithelialen Ursprungs, Fibroblasten, die die Kapsel bilden,
mesenchymalen Ursprungs und dendritische Zellen und Makrophagen hämatopoetischen
Ursprungs (Janeway et al. 1999; Rodewald 2000).
Einen weiteren Zelltyp im Thymus stellen die Hassall-Körperchen dar, die sehr wahrscheinlich
epithelialen Ursprungs sind und die Zellfragmente der apoptotischen Thymozyten im Thymus
abbauen (Picker et al. 1993).
Bei den Teleostiern ist nur die mediale Seite des Thymus durch eine Kapsel verdeckt,
wohingegen der laterale Teil des Thymus in Verbindung mit dem Schlundepithel bleibt (Zapata
et al. 1990, zitiert nach Willett et al. 1997; Chilmonczyk et al. 1992).
Im Thymusaufbau der Regenbogenforelle können in einem transversalen histologischen Schnitt
fünf unterschiedliche Zonen beschrieben werden (s. Abb. 2.3.).
Abb. 2.3.
Darstellung des Thymusaufbaus von Teleostiern am Beispiel der Regenbogenforelle nach Castillo et al. (1990).
C: Kapsel, BM: Basalmembran, SZ: subkapsuläre Zone, IZ: innere Zone, OZ: äußere Zone, PE: Schlundepithel,
SE: subkapsuläre Epithelzellen, EO: Epithelzellen der äußeren Zone, CC: zystische Zelle, M: Makrophage
12

2. Einleitung
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Die Thymuskapsel, welche aus einer dicken Schicht von Fibroblastengewebe besteht, bildet
mehrere Septa in das Innere des Thymus. Die Kapsel und die Septa werden durch eine dicke
Basalmembran vom lymphoepithelialen Parenchym getrennt.
Die subkapsuläre Zone besteht aus einer durchgehenden Schicht von Epithelzellen, die in
Kontakt mit der Basalmembran steht, und aus einer nicht durchgehenden lymphoepithelialen
Region, die sich aus großen Epithelzellen, wenigen Lymphoblasten und mittleren Thymozyten
zusammensetzt.
Die innere Zone, die dicht mit mittleren und kleinen Thymozyten besiedelt ist, belegt den
zentralen Teil des Thymus. In dieser Zone bilden Epithelzellen den Hauptzelltyp des
Thymusstroma.
Die äußere Zone, welche unter dem Schlundepithel liegt, weist wenige mittlere und kleine
Thymozyten auf, die zwischen vielen spindelförmigen Epithelzellen angeordnet sind.
Das Schlundepithel, das den Thymus bedeckt, besteht aus ein oder zwei Lagen von Epithelzellen
und vielen Becherzellen (Castillo et al. 1990).
In den drei Zonen Thymuskapsel, subkapsuläre Zone und innere Zone kommen Makrophagen
vor, die über diese Zonen verteilt sind.
Es konnte nachgewiesen werden, dass sich im Teleostierthymus mikroskopisch dieselben
Zelltypen wie bei Säugern befinden (Romano et al. 1999; Castillo et al. 1990).
Die Hassall-Körperchen sind in manchen Spezies, wie z. B. dem Karpfen, vorhanden, in anderen
nicht (Romano et al. 1999). Die Abwesenheit der Hassall-Körperchen hat jedoch in den
untersuchten Teleostiern keine Auswirkungen auf die Funktion des Thymus.
Makrophagen spielen eine wichtige Rolle bei der T-Zellaktivierung in Säugern und sind auch im
Teleostierthymus im Cortex und in der Medulla vorhanden (Clem et al. 1985; Miller et al. 1985).
Die Differenzierung des Thymus in Medulla und Cortex ist nicht in allen Fischen gegeben. Viele
Teleostier, wie z. B. der Karpfen und die Regenbogenforelle besitzen diese Differenzierung
(Romano et al. 1999; Castillo et al. 1990), anderen Teleostiern fehlt sie.
Die Abwesenheit der Unterteilung von Medulla und Cortex scheint jedoch nicht zu einer
fehlerhaften Funktion des Thymus zu führen (Trede et al. 1998).
13

2. Einleitung
_____________________________________________________________________________
2.5.3. Die Funktion des Thymus als Organ zur T-Zellreifung
Der Thymus der Säuger stellt für die Entwicklung von reifen T-Zellen ein gut strukturiertes
Mikromilieu dar, in das unreife T-Vorläuferzellen vom Knochenmark einwandern. Die primäre
Funktion des komplexen lymphoepithelialen Organs ist die Generierung und Selektion eines
großen T-Zellrepertoires, das selbsttolerant und selbst-MHC-restringiert ist (von Boehmer 1997).
Die anatomische Unterscheidung des Thymus in verschiedene Bereiche steht in funktioneller
Beziehung zur Reifung der T-Zellen. Am äußeren Cortexrand, der subkapsulären Zone, befinden
sich frisch eingewanderte, proliferierende, doppelnegative CD4 - 8 - Thymozyten. Doppelnegative
Thymozyten sind unreife T-Zellen im Thymus, die keinen der beiden Corezeptoren CD4 und
CD8 exprimieren. Diese entwickeln sich zu kleinen doppelpositiven CD4 + 8 + Thymozyten,
welche sich im Cortex aufhalten. Im Cortex erfolgt die positive Selektion durch Interaktionen
mit MHCI- und MHCII-exprimierenden Thymusepithelzellen. Zellen, die diese Selektion
überleben, dringen tiefer in den Thymuscortex vor (Janeway et al. 1999).
Die anschließende negative Selektion der Thymozyten auf Selbsttoleranz erfolgt im Übergang
zur Medulla, in der autoreaktive Zellen apoptotische Signale von den dendritischen Zellen und
auch von den Makrophagen erhalten (Nossal 1994; Sebzda et al. 1994).
In der Medulla selbst befinden sich nur noch kleine, reife einfach positive CD4 + oder CD8 +
T-Zellen, die den Thymus verlassen und in den Blutkreislauf gelangen (Janeway et al. 1999).
Die Entwicklung der Vertebraten-T-Zellen im Thymus beginnt mit der Kolonisierung der
Thymusanlage, so dass die hämatopoetischen Vorläufer durch die Schlundgefäße wandern
müssen, um den Thymus zu erreichen.
Dies ist eine Reaktion auf einen Gradienten von sog. Chemokinen, kleinen löslichen Cytokinen,
die die Wanderung und Aktivierung von phagozytischen Zellen und Lymphozyten beeinflussen
und von MHC Klasse II-positiven Epithelzellen des Thymus produziert werden (Wilkinson et al.
1999). Ein typisches Beispiel dafür ist das TECK (Thymus expressed chemokine), von dem
gezeigt werden konnte, dass es eine Anziehungsaktivität auf isolierte T-Zell-Vorläufer ausübt,
welche G-Protein gekoppelte Chemokinrezeptoren auf ihrer Oberfläche besitzen (Bleul et al.
2000).
Während der Wanderung zum Thymus exprimieren die Vorläuferzellen CD45, c-kit, CD44,
CD35 und das α4-Integrin. Wenn diese in den Thymus gelangen, fehlen ihnen zunächst die
charakteristischen Oberflächenmoleküle reifer T-Zellen und ihre Rezeptorgene sind noch nicht
umgeordnet (Shortman et al. 1996). Diese frühen Vorläuferzellen im Thymus sind durch die
Expression von CD44 und das Fehlen der α-Kette des IL2-Rezeptors (CD25) auf der Oberfläche
charakterisiert. In diesem Stadium ist eine Entwicklung zu αβ- und γδ-T-Zellen wie auch zu
natürlichen Killerzellen (NK) und zu dendritischen Zellen des Thymus (DZ) möglich (Godfrey
et al. 1993).
Wechselwirkungen mit dem Stroma führen zu Proliferation und Differenzierung, so dass sich die
Thymozyten über mehrere Stadien, wie CD44 + CD25 + , erfolgreiche Umlagerung der β-Kette,
Paarung der β-Kette mit pTα und Erscheinen auf der Zelloberfläche, Verlust von CD25,
Beendigung der β-Kettenumlagerung, Expression von CD4 und CD8 und Umlagerung der Gene
der α-Kette zu doppelpositiven T-Zellen entwickeln. Doppelpositive T-Zellen exprimieren den
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2. Einleitung
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αβ-T-Zellrezeptor, den assoziierten CD3-Komplex und die CD4 und CD8 Oberflächenmoleküle
(Janeway et al. 1999).
Gleichzeitig zur β-Umlagerung findet im Thymus auch die Umlagerung der γ- und δ-Gene statt,
was zur Entwicklung von T-Zellen mit γδ-Rezeptoren führt. Solche Zellen besiedeln bevorzugt
die Epidermis, wo sie auch als dendritische Epidermis T-Zellen bezeichnet werden (Havran et al.
1994), sowie die Schleimhäute des Verdauungs- und Reproduktionstraktes.
Die doppelpositiven CD4 + CD8 + Thymozyten mit dem αβ-Rezeptor durchlaufen zunächst die
positive Selektion, bei der die Erkennung der eigenen MHC-Moleküle überprüft wird.
Während und nach dem doppelpositiven Stadium der Entwicklung durchlaufen die Zellen auch
die negative Selektion, bei der autoreaktive Zellen eliminiert werden. Diejenigen Zellen, die das
zweifache Screening überlebt haben, reifen zu einfach positiven Zellen heran und gelangen
anschließend in den Blutkreislauf (Janeway et al. 1999).
Abb. 2.4.
Schematische Darstellung eines Thymusläppchens der Maus mit reifenden T-Zellen in verschiedenen
Entwicklungsstadien nach Moroy et al. (2000). Die Cortex-Region beinhaltet T-Vorläuferzellen, die während der
Reifung in Richtung Medulla wandern. Zellen, die die positive und negative Selektion überstehen, treten in die
Medulla ein, um den Thymus anschließend zu verlassen.
CD4-/CD8-: doppelnegative T-Vorläuferzellen, CD4+/CD8+: doppelpositive T-Zellen, CD4+ und CD8+: reife
T-Zellen, rosa sternförmige Zellen: Epithelzellen, grüne sternförmige Zellen: dendritische Zellen, grüne runde
Zellen: Makrophagen.
15

2. Einleitung
_____________________________________________________________________________
Die unterschiedliche Funktion von Cortex und Medulla für die Reifung der T-Zellen im Säuger
scheint auch bei den Teleostiern vorhanden zu sein.
Dies zeigt die Beobachtung beim Karpfen, bei dem ab 4 Wochen nach der Befruchtung im
Cortex viele apoptotische Zellen auftreten, was vermuten lässt, dass eine ständige Selektion der
Thymozyten im Cortex stattfindet (Romano et al. 1999).
Studien beim Teleost Dicentraruchs labrax zeigen ebenfalls das Vorkommen von apoptotischen
Prozessen während der Entwicklung des Thymus und Reifung der Lymphocyten. In der
Thymusanlage können noch keine apoptotischen Zellen gefunden werden, sondern sie treten
erstmals 35 Tage nach dem Schlüpfen auf. Die Anzahl der apoptotischen Zellen steigt ab 74
Tagen nach dem Schlüpfen an, wobei die apoptotischen Thymozyten im Cortex häufiger
vorkommen als in der Medulla und sich ganz besonders zwischen diesen beiden Regionen
konzentrieren (Abelli et al. 1998).
2.6. Die Hämatopoese in Teleostiern und die wichtigsten Marker für
die Entwicklung der T-Zelllinie; SCL, Ikaros, Gata3, rag-Gene
In allen Vertebraten, die bisher untersucht wurden, entsteht hämatopoetisches Gewebe aus dem
ventralen Mesoderm, dem dritten Keimblatt (Hansen et al. 1998).
Unter Blutbildung, bzw. Hämatopoese, versteht man den Prozess, bei dem Blutzellen auf
koordinierte und zellspezifische Genexpression hin definierte Phänotypen erwerben (Shivdanasi
et al. 1996). Die hämatopoetische Entwicklung in niederen Tieren ist hoch konserviert.
Teleostier besitzen differenzierte Blutzellen, die den meisten reifen Blutzelllinien in Säugern
analog sind (Gering et al. 1998).
Im Jahre 1872 zeigte Joseph Oellacher, dass die embryonische Hämatopoese in den meisten
Teleostiern in einer intraembryonischen Region, der intermediate cell mass (ICM), stattfindet
(Oellacher 1872, zitiert nach Detrich et al. 1995). Diese Beobachtung war sehr überraschend, da
in allen anderen bisher untersuchten Vertebraten die Blutbildung im extraembryonischen
Dottersack zu finden war (Detrich et al. 1995).
Die ICM im Zebrafisch ist der anfängliche Hämatopoeseort während der Embryogenese, in der
die ersten Blutzellen produziert werden (Zon 1995). Sie ist das Äquivalent zu den Blutinseln im
Dottersack von Mensch, Maus und Hühnchen (Dzierzak et al. 1998; Bonifer et al. 1998), einigen
Teleostiern (Al-Adhami et al. 1977; Iuchi et al. 1983), Reptilien (Deeb et al. 1990) und
Elasmobranchiern (Zapata et al. 1996b). In anderen Teleostiern findet die Hämatopoese
ausschließlich in den Blutinseln des Dottersacks oder in beiden Organen statt (Willett et al.
1999).
Die ICM wird in der frühen Gastrulation vom Mesoderm gebildet und befindet sich zwischen
dem Notochord und dem Endoderm oberhalb des Dottersacks (Hansen et al. 1998).
16

2. Einleitung
_____________________________________________________________________________
Die primitive Hämatopoese im Zebrafischembryo beginnt in der ICM mit der Einwanderung von
hämatopoetischen Vorläufern ungefähr 12 hpf, was dem 4-5 Somitenstadium entspricht, aus
denen dann die ersten Blutzellen gebildet werden (Trede et al. 1998).
Nachdem schon histologische Studien am Zebrafisch die ICM als hämatopoetisches Organ
identifizierten (Al-Adhami et al. 1977), konnte inzwischen auch mittels ISH die Expression
verschiedener hämatopoetischer Marker in der ICM nachgewiesen werden. Gleichzeitig wurden
dabei weitere intraembryonische Orte entdeckt, welche für die frühe Zebrafischhämatopoese von
Bedeutung sind (Detrich et al. 1995; Gering et al. 1998).
Der Dottersack und seine Äquivalente sind nicht die einzigen Orte der Hämatopoese in sich
entwickelnden Vertebraten. Es gibt zusätzlich einen zweiten Ort der Hämatopoese, die
sogenannte Aorta-Gonad-Mesonephros(AGM)-Region, der erste Ort von definitiver
Hämatopoese in verschiedenen Vertebraten, wie z. B. Maus (Godin et al. 1995) und Hühnchen
(Dieterlen-Lievre et al. 1993).
Thompson et al. (1998) nehmen an, dass die dorsale Aorta, eine mit der ICM verwandte Struktur,
die jedoch in der Entwicklung später erscheint, das Zebrafischequivalent zur AGM-Region sein
könnte. Zellen in dieser Region exprimieren Transkriptionsfaktoren, wie z. B. c-myb, welche für
die definitive Hämatopoese in Säugern bekannt sind.
Die pluripotente hämatopoetische Stammzelle (HSZ) der Vertebraten ist fähig, sich selbst zu
erneuern und sich zu verschiedenen, reifen, differenzierten Zellen der erythroiden, myeloiden
oder lymphoiden Reihen zu entwickeln. Dabei spielt der Transkriptionsfaktor stem cell leukemia
(SCL) eine Schlüsselrolle, da die Expression von SCL in der HSZ die Differenzierung zu den
ersten hämatopoetischen Vorläufern bewirkt (Shivadsani et al. 1996; Liao et al. 1998).
Die erste Expression von SCL im Zebrafisch in der ICM, dem ersten hämatopoetischen Gewebe
des Zebrafisches, kann im 20 Somitenstadium bei 19 hpf, wenn die Blutzirkulation beginnt,
beobachtet werden, wenn die SCL-positiven Zellen sich in einem Streifen entlang des Schwanzes
befinden (Gering et al. 1998).
Die Nachkommen der HSZ werden entweder als primitiv (embryonal) oder als definitiv (larval
oder adult) bezeichnet (Hansen et al. 1998).
Das Ende der hämatopoetischen Aktivität der ICM wird nach ca. 48 hpf (d2.0) erreicht. Nach
etwa 96 hpf (d4.0) beginnt sich die Niere zu differenzieren und der Pronephros enthält erstmals
erythroide Vorläuferzellen. Nach zwei Wochen sind im Pronephros sowohl Erythrozyten als
auch Leukozyten nachweisbar und nach einem Monat ist die ganze Niere hämatopoetisch. Beim
Zebrafisch wie auch bei anderen Teleostiern ist der Ort von weiteren blutbildenden Organen vom
Zeitpunkt zwischen dem Ende der ICM-Aktivität nach 2 Tagen und dem Erscheinen von
erythroiden Vorläuferzellen im Pronephros am Tag 4 noch nicht bekannt (Willett et al. 1999).
Thompson et al. (1998) nehmen an, dass die ventrale Wand der dorsalen Aorta diese Funktion
übernimmt, da in 48 hpf alten Embryonen dort c-myb-exprimierende Zellen nachgewiesen
werden konnten.
Der ursprünglichen Annahme, dass die endocardialen Zellen des primitiven Herzens solch eine
Funktion übernehmen könnten (Al-Adhami et al. 1977) steht die Vermutung entgegen, dass es
17

2. Einleitung
_____________________________________________________________________________
sich dabei lediglich um eine Ansammlung von zirkulierenden Blutzellen handelt (Willett et al.
1999).
Die Ergebnisse von Willett et al. (1999) deuten demnach darauf hin, dass lymphoide Vorläufer
im Thymusprimordium eines 72 h alten Embryos nicht vom Pronephros stammen können, da
dieser seine hämatopoetische Aktivität erst nach ca. 96 h erreicht, weil zu einem früheren
Zeitpunkt das hämatopoetische Gewebe der Niere noch nicht etabliert ist. Es ist daher sehr
wahrscheinlich, dass die definitive Hämatopoese zunächst nicht in der Niere stattfindet, so dass
lymphoide Vorläuferzellen, die das Thymusprimordium kolonisieren von anderen frühen
hämatopoetischen Zentren stammen und nicht von hämatopoetischem Gewebe der Niere.
Frühe hämatopoetische Zentren des Zebrafisches sind demnach die ICM und die schon oben
erwähnte AGM-Region, der ventrale Teil der dorsalen Aorta. Klärende Experimente, woher
letztendlich die Lymphozyten stammen, die den Thymus besiedeln, stehen noch aus.
T-Zellen entstehen aus Vorläufern der hämatopoetischen Linie, welche, nachdem sie in den
Thymus eingewandert sind, ein Programm von Proliferation, Differenzierung und Selektion
durchlaufen, um dadurch eine Population von funktionell kompetenten T-Zellen für den Export
zur Peripherie zu generieren (Anderson et al. 1996). Verschiedene Stadien der Differenzierung
können anhand der Expression bestimmter Gene, den spezifischen Markern der lymphoiden
Linie, charakterisiert werden (Dorshkind 1994).
Der erste Transkriptionsfaktor, der für die Differenzierung zur lymphoiden Linie, wie T-Zellen,
B-Zellen und Natural Killer Zellen (NK) verantwortlich ist, ist Ikaros, ein DNA-bindendes
Protein mit Zink-Finger Struktur (Georgopoulos et al. 1994; Georgopoulos et al. 1997).
Die Ikaros-mRNA im Zebrafisch kann schon nach 24 hpf im unreifen Vorläuferpool in der ICM
nachgewiesen werden, nach 2 Tagen erscheint sie in der dorsalen Aorta und am Tag 3 kann sie
im Thymus detektiert werden (Trede et al. 1998).
Die Entscheidung in der lymphoiden Linie zur T-Zellentwicklung wird durch den
Transkriptionsfaktor Gata3 getroffen (Oosterwegel et al. 1992; Akashi et al. 2000). Gata3 wurde
zuerst als ein T-Zell-spezifischer Transkriptionsfaktor charakterisiert, welcher die Transkription
der T-Zell-Rezeptorgene (für die α-Kette) aktiviert (Ho et al. 1991; Ko et al. 1991). Die
Mitglieder der Gata-Familie erkennen und binden an eine T/A(GATA)A/G DNA-
Konsensussequenz und besitzen hochkonservierte Zink Finger-DNA-bindende Domänen (Neave
et al. 1995).
In Neave et al.(1995) werden die Expressionsdomänen von Gata3 im Zebrafisch bis zum Alter
von 52 hpf mittels ISH beschrieben. Diese Analyse zeigt Gata3-Transkripte im späten
Blastulastadium und in ventralen Regionen im Gastrulastadium. Nach 24 hpf lassen sich
eindeutig Transkripte in den Vornierengängen nachweisen, die auch nach 52 hpf noch vorhanden
sind. Dieses Ergebnis steht im Widerspruch zu Willett et al. (1999) und es müssen noch weitere
Untersuchungen durchgeführt werden, um diesen Aspekt zu klären.
18

2. Einleitung
_____________________________________________________________________________
Ein weiterer Expressionsort konnte in den Neuronen des sich entwickelnden ZNS nachgewiesen
werden. Ab 15 hpf kann die Expression von Gata3 im Spinal Cord nachgewiesen werden, die
nach 36 hpf zwar abnimmt, jedoch noch bis 52 hpf detektierbar bleibt (Neave et al. 1995).
Zum späteren Zeitpunkt der Entwicklung am Tag 5.0 kann eine Gata3-Expression im Thymus
und im Endoderm der Kiemenbögen nachgewiesen werden.
rag
Gata3
Ikaros
LT-HSC
ST-HSC
Mesoderm
SCL, c-myb
CLP CMP
lck Th KM Myeloid Erythroid
T-Zellen B-Zellen
Abb. 2.5.
Schematisierte Übersicht der Differenzierungsschritte der Hämatopoese und die wichtigsten Marker für spezifische
Entwicklungsstadien der T-Lymphozyten der Maus (abgeändert nach Akashi et al. 2000). Diese Marker sind im
Zebrafisch konserviert (Trede et al. 1998; Greenhalgh et al. 1995; Neave et al. 1995; Gering et al. 1998; Thompson
et al. 1998; Willett et al. 1997), wobei die unterstrichenen T-Zell-Marker für die Charakterisierung der Mutanten
vorliegender Arbeit verwendet wurden und im Text genauer beschrieben sind.
LT-HSC: long-term hematopoietic stem cell, ST-HSC: short-term hematopoietic stem cell, CLP: common lymphoid
progenitors, CMP: common myeloid progenitors, TH: Thymus, KM: Knochenmark der Maus, bzw. KM-Äquivalent
im Fisch.
Weitere spezifische Marker von unreifen, sich entwickelnden B- und T-Zellen sind die
hochkonservierten rekombinationsaktivierenden Gene rag1 und rag2.
Rag1 und rag2 werden in T-Zellen exprimiert, wenn die genomische Umlagerung der
T-Zellrezeptorgene zu VDJ-Verknüpfungen in unreifen T-Zellen zur Bildung eines funktionellen
Gens stattfindet. Rag1 und rag2 sind auch für die Umlagerung der Immunglobulingene zur
Bildung der Antikörper in B-Zellen zuständig (Oettinger et al. 1990; Gent v. et al. 1995).
19

2. Einleitung
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Das Zebrafisch-rag1-Gen wurde erstmals von Patricia Greenhalgh und Lisa A. Steiner 1995
kloniert (Greenhalgh et al. 1995). Im adulten Zebrafisch kann die rag1-Expression hauptsächlich
im Thymus nachgewiesen werden, aber auch in viel geringerem Maße im Pronephros, im
Mesonephros, in den Ovarien und in olfaktorischem Gewebe (Willett et al. 1999), jedoch nicht in
der Milz (Willett et al. 1997).
Die erste rag1-Expression in T-Zellvorläufern im Thymus kann mittels ISH nach 92 hpf
detektiert werden, die danach noch mindestens 3 Wochen lang zunimmt. Das Expressionsmuster
von rag2 ist identisch zu dem von rag1, mit dem Unterschied, dass rag2 in viel geringerem
Maße exprimiert wird (Willett et al. 1997).
Die Daten der rag1-Expression im Zebrafisch und die Expression der weiteren, oben
beschriebenen Gene für die Lymphozytenentwicklung stimmen mit denen von anderen
Vertebraten weitestgehend überein (Willett et al. 1997). Die Vermutung liegt demnach nahe,
dass das hämatopoetische Programm in der Stammzelldifferenzierung in spezialisierten Organen
während der Embryogenese in der Vertebratenevolution beibehalten wurde, so dass
Beobachtungen der Entwicklung und Funktion von T-Zellen im Zebrafischmodellsystem
anschließend auf höhere Vertebraten weitestgehend übertragbar sind (Trede et al. 1998).
Da sich die Expression des rag1-Gens gut für die Auffindung der Pre-B- und Pre-T-Zellen
während der Entwicklung des Immunsystems eignet, wurde die Suche nach Thymusmutanten in
vorliegender Arbeit mittels ISH mit einer rag1-Sonde durchgeführt.
Dadurch können T-Zellen, in denen die Umlagerung der Gene für den T-Zellrezeptor stattfindet,
im Thymus detektiert und somit die Thymusdrüsen lokalisiert werden, die durch die Anhäufung
von T-Zellen als stark gefärbte Organe erscheinen.
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3. Ziele der Arbeit
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3. Ziele der Arbeit
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Identifizierung von neuen Genen der Vertebraten-
Thymusentwicklung, deren Analyse einen Beitrag zur Aufklärung der genetischen Prozesse der
Thymusorganogenese leisten können.
Dazu sollten Thymusmutanten im Zebrafisch-Modellorganismus anhand eines Markerbasierenden
Organscreens identifiziert und die isolierten Mutanten auf die Ursache des
Phänotyps mit weiteren spezifischen Markern und mit Methoden der Histologie untersucht
werden.
Mit Hilfe von Kartierungsmethoden sollten anschließend an die Mutationen gekoppelte Marker
identifiziert, die Lage der mutierten Gene bestimmt und durch Kandidatengenanalysen schon
bekannte Gene auf eventuelle Basenaustausche überprüft werden.
Durch die Ergebnisse dieser Arbeit konnte die Grundlage für die Isolierung einer großen Anzahl
an Thymusmutanten und die Identifizierung der betroffenen Gene geschaffen werden.
21

4. Material
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4. Material
4.1. Geräte, Material, Reagenzien
4.1.1. Geräte
8-Kanalpipette (Eppendorf), Biomek 2000 (Beckmann Coulter), Brutschränke (Heraeus),
Elektroporationsgerät E.coli Pulser (BioRad), Frenchpress French Pressure Cell Press (American
Instrument Company AMINCO), Gelapparatur für Grobkartierung: Schlitten 25 x 24 x 2,7 cm
für 4 Kämme mit 50 Taschen im Abstand von 5,2 cm, Kammer 47 x 25,5 x7 cm (hauseigene
Werkstatt), Gelapperatur für Standardagarosegele: für 10 Taschen 6,5 x 5,5 x 2,3 cm, für 30
Taschen 18 x 7 x 2,3 cm (hauseigene Werkstatt), Heizblock (Liebisch), Heizplatte mit
Magnetrührer RCTbasic (IKA Labortechnik), Kammer für Agarosegele, passend für
Standardgele (hauseigene Werkstatt), Kammer für PAA-Gel, passend für die Glasplatten
(hauseigene Werkstatt), Kolben für Frenchpress French Pressure Cell –20.000 psi (SIM
AMINCO), Mikroskop Stemi 2000 (Zeiss), Mikrotom RM 2135 (Leica), Mikrowelle
(Panasonic), Paraffinstrecktisch Hl 1210 (Leica), PCR-Gerät PTC-200 (Biozym), Photometer
DU 530 UV/Vis Spectrophotometer (Beckmann), Pipetboy acu (Integra Biosciences), Pipetten
20, 200, 1000 µl (Gilson), Reinstwasseranlage membra pure LFG50M (MembraPure), Schüttler
HS 250 Basic (IKA Labortechnik), Schüttler Unimax 1010 (Heidolph), Sequencer ABI Prism
377 DNA Sequencer (Perkin Elmer), Sorvallzentrifuge RC5C (Sorvall), Spannungsgerät für
Gele LKB.GPS 200/400 (Pharmacia), Thermomixer 5436 (Eppendorf), Tischzentrifuge
Centrifuge 5417R (Eppendorf), UV-Detektionsgerät für Gele raytest, IDA (Herolab), Vortexer
Reax 2000 (Heidolph), Wärmeschüttler für Bakterien Incubator Shaker Model G25 (New
Brunswick Scientific), Wasserbad (Bender und Hobein)
4.1.2. Material
Cryoröhrchen 2 ml (Costar), Deckgläschen 24 x 60 mm, No.1 (Marienfeld/Automat),
Einbettform 8 Kammern, je 35 x 25 mm (Leica), Elektroporations-Küvette (BTX), Eppis
Safelock 1,5 und 2 ml (Eppendorf), Falcon 12 ml Röhrchen mit Schnappdeckel (Becton
Dickinson), Filter für Sterilfiltration Steritop (Millipore), Filterspitzen 10, 20, 200, 100 µl
(Greiner), Gläschen mit Schnappdeckel ∅ 2 cm, h=4,5 cm, Glaspasteurpipette (Brand),
Glasplatten für PAA-Gele 20,7 x 20 cm (Thoma Glasbäserei, Freiburg), Impfnadel gelb
(Greiner), Klebe-Folie für 96er PCR-Platte (neolab), Microseal”A” Film (Biozym),
Mikroküvette (Hellma), Mikrotiterplatte 24 Well (Nunc), Mikrotomklingen Model 819 (Leica),
Objektträger Superfrost Plus (Menzel-Gläser), Parafilm “M” (Greenwich), PCR-Platte 96 Well
(Biozym), PCR-Tubes 0,5 ml (Biozym), Petrischale ∅ 8,5 cm (Greiner), Pinzetten zum
Dechorionieren No.5 (Dumont und Fils, CH), Plastikpasteurpipetten Pastettes, 3 ml (neolab) ,
Plastikpipette steril RNAse frei 2, 5, 10, 20 ml (Greiner), Schlitten, Glas für bis zu 20
22

4. Material
_____________________________________________________________________________
Objektträger, Skalpell No.10 (Feather), Spitzes Skalpell (Feather), Standardspitzen für
Gilsonpipetten gelb und blau (Roth), Tube 15 ml, 50 ml Tube Cellstar (greiner), UV-Lampe für
Spermieninaktivierung Philips Ultra-violet Tüv 15 W/G 18 T8, Long life (Philips), Wanne, Glas
für Histologie 9,5 x 7,7 x 6,5 cm, Zahnstocher (Fackelmann), Zellstoff Küchenrolle AS68
(astrein)
4.1.3. Reagenzien
Acrylamid 40% rotiphorese Gel40 38% Acrylamid 2% Bisacrylamid (19:1) (Roth), Agar Bacto-
Agar (DIFCO), Agarose NEEO (Roth), Alcian Blue 8 GX (Sigma), Aluminiumkaliumsulfat
Dodecahydrat (Merck), Ammonium Persulfat (APS) (Merck), Ammoniumacetat (NH4Ac)
(J.T.Baker), Ampicillin Natriumsalz (Sigma), Anti-Digoxygenin-AP Fab fragments (Boehringer
Mannheim), Benzylalkohol (Merck), Benzylbenzoat (Merck), Borsäure (Merck),
Bromphenolblau (Sigma), Butanol (Merck), Calciumchlorid (CaCl2) (Merck), Chloralhydrat
(Merck), Chloroform (J.T.Baker), Coral Reef Red Sea-Salz (Free Trade Industrial Zone, Eilat
Israel), Diethyl pyrocarbonat (DEPC) (Fluka), Dig-RNA labelling Mix (Boehringer Mannheim),
Dimethylsulfoxid (DMSO) (Merck), Dinatriumsalz Dihydrat Titrierkomplex III (EDTA) (Roth),
DMFA (Dimethylformamid) (J.T.Baker), dNTPs (Promega), ENU: N-Nitroso-N-Ethylurea
(Sigma), Eosin (Roth), Essigsäure 100% (J.T.Baker), Ethanol (J.T.Baker), Ethidiumbromid (10
mg/ml) (Roth), Ficoll 400 (Applichem), Formaldehyd 37% (Merck), Formamid RNAse frei
MicroSelect for molecular biologie (Fluka), Formamid zur Analyse (Roth), Fuchsin Neufuchsin
(Fluka), Glycerin Rotipuran ≥99,5% (Roth), Hämatoxylin (Sigma), Heparin (Sigma), Hexamer-
Primer (Promega), Isopropanol (2-Propanol) (J.T.Baker), Kaliumchlorid (KCl) (J.T.Baker),
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) (J.T.Baker), Längenstandard 75-12216 bp (Gibco BRL),
Lauryl Sulfat Sodium salt (SDS) (Sigma), Magnesiumsulfat (MgSO4) (Merck), Maleinsäure
(Merck), Methanol (J.T.Baker), Methylenblau (Gibco BRL), NaOH (Merck), Natrium Jodat
(NaJo3)(Merck), Natriumacetat (NaAc) (Merck), Natriumazid (NaN3) (Applichem),
Natriumchlorid (NaCl) (J.T.Baker), Natriumcitrat (C6H5Na3O7) (Roth),
Natriumhydrogencarbonat z.A. (NaHCO3) (J.T.Baker), Natriumhydroxid Plätzchen (Merck),
Natriummonohydrogenphosphat (Na2HPO4) (J.T.Baker), NBT/BCIP-Stock Lösung (Boehringer
Mannheim), New born calf Serum (Gibco BRL), Nonidet 40 (Sigma), Oligo(dT)15-Primer
(Promega), Paraffin Histowax, Schmelzpunkt 57-58°C (Leica), Paraformaldehyd (PFA) (Fluka),
PBS Dulbecco`s phosphate buffered saline (Sigma), Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 (Roth),
Phenylthiocarbamide (PTC) (Sigma), Polyoxyethylensorbitan Monolaurat Tween 20 (Sigma),
Proteinase K (Boehringer Mannheim), Puffer P1, P2, P3 (Qiagen), Roticlear (Xylolersatz)
(Roth), Roti-Histokitt (Roth), Salz für Fischwasser Coral Reef Red Sea Salt (Eilat, Israel),
Salzsäure (HCL) (Merck), Sequenzierungsmix DNA Sequencing Kit Big Dye Terminator Cycle
Sequencing Ready reaction (ABI Prism), TEMED (N,N,N`,N`-Tetramethyl-Ethylenediamine)
(Sigma), Transkriptionspuffer 10x (Boehringer Mannheim), Tricain 3-amino benzoic
acidethylester (Sigma), Tris-(hydoxymethyl)-amino methane (Tris) (Roth), Tryptone Hefeextrakt
23

4. Material
_____________________________________________________________________________
(DIFCO), X-gal (Sigma), Yeast Extrakt (DIFCO), Yeast tRNA (Gibco BRL), Zitronensäure
Monohydrat (Merck)
Bei allen nicht erwähnten Reagenzien wurde beim Kauf nicht auf den Hersteller geachtet und
wurde von folgenden Firmen bezogen: Merck, Roth, Sigma, J.T.Baker, Applichem, Boehringer
Mannheim, Promega, Gibco BRL, Fluka.
4.2. Medien, Gele
4.2.1. Medien
Embryomedium 60 x: 17,2 g NaCl
0,75 g KCl
2,9 g CaCl2 x 2 H2O
4,9 g MgSO4 x 7 H2O
ad 1 l mit H2Odest.
autoklavieren
Embryomedium: Embryomedium 60 x 1:60 in H2Odest. verdünnen
Embryomedium/MB: 100 µl 0,2% Methylenblau in 1 l Embryomedium
0,2% Methylenblau: 0,2% Methylenblau in H2Odest.
LB/Amp Platten: 10 g Tryptone
5 g Yeast Extrakt
10 g NaCl
15 g Agar
ad 1 l mit H2Odest.
autoklavieren
1 ml Ampicillin (80 mg/ml)
LB Medium: Herstellung wie LB-Amp-Platten, nur ohne Agar und
ohne Ampicillin
LB/Amp Medium: Herstellung nach LB Medium
Ampicillin zu einer Endkonzentration von 50 µg/ml
24

4. Material
_____________________________________________________________________________
4.2.2. Gele
5% PAA-Gel: 5 ml 40% Acrylamid
4 ml 5 x TBE
128 µl 25% APS
48 µl TEMED
30,8 ml H2Odest.
3% Agarose/TBE für Kartierung: 3 g Agarose
100 ml 1 x TBE
in Mikrowelle aufkochen
1,5% bzw. 0,8% Agarose/TAE: 1,5 g bzw. 0,8 g Agarose
100 ml 1 x TAE
in Mikrowelle aufkochen
4.3. Puffer, Lösungen, Kits
Mitgelieferte Puffer aus kommerziell erworbenen Kits und Enzymen sind nicht aufgeführt.
4.3.1. Für den Screen
ENU-Lösung: 3 mM in Fischwasser
Fischwasser: 0,4 g Coral Reef Red Sea-Salz
ad 1 l H2Odest.
1 M Tris pH9: 1 M Tris in H2Oreinst
pH9 mit HCl einstellen
autoklavieren
Tricainstock: 400 mg Tricain
97,9 ml H2Odest.
2,1 ml 1 M Tris pH9
auf pH7 einstellen
lichtgeschützt bei 4°C lagern
Tricainlösung: 4,2 ml Tricainstock
ad 100 ml mit Fischwasser
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4. Material
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Solution 1: 8 g NaCl,
0,4 g KCl
ad 100 ml mit H2Odest.
Solution 2: 0,358 g Na2HPO4
0,6 g KH2PO4
ad 100 ml mit H2Odest.
Solution 4: 0,72 g CaCl2
ad 50 ml mit H2Odest.
Solution 5: 1,23 g MgSO4 x 7H2O
ad 50 ml mit H2Odest.
Solutions 1, 2, 4, 5 sterilfiltrieren, bei 4° C lagern.
Hanks-Premix: 10 ml Solution 1
1 ml Solution 2
1 ml Solution 4
1 ml Solution 5
86 ml H2Odest.
lagern bei 4°C
Solution 6: 0,35 g NaHCO3
ad 10 ml mit H2Odest.
Hanks-Puffer: 5 ml Hanks-Premix
50 µl frisch angesetzte Solution 6
lagern bei 4°C
PTC-Stock: 100 mM in 100% Ethanol
4% PFA: 4% PFA in PBS ansetzen
bei 50°C lösen
sterilfiltieren, bei –20°C (länger) oder 4°C (kurz) lagern
PBST: 5 ml 20% Tween20 (0,1%) auf 1 l PBS
sterilfiltrieren, lagern bei 4°C
26

4. Material
_____________________________________________________________________________
4.3.2. Für whole mount in situ Hybridisierung
H2O/DEPC: 100 µl DEPC (0,01%)
ad 1 l H2Oreinst
gut schütteln, über Nacht stehen lassen
2 x autoklavieren
3 M NaAc pH5.6: 204,14 g NaAc
400 ml H2Oreinst
mit ca. 22 ml 37% HCl pH5.6 einstellen
ad 500 ml mit H2Oreinst
autoklavieren
7,8 M NH4Ac: 300,6 g Ammoniumacetat
ad 500 ml mit H2Oreinst
autoklavieren
Proteinase K-Stock: 10 mg/ml in H2O/DEPC
lagern bei –20°C
0,5 M EDTA pH8: 186,1 g EDTA
in 500 ml H2Oreinst lösen
pH 8 mit ca. 20 g Natriumhydroxid Plätzchen
ad 1 l H2Oreinst, autoklavieren
20 x SSCT: 175,3 g NaCl
88,2 g Natriumcitrat
800 ml H2Oreinst
pH7 einstellen
ad 1 l H2Oreinst
autoklavieren
Hyb-: 50% Formamid RNAse frei
5 x SSCT
0,1% Tween20
in H2O/DEPC, lagern bei -20°C
Hyb+: 25 mg yeast tRNA
25 µl Heparinstock (100 mg/ml)
ad 25 ml mit Hyb-, lagern bei -20°C
Heparinstock: 100 mg/ml in H2O/DEPC
bei –20°C lagern
27

4. Material
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MBS: 11,6 g Maleinsäure (100 mM)
in 500 ml H2Oreinst lösen
50 ml 3 M NaCl (150 mM)
pH 7.5 mit ca. 35-40 ml 5 N NaOH einstellen
ad 1 l mit H2Oreinst
sterilfiltrieren
3 M NaCl: 3 M NaCl in H2Oreinst
autoklavieren
NCS-MDT: 20% New Born Calf Serum
1% DMSO
0,1% Tween20
in MBS
sterilfiltrieren, lagern bei 4°C
MBST: MBS mit 0,1% Tween20, frisch ansetzen
TBST: 100 mM Tris/HCl pH9.5
50 mM MgCl2
100 mM NaCl
in H2Oreinst
sterilfiltrieren
0,1% Tween20 frisch zugeben
BB:BA: 2 x Volumen Benzylbenzoat
1 x Volumen Benzylalkohol
lichtgeschützt bei RT lagern
20% Tween 20: 40 ml Tween 20
160 ml H2O/DEPC
sterilfiltrieren
H2Oreinst entspricht dem entnommenen Wasser der membra pure Anlage, es ist laut Angabe des
Herstellers steril und RNAse-frei und kann für sämtliche Lösungen für die ISH benutzt werden.
Bei Bedarf kann jede autoklavierbare Lösung mit 0,01% DEPC, wie unter H2O/DEPC
beschrieben, behandelt werden. Sofern keine andere Angaben angegeben, werden die Lösungen
bei RT gelagert.
28

4. Material
_____________________________________________________________________________
4.3.3. Für die Histologie
Eosin-Färbelösung: 10 g Eosin
in 1 l H2Odest. lösen
durch Filter laufen lassen
lichtgeschützt aufbewahren
3-5 Tropfen Eisessig frisch pro Wanne zugeben
Hämatoxylin-Färbelösung: 1 g Hämatoxylin
(Mayers saures Hämalaun) in 1 l H2Odest. lösen
genau 0,2 g Natrium-Jodat z.A.
50 g Aluminiumkaliumsulfat-Dodecahydrat
gut rühren
50 g Chloralhydrat
1 g Zitronensäure-Monohydrat
durch Filter laufen lassen
lichtgeschützt aufbewahren
Fuchsin Stocklösung: 0,5% Fuchsin in 40% Ethanol
Fuchsinfärbelösung: Fuchsin Stocklösung wird 1:20 in 40% Ethanol
verdünnt
Fixier- und Färbelösung: 75 ml 70% Ethanol
15 ml 37% Formaldehyd
20 ml 100% Essigäure
15 mg Alcianblau 8 GX
lagern bei 4°C
4.3.4. Für die Molekularbiologie
dNTPs (25 mM): je 5 µl aus dATP, dGTP, dCTP, dTTP (10 µmol in
100 µl) in 18 µl H2Oreinst
lagern bei –20°C
Ethidiumbromidbad: 1 ml Ethidiumbromid (10 mg/ml)
in 3 l H2Odest.
lichtgeschützt lagern
29

4. Material
_____________________________________________________________________________
Ladepuffer für Sequenzproben: 25 mM EDTA
50 mg/ml Dextranblau
in H2Odest. lösen
diese Lösung 1:5 mit Formamid verdünnen
Ficoll-Ladepuffer: 0,25% Bromphenolblau
50% Ficoll 400
in H2Odest. lösen
TE pH7.6: 10 mM Tris
1 mM EDTA
in H2Oreinst
autoklavieren
TE pH7.6/RNAseA: 0,15 mg/ml RNAse A Endkonzentration
in TE pH7.6
5 x TBE: 54 g Tris
27,5 g Borsäure (0,045 M Trisborat)
20 ml 0,5 M EDTA pH8 (0,001 M)
ad 1 l mit H2Odest.
autoklavieren
Ampicillin Stock: 500 mg/ml in 70% Ethanol
lagern bei –20°C
50 x TAE: 252 g Tris
57,1 ml Eisessig
100 ml 0,5 M EDTA pH8
ad 1 l mit H2Odest., autoklavieren
X-Gal Lösung: 20 mg X-Gal
1 ml Dimethylformamid
lagern bei –20°C
25% APS: 0,25 g APS in 1 ml H2Odest.
lagern bei –20°C
30

4. Material
_____________________________________________________________________________
4.3.5. Für Mappinganalysen
Lysispuffer: 10 mM Tris-HCL pH 8.3
50 mM KCL
0,3% Tween 20
0,3% Nonidet 40
pH8.3 mit HCl einstellen
ad 1 l mit H2Oreinst
autoklavieren
Proteinase K zu einer Endkonzentration von
0,5 µg/µl frisch zugeben.
Proteinase K Stocklösung: 10 mg Proteinase K (10 mg/ml)
1 ml H2O/DEPC
lagern bei –20°C
Extraktionspuffer: 1 ml 1 M Tris pH8 (10 mM)
2 ml 0,5 M EDTA pH8.0 (10 mM)
4 ml 5M NaCl (200 mM)
2,5 ml 20% SDS (0,5%)
ad 100 ml mit H2Oreinst
Proteinase K zu einer Endkonzentration von 150µg/ml
frisch zugeben
4.3.6. Kits
RNeasy Mini Kit (Qiagen)
QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen)
QIAGEN Plasmid Purification Kit (Qiagen)
QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)
4.4. Oligodesoxynukleotide
4.4.1. Marker für Grobkartierung
Die Sequenzen der zugehörigen Sense und Antisense Primer und die zugehörige
Kopplungsgruppe (LG) können unter http://zfin.org, SSLP database nachgeschaut werden.
31

4. Material
_____________________________________________________________________________
z10008 z10036 z10056 z10164 z10183 z10289
z10321 z10456 z1059 z10673 z1068 z10785
z10789 z10919 z10929 z10960 z11227 z11229
z11320 z1136 z11403 z1144 z1145 z11464
z1148 z11496 z1165 z1182 z11841 z1191
z1202 z1206 z1215 z1225 z1226 z1239
z1270 z1274 z1313 z13230 z13232 z13275
z13329 z13411 z13412 z1351 z1358 z13611
z13611 z13614 z13632 z1366 z13666 z1378
z13822 z13880 z1390 z1393 z13936 z1400
z1406 z1408 z14143 z1462 z1473 z1490
z1497 z1523 z1531 z1536 z15414 z15422
z15457 z1584 z1590 z160 z1627 z1634
z1677 z1680 z1703 z1705 z17219 z176
z1773 z1777 z1778 z1781 z1786 z1801
z1803 z1805 z1826 z1837 z1928 z1990
z20031 z20058 z20550 z20860 z21115 z21155
z21243 z21636 z21911 z21982 z22041 z22083
z22107 z22347 z22375 z22674 z230 z23011
z3157 z3260 z3273 z3275 z3362 z3399
z3430 z3476 z3490 z3491 z3526 z3527
z3528 z3558 z3725 z3741 z3782 z3804
z3816 z3901 z3954 z3964 z3984 z4003
z4009 z4053 z4074 z4175 z4188 z4188
z4190 z4203 z4268 z4278 z4289 z4297
z4299 z4318 z4323 z4329 z4396 z4421
z4425 z4492 z4577 z4593 z4662 z4670
z4673 z4682 z4706 z4830 z5075 z5080
z5112 z5223 z5294 z5321 z5395 z5413
z5435 z5436 z5508 z5563 z562 z5643
z5657 z5669 z5683 z6007 z6019 z6024
z6104 z6268 z6312 z6365 z6410 z6617
z6624 z6657 z6661 z6666 z6712 z6727
z6802 z6804 z6909 z7102 z7158 z733
z7381 z740 z7450 z7486 z7490 z7506
z7634 z7666 z7819 z789 z7926 z8146
z8156 z8208 z8488 z851 z8554 z872
z880 z8945 z9084 z9154 z9199 z9290
z9334 z9394 z9402 z953 z9701 z9704
z9708 z9817 z984 z9847 z9920 z9964
32

4. Material
_____________________________________________________________________________
4.4.2. Marker für Feinkartierung
Die Sequenzen der zugehörigen Sense und Antisense Primer und die Lokalisation der Marker auf
der LG können unter http://zfin.org, SSLP database nachgeschaut werden.
4.4.2.1. Kopplungsgruppe 5
z10456 z11632 z13641 z13883 z14437 z1454
z14567 z14580 z21057 z21290 z23491 z24323
z31983 z3334 z33729 z3516 z379 z5552
z6371 z6880 z7313 z7315 z7339 z7428
z7685 z7824 z9815 z9871
4.4.2.2. Kopplungsgruppe 6
z10479 z1050 z10914 z11310 z11466 z11919
z13538 z14158 z1461 z15771 z17248 z17402
z19665 z20381 z20411 z22444 z22467 z22745
z23353 z23866 z25827 z265 z26626 z27325
z3368 z4761 z4950 z6601 z6767 z7024
z8532 z9738
4.4.2.3. Kopplungsgruppe 8
z10048 z1052 z10731 z11001 z11148 z11237
z11623 z14025 z14407 z14886 z15031 z15045
z170 z17338 z17362 z20180 z21390 z21483
z22270 z22483 z24272 z24511 z25211 z25225
z25243 z25335 z25843 z26584 z27391 z3083
z31349 z34962 z3885 z4956 z5081 z6763
z8770 z9006 z9279 z9420 z987
4.4.2.4. Kopplungsgruppe 9
z10166 z13450 z22173 z23575 z24451 z24454
z24680 z24844 z25549 z26687 z28226 z3124
33

4. Material
_____________________________________________________________________________
z34459 z47923 z50394 z5394 z6336 z6845
z8233 z9112
4.4.2.5. Kopplungsgruppe 20
z10756 z13214 z13867 z14543 z17204 z20046
z25642 z7803 z7933 z8150
4.4.3. Für Gata3-Sonden-Amplifizierung
BrGata3S1 5´-agt aag tcc gga gca gca c- 3´
BrGata3AS3 5´-atc gcc gtc acc ata cta ga- 3´
4.4.4. Für rag1-Sonden-Amplifizierung
In die Sense und Antisense Primer wurde je eine XbaI-Schnittstelle an das 5`-Ende des Primers
angeheftet, um die PCR-Produkte in einen XbaI-geschnittenen Vektor zu klonieren.
Br239xba: 5´-cgc tct aga agt atc aca aga tgt acc gca c- 3´
Br240xba: 5´-cgc tct aga aag ttc gaa tgt ctt gga ctg c- 3´
4.4.5. Für pim1-Amplifizierung und -Sequenzierung
zpim1 5´-gac atg gat atg ctc tgc tga g- 3´
zpim3 5´-cag tat act atg gga aat ctt ctg- 3´
zpim4 5´-acc act gtt gga ttc tgt ctc g- 3´
zpim5 5´-agg ttg cta tca aac aaa tat c- 3´
zpim6 5´-tcc ttt agc gtt gct cct gat c- 3´
zpim7 5´-gag att gct ctc ctg cag agt c- 3´
zpim9 5´-ccg agt cta cag tcc acc tg- 3´
zpim10 5´-gaa gcc agc aac tcg agt tcg- 3´
zpim13 5´-ttg gag atg cgt tta ttg aag c- 3´
zpim18 5´-tcc tca agc aag tca ttg aag ct- 3´
34

4. Material
_____________________________________________________________________________
4.4.6. Für Cathepsin L-Amplifizierung und -Sequenzierung
zCat1 5´-gtg ttt tca tca tga ggg tgt- 3´
zCat2 5´-tct cca aag tgg ttc att ccg agt- 3´
zCat4 5´-cct gat ctt tca cag gag tca c- 3´
zCat7 5´-ttc ttg ctg ggc ttt tag cac- 3´
zCat8 5´-act ggt aaa act gga aag act c- 3´
zCat12 5´-gtc aca cag tac cta gag ctc- 3´
zCat13 5´-gat aaa gga tac atc tac atg gc-3´
4.5. Vektoren, Bakterienstamm, Fischlinien
4.5.1. Vektoren
pBluescript (pBS) SK und KS (Gibco BRL)
4.5.2. Bakterienstamm
E.coli DH10B (Gibco BRL)
4.5.3. Fischlinien
AB: für die Mutagenisierung und weitere Auskreuzungen.
Wik: für die Einkreuzung eines polymorphen Hintergrunds in den AB-Hintergrund für
Kartierungsanalysen.
4.6. Enzyme
Dnase (Rnase frei) (10 U/µl) (Boehringer Mannheim)
Expand High Fidelity PCR-System (3,5 U/µl) (Roche)
M-MLV Reverse Transkriptase (200 U/µl) (Promega)
RNasin (40 U/µl) (Promega)
T3 RNA-Polymerase (20 U/µl) (Boehringer Mannheim)
T4 DNA-Ligase (3 U/µl) (Promega)
35

4. Material
_____________________________________________________________________________
T4 DNA-Polymerase (4 U/µl) (Takara)
T7 RNA-Polymerase (20 U/µl) (Boehringer Mannheim)
Taq DNA-Polymerase (1 U/µl) (MBI)
Taq DNA-Polymerase (5 U/µl) (Qiagen)
Bei allen anderen, nicht genannten Enzymen wurde nicht auf den Hersteller geachtet und wurden
entweder von Takara oder Promega bezogen.
4.7. Verwendete Sonden
4.7.1. Rag1
Rag1 wurde als 1500 bp-Fragment nach Vorlage der rag1-Zebrafischsequenz mit den Primern
Br239xba und Br240xba aus cDNA von 5 Tage alten Embryonen amplifiziert und in pBluescript
kloniert. Durch einen Verdau des Klons #1 mit XhoI und Synthese mit T3 RNA-Polymerase
kann die AS-RNA-Sonde synthetisiert werden.
4.7.2. Gata3
Die Gata3-Sonde wurde als 1300 bp-Fragment nach Vorlage der Gata3-Zebrafischsequenz mit
den Primern Gata3S1 und Gata3AS3 aus cDNA von 24 h alten Embryonen amplifiziert und in
pBluescript kloniert. Sie entspricht fast der kompletten cDNA: atg ga -Sonde- g ggc taa. Durch
einen Verdau des Klons #12 mit XbaI und Synthese mit T3 RNA-Polymerase kann die AS-
RNA-Sonde synthetisiert werden.
4.7.3. Dlx3
Die dlx3-Sonde wurde uns von Dr. Matthias Hammerschmidt, MPI für Immunbiologie, Freiburg,
zur Verfügung gestellt. Das klonierte Fragment ist 450 bp groß und die AS-Sonde kann durch
einen Verdau mit XhoI und anschließender Synthese mit der T7 RNA-Polymerase synthestisiert
werden.
36

4. Material
_____________________________________________________________________________
4.7.4. SCL
Die SCL-Sonde in pBluescript SK- (pZE62) wurde uns von Herrn Dr. Martin Gering, University
of Cambridge, MRC Centre, Nottingham, UK, zur Verfügung gestellt. Die Sequenz umfasst ein
800 bp großes cDNA-Fragment im 3´-untranslatierten Bereich, wie in Gering et al. (1998)
beschrieben.
Durch einen Verdau mit EcoRI und RNA Synthese mit T7 RNA-Polymerase kann die AS-RNA-
Sonde synthetisiert werden.
4.7.5. Ikaros
Die komplette Ikaros-cDNA in pBluescript SK wurde uns über Frau Dr. Nadia Danilova,
MIT/Biology Cambridge, USA, von Herrn Dr. Chris Ameniya, Center for Human Genetics,
Boston University School of Medicine, Boston, USA, zur Verfügung gestellt. Durch einen
Verdau mit SalI und RNA-Synthese mit T3 RNA-Polymerase kann die AS-RNA-Sonde
synthetisiert werden.
4.7.6. Pax9a
Die klonierte pax9a-Sonde mit 1300bp wurde uns von Herrn Dr. Terje Johansen, Biochemistry
Department, IMB, University of Tromso, Norwegen, zur Verfügung gestellt. Sie ist als
komplette cDNA in pBluescript SK kloniert und die Synthese der RNA-Sonde wurde nach
Beschreibung im Methodenteil der Veröffentlichung von Nornes et al. 1996 durchgeführt.
4.8. Computer Software
4.8.1. Für DNA-Sequenzierung und Sequenzanalysen
ABI-Prism DNA Sequencing Software Paket von PE Applied Biosystems, Weiterstadt, für die
Sammlung von Rohdaten und Sequenzeditierungen.
DNASTAR Software Paket Lasergene von DNA-Star Inc., USA:
Seqman (3.96), um Contigs von überlappenden Sequenzen herzustellen; Editseq, um die
Sequenzen zu editieren, MegaAlign (3.14), um zwei oder mehrere Consensussequenzen zu
vergleichen und MapDraw (3.11), um Restriktionskarten von DNA-Sequenzen zu erstellen.
37

5. Methoden
_____________________________________________________________________________
5. Methoden
5.1. Molekularbiologische Methoden
5.1.1. RNA-Präparation
Mit Hilfe des RNeasy Mini Kits von Qiagen wird Gesamt-RNA aus Zebrafischgewebe isoliert.
Bei der RNA-Präparation sind grundsätzlich Handschuhe zu tragen, jegliche RNAse-
Kontaminationen zu vermeiden und RNAse-freie Lösungen zu benutzen.
4 Wochen alte Fische werden in flüssigem Stickstoff zermörsert, 5 Tage alte Fische werden
direkt in den Puffer RTL zum Lysieren gegeben, wo das Gewebe anschließend mit einer 0,9 mm
Kanüle und 10 ml Spritze durch 5 maliges Auf- und Abziehen homogenisiert wird. RTL-Puffer
enthält das stark denaturierende Guanidinium Isothiocyanat, das RNasen sofort inhibiert.
Das Homogenat wird in Eppis umgefüllt, nach Kitvorschrift “For total RNA minipreps from
animal tissues” weiterverarbeitet und auf eine RNeasy-Säule aufgetragen.
Beim Lauf durch die Säule kann die Säulen-Membran bei hohen Salzkonzentrationen bis zu
100 µg RNA (> 200 Basen) binden, wobei Verunreinigungen ausgewaschen werden. Die RNA
wird anschließend mit 30 µl und weiteren 20 µl H2O/DEPC ausgewaschen und zu 50 µl
Endvolumen vereinigt.
5.1.2. RNA-Messung
Präparierte RNA (s. 5.1.1.) wird 1:50 mit H2O/DEPC verdünnt und die Konzentration im
Photometer durch die Messung der Absorption bei A260(nm) bestimmt:
A260(nm) x 40 x Verdünnungsfaktor = .... (ng/µl)
Die Reinheit wird durch die Messung wie folgt bestimmt:
A260(nm)/A280(nm) > 1,8-2.0 gilt als rein
5.1.3. cDNA-Synthese
Um die Amplifizierung von exprimierten Genen durchführen zu können, wird die mRNA aktiver
Gene mit Hilfe der Reversen Transkriptase in vitro in komplementäre DNA (cDNA)
umgeschrieben. Dieser zunächst als RNA-DNA-Hybrid vorliegende Doppelstrang kann
anschließend als Template in einer PCR eingesetzt werden.
38

5. Methoden
_____________________________________________________________________________
Standardvorschrift für einen 200 µl-Ansatz:
5 µg Gesamt-RNA v. 5.1.1. (entspricht ca. 3% = 150 ng mRNA) und 750 ng Primer (entweder
Oligo(dT)15-Primer oder Hexamer-Primer, ca. 5 ng pro ng mRNA) in einem Gesamtvolumen
von 80 µl H2Oreinst werden 10 min bei 60°C inkubiert und anschließend auf 37°C temperiert.
Dazu werden 4 µl dNTPs (25mM), 40 µl 5 x RT-Puffer, 5 µl RNasin (40U/µl), 0,2 µl M-MLV
Reverse Transkriptase (200U/µl) pipettiert und mit H2Oreinst auf 200 µl aufgefüllt.
Dieser Ansatz wird 1 Stunde bei 37°C inkubiert und kann bis zum Gebrauch bei -20°C gelagert
werden.
5.1.4. Polymerase Ketten Reaktion (PCR)
Die PCR wird eingesetzt, um eine gewünschte DNA-Sequenz zu amplifizieren.
Ein Oligonukleotidpaar (Primerpaar), das jeweils zu einer Sequenz des Sense-Stranges und des
Antisense-Stranges des zu vermehrenden DNA-Abschnittes komplementär ist, ist Voraussetzung
für die Synthese des DNA-Fragments durch DNA-Polymerasen.
Durch wiederholtes Durchlaufen von Zyklen der Denaturierung der DNA, Hybridisierung der
Primer an die komplementären DNA-Sequenzen und anschließende Synthese des Gegenstranges
entstehen die Amplifikate exponentiell.
Die Menge an dNTPs muss bei sehr langen Templates entsprechend erhöht werden. Bei
Primerpaaren mit verschiedenen Annealingtemperaturen wird die niedrigste für die PCR
gewählt.
Um eine spezifische Amplifikation zu erhalten, wird bei DNA mit hohem GC-Gehalt 5% DMSO
pro Ansatz zugegeben. Außerdem kann die Magnesium- und die Primerkonzentration variiert
werden. Mit weniger Primern pro Ansatz können oft bessere Ergebnisse erzielt werden.
Die PCR-Bedingungen werden auf diese Weise den verschiedenen Templates angepasst.
Dafür werden je nach Versuch verschiedene Systeme verwendet:
1. Für analytischen PCR-Ansatz mit DNA Taq-Polymerase (MBI).
Die verwendeten Primer dafür besitzen eine errechnete AT von 58 - 60°C.
Standardvorschrift für einen 20 µl-Ansatz:
3-5 µl cDNA (aus 5 µg Gesamt-RNA) bzw. 20 - 50 ng Plasmid, bzw. 1-3 µl aus PCR
Ansatz, bzw. 10 µl Bakteriensuspension von gepickten Klonen
0,2 µl DNA Taq-Polymerase
2 µl 10 x Puffer (15 mM Magnesium)
2 µl dNTPs (2,5 mM)
1 µl Sense Primer (20 µM)
1 µl Antisense Primer (20 µM)
ad 20 µl mit H2Oreinst
Standard-PCR-Programm: 1 min 94°C (1x), 15 sec 94°C, 30 sec AT 58°C, 1,5 min 72°C (25-
35x), 4 min 72°C (1x).
39

5. Methoden
_____________________________________________________________________________
2. Für lange Templates mit Expand High Fidelity PCR-System (Roche)
Für eine Synthese von Fragmenten bis 10 kb Länge. Der Polymerasenmix besitzt 3´-5´-
Exonuklease-Proofreading-Aktivität.
Standardvorschrift für einen 20 µl-Ansatz:
2 µl 10 x Puffer (15 mM MgCl2)
100 ng DNA
0,4 µl dNTP (25 mM)
1 µl Sense Primer (20 µM)
1 µl Antisense Primer (20µM)
0,3 µl Expand High Fidelity PCR-System
ad 20 µl H2Oreinst
Standard-PCR-Programm: 2 min 94°C (1x), 30 sec 94°C, 30 sec AT (60°C), 8 min 68°C (38x), 7
min 72°C (1x).
3. Nested PCR
Um ein spezifisches Fragment zu erhalten, gibt es die Möglichkeit der nested PCR. Dafür
werden 2-3 Primerpaare benutzt, die jeweils weiter innerhalb des Primerpaars liegen, mit dem
die erste Amplifikation durchgeführt wurde.
Gleichzeitig ermöglicht diese Methode eine sehr geringe Anzahl an Ampifikaten durch die
wiederholten Zyklen mit neuen Primern zu vermehren.
Die Standardvorschrift entspricht der vorhergegangenen PCR, außer dass anstatt cDNA 1 µl
PCR-Ansatz zupipettiert wird, die Anzahl der Zyklen zur Amplifikation auf 25x reduziert wird
und ein weiter innen liegendes Primerpaar benutzt wird.
4. Boost PCR
Wird aus einer PCR-Reaktion mit einer spezifischen Bande viel Material benötigt, kann das
Amplifikat mit den gleichen Primern wie bei der ersten PCR-Reaktion geboostet werden. Enthält
die PCR-Reaktion Nebenbanden, so muss die spezifische Bande zuvor aus dem Gel
ausgeschnitten und eluiert werden (s. 5.1.7., 5.1.8.).
Die Standardvorschrift entspricht der vorhergegangenen PCR, außer dass anstatt cDNA entweder
1µl PCR-Ansatz oder 2-4 µl einer Gelelution zupipettiert wird und die Anzahl der Zyklen zur
Amplifikation auf 25x reduziert wird.
5.1.5. Agarose-Gelelektrophorese
Mit Hilfe der Agarose-Gelelektophorese können DNA-Moleküle, bevorzugt Fragmente >500
Basenpaaren, nach Größe, Nettoladung und Gestalt aufgetrennt werden. Bei der Auftrennung
von DNA-Fragmenten reichen die im Molekül vorhandenen negativen Ladungen aus, um sie in
einheitlicher Weise zum Plus-Pol der Apparatur hinwandern zu lassen.
Es wird 1/10 des PCR-Ansatzvolumens mit 2 µl Ficoll-Ladepuffer in die Taschen aufgetragen.
Die Spannung für den Gellauf beträgt ca. 10 V/cm. Nach Auftrennung der Komponenten wird
40

5. Methoden
_____________________________________________________________________________
das Gel entnommen, in Ethidiumbromidlösung inkubiert, kurz gewässert und unter UV-Licht
analysiert. Ethidiumbromid interkaliert in DNA und fluoresziert unter UV-Licht.
Je nach Fragmentgrößen wird die Prozentigkeit der Agarose angepasst. (Standardgele mit 0,8%
Agarose für Fragmente von 3 bis 30 kb, mit 1,5% von 1 bis 3 kb und mit 3% von 0,1 bis 1 kb).
Gele können mit 1 x TAE oder 1 x TBE hergestellt und der Lauf mit entsprechendem 1x-Puffer
als Laufpuffer durchgeführt werden.
Zum Vergleich wird 5 µl Längenstandard (100 ng/µl) mit 2 µl Ficoll-Ladepuffer mit DNA-
Fragmenten von 75-12216 bp mit aufgetragen.
5.1.6. PAA-Gelelektrophorese
Für das Auftrennen von DNA-Fragmenten

5. Methoden
_____________________________________________________________________________
Zum Überstand wird 2,5 x Vol. 100% Ethanol zugegeben, 15 min bei 15000 rpm und 4°C
zentrifugiert, das Pellet 10 min mit 400 µl 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 10 µl
H2Oreinst aufgenommen.
5.1.9. Aufreinigen eines PCR-Ansatzes
Die Aufreinigung eines PCR Ansatzes für eine anschließende Sequenzierung der Amplifikate
erfolgt mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). Dabei werden PCR-Produkte von
100 bp-10 kb Größe von Primern, Nukleotiden, Polymerasen und Salzen gereinigt.
Zum 20 µl PCR-Ansatz wird 100 µl Puffer PB zugegeben und nach Vorschrift fortgefahren. Die
DNA wird bei hoher Salzkonzentration an die Membran der Säulchen gebunden und
Verunreinigungen ausgewaschen. Die Elution der DNA-Fragmente erfolgt mit 30 µl H2Oreinst.
5.1.10. DNA-Sequenzierung
Die Sequenzierung wurde mit dem Gerät ABI Prism 377 DNA Sequencer von Perkin Elmer
nach der Didesoxynuktleotidabbruch-Methode durchgeführt.
Der 10 µl Standardansatz setzt sich wie folgt zusammen:
4 µl Sequenzierungmix
1 µl Primer (20 µM)
500 ng-1 µg Plasmid oder 200 bis 400 ng aufgereinigte PCR-Amplifikate
ad 10 µl H2Oreinst
Bei geringer Templatekonzentration kann der Ansatz verdoppelt werden.
Standard PCR-Programm: 15 sec 96°C, 15 sec AT (Standardprimer mit 58°C), 1 min 60°C (25x)
Die Probe wird gefällt und in Ladepuffer aufgenommen:
Zum 10 µl Ansatz wird 10 µl H2Odest., 2 µl 3M NaAc pH4,6 und 50 µl 100% Ethanol
zugegeben und bei bei 12500 rpm für 30 min bei RT zentrifugiert. Der Überstand wird
abgenommen, auf das Pellet 200 µl 70% Ethanol pipettiert, 5 min bei RT inkubiert, kurz
anzentrifugiert, der Überstand abgenommen, das Pellet getrocknet und anschließend in 3 µl
Ladepuffer aufgenommen.
Das Laden der Proben und der Lauf des Sequenziergels erfolgt nach Vorschrift des
Geräteherstellers. Die Auswertung der Sequenzen wurde mit dem Software Programm
DNASTAR durchgeführt.
42

5. Methoden
_____________________________________________________________________________
5.1.11. Entfernen von 3´-Überhängen an dsDNA mit T4 DNA-Polymerase
Um blunt end-Ligationen mit DNA-Fragmenten durchführen zu können, die sticky aus einem
Vektor ausgeschnitten wurden oder die A-Überhängen von einer PCR-Amplifikation besitzen,
werden die Fragmente mit T4 DNA-Polymerase behandelt. Dazu wird die T4 DNA-Polymerase
von Takara benutzt, die eine 3´→5´-, jedoch keine 5´→ 3´-Exonucleaseaktivität besitzt und die
überstehenden Basen abbaut.
10 µl Standardansatz:
100 - 200 ng DNA
1 µl 10 x T4 DNA- Polymerasepuffer
1 µl 0,1 % BSA
1 µl dNTPs (1,7 mM)
ad 9 µl H2Odest.
Der Ansatz wird für 5 min bei 70°C inkubiert, auf 37°C temperiert, 1 µl T4 DNA-Polymerase
zugegeben, für 5 min bei 37°C inkubiert und gut gevortext, damit das Enzym zerstört ist.
Für eine anschließende Ligation in einen blunt-geschnittenen Vektor wird für einen 50 µl
Ligationsansatz der komplette 10 µl Ansatz benutzt.
5.1.12. Ligation
Unter einer Ligation versteht man das kovalente Verknüpfen von DNA-Fragmenten mit Hilfe
der DNA-Ligase, die die Phosphodiester-Bindung zwischen einer 5´- Phosphatgruppe an einem
DNA-Ende und der 3´-OH Gruppe am anderen DNA-Ende verknüpft.
Die Ligation wird in einem 10 µl Ansatz wie folgt durchgeführt :
25-50 ng linearisierter Vektor
... ng Insert (Menge je nach Molarität)
1 µl 10 x Ligationspuffer
1 µl T4 DNA-Ligase
ad 10 µl mit H2Odest.
Der Ansatz wird über Nacht bei 14 - 16°C inkubiert.
Bei einer blunt end-Ligation wird ein Vektor-Insert-Verhältnis von 1:5-1:10 Molarität, bei einer
sticky end-Ligation ein Vektor-Insert Verhältnis von 1:1-1:4 Molarität eingesetzt. Der Ansatz
kann bis zum Gebrauch bei -20°C gelagert werden.
43

5. Methoden
_____________________________________________________________________________
5.1.13. Transformation mittels Elektroporation
Durch die Elektroporation von kompetenten E.coli DH10B durch elektrische Pulse wird die
Aufnahme exogener DNA möglich gemacht. Optimal sind 10 ng Gesamt-DNA für einen
Transformationsansatz.
40 µl kompetente Bakterien werden auf Eis aufgetaut, 1-3 µl Ligationsansatz zugegeben, kurz
umgerührt und für ca. 1 min auf Eis inkubiert. Anschließend wird die Probe in vorgekühlte
Küvetten pipettiert und im Elektroporationsgerät bei der Einstellung von 2500 V den
Elektropulsen ausgesetzt, bis der Signalton ertönt. Je länger die Zeit, desto effektiver ist die
Transformation.
Danach wird sofort 1 ml LB bei RT zupipettiert, alles zusammen in ein 12 ml-Plastikröhrchen
gegeben und 45 min bei 37°C und 220 rpm im Wärmeschüttler inkubiert.
Anschließend wird auf LB-Antibiotika-Platten (Antibiotika je nach Vektorresistenz) je ein
Aliquot von 50 µl, 100 µl und 200 µl ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Bei einer Blau-Weiss-Selektion wird die LB-Platte zuvor mit 100 µl X-Gal (20 mg/ml)
ausplattiert, so dass am nächsten Tag die positiven weißen Klone gepickt werden können.
Für eine anschließende Test-PCR werden Klone mit Zahnstochern in je 20 µl H2Oreinst
überführt und davon mit 10 µl Bakteriensuspension eine Test-PCR nach 5.1.4./1. durchgeführt,
um zu sehen, ob das Fragment die erwartete Größe besitzt und kein falsches Fragment kloniert
wurde.
Bei positiven Klonen kann mit den restlichen 10 µl eine 3 ml Übernachtkultur angesetzt werden,
um anschließend Plasmid zu gewinnen (s. 5.1.15., 5.1.16.).
Nach der Transformation wird die Küvette mit 70% Ethanol gespült, in frischem 70% Ethanol
über Nacht inkubiert, in 0,1% Natriumazid überführt, über Nacht inkubiert, kurz in 70% Ethanol
gespült, 3 h bei 60°C zum Trocknen inkubiert und in einem sterilen Becherglas gelagert.
5.1.14. Übernachtkultur
Für analytische Plasmidpräparationen (Mini-Präparationen) wird 3 ml LB mit einer
Ampicillinkonzentration von 50 mg/l mit 10 µl der gepickten Klonen (s.5.1.13.) versetzt und
über Nacht bei 37°C und 220 rpm im Wärmeschüttler inkubiert.
Für präparative Plasmidpräparationen (Midi- und Maxi-Präparationen) wird 10 µl der gepickten
Klone in 3 ml LB mit einer Ampicillinkonzentration von 50 mg/l für 2 - 3 Stunden bei 37°C und
220 rpm inkubiert. Von dieser Vorkultur wird je nach Dichte 0,5 - 1 ml zu 50 ml LB/Amp (Midi)
bzw. 1 - 2 ml zu 100 ml LB/Amp (Maxi) gegeben und über Nacht bei 37°C und 220 rpm im
Wärmeschüttler inkubiert.
44

5. Methoden
_____________________________________________________________________________
5.1.15. Plasmid-Mini-Präparation
Für diese analytische Plasmid-Präparation werden die Puffer P1, P2, P3 von Qiagen benutzt, die
im QIAGEN Plasmid Purification Kit enthalten sind.
Es wird 1,5 ml Übernachtkultur (s. 5.1.14.) in einem 1,5 ml Eppi 5 min bei 10°C und 10.000 rpm
zentrifugiert, der Überstand verworfen, nochmals kurz anzentrifugiert und den restlichen
Überstand sauber mit einer Pipette abgenommen.
Auf das Pellet wird 150 µl Puffer P1 gegeben, resuspendiert, 400 µl Puffer P2 zugegeben, 2 - 3x
vorsichtig über Kopf gemischt, 5 min bei RT inkubiert, 300 µl Puffer P3 zupipettiert, 5x gut über
Kopf gemischt, 10 min auf Eis inkubiert und danach 10 min bei 14 000 rpm und 4°C
zentrifugiert. Vom Überstand werden 800 µl in ein neues Eppi transferiert, 500 µl (0,6x Vol)
Isopropanol zugegeben, 15 min bei RT inkubiert, 10 min bei 15 000 rpm und 20°C zentrifugiert,
der Überstand abgegossen und nochmals kurz für 5 min zentrifugiert. Der restliche Überstand
wird vollständig mit einer Pipette abgenommen, das Pellet in TE pH7,6/RNAseA resuspendiert
und 15 min bei RT, bzw. 5 min bei 37°C inkubiert, bis das Pellet gelöst ist.
Danach wird 120 µl 88% Isopropanol/0,2 M KAc zugegben, 10 min bei 15 000 rpm und 20°C
zentrifugiert, der Überstand gut abgenommen und das Pellet getrocknet.
Das Pellet wird in 20 - 30 µl H2Oreinst gelöst und zur Kontrolle 1 µl auf ein 1,5% Agarosegel
aufgetragen.
5.1.16. Midi- und Maxi-Plasmid-Präparation
Um größere Mengen an Plasmid-DNA zu erhalten, wird mit dem QIAGEN Plasmid Purification
Kit genau nach Vorschrift Plasmid-DNA präpariert.
Für high-copy Plasmide werden für Midi-Präparationen 50 ml und für Maxi-Präparationen 100
ml Übernachtkultur (s. 5.1.14.) benötigt. Die Ausbeute für Midi-Präparationen liegt bei
75 - 100 µg, für Maxi-Präparationen bei 300-500 µg DNA.
Die Zentrifugationsschritte werden in 50 ml-Tubes in der Sorvallzentrifuge bei 6500 rpm und
4°C mit einem HS-4 Rotor durchgeführt. Das DNA-Pellet wird in 250 µl H2Oreinst
aufgenommen, die DNA-Menge gemessen und bis zum Gebrauch bei -20°C gelagert.
5.1.17. Bakterien-Glycerinstock
Für einen schnell verfügbaren Bakterien-Glycerinstock werden 850 µl Kultur mit 150 µl
autoklaviertem Gycerin (99,5%) in einem Cryoröhrchen gemischt, in flüssigem Stickstoff
gefroren und bei -80°C gelagert.
Für eine Übernachtkultur wird mit einer Impfnadel wenig Glycerinstock abgekratzt, in 3 ml
LB/Amp überführt und wie unter 5.1.14. beschrieben weiterbehandelt
45

5. Methoden
_____________________________________________________________________________
5.1.18. DNA-Messung
Für die Konzentrationsbestimmung von DNA wird die zu messende Probe 1:50 in H2Odest. in
einem Volumen von 50 µl verdünnt, in die Mikroküvette überführt und die Absorption im
Photometer bei 260 nm (A260(nm)) gemessen.
Die Konzentration ergibt sich wie folgt:
A260(nm) x 50 x Verdünnunsfaktor = ... ng/µl
5.1.19. Gewinnung eines klonierten Fragments aus einem Vektor
200 µl Standardansatz:
10 µg Plasmid wird mit 2 µl Enzym, 20 µl 10x Puffer und restlichem Volumen an H2Oreinst
zusammenpipettiert und über Nacht bei der optimalen Temperatur des Enzyms inkubiert.
Der Verdau wird gefällt durch Zugabe von 1/10 x Vol. 3 M NaAc pH4.6 und 2,5 x Vol. 100%
Ethanol, Inkubation für 10 min bei –20°C, Zentrifugation für 15 min bei max bei 4°C, Waschen
des Pellets mit 70% Ethanol, Trocknen und Aufnahme des Pellets in 20 µl H2Oreinst.
Für einen weiteren Verdau mit einem zweiten Enzym wird nochmals einen Verdau wie oben
beschrieben durchgeführt, gefällt und anschließend in 20 µl H2Oreinst aufgenommen.
5.1.20. Whole mount in situ Hybridisierung
Mit dieser indirekten Methode lässt sich exprimierte mRNA durch Hybridisierung einer
markierten komplementären Antisense(AS)-RNA-Sonde durch anschließende
Antikörper(AK)bindung mit gekoppeltem Enzym und folgender Farbreaktion am Gesamtembryo
sichtbar machen.
In die AS-RNA-Sonde wird während der Synthese Digoxygenin (Dig) eingebaut. Die AS-RNA-
Sonde wird im Embryo an die zelleigene mRNA hybridisiert, so dass ein für Dig spezifischer,
mit dem Enyzm Alkalische Phosphatase (AP) gekoppelter, Antikörper (AK) an das Dig der
Sonde binden kann. Die Zugabe von Substrat führt zu einer Farbreaktion durch die AP-
Enzymaktivität und somit zu einer optischen Detektierung der hybridisierten Sonde.
Alle Lösungen und das Arbeitsmaterial müssen bis zum Schritt nach der Hybridisierung RNAsefrei
sein. Zum Pipettieren werden gestopfte Spitzen verwendet.
Alle Wasch- und Inkubationsschritte werden schüttelnd bei 80 rpm durchgeführt, wenn nicht
anders vermerkt, erfolgen diese bei RT.
46

5. Methoden
_____________________________________________________________________________
5.1.20.1. Herstellung von RNAse-freien Lösungen und Materialien
Lösungen werden mit 0,01% DEPC versetzt und wie unter 4.3.2. beschrieben behandelt.
Autoklavierbare Gegenstände können über Nacht in H2O/DEPC inkubiert und am nächsten Tag
autoklaviert werden, für nicht autoklavierbare Materialen kann eine Inkubation über Nacht in 1%
SDS und anschließendes Spülen mit RNAse-freiem Wasser erfolgen.
5.1.20.2. Plasmidlinearisierung
Das Plasmid mit dem enthaltenen Insert, von dem die Sonde synthetisiert werden soll, wird vor
der Sondensynthese linearisiert, um zu verhindern, dass noch zusätzlich Stücke des Vektors mit
synthetisiert werden und dadurch die Sonde unspezifisch wird. Das Plasmid wird immer am
anderen Ende des Inserts geschnitten, an dem der Promotor für die benutzte RNA-Polymerase
liegt.
300 µl Standardansatz:
10 µg Plasmid wird zusammen mit 2 µl Enzym, 30 µl zugehörigem 10 x Puffer und restlichem
Volumen an H2O/DEPC für mindestens 3 h bei 37°C inkubiert und anschließend nach 5.1.20.3.
aufgereinigt.
5.1.20.3. Phenol/Chloroform-Extraktion
Um das verdaute Plasmid aufzureinigen, wird eine Phenol/Chloroform-Extraktion wie folgt
durchgeführt. Phenol denaturiert Proteine, die dadurch, wie auch RNAsen und Salze, aus dem
Ansatz entfernt werden.
Zum linearisierten Plasmid (s. 5.1.20.2.) mit 300 µl Volumen wird 200 µl H2Oreinst und 500 µl
Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 zugegeben, gut gevortext und 10 min bei max bei 20°C
zentrifugiert. Die obere Phase wird abgenommen, in ein frisches Eppi überführt, das gleiche
Volumen an Chloroform (ca. 480 µl) zugegeben, gut gevortext und zentrifugiert wie zuvor.
Dieser Schritt wird mit ca. 470 µl Chloroform wiederholt. Der Überstand von ca. 450 µl wird in
ein frisches Eppi gegeben und 0,1 x Vol. 3 M NaAc pH 5,6 und 2,5 x Vol. Ethanol zugegeben
und 20 min bei -20°C inkubiert. Danach folgt eine Zentrifugation für 20 min bei max bei 10°C,
der Überstand wird abgenommen, 1 ml 70% Ethanol/DEPC auf das Pellet pipettiert, 5 min bei
RT stehen gelassen, wieder abgenommen, das Pellet getrocknet und in 20 µl RNAse freiem
Wasser aufgenommen.
Anschließend wird zur Kontrolle 0,5 µl auf ein 1,5% Agarosegel aufgetragen und die Menge
durch eine A260(nm)-Messung (s. 5.1.18.) bestimmt.
47

5. Methoden
_____________________________________________________________________________
5.1.20.4. In vitro Synthese von RNA-Sonden
Für die Synthese einer RNA-Sonde wird der linearisierte und nach 5.1.20.3. aufgereinigte Vektor
mit Insert benutzt. Durch Zugabe von RNA-Polymerase und einem Nukleotidmix, der einen Teil
seiner U mit Digoxygenin gekoppelt enthält, werden diese bei der Synthese nach dem
Zufallsprinzip in die RNA eingebaut.
20 µl Standardansatz :
1 µg linearisierter Vektor mit gewünschtem Insert
2 µl 10 x Transkriptionspuffer
2 µl Dig RNA labelling Mix
1 µl RNasin
2 µl T3 oder T7 RNA-Polymerase
ad 20 µl H2O/DEPC
Der Ansatz wird 2 Stunden bei 37°C inkubiert und anschließend die Plasmid-DNA wie folgt
verdaut. Zum Ansatz wird 2 µl 10 x Transkriptionspuffer, 1 µl RNase-freie DNAse, 17 µl
RNAse-freies Wasser zugegeben und 30 min bei 37°C inkubiert.
Die Reaktion wird durch die Zugabe von 2 µl 0,5 M EDTA/DEPC gestoppt und danach erfolgt
die Fällung der synthetisierten RNA durch die Zugabe von 21 µl 7,8 M NH4Ac/DEPC und
126 µl 100% Ethanol einer Inkubation für 20 min bei -20°C und ein Zentrifugationsschritt bei
max für 20 min bei 10°C.
Der Überstand wird abgenommen, 1 ml 70% Ethanol/DEPC auf das Pellet pipettiert, nach 10
min bei RT wieder abpipettiert, das Pellet entweder bei RT oder im 37°C-Block getrocknet und
anschließend mit 20 µl H2O/DEPC resuspendiert. Davon wird zur Kontrolle 0,5 µl auf ein 1,5%
Agarosegel aufgetragen.
Zum restlichen Volumen wird 20 µl RNAse-freies Formamid zugegeben. So kann die Sonde bei
-20°C für ein paar Wochen und bei –80°C für längere Zeit stabil aufbewahrt werden.
5.1.20.5. Proteinase K-Verdau und Nachfixierung
Der Verdau von Proteinen durch Proteinase K dient einerseits dazu, das Gewebe des Embryos zu
permeabilisieren, damit die Sonde zum Hybridisieren in das Gewebe eindringen kann und
andererseits dazu, die an RNA gebundenen Proteine abzubauen, damit eine Hybridisierung der
markierten Sonde an das Zielgen möglich ist.
Die fixierten Embryonen (s. 5.2.5.) werden in Gläschen umgefüllt, das Methanol abgesaugt, 2 x
5 min mit 5 ml PBST gewaschen, 20 min in 5 ml 4% PFA fixiert und nochmals 2 x 5 min mit 5
ml PBST gewaschen.
Der anschließende Verdau erfolgt bei RT mit 3 ml 20 µg Proteinase K/ml PBST. Die
Inkubationsdauer erfolgt bei Embryonen bis d 2.0 für 5 min und bis d 5.0 für 10 min.
Die Embryonen werden dann 2 x 5 min mit 5 ml PBST gewaschen, 20 min mit 5 ml 4% PFA
fixiert, 5 min mit 5 ml PBST, 1 min mit 5 ml H2O/DEPC und 5 min mit 5 ml PBST gewaschen.
48

5. Methoden
_____________________________________________________________________________
5.1.20.6. Prähybridisierung und Hybridisierung
Diese Schritte erfolgen bei 60°C im Wasserbad oder Ofen mit vorgewärmten Lösungen.
Die Embryonen werden mit einer Plastikpasteurpipette in 0,5 ml PCR Tubes umgefüllt, das
PBST abgesaugt, 0,5 ml Hyb- zugegeben und 10 min stehen gelassen. Danach wird der
Überstand abgesaugt, 0,2 ml Hyb+ zugegeben und für 1 - 3 Stunden inkubiert. Die Hefe-tRNA
im Hyb+ Puffer sättigt unspezifische Bindungen ab.
Die synthetisierte Sonde (s. 5.1.20.4.) wird 1:100 in Hyb+ verdünnt und 5 min bei 80°C
denaturiert.
Das Hyb+ wird abgesaugt, ca. 100µl (ca. das doppelte Volumen der Fische) denaturierte Sonde
zugegeben und über Nacht inkubiert.
5.1.20.7. Sondenentfernung und Waschen der Embryonen
Alle Schritte erfolgen bei 60°C, benutzte Lösungen werden vorgewärmt.
Die Sonde wird abgenommen (kann bei –20°C gelagert und wiederverwendet werden) und 0,5
ml Hyb- für 20 min zu den Embryonen gegeben. Danach werden sie 2 x 20 min mit 0,5 ml 2 x
SSCT/50% Formamid, 1 x 20 min mit 0,5 ml 2 x SSCT/25% Formamid, 2 x 20 min mit 0,5 ml
2 x SSCT, 3 x 30 min mit 0,5 ml 0,2 x SSCT und 5 min mit 0,5 ml MBST gewaschen.
5.1.20.8. Detektion
Soweit nicht anders vermerkt, finden die Schritte bei RT, schüttelnd bei 80 rpm statt.
Die Embryonen werden in 24er Mikrotiterplatten umgefüllt, das MBST abgesaugt und mit 1 ml
NCS/MDT für 1 h geblockt. Der Überstand wird abgesaugt, 0,4 ml anti Dig-Fab-AK-AP (1:5000
in NCS-MDT) zugegeben und bei 4°C über Nacht inkubiert.
Danach wird mit 2 ml NCS-MDT schüttelnd 1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 15 min und 3 x 30 min
und mit je 1 ml TBST 3 x 10 min gewaschen.
Anschließend wird 0,5 ml Färbelösung (NBT/BCIP 1: 50 in TBST verdünnt) zugegeben und
solange inkubiert, bis eine deutliche Färbereaktion (1,5 - 6 h oder auch über Nacht bei 4°C) zu
erkennen ist.
Die Färbung wird abgestoppt, indem 2 x für 10 min mit 2 ml PBST gewaschen wird. Die
Embryonen werden in 2 ml-Tubes umgefüllt, das PBST abgesaugt, 2 x 5 min mit 2 ml Methanol
gewaschen und durch 2 ml Benylbenzoat:Benzylalkohol 2:1 (BB:BA) ersetzt.
Die Embryonen können abgedunkelt bei 4°C für ca. 1 - 2 Wochen aufbewahrt werden.
49

5. Methoden
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5.1.21. Kartierung von mutierten Genen
5.1.21.1. DNA-Präparation aus ISH-gefärbten Fischembryonen
Es werden ISH gefärbte Fische aus BB:BA 2 x 5 min in Methanol und 4 x 5 min in PBST bei RT
gewaschen und anschließend 1 Fisch pro Well in eine 96er Well-PCR-Platte überführt.
Pro Well wird 50 µl Lysispuffer zugegeben, die Platte mit Klebe-Folie abgeklebt, über Nacht bei
50°C im Ofen inkubiert und am nächsten Tag durch eine Inkubation von 10 min bei 98°C
inaktiviert. Die DNA muss bis zum Gebrauch bei -20°C gelagert werden.
5.1.21.2. Herstellung von DNA-Pools für Grobkartierungsanalysen
Für die PCR zur Grobkartierung wird je ein DNA-Pool aus DNA von 48 Mutanten und 48 WT
Fischen benötigt.
Für die Herstellung eines DNA-Pools wird die DNA wie unter 5.1.21.1. beschrieben präpariert,
anschließend pro Fisch 20 µl der präparierten DNA in einem Pool vereint, 2,5 ml H2Oreinst
zupipettiert und bis zum Gebrauch bei -20°C gelagert.
5.1.21.3. PCR zur Grobkartierung
Für die Grobkartierungsanalyse wird ein Panel von 240 Primerpaaren (s. 4.4.1.) benutzt, das aus
Primerpaaren für Marker besteht, die über die 25 Chromosomen des Zebrafischgenoms verteilt
lokalisiert sind.
Pro Primerpaar wird eine PCR-Reaktion mit je dem WT- und Mutanten-DNA-Pool durchgeführt
und die amplifizierten Banden auf einem 3% Agarosegel/1xTBE analysiert.
10 µl Standardreaktionsansatz in 96er Well PCR-Platten. Die Platte wird mit einem Microseal
“A” Film abgedeckt.
1 µl 10 x PCR Puffer (Qiagen)
0,1 µl dNTPs (25 mM)
2,5 µl DNA-Pool
1,35 µl H2Oreinst
0,05 µl DNA-Polymerase (Qiagen)
5 µl Primermix (S und AS je 0,8 µM)
PCR-Programm: 2 min 94°C (1x), 30 sec 94°C, 30 sec 60°C, 1 min 73°C (35x), 5 min 73°C (1x)
Zu den Proben wird je 2 µl Ficoll-Ladepuffer pipettiert und je 7 µl auf ein 3%
Agarosegel/1xTBE in der Gelapperatur für Grobkartierung (s. 4.1.1.) so aufgetragen, dass sich je
die WT- und Mutanten-PCR-Amplifikation eines Primerpaares nebeneinander auf dem Gel
50

5. Methoden
_____________________________________________________________________________
befinden. Die DNA wird im Gel mit 200 V aufgetrennt, im Ethidiumbromidbad gefärbt und
unter UV-Licht analysiert.
5.1.21.4. Einzelembryoanalysen
Um die Lokalisation eines Markers im Verhältnis zur Mutation ermitteln zu können, wird mit
Markern, die bei der Grobkartierung gelinkt erscheinen, Einzelembryoanalysen durchgeführt.
Dazu werden zuerst die Mutantenembryonen, die für die Zusammensetzung des Pools eingesetzt
wurden, benutzt und mit demselben Marker der Grobkartierung je eine PCR durchgeführt.
10 µl Standardansatz:
1 µl 10 x PCR Puffer (Qiagen)
0,1 µl dNTPs (25 mM)
0,5 µl DNA eines Embryos
3,37 µl H2Oreinst
0,03 µl DNA-Polymerase (Qiagen)
5 µl Primermix (S und AS je 0,8 µM)
PCR-Programm: 2 min 94°C (1x), 30 sec 94°C, 30 sec 60°C, 1 min 73°C (35x), 5 min 73°C (1x)
Es wird je 2 µl Ficoll-Ladepuffer zugegeben, das gesamte Volumen auf einem 3%
Agarosegel/1xTBE aufgetragen, aufgetrennt und die DNA im Ethidiumbromidbad angefärbt.
5.1.21.5. Aufbewahrung von Fischen bis zur späteren DNA-Präparation
Um die DNA eines Fisches für eine spätere Präparation aufzubewahren, wird der Fisch in
Tricainlösung betäubt, gut auf Zellstoff abgetrocknet, in flüssigen Stickstoff überführt und bis
zur weiteren Verwendung bei -80°C aufbewahrt.
5.1.21.6. Präparation von genomischer DNA aus adulten Fischen
Es wird ca. 1/4 des Fisches im gefrorenen (-80°C) Zustand (s. 5.1.21.5.) abgeschnitten, in
flüssigem Stickstoff zermörsert und in 5 ml Extraktionspuffer im 15 ml Tube über Nacht bei
55°C schüttelnd im Heizschüttler verdaut. Am nächsten Tag wird der Verdau 5 min bei 2000
rpm und 22°C zentrifugiert, um so die Feststoffe zu eliminieren. Der Überstand wird in ein
frisches Tube überführt, 1 x Volumen Phenol:Chloroform:IAA zugegeben, ca. 30 x über Kopf
gedreht, 5 min bei 3500 rpm und 20°C zentrifugiert und der Überstand in ein neues Tube
51

5. Methoden
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überführt. Dieser Vorgang wird wiederholt. Zum erhaltenen Überstand wird 1 x Volumen an
Chloroform zugegeben und weiterbehandelt wie oben mit Phenol:Chloroform.
Zum Überstand wird zum Fällen der DNA 1 x Volumen 100% Isopropanol bei RT zugegeben
und 3x über Kopf gedreht. Die DNA fällt aus und bildet ein wattebauschähnliches Gebilde. Mit
einer Glaspasteurpipette, bei der die Öffnung zuvor verschmolzen wurde, wird die
hochmolekulare genomische DNA aufgedrillt, 3 - 4 x in 70% Ethanol getunkt, auf Zellstoff
abgetupft, anschließend in 1ml H2Oreinst überführt und durch wiederholtes Schnippen an das
Eppi gelöst.
Für den Erhalt von hochmolekularer DNA für eventuelle Southern Blot-Analysen wird die DNA
bei 4°C und für DNA-Fragmente für PCR Analysen wird die DNA bei -20°C aufbewahrt.
5.1.21.7. “Fin Clips” zur Genotypisierung
Um kleine Mengen an DNA von erwachsenen lebenden Fischen zu erhalten, kann ihnen ein
Stück der Schwanzflosse abgeschnitten und daraus DNA präpariert werden.
Die Fische werden in Tricainlösung betäubt und mit einer feinen sterilen Schere wird ca. 2/3 der
Schwanzflosse abgeschnitten. Das Stück Schwanzflosse wird in 100 µl Extraktionspuffer
gegeben und über Nacht bei 55°C schüttelnd inkubiert.
Am nächsten Tag wird 200 µl gekühltes 100% Ethanol zugegeben, 30 min auf Eis inkubiert, 25
min bei 20°C und 14000 rpm zentrifugiert, das Pellet mit 500 µl 70% Ethanol 5 min bei RT
inkubiert, wieder abgenommen, das Pellet getrocknet, mit 50 µl H2Oreinst aufgenommen,
10 min bei 20°C und 14000 rpm zentrifugiert und den Überstand mit der DNA in ein frisches
Tube überführt. Davon wird 2,5 µl in einem 10 µl PCR Ansatz eingesetzt.
10 µl Standard PCR Ansatz:
1 µl 10 x Puffer (Qiagen)
0,1 µl dNTPs (25 mM)
2,5 µl DNA aus Fin Clip-Präparation
0,03 µl DNA-Polymerase (Qiagen)
5 µl Primermix (S und AS je 0,8 µM)
1,37 µl H2Oreinst
PCR-Programm: 2 min 94°C (1x), 30 sec 94°C, 30 sec 60°C, 1 min 73°C (35x), 5 min 73°C (1x)
Es wird je 2 µl Ficoll-Ladepuffer zugegeben, das gesamte Volumen auf ein 3%
Agarosegel/1xTBE aufgetragen, aufgetrennt und im Ethidiumbromidbad angefärbt.
52

5. Methoden
_____________________________________________________________________________
5.2. Methoden für den Screen
5.2.1. Mutagenisierung
Für das Einbringen von Punktmutationen in das Genom von Zebrafischen wird die
Mutagenisierung mit Ethylnitrosoharnstoff (ENU) durchgeführt.
Es werden je 5 erwachsene Männchen pro Gefäß in 400 ml 3 mM ENU für 45 min inkubiert.
Danach werden sie vorsichtig in 400 ml Fischwasser mit 10 mM Natriumphosphatpuffer pH 7.4
gegeben, dort über Nacht gelassen und am nächsten Tag in die Tanks des Aquariensystem
zurückgesetzt. Dieses Vorgehen wird 4 mal im Abstand von einer Wochen wiederholt.
Die Bedingungen sind so gewählt, dass sich optimalerweise 1 Mutation pro Spermtogonium
befindet.
Die Inkubation in ENU wird unter dem Abzug durchgeführt. Es muss jede Aufregung der Fische
vermieden werden, da sie in dieser Phase leicht an Herzstillstand sterben, d. h. nur langsame
Bewegungen ausführen, den Abzug abkleben, das Licht im Raum abschalten und die Gefäße auf
schwarzes Papier stellen.
Ab 3 Wochen nach der letzten Runde werden die Männchen mit WT-Weibchen 5 Wochen lang
wöchentlich verpaart und die Gelege verworfen. In dieser Zeit werden die unerwünschten
Mutationen weitergegeben, die in den Spermatiden stattgefunden haben. Erst nach ca. 8 Wochen
werden die Mutationen vererbt, die in den Spermatogonien stattgefunden haben. Ab diesem
Zeitpunkt werden die F0-Männchen mit WT-Weibchen verpaart und die entstandene F1-Familie
großgezogen.
5.2.2. Verpaaren von Fischen
Ein Fischpärchen wird abends in einem Sieb in einer Box mit Fischwasser zusammengesetzt. Bei
Lichtbeginn am nächsten Tag legt das Weibchen die Eier, sie werden vom Männchen befruchtet
und fallen durch das Sieb auf den Boden. Die Fische werden entnommen und die Eier in eine
Petrischale überführt.
Danach werden die befruchteten Eier in frisches Embryomedium/MB überführt und
weiterbehandelt, wie unter 5.2.3. beschrieben.
53

5. Methoden
_____________________________________________________________________________
5.2.3. Behandlung der Embryonen bis zur Fixierung bzw. zum adulten
Stadium
Befruchtete Eier (aus Gelege oder durch Gynogenese) werden in Embryomedium/MB überführt
und über Nacht bei 28,5°C inkubiert. MB verhindert das Verpilzen des Geleges.
Am nächsten Tag werden tote Embryonen aussortiert und Embryomedium/MB durch
Embryomedium ersetzt. Die weitere Inkubation bis zur Fixierung erfolgt bei 28,5°C, wobei jeden
Tag tote Embryonen und später die Eihüllen entfernt und jeden zweiten Tag das Embryomedium
durch frisches ausgetauscht werden muss.
Findet die Fixierung bis d5.0 statt, kann wie beschrieben vorgegangen werden. Werden die
Fische in späteren Stadien fixiert, so brauchen sie ab ca. d5.0 zusätzlich Futter.
Sollen die Fische das adulte Stadium für anschließende Auskreuzungen erreichen, werden sie ab
d5.0 in die Fischanlage überführt.
5.2.4. Verhindern der Pigmentierung von Fischembryonen
Für Fische, die in einer in situ Hybridisierung (ISH) eingesetzt werden sollen, kann die
Pigmentierung durch Zugabe von Phenylthiocarbamid (PTC) verhindert werden.
Nach 24 hpf, nach der Zugabe von Embryomedium, wird pro halb gefüllte Petrischale 50 µl
100 mM PTC-Stock zugegeben.
Die weitere Behandlung erfolgt wie unter 5.2.3. beschrieben, mit der Ausnahme, dass das
Embryomedium mit PTC nur dann erneuert wird, wenn ein schlechter Zustand des
Embryomediums es erfordert.
5.2.5. Fixierung von Fischembryonen
Eine Fixierung von Embryonen, bei der Proteine kovalent verknüpft werden, wird durchgeführt,
um die Morphologie des biologischen Materials zu erhalten.
Die Embryonen werden getötet, indem sie 5 bis 10 min auf Eis gestellt werden. Danach wird das
Medium abgesaugt und 4% Paraformaldehyd (PFA) zugegeben.
Bei Fischen mit einem Alter von bis zu drei Tagen wird die Inkubation mit 4% PFA entweder
bei RT für 6 h oder über Nacht bei 4°C, und bei älteren über Nacht bei RT durchgeführt
Danach werden die Embryonen 2 x 5 min mit PBST bei RT gewaschen, mit einer
Plastikpasteurpipette in 2 ml Eppis überführt, bzw. vorher noch dechorioniert und anschließend 2
x 5 min mit 2 ml 100% Methanol gewaschen. Die Fische können in Methanol bei -20°C für
mehrere Monate gelagert werden.
Alle Inkubationsschritte werden schüttelnd bei 80 rpm durchgeführt.
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5. Methoden
_____________________________________________________________________________
5.2.6. Dechorionieren von Embryonen
Um frühe embryonale Stadien für eine ISH einsetzen zu können, müssen zuvor die Eihüllen
(Chorion) von den Embryonen entfernt werden.
Dies wird nach der Fixierung (s. 5.2.5.) mit 4% PFA, nach dem zweiten Waschgang mit PBST
durchgeführt. Die Embryonen werden in eine Petrischale mit PBST überführt und unter dem
Mikroskop mit zwei feinen Pinzetten die Hüllen vorsichtig entfernt.
5.2.7. Testen von Mutanten auf Temperatursensitivität (TS)
Embryonen, die einer erhöhten Temperatur ausgesetzt werden sollen, werden bis Ende d1.0 bei
28,5°C in Embryomedium/MB gehalten. Danach erfolgt die Zugabe von PTC (s. 5.2.4.) und
anschließend werden die Embryonen bei erhöhter Temperatur (bis 33°C möglich) bis d5.0
gehalten und dann, wie unter 5.2.5. beschrieben, fixiert.
Soll damit ein Effekt untersucht werden, der vor d1.0 auftritt, müssen die Embryonen noch vor
der Zugabe von PTC der erhöhten Temperatur ausgesetzt und die Inkubationszeit vor der PTC-
Zugabe verkürzt werden, da die Pigmentierung bei höherer Temperatur früher einsetzt.
5.2.8 Hodenpräparation und Spermienisolierung
Ein Männchen wird in Tricainlösung betäubt und sein Kopf hinter den Kiemendeckeln mit einem
Skalpell abgetrennt. Mit einem spitzen Skalpell wird von vorne an der Bauchseite eingedrungen,
das Skalpell nach hinten bis zum After geschoben und der Fisch dadurch am Bauch entlang
geöffnet. Mit zwei Pinzetten werden unter dem Mikroskop die Innereien entfernt, wobei der
Hoden beidseitig als weißliche Stränge im Innern haften bleibt. Diese werden entnommen und
auf Eis in ein Eppi gegeben, das 500 µl Hankspuffer enthält. Es werden Hoden von ca. 15
Männchen für insgesamt 1 ml Spermien vereint.
Die Hoden werden mit einer 1 ml-Pipettenspitze vorsichtig umgerührt und resuspendiert und das
1,5 ml-Eppendorftube ca. 5 min auf Eis gestellt. Das Gewebe setzt sich ab und der trübe
Überstand mit den Spermien wird in ein neues Eppi überführt.
Auf das Gewebe wird 500 µl frischer Hanks-Puffer zugegeben, resuspendiert, damit sich die
restlichen Spermien lösen, auf Eis gestellt und der Überstand zum ersten Überstand zugegeben.
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5. Methoden
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5.2.9. Herstellung von UV-inaktivierten Spermien
Für die Inaktivierung von Spermien mit UV-Licht werden je 500 µl präparierte Spermien
(s. 5.2.8.) flächig auf einem Objektträger verteilt, die UV-Lampe auf genau 27 cm Entfernung
zum Objektträger zur Röhrenmitte eingestellt und die Spermien 1 min mit UV-Licht bestrahlt.
Mit einer neuen Spitze werden die Spermien wieder abgenommen, in ein frisches Eppi überführt
und solange auf Eis inkubiert, bis die Eier von Weibchen zur Verfügung stehen.
5.2.10. Gewinnung von Fischeiern durch “squeezen” von Weibchen
Über Nacht wird das Weibchen mit einem durch ein Sieb getrenntes Männchen inkubiert. Bei
Lichtbeginn wird das Weibchen zur Betäubung in Tricainlösung gegeben, auf beiden Seiten kurz
mit Zellstoff abgetrocknet, in eine trockene Petrischale gelegt, die Eier werden ausgestreift und
das Weibchen wird zum Aufwachen zurück in Fischwasser gelegt.
Die Befruchtung der Eier (s. 5.2.11.) soll innerhalb von 5 min stattfinden, damit sie nicht
austrocknen.
5.2.11. Generierung von haploiden Zygoten
Zu den Eiern der gesqueezten Weibchen wird in einer Petrischale 30 µl der UV-bestrahlten
Spermien (s. 5.2.9.) zugegeben, ca. 30 s gewartet und durch Zupipettieren von 1 ml
Embryomedium die Befruchtung aktiviert. Für die Erzeugung von gynogenetisch diploiden
Embryonen werden diese Zygoten unmittelbar für die French Press benutzt (s. 5.2.12.).
Sind die haploiden Embryonen für Untersuchungen in späteren Stadien bestimmt, werden sie wie
unter 5.2.3. beschrieben weiterbehandelt.
5.2.12. Gynogenese und French Press-Anwendung
Es werden haploide Zygoten nach Vorschrift (s. 5.2.11.) hergestellt und ab Zugabe von 1 ml
Embryomedium, was der Zeit der Befruchtung entspricht, die Zeit gestoppt.
Die Petrischale wird bis zur Hälfte mit Embryomedium/MB gefüllt, die Zygoten werden mit
einer Plastikpasteurpipette entnommen und in 2 ml-Eppendorftubes mit Löchern im Deckel
überführt. Diese werden in einen mit Embryomedium/MB gefüllten Kolben gegeben, in die
Frenchpress eingebaut und einem Druck von 513 P.s.i. (3,5 bar) ausgesetzt. Der Zeitraum
zwischen Beginn der Befruchtung und Beginn der Druckeinwirkung sollte nicht länger als 90 s
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5. Methoden
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sein, damit die Gynogenese noch erfolgreich stattfinden kann. Die Zygoten werden dem Druck
für bis genau 6 min nach der Befruchtung ausgesetzt.
Die zweite meiotische Teilung wird dadurch inhibiert und es entsteht aus einer haploiden Zygote
ein diploider Embryo.
Die Eppis werden aus dem Kolben entnommen, bei 28,5°C für ca. 3 - 4 Stunden inkubiert, die
Embryonen in eine Petrischale mit Embryomedium/MB überführt, die unbefruchteten Eier
aussortiert und die Embryonen zum Verhindern der Pigmentierung nach 5.2.4. weiterbehandelt.
Zur Kontrolle werden bei einigen Gelegen ein Teil der Eier nicht dem Druck der French Press
ausgesetzt, sondern die mit UV-behandelten Spermien befruchteten Eier bei 28,5°C inkubiert.
Hat die Zerstörung der Spermien-DNA und somit die Gynogenese der restlichen Eier, die dem
Druck ausgesetzt wurden, funktioniert, dann dürfen aus der Kontrolle nur haploide Embryonen
entstehen.
5.3. Methoden der Histologie
5.3.1. Einbettung von in situ gefärbten Fischen in Paraffin
Um eine genauere Analyse einer whole mount ISH-Färbung zu erhalten kann es notwendig sein,
den Fisch einzubetten und das gefärbte Gewebe zu schneiden.
Für Färbungen außerhalb des Dottersacks:
Die Embryonen in BB:BA werden 2 x 30 min in 2 ml Methanol und 30 min in 2 ml Isopropanol
je bei RT gewaschen. Die weiteren Schritte erfolgen bei 60°C. Zuerst erfolgt eine Inkubation für
1 h in 2 ml Isopropanol:Paraffin 1:1. Danach wird der Deckel geöffnet und über Nacht bei 60°C
inkubiert, so dass das Isopropanol verdampft. Am nächsten Morgen wird das Paraffin durch
neues ausgetauscht und am Abend werden die Embryonen in eine Einbettform mit frischem
Paraffin eingebettet.
Für Färbungen im Dottersack:
Die Einbettung muss so erfolgen, dass der Dottersack stabilisiert und beim Schneiden nicht
zerstört wird. Folgende Schritte werden bei RT mit 2 ml Lösung durchgeführt:
Die Embryonen in BB:BA in 2 ml Eppis werden 2 x 30 min mit Methanol, 2 x 15 min mit 70%
Ethanol, 30 min mit 80% Ethanol, 30 min mit 80% Ethanol:Butanol 3:1, 30 min mit 90%
Ethanol:Butanol 1:1 und 30 min mit 100% Ethanol:Butanol 1:3 gewaschen. Zu den Embryonen
wird 100% Butanol gegeben und für 1 h oder über Nacht bei 4°C inkubiert.
Die folgenden Schritte werden bei 60°C mit je 2 ml Volumen durchgeführt: Die Fische werden
für 20 min in Butanol:Paraffin 1:1 inkubiert, das Gemisch wird durch frisches Paraffin ersetzt,
über Nacht inkubiert, für 15 min in frischem Paraffin inkubiert und anschließend mit Paraffin in
eine Einbettform eingebettet. Diese Fische werden bis zum Schneiden bei 4°C aufbewahrt.
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5. Methoden
_____________________________________________________________________________
5.3.2. Einbettung von Fischembryonen in Paraffin
Alle Arbeitsschritte bei 4°C und RT werden auf dem Schüttler bei 80 rpm durchgeführt, die
Schritte bei 60°C im Ofen ohne Schüttler. Sollen die Schnitte für eine ISH verwendet werden,
müssen die Lösungen RNAse-frei sein. Diese Vorschrift wurde bei Embryonen bis zu einem
Alter von 4 Wochen angewendet.
Die Fischembryonen werden in Gläschen überführt, 2 x 5 min mit 5 ml PBST gewaschen, 5 min
auf Eis gestellt, das PBST abgenommen, 5 ml 4% PFA zugegeben und über Nacht bei 4°C
fixiert.
Am nächsten Tag werden die Embryonen zuerst für 1 h in 5 ml PBST bei 4°C, dann für 1 h mit
5 ml 0,86% NaCl bei 4°C, für 5 h mit 50% Ethanol bei 4°C und über Nacht mit 5 ml 70%
Ethanol bei 4°C gewaschen. In diesem Stadium können die Embryonen auch mehrere Tage bei
4°C aufbewahrt werden.
Danach werden die Embryonen 3 h bei RT in 90% Ethanol, 3,5 h bei RT in 96% Ethanol und
anschließend über Nacht bei 4°C in 96% Ethanol inkubiert. Am nächsten Tag werden die
Embryonen in 2 ml Eppis umgefüllt und in 2 ml Isopropanol für 4 h bei RT inkubiert.
Die folgenden Schritte werden bei 60°C durchgeführt:
Es wird vorgewärmtes Isopropanol:Paraffin 1:1 zugegeben, 4,5 h inkubiert, dann der Deckel
geöffnet und über Nacht inkubiert, so dass das Isopropanol verdampft. Abends wird das Paraffin
durch frisches ersetzt und über Nacht mit offenem Deckel bei inkubiert. Am nächsten Tag
können die Fische auf einer 100°C warme Heizplatte in eine Einbettform eingebettet werden.
Die eingebetteten Fische werden bis zum Schneiden bei 4°C aufbewahrt.
5.3.3. Herstellung von Paraffinschnitten
Der Paraffinblock mit den eingebetteten Embryonen (s. 5.3.1., 5.3.2.) wird mit einer
Rasierklinge getrimmt und in das Mikrotom eingespannt. Es werden 5 µm dicke Schnitte
hergestellt, die mit einer Pinzette auf die Oberfläche des 40°C warmen, destillierten Wassers im
Paraffinstrecktisch gelegt werden. Nach ca. 2 min werden die Schnitte auf einen Objektträger
übertragen und zusammen auf der 40°C Wärmeplatte des Strecktisches getrocknet.
Soll an den Schnitten eine Färbung durchgeführt werden, so werden diese bei 4°C aufbewahrt.
5.3.4. Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung
Um Gewebestrukturen an Schnitten genauer zu erkennen, kann eine HE-Färbung durchgeführt
werden. Dabei werden Zellkerne blau und das Cytosol orange gefärbt.
Es werden je Wanne 250 ml Lösung benötigt und bei RT inkubiert. Bei Inkubationsschritten
ohne Zeitangabe wird zügig, mit 5 - 6 maligem Auf- und Abbewegen des Schlittens in der
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5. Methoden
_____________________________________________________________________________
Wanne vorgegangen. Färbelösungen können wiederverwendet werden, wenn sie lichtgeschützt
aufbewahrt werden.
Je 10 Paraffinschnitte (s. 5.3.3.) werden in einem Schlitten 2 x 5 min in frischem Roticlear
(Xylolersatz) zum Entparaffinieren inkubiert. Danach erfolgt eine 5-minütige Inkubation mit
Isopropanol und anschließend eine absteigende Ethanolreihe mit je 2-minütiger Inkubationszeit
wie folgt: 2 x 100%, 1 x 80%, 1 x 60%, 1 x 30%. Danach werden die Schnitte für mindestens 2
min in H2Oreinst inkubiert. Durch diesen Schritt werden basische Proteine entfernt.
Der Schlitten wird entnommen, gut auf Zellstoff abgetrocknet, für ca. 2- 5 min in Hämatoxylin-
Färbelösung inkubiert, entnommen, ca. 3 x 15 s in Leitungswasser (enthält benötige Ionen)
gewaschen und sofort die Färbung unter dem Mikroskop kontrolliert.
Bei guter Färbung wird der Schlitten für 2 - 5 min in der Eosin-Färbelösung inkubiert,
entnommen, ca. 3 x 15 s in Leitungswasser gewaschen und ebenfalls sofort die Färbung unter
dem Mikroskop kontrolliert.
Bei der weiteren Behandlung muss damit gerechnet werden, dass die Eosinfärbung im Gegensatz
zur Hematoxilinfärbung noch etwas schwächer wird.
Die Schnitte werden nun zügig in einer aufsteigenden Ethanolreihe inkubiert, wobei die
Lösungen von der absteigenden Reihe benutzt werden können. 1 x 30%, 1 x 60%, 1 x 80%, 1 x
100%, 1 x Isopropanol, 1 x frisches Roticlear. Der Schlitten wird auf Zellstoff gestellt, die
Objektträger entnommen, 5 Tropfen Histokitt mit einer Plastikpipette auf die Objektträger
getropft, mit einem Deckgläschen luftblasenfrei abgedeckt und über Nacht und für längere Zeit
bei RT gelagert.
5.3.5. Fuchsin-Färbung
Werden Schnitte nach einer ISH mit gefärbtem Gewebe hergestellt, sollte die anschließende
Färbung die ISH-Signale nicht überdecken. Aus diesem Grund wird in diesem Fall die Färbung
mit dem etwas schwächeren basischen Fuchsin durchgeführt.
Die Durchführung erfolgt wie die HE-Färbung (s. 5.3.4.) ohne Eosinfärbung, mit einer
Inkubation in der Fuchsinfärbelösung für 2 min.
5.3.6. Alcianblau-Knorpelanfärbung am ganzen Embryo
Diese Methode wird angewendet, um Knorpelstrukturen im Embryo sichtbar zu machen.
Es werden Embryonen unter PTC-Behandlung (s. 5.2.4.) großgezogen (in dieser Arbeit bis d5.0),
5 min auf Eis gestellt, in die kombinierte Fixier- und Färbelösung überführt und anschließend für
ca. 6 h bei RT inkubiert. Bei eventueller Überfärbung kann mit 3% Essigsäure in 70% Ethanol
die überflüssige Farbe ausgewaschen werden.
Für die folgende Dehydrierung werden die Embryonen 10 min in 70% Ethanol bei RT, 10 min in
95% Ethanol bei RT und über Nacht bei 4°C in 100% Ethanol inkubiert.
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5. Methoden
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Am nächsten Tag werden die Embryonen rehydriert, indem sie 1 min in 80% Ethanol bei RT,
1 min in 50% Ethanol bei RT, 1 min in 30% Ethanol bei RT und 1 min in Wasser bei RT
inkubiert werden.
Anschließend werden sie für 20 min in 25% Glycerin/H2Odest. bei RT, für 20 min in 50%
Glycerin/H2Odest. bei RT inkubiert und in 80% Glycerin/H2Odest. überführt, wo die Embryonen
bei 4°C längere Zeit aufbewahrt werden können.
5.4. Fischhaltung
Die Haltung der 5 Tage alten Fischen bis hin zum adulten Stadium erfolgte in einem Überlaufund
einem Tank-Aquariensystem, wie in Mullins et al. (1994) beschrieben.
5.5. Sonstiges
Sofern nicht anders angegeben entspricht ein Zentrifugationsschritt bei max 15000 rpm in der
Tischzentrifuge.
Zu DEPC-behandelten Lösungen wird /DEPC angefügt, RT entspricht 23 - 24°C, H2Oreinst
entspricht frisch entnommenem Wasser aus der membra pure-Anlage und H2Odest. entspricht
zweifach destilliertem VE-Wasser.
Die Pipettierschritte in 96er Well Platten der PCR für die Grobkartierung wurde mit dem
Biomek 2000 durchgeführt.
60

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
6. Ergebnisse
6.1. Thymusscreen
Nach der Mutagenisierung der F0-Männchen des AB-Stammes mit ENU (s. 5.2.1.) besitzt jedes
Männchen Punktmutationen in den Spermatogonien, die so an die Nachkommen weitergegeben
werden können.
Die mutagenisierten Männchen wurden mit Wildtyp (WT)-AB-Weibchen ausgekreuzt, so dass
einzelne Mutationen auf verschiedene Individuen verteilt werden und somit in der entstehenden
F1-Generation bei genügend starker Mutagenisierung jeder Nachkomme eine Mutation in allen
Zellen trägt. Handelt es sich um eine rezessive Mutation, so kommt ein Phänotyp in den
heterozygoten F1-Tieren noch nicht zum Vorschein.
Um homozygote Tiere und somit den Phänotyp der rezessiven Mutanten zu erhalten, kann
entweder der klassische 2-Generationen-Screen (s. 2.3.) oder der verkürzte Gynogenese-Screen
(s. 2.3.) angewendet werden. Da die Durchführung der Gynogenese den Screen um eine
Generationsdauer verkürzt und dadurch weniger Fische gehalten werden müssen, wurde dieser in
der vorliegenden Arbeit angewendet, um Thymusmutanten zu isolieren.
Für den eigentlichen Screen wurden nur die Weibchen der F1-Generation (s. Zusammenfassung
in Abb. 6.3.) benutzt. Von ihnen wurden die Eier entnommen (s. 5.2.10.), mit UV-inaktivierten
Spermien befruchtet (s. 5.2.11.) und anschließend durch die Early Pressure-Methode
gynogenetisch diploide Embryonen erzeugt (s. 5.2.12.). Diese wurden bei Normaltemperatur von
28,5°C bis zum Tag d5.0 unter dem Einfluss von PTC großgezogen (s. 5.2.4.) und anschließend
fixiert (s. 5.2.5.). Die PTC-Behandlung verhindert die Pigmentierung der Embryonen, so dass
eine spätere Analyse nicht durch Pigmente erschwert wird.
Beim Fixieren der F2g-Embryonen (s. Abb. 6.3.) wurden nur normal entwickelte Embryonen
benutzt, bei denen die Kiemen- und Kieferbögen vollständig und korrekt entwickelt sind.
Degenerierte, missgebildete oder haploide Embryonen wurden verworfen. Damit wurde
vermieden, dass ein Fehlen des Thymus Folge einer generellen Deformierung oder
Fehlentwicklung des Kopfbereiches ist.
Da der Thymus im nativen, fixierten Fisch nicht sichtbar ist, muss er mit einer geeigneten
Methode erkennbar gemacht werden. Dies wurde durch Hybridisierung an Gesamtembryonen,
durch sog. whole mount in situ Hybridisierung (ISH) (s. 5.1.20.) mit einer rag1 (recombination
activating gene1)-Antisense (AS)-Sonde an d5.0 alten Fischen erreicht.
Rag1 wird in T-Zellen exprimiert, wenn die Umlagerung der Gene für die T-Zellrezeptoren
stattfindet. Da sich T-Zellen in diesem Entwicklungsstadium im Thymus befinden, wird dieser
durch die enzymatische Farbreaktion blau gefärbt. Somit kann die Lage des Thymus durch die
Anfärbung der T-Zellen ermittelt werden. Der Thymus erscheint im Zebrafisch als bilaterales
Organ auf Höhe des 3. Kiemenbogens unterhalb der Ohrkapsel. Dies konnte erstmals von Willett
61

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
et al. (1997) am Zebrafisch gezeigt werden, wobei die Lage der rag1-gefärbten Thymi im
Zebrafisch mit der von anderen Teleostiern überein stimmt (Willett et al. 1997).
In Abb. 6.1. und Abb. 6.2. ist die Färbung einer rag1-ISH an 5 Tage alten WT-Embryonen
dargestellt.
Abb. 6.1. Abb. 6.2.
Thymusfärbung eines 5 Tage alten Embryos nach Färbung eines 5 Tage alten Embryos nach rag1-ISH.
rag1-ISH. Laterale Ansicht auf eine Thymusdrüse (Pfeil), Ventrale Ansicht der bilateralen Thymi, die je mit
wobei darüber im Hintergrund die andere durch den einem Pfeil markiert sind.
Embryo hindurch zu erkennen ist.
Die gynogenetisch diploiden Gelege (F2g) der einzelnen Weibchen wurden nach diesem
Vorgehen nach Kriterien der Größe und Form der Färbung der Thymi untersucht. Erscheint in
einem Gelege bei bis zu 50% der Nachkommen eine, im Vergleich zum WT, andersartige
Thymusfärbung, so trägt das zuhörige F1-Weibchen eine Mutation, die zu diesem
Erscheinungsbild führt.
Der Prozentsatz an Thymusmutanten in Fischen eines Geleges kann bis zu maximal 50%
betragen. 50% treten dann auf, wenn während der Meiose kein Crossing-over stattgefunden hat,
was zu Heterozygotie führt. Bei erfolgter Rekombination hängt der Prozentsatz von der
Entfernung des Zentromers ab. Je weiter die Mutation vom Zentromer weg liegt, desto größer ist
die Wahrscheinlichkeit eines Crossing-overs und desto geringer ist der Prozentsatz an
Thymusmutanten in Fischen eines Geleges.
Das Ziel vorliegender Arbeit war, neue Gene zu identifizieren, die für die Thymusentwicklung
zuständig sind. Es wurden deshalb Mutanten gesucht, bei denen die rag1-Färbung komplett fehlt
oder schwächer ausgeprägt ist.
Im Zuge dieser Arbeit wurden 1413 F1-Weibchen dem Screen unterzogen. Bei 281 Fischen
konnten auswertbare Gelege generiert werden. “Auswertbare Gelege” bedeutet, dass genügend
Embryonen der F2g-Gelege bis d5.0 großgezogen und fixiert werden konnten und die Färbung
nach der rag1-ISH ausgewertet werden konnte (s. Abb. 6.1.). Die im Vergleich zur Zahl der
behandelten Fische geringe Anzahl der auswertbaren Gelege hängt von mehreren Faktoren ab,
auf die in 7.1. näher eingegangen wird.
62

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
Konnte im F2g-Gelege ein Thymusmutantenphänotyp ermittelt werden, wurde das zugehörige
F1-Weibchen gegen ein WT-AB-Männchen zur F2-Generation ausgekreuzt, um so die
Mutantenlinie zu erhalten.
6.1.1. Rescreen
F1-Weibchen, die nach dem Screendurchgang Thymusmutanten unter ihren Nachkommen
besaßen, wurden nach dem Auskreuzen mit einem WT-AB-Männchen einem Rescreen
unterzogen. Dabei wurden dem F1-Weibchen nochmals Eier entnommen, davon gynogenetisch
diploide Embryonen erzeugt, die Embryonen unter PTC-Behandlung bei 28,5°C bis d5.0
großgezogen, fixiert und eine rag1-ISH durchgeführt. So konnte das erste Ergebnis der ISH von
6.1. überprüft und bestätigt werden.
In dieser Arbeit wurden von den 281 erfolgreich untersuchten Fischen 25 Fische isoliert, bei
denen bei bis zu 50% der Embryonen eine veränderte Anfärbung des Thymus vorhanden war.
Diese 25 F1-Weibchen wurden im Rescreen eingesetzt, wobei bei 3 Fischen, den Mutanten
briesle, minibries und briessche, die Beobachtung eines Mutantenphänotyps bestätigt werden
konnte. Das Gelege der briesle-Mutante beinhaltete 46% Mutanten, das Gelege von minibries
38% und das Gelege von briessche 43% Mutantenembryonen.
Bei den restlichen 22 Fischen konnten die Mutanten nicht bestätigt werden und die schon
erfolgten Auskreuzungen mit dem WT-AB-Männchen wurden verworfen.
6.1.2. Verifizierung
Konnte bei einem Rescreen (s. 6.1.1.) die Beobachtung der ersten rag1-ISH (s. 6.1.) bestätigt
werden, so wurde eine Verifizierung der Mutation durchgeführt, bei der gleichzeitig
heterozygote Trägerfische identifiziert werden konnten.
Dazu wurden die Geschwister der zugehörigen F2-Generation zufällig untereinander gekreuzt.
Die Embryonen wurden bis d5.0 unter PTC-Behandlung großgezogen, eine ISH mit der rag1-
AS-Sonde durchgeführt und die Färbung analysiert. Das Ziel war es, Gelege zu identifizieren, in
denen ein gewisser Prozentsatz der Embryonen den Mutantenphänotyp aufweist. Bei einer
rezessiven Mutation wäre dies ein Anteil von 25% und bei einer dominanten Mutation ein Anteil
von 75%. Die Wahrscheinlichkeit, dass zwei heterozygote Merkmalsträger der F2-Generation
miteinander gekreuzt werden, beträgt 25%.
Bei allen drei Fischen, die den Rescreen positiv durchlaufen hatten, konnte bei der Verifizierung
der Mutantenphänotyp wieder generiert werden. Bei der Kreuzung von je zwei heterozygoten
Tieren entstanden je ca. 25% Mutanten. Die Prozentzahl der Mutantenphänotypen bei der
Verifizierung zeigt, dass es sich bei allen drei Mutanten je um eine rezessive Mutation handeln
muss.
63

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
F0 ➤ W ➤ M
F1 ➤ W n=1413
64
ENU-
Mutagenisierung
Eigewinnung und Gynogenese, EP
F2g diploide Embryonen, d5.0
ISH mit rag1
bis zu 50 % Mutantenphänotyp ?
Rescreen n=25
Nein n=256 (~91%) Ja n=25 (~9%)
F1 ➤ W X WT ➤ M
F2 ➤ +/- ➤+/+ ➤+/+ ➤ +/- 50 % heterozygot
Rescreen positiv n=3 Verifizierung n=3
25 % Phänotyp,
positiv n=3
Charakterisierung der Mutanten n=3
Abb. 6.3.
Zusammenfassendes Schema des Screenvorganges von der Mutagenisierung der F0-Männchen bis zur Verifizierung
der Mutanten. Die Anzahl der Fische in den verschiedenen Stadien des Screens sind rot dargestellt.
W: Weibchen, M: Männchen, +/-: heterozygot, +/+: WT, n: Anzahl

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
Bei positiver Verifizierung wurde das zugehörige heterozygote Pärchen der F2-Generation
nochmals wie schon zuvor getestet, um das Ergebnis zu bestätigen. War eine solche Bestätigung
erfolgt, wurden insgesamt 2 Träger mit verschiedenen Wik-Fischen für die anschließende
Kartierung gekreuzt. Von jedem Kreuzungspärchen wurden ca. 150 Fische großgezogen und die
Elternfische danach für spätere DNA-Präparation bei -80 °C weggefroren (s. 5.1.21.5.).
6.2. Isolierte Thymusmutanten
Nach der Durchführung des kompletten Screendurchganges (s. Abb. 6.3.) konnten drei
Thymusmutanten isoliert werden: briesle, minibries und briessche.
Die ISH-Färbung mit der rag1-AS-Sonde ergab bei allen drei Mutanten einen Phänotyp, der im
Vergleich zum WT-Fisch einen kleineren gefärbten Bereich im Thymus aufweist. Dies wird in
den Abb. 6.4. bis Abb. 6.9. demonstriert, in denen jeweils ein WT-Embryo und die zugehörige
Mutante abgebildet ist.
Abb. 6.4. Abb. 6.5.
Briesle, WT, laterale Ansicht. Briesle, Mutante, laterale Ansicht.
Rag1-ISH eines d5.0-Embryos. Die Pfeilspitze zeigt auf Rag1-ISH eines d5.0-Emryos. Die Pfeilspitze zeigt auf
den Thymus, der gut als starke Färbung zu erkennen ist. den Thymus, der im Vergleich zu Abb. 6.4. eine
geringere Färbung aufweist. .
65

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
Abb. 6.6. Abb. 6.7.
Minibries, WT, laterale Ansicht. Minibries, Mutante, laterale Ansicht.
Rag1-ISH eines d5.0-Embryos. Der Thymus ist als Rag1-ISH eines d5.0-Embryos. Der Thymus zeigt nur
stark gefärbtes Organ gut zu erkennen. noch einen Teil der Färbung im Vergleich zum WT
in Abb. 6.6..
Abb. 6.8. Abb. 6.9.
Briessche, WT, laterale Ansicht. Briessche, Mutante, laterale Ansicht.
Rag1-ISH eines d5.0 Embryos. Die Pfeilspitze zeigt auf Rag1-ISH eines d5.0 Embryos. Der kleinere gefärbte
den stark gefärbten Thymus. Thymus ist deutlich zu erkennen.
Jede der drei Mutanten zeigt im Mutantenphänotyp noch einen Rest an rag1-Färbung.
Aus dieser Beobachtung kann zu diesem Zeitpunkt nur geschlossen werden, dass sich im Bereich
des Thymusgewebes im jeweiligen Mutantenfisch weniger T-Zellen befinden, die rag1
exprimieren als im Vergleich zum WT-Fisch. Ob diese veränderte Färbung auftritt, weil durch
die Mutation die T-Zell-, die Thymusentwicklung oder die Entwicklung der Zellen der
Neuralleiste betroffen ist, kann nicht beurteilt werden. Darauf wird noch näher in Abschnitt 6.6.
eingegangen.
Die Färbungen im Bauchbereich, wo die Schwimmblase und der Magenbereich angefärbt sind,
sowie die Färbungen im Kiemenbereich, wo sich Teile der Chorions von geschlüpften
Embryonen verfangen haben, sind unspezifische Färbungen. Es wird jeweils Sonde darin
66

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
zurückgehalten, die nicht mehr vollständig ausgewaschen werden kann. Es entsteht somit im
späteren Verlauf der ISH eine Färbung in diesen Bereichen.
6.3. Test der Mutanten auf Temperatursensitivität
Beim Test der Temperatursensititvität einer Mutante wird die Stabilität des veränderten Proteins,
das durch die Mutation im entsprechenden Gen entstanden ist, bei erhöhter Temperatur
überprüft.
Ziel dieses Tests war hier, zu überprüfen, ob der bei Normaltemperatur hypomorphe Phänotyp zu
einem noch stärkeren hypomorphen oder sogar zu einem Null-Phänotyp führen kann.
Ein schwächerer Phänotyp ist oftmals auf eine Punktmutation zurückzuführen, welche eine
Missense-Mutation produziert. Deshalb kann ein schwächerer Phänotyp ein guter Indikator für
eine Punktmutation sein, wie in Mullins et al. (1994) erwähnt wird.
Diese Methode gilt auch als weiterer Nachweis dafür, dass es sich bei einer identifizierten
hypomorphen Mutante um eine tatsächliche Mutation handelt und eine schwächere Färbung
nicht durch einen Fehler in der Methodik entstanden ist. Dies bedeutet jedoch nicht, dass
Mutanten, die nicht temperatursensitiv sind, keine “echten” Mutanten sind.
Von jeder Mutante wurden zwei heterozygote Tiere gekreuzt und die Embryonen, wie unter
5.2.7. beschrieben, ab Ende d1.0 bei erhöhter Temperatur von 31,5°C anstatt 28,5°C
Normaltemperatur inkubiert. Am Tag d5.0 wurden sie fixiert und die Färbung der Thymusdrüsen
nach einer ISH mit rag1 analysiert.
Die Auswertung erfolgte ebenfalls über die Anzahl der Mutantenphänotypen in einem Gelege, da
die Mutanten keinen zusätzlichen Phänotyp zeigen, an dem sie hätten erkannt werden können.
Tritt ein Phänotyp wieder zu 25% auf und kann dieses Ergebnis mehrmals wiederholt werden, so
kann angenommen werden, dass der Phänotyp nicht auf ein Artefakt in der ISH zurückzuführen
ist.
Das Ergebnis dieser Analyse zeigt, dass von den drei getesteten Mutanten nur briesle
temperatursensitiv reagiert. Die Färbung der Thymusdrüsen verschwindet bei einem Viertel des
Geleges im Vergleich zur Normaltemperatur vollständig. Dieses Ergebnis konnte mehrmals
durch Wiederholungen der Methode verifiziert werden und ist in Abb. 6.10. und Abb. 6.11.
dargestellt.
Minibries und briessche zeigen bei 31,5°C denselben Mutantenphänotyp wie bei 28,5°C (s. 6.2.)
und sind demnach nicht temperatursensitiv. Auch diese Ergebnisse konnten durch
Wiederholungen verifiziert werden.
67

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
Abb. 6.10. Abb. 6.11.
Briesle, WT, 31,5°C, laterale Ansicht. Briesle, Mutante, 31,5°C, laterale Ansicht.
Die Thymusfärbung mit einer rag1-Sonde ergibt eine gut Es ist keine Thymusfärbung mehr zu erkennen.
erkennbare Färbung, die durch die Pfeilspitze angezeigt Die Pfeilspitze zeigt auf die Position, an der der
wird. Thymus lokalisiert ist. Das kleine Pünkten rechts vom
Pfeil sind Pigmente und nicht zu beachten.
68

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
6.4. Genauere Analyse der Thymi in WT- und Mutantenembryonen
Um zu ermitteln, ob der gefärbte Bereich, nach dessen Betrachtung die Mutanten isoliert
wurden, auch tatsächlich dem Thymusgewebe entspricht, und ob eine Veränderung des
Thymus auch an ungefärbten Embryonen morphologisch nachgewiesen werden kann, wird in
diesem Abschnitt näher auf diese Fragestellungen eingegangen.
In Abb. 6.12. und Abb. 6.13. ist die Lage des Thymus in einem 5 Tage alten Embryo genauer
demonstriert. Die Thymi befinden sich je auf Höhe des 3. Kiemenbogens (5 th Visceral arch =
5. Kieferbogen) unterhalb der Ohrkapsel. In Abb. 6.13. sind die Thymi mit einer Pfeilspitze und
der 3. Kiemenbogen mit einem gestrichelten Pfeil markiert (s. Willett et al. 1997).
Abb. 6.12. Abb. 6.13.
Transversale Schnittebenen in einem 5 Tage alten Querschnitt durch die Schnittebene 7 von Abb. 6.12., in der
Embryo (nach http://zfin.org, developmental sich auch die Thymusdrüsen befinden. Sie befinden sich je
atlas, 120h), laterale Ansicht. auf Höhe des 3. Kiemenbogens (durch gestrichelten Pfeil
markiert) und unterhalb der Ohrkapsel und sind hier durch
eine Pfeilspitze angezeigt.
6.4.1. Kontrolle der rag1-Färbung
Am Beispiel der briesle-Mutante wurde der Aspekt untersucht, ob die rag1-Färbung, die in dem
Screen zur Auffindung von Mutanten diente, auch tatsächlich in den T-Zellen im Thymus zu
finden ist.
Dazu wurden zwei heterozygote Träger gekreuzt, die Embryonen bei 31,5°C und PTC-
Behandlung großgezogen und einer rag1-ISH unterzogen. Die isolierten Mutanten- und WT-
69

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
Fische wurden je in Paraffin eingebettet (s. 5.3.1.), 5 µm dicke, transversale Schnitte angefertigt
(s. 5.3.3.), diese mit Fuchsin gefärbt (s. 5.3.5.) und darauf die rag1-Färbung analysiert.
Abb. 6.14. zeigt den Querschnitt, der der Schnittebene 7 in Abb. 6.12. entspricht, nach der
Färbung des Thymus mit einer rag1-AS-Sonde eines WT-Fisches. Es ist deutlich der gefärbte
Thymusbereich als rundes Organ mit vielen angefärbten T-Zellen auf Höhe des
3. Kiemenbogens unterhalb der Ohrkapsel zu erkennen. In Abb. 6.15. ist der zugehörige
Mutantenfisch dargestellt, bei dem der Thymus als flaches Organ erscheint und keine
Thymusfärbung zu erkennen ist.
Abb. 6.14. Abb. 6.15.
Briesle, WT, 31,5°C. Briesle, Mutante, 31,5°C.
5 µm-Paraffinschnitt eines d5.0-Embryos nach 5 µm-Paraffinschnitt eines d5.0-Embryos nach
rag1-ISH, Fuchsinfärbung. Es ist eine deutliche Färbung rag1-ISH, Fuchsinfärbung. Es ist keine Färbung von
der T-Zellen im Thymus zu erkennen. T-Zellen im Thymusbereich vorhanden.
Abb. 6.14. zeigt am Beispiel von briesle bei 31,5°C deutlich, dass es sich bei dem rag1gefärbten
Gewebe der isolierten Mutanten um den Thymus handelt. Die Mutante in
Abb. 6.15. weist keine Färbung im Thymus mehr auf. Die rag1-Färbung im Thymus erscheint
im Zentrum, was der allgemeinen Beobachtung von rag1-ISH in WT-Fischen entspricht.
6.4.2. Gewebeanalyse von ungefärbten WT- und Mutantenembryonen
In einer weiteren Studie wurde untersucht, ob auch ohne einer vorausgegangener ISH eine
veränderte Struktur des Thymus in Embryonen zu erkennen ist, die gleich nach dem Fixieren
geschnitten werden. Dadurch kann das Gewebe der Thymi untersucht werden, da die
Gewebestrukturen noch weitestgehend erhalten und einzelne Zellen sichtbar sind.
Die Embryonen eines Geleges zweier heterozygoter Träger wurden am Tag 5.0 in Paraffin
eingebettet (s. 5.3.2.), 5 µm dicke Schnitte am Mikrotom erstellt (s. 5.3.3.) und eine HE-Färbung
70

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
durchgeführt (s. 5.3.4.). Da die Mutanten ohne ISH-Färbung nicht zu erkennen sind, müssen die
Thymi einiger Embryonen eines Geleges ausgewertet und miteinander verglichen werden, ob bei
etwa 25% der Embryonen eine veränderte Struktur oder Größe des Thymus auftritt.
Für die Auswertung wurden jeweils die Schnitte der Thymi in Betracht gezogen, bei denen die
dickste Schicht an Thymusgewebe zu erkennen war.
Es wurde erwartet, dass 25 % der untersuchten Fische einen veränderten Thymus aufweisen.
Um die genaue Zellstruktur im Thymus der beschriebenen WT- und Mutantenembryonen klären
zu können, sind weitere Analysen, wie zum Beispiel die Betrachtung von Thymusschnitten im
Elektronenmikroskop nötig.
6.4.2.1. Briesle
Es wurden von einem Gelege zweier heterozygoter Fische 16 Fische geschnitten und die Schnitte
HE-gefärbt. Bei der Analyse der Schnitte konnte bei 5 Fischen ein kleinerer Thymus gefunden
werden, was etwa einem Viertel des Geleges entspricht.
Bei den dunkel angefärbten Zellen im Thymus in Abb. 6.16. handelt es sich sehr wahrscheinlich
um T-Zellen, die durch ihren großen Zellkern diese kräftige Färbung erhalten. Deshalb ist
anzunehmen, dass die Anhäufung der Zellen im Thymus in Abb. 6.16. aus T-Zellen besteht. Im
Vergleich dazu kann man in Abb. 6.17. im Mutantenthymus nur noch ein paar wenige Zellen
erkennen. Diese geringe Anzahl an T-Zellen führt zu dem schwächeren rag1-ISH-Signal im
Mutantenembryo.
Abb. 6.16. Abb. 6.17.
Briesle, WT. Briesle, Mutante.
5 µm-Paraffinschnitt eines d5.0-Embryos, HE-gefärbt. 5 µm-Paraffinschnitt eines d5.0-Embryos, HE-gefärbt.
Die Pfeilspitze zeigt auf den Thymus mit den dunkel Der Thymus weist nur noch wenige T-Zellen auf.
angefärbten T-Zellen.
71

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
Dieselben Analysen wurden bei briesle auch mit Embryonen durchgeführt, die bei 31,5°C
großgezogen wurden, um den temperatursensitiven Phänotyp genauer zu analysieren.
Abb. 6.18. und Abb. 6.19. zeigen dazu Schnitte von Embryonen, die nach einer Kreuzung zweier
heterozygoter Tiere bei einer Aufzuchttemperatur von 31,5°C direkt am Tag 5.0 eingebettet
wurden. Von 13 eingebetteten Embryonen zeigten 3 Fische einen Thymus, der nur noch
vereinzelte T-Zellen enthält. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass sich bei hoher
Aufzuchttemperatur weniger T-Zellen als bei Mutantenembryonen bei 28,5°C im Thymus
befinden und dass diese aber keine rag1-Expression aufweisen, wie in der ISH mit rag1 zu sehen
ist.
Abb. 6.18. Abb. 6.19.
Briesle, WT, 31,5°C. Briesle, Mutante, 31,5°C.
5 µm-Paraffinschnitt eines d5.0-Embryos, HE-Färbung. 5 µm-Paraffinschnitt eines d5.0-Embryos, HE-Färbung.
Es ist eine Anhäufung von T-Zellen im Thymus zu Im Thymus sind nur noch ganz vereinzelt T-Zellen
erkennen. vorhanden.
6.4.2.2. Minibries
Um die in 6.4. erwähnten Aspekte auch bei der Mutation von minibries zu erörtern, wurden
dieselben Analysen, wie unter 6.4.2. beschrieben, durchgeführt.
In Abb. 6.20. und Abb. 6.21. sind die Schnitte dargestellt, die aus den Embryonen eines Geleges
zweier heterozygoter Fische erhalten wurden. Von 16 geschnittenen Fischen wiesen 4 einen
veränderten Thymus auf. Dieses Ergebnis entsprach der Erwartung von 25%
Mutantenembryonen und bestätigte somit die Beobachtung der ISH.
In Abb. 6.20. sind die stark gefärbten T-Zellen zu erkennen, die sich im Thymus ansammeln,
wohingegen in Abb. 6.21. nur noch wenige T-Zellen zu erkennen sind.
72

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
Abb. 6.20. Abb. 6.21.
Minibries, WT. Minibries, Mutante.
5 µm-Paraffinschnitt eines d5.0-Embryos, HE-Färbung. 5 µm-Paraffinschnitt eines d5.0-Embryos, HE-Färbung.
Es sind viele T-Zellen im Thymus vorhanden, die durch Es sind weniger T-Zellen im Vgl. zu Abb. 6.20. zu
ein Pfeil markiert sind. erkennen.
6.4.2.3. Briessche
Auch die Embryonen eines Geleges von zwei heterozygoten briessche-Fischen wurden den in
6.4.2. beschriebenen Analysen unterzogen.
Die Ergebnisse der Schnitte von eingebetteten Embryonen eines Geleges nach der Kreuzung von
zwei heterozygoten Fischen werden in den Abb. 6.22. und Abb. 6.23. demonstriert. Es wurde bei
4 von 17 Fischen ein veränderter Thymusaufbau gefunden.
Abb. 6.22. Abb. 6.23.
Briessche, WT. Briessche, Mutante.
5 µm-Paraffinschnitt eines d5.0-Embryos, HE-Färbung. 5 µm-Paraffinschnitt eines d5.0-Embryos, HE-Färbung.
Im Thymus sind viele T-Zellen vorhanden, die als dunkel Es sind nur wenige T-Zellen, im Vgl. zu Abb. 6.22.
gefärbte Zellansammlung zu sehen sind (Pfeil). durch die Anfärbung zu erkennen.
73

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
Auch diese Analyse zeigt deutlich, dass die schwächere whole mount rag1-ISH-Färbung des
Mutantenfisches von einer geringeren T-Zellzahl herrührt.
6.5. Komplementationsanalyse
Um zu testen, ob die drei aus dem Screen erhaltenen Mutanten einer gleichen
Komplementationsgruppe angehören, wurde eine sog. Komplementationsanalyse durchgeführt.
Dabei wurde getestet, ob durch die Mutagenese bei den Mutanten dasselbe Gen betroffen ist. Da
die isolierten Mutanten dieser Arbeit sich vom Phänotyp nach der ISH mit rag1 sehr ähnlich
sind, ist diese Annahme durchaus möglich.
Es wurde je ein heterozygoter Trägerfisch einer Mutante mit je einem heterozygoten Träger der
anderen beiden Mutanten gekreuzt, die Gelege unter PTC-Behandlung großgezogen, die
Nachkommen nach 5 Tagen fixiert und eine ISH mit einer rag1-AS-Sonde durchgeführt. Ist bei
zwei Mutanten dasselbe Gen betroffen, ist es sehr wahrscheinlich, dass bei einer solchen
Kreuzung ein Mutantenphänotyp sichtbar wird.
Bei allen Kreuzungen ergaben sich nur WT-Muster der rag1-ISH.
Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass es sich bei den Mutanten um drei verschiedene
Komplementationsgruppen handelt.
74

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
6.6. Charakterisierung der erhaltenen Mutanten
Der Screen nach Thymusmutanten mit rag1 erfasst in der vorliegenden Arbeit alle Mutanten, bei
denen sich im Thymus eine veränderte rag1-Expression nachweisen lässt.
Hierbei können mehrere Pfade, die zur Thymusentwicklung führen, gestört sein, wobei in
vorliegender Arbeit die Mutanten auf die folgenden Aspekte näher untersucht wurden:
Mutationen, die die Entwicklung der T-Zellen (Mesoderm), Mutationen, die die Entwicklung des
Thymusepithels (Endoderm) und Mutationen, die die Entwicklung der Zellen der Neuralleiste
(Mesenchym) betreffen.
Ist die Entwicklung des Thymusepithels gestört, so dass T-Zellen nicht mehr normal einwandern
können, kann dies zu einem Mutantenphänotyp führen. Es ist auch denkbar, dass die
T-Zellentwicklung der lymphoiden Linie betroffen ist, so dass die Einwanderung der T-Zellen in
den Thymus behindert wird oder dass sich die T-Zellen erst gar nicht entwickeln.
Eine weitere Möglichkeit, wie eine geringere Thymusfärbung entstehen kann, ist, dass die
T-Zellen zwar einwandern können, jedoch keine oder nur eine reduzierte rag1-Expression
aufweisen, weil die eingewanderten Zellen sich nicht weiterentwickeln können oder sogar
absterben. Jeder dieser Punkte führt zu Mutanten, bei denen eine Abnahme der Färbung bei der
rag1-ISH nachgewiesen werden kann.
Um beurteilen zu können, welche Entwicklungsprozesse durch die Mutation gestört sind, wurde
unter anderem eine Charakterisierung der Mutanten mit verschiedenen Sonden durchgeführt.
Zum einen wurden Sonden für exprimierte Gene verwendet, die für bestimmte
Entwicklungsstadien von Zellen in der Hämatopoese bekannt sind (SCL, Ikaros, Gata3, rag1)
und andererseits Sonden, die in Endodermgewebe zu finden sind, welche mit in die Entwicklung
des Thymusepithels involviert sind (pax9a, Gata3). Zusätzlich wurde mit einer Sonde (dlx3) wie
auch mit einer histologischen Färbung (Alcianblau) überprüft, ob die Entwicklung der Kiemenund
Kieferbögen korrekt stattgefunden hat und somit ausgeschlossen werden kann, dass der
Phänotyp von einer generellen Deformation im Pharynx- und Kopfbereich herrührt.
Auch hier gilt bei der Auswertung der Färbung dasselbe Kriterium wie bei der Verifizierung des
Screenvorganges mit rag1. Besitzt ein Viertel der Embryonen eines Geleges denselben Phänotyp
und kann dieses Ergebnis beliebig oft wiederholt werden, so kann angenommen werden, dass es
sich um eine tatsächliche Mutation und nicht um ein methodischer Artefakt handelt.
75

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
6.6.1. Thymusentwicklung
Für die Untersuchung der Thymusentwicklung wurden für diese Arbeit die zwei
Endodermmarker pax9a und Gata3 benutzt.
Ein geeigneter Marker, der direkt im Zebrafisch-Thymusepithel exprimiert wird und somit das
Epithel direkt durch ISH detektieren lässt, existierte zum Zeitpunkt dieser Arbeit nicht.
6.6.1.1. Pax9a
Pax9 (paired box) ist ein Transkriptionsfaktor, der unter anderem im Schlundendoderm von
Vertebraten exprimiert wird, aus dem sich auch das Thymusepithel entwickelt. Im Zebrafisch
entstehen durch alternatives Splicen zwei Transkripte, pax9a und pax9b, die in den ventralen
Sklerotomzellen von 24 h und 48 h alten Embryonen nachgewiesen werden konnten. Im 48 h
alten Embryo wird zusätzlich eine Expression im lateralen Kopfmesoderm beobachtet (Nornes et
al. 1996). Für diese Arbeit wurde eine AS-RNA-Sonde des pax9a-Transkriptes hergestellt.
Es wurden jeweils zwei heterozygote Träger verpaart, die Embryonen unter PTC-Einfluss groß
gezogen, am Tag 5.0 fixiert und eine ISH mit der pax9a-AS-Sonde durchgeführt.
Bei allen drei Mutanten ergab sich kein veränderter Phänotyp, sondern das Endoderm aller
Embryonen war gleich stark gefärbt. So kann davon ausgegangen werden, dass die pax9a-
Expression bei allen drei Mutanten durch die Mutation nicht beeinflusst wird.
Zur Ansicht wird in Abb. 6.24. ein pax9a-gefärbter Embryo gezeigt, der stellvertretend für alle
Färbungen der Gelege der drei Mutanten gesehen werden kann. Die Abbildung zeigt, dass die
Expression im Schlundendoderm auch in 5 Tage alten Zebrafischembryonen gefunden werden
konnte, was bisher noch nicht beschrieben wurde.
Abb. 6.24.
Pax9a-ISH, WT, d5.0.
Dorsale Ansicht eines Embryos, bei dem das Endoderm der Kiemenbögen
angefärbt ist. Es sind deutlich die 5 Kiemenbögen, die je mit einem Pfeil
markiert sind, zu erkennen.
76

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
6.6.1.2. Gata3
Ein weiterer Endodermmarker ist Gata3, der vor allem als T-Zellmarker bekannt und
beschrieben ist (s. 2.6.). Jedoch wird Gata3 auch im Endoderm von menschlichen Embryonen im
Pharynx und in den Kiemenbögen nachgewiesen (Debacker et al. 1999). Auch im
Zebrafischembryo findet eine Gata3-Expression im Schlundendoderm in den Kiemenbögen statt
(Trede N., persönliche Mitteilung) und kann somit für die weitere Charakterisierung der
isolierten Mutanten eingesetzt werden.
Weitere Expressionsdomänen im Zebrafisch sind die Vornierengänge von 24 h alten Embryonen
und die Neuronen im Spinal Cord des sich entwickelnden ZNS in 15 h bis 52 h alten Embryonen
(Neave et al. 1995). Für spätere Entwicklungsstadien gibt es dazu keine weiteren Daten.
Es wurden je zwei heterozygote Träger gekreuzt, die Embryonen unter Verhinderung der
Pigmentierung großgezogen, am Tag d5.0 fixiert und anschließend eine ISH mit einer Gata3-
AS-Sonde durchgeführt.
Bei allen drei Mutanten trat in der Endodermfärbung keine Veränderung im Vergleich zur WT-
Färbung auf, weshalb angenommen werden kann, dass die Entwicklung des Endoderms durch
die Mutation nicht beeinflusst wird.
In Abb. 6.25. wird an einem Embryo die Gata3-Färbung demonstriert, die für die Ergebnisse der
Anfärbungen aller drei Mutanten steht. Die Färbung des Schlundendoderms kann auch in diesem
späteren Stadium noch nachgewiesen werden.
Abb. 6.25.
Gata3-ISH, WT, d5.0.
Dorsale Ansicht eines Embryos. Das Endoderm der Kiemenbögen ist
angefärbt, so dass die je mit einem Pfeil markierten 5 Kiemenbögen
zu erkennen sind.
77

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
6.6.2. T-Zellentwicklung
Für die genauere Betrachtung der T-Zellentwicklung stehen die Marker SCL, Ikaros und Gata3
zur Verfügung, die in verschiedenen Differenzierungsstadien der Blutzellentwicklung, vom ganz
frühen Stadium der Hämatopoese an bis hin zum Stadium der T-Zellen, exprimiert werden.
6.6.2.1. SCL
SCL bewirkt die Differenzierung der hämatopoetischen Stammzelle zu ersten hämatopoetischen
Vorläuferzellen und ist der früheste Marker in der Hämatopoese und somit auch in der
T-Zellentwicklung. Dieser Faktor konnte von Finger et al. (1989) (zitiert nach Liao et al. (1998))
identifiziert werden.
Die Expression von SCL im Zebrafisch ist in der ICM in frühen Embryonalstadien lokalisiert
und wird von Gering et al. (1998) beschrieben.
Es wurden je zwei heterozygote Fische gekreuzt, die Embryonen nach 20,5 h fixiert und
anschließend eine ISH mit einer SCL-AS-Sonde durchgeführt.
Bei den Gelegen aller drei Mutanten konnte bei keinem Embryo ein veränderter Phänotyp
ermittelt werden. Dadurch liegt die Vermutung nahe, dass die früheste Hämatopoese in der ICM
durch die Mutationen der drei Mutanten noch nicht beeinflusst wird.
In Abb. 6.26. wird ein 20,5 h Embryo mit SCL-Färbung gezeigt. Es ist deutlich die Färbung in
der ICM des Embryos zu erkennen.
Abb. 6.26.
SCL-ISH, 20,5 h Embryo.
Die ICM erstreckt sich über den gesamten Schwanzbereich
des Embryos (Pfeilspitze).
78

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
6.6.2.2. Ikaros
Der erste Transkriptionsfaktor, der in der hämatopoetischen Linie für die Differenzierung zur
lymphoiden Zelllinie verantwortlich ist, ist Ikaros. Ikaros wird noch vor Gata3 und rag1
exprimiert. Georgopoulos et al. (1992) konnte dies an der Maus zeigen, wobei die Ikaros-mRNA
zuerst in der fötalen Leber und im Thymus nachgewiesen werden konnte.
Auch in Teleostiern kann eine Ikaros-Expression nachgewiesen werden (Hansen et al. 1997).
Mit einer AS-RNA-Sonde wurde eine ISH an d5.0 alten 28,5°C-Embryonen aus je einer
Kreuzung von zwei heterozygoten Trägern durchgeführt, wobei eine Färbung im Thymus
erwartet wurde, da sich dort am Tag 5 T-Vorläuferzellen befinden, die Ikaros exprimieren (Trede
et al. 1998).
Die Ergebnisse der ISH zeigten, dass sich bei allen drei Mutanten ein Phänotyp erkennen lässt,
der durch eine im Vergleich zum WT-Fisch schwächere Färbung im Thymus erkennbar wird.
Die Unterschiede zwischen WT- und Mutantenphänotyp werden im folgenden Abschnitt
demonstriert.
Die Auswertung erfolgte ebenfalls über die Anzahl an Phänotypen eines Geleges. Treten 25%
Mutantenphänotypen auf und kann dies wiederholt werden, so kann das Ergebnis als bestätigt
angesehen werden. Die Ikaros-Färbung ist im Vergleich zur rag1-Färbung nicht so stark zentriert
und es sind um den Thymus einwandernde T-Zellen zu erkennen.
6.6.2.2.1. Briesle
Bei der briesle-Mutante ist bei Normaltemperatur deutlich bei einem Viertel eines Geleges ein
Unterschied der Ikaros-Färbung zwischen WT- und Mutantenembryo zu erkennen.
Der Mutantenphänotyp bei einer Aufzuchttempertaur von 28,5°C in Abb. 6.28. weist im
Vergleich zum WT-Embryo in Abb. 6.27. im Thymus eine schwächere Anfärbung auf. Werden
die Embryonen bei erhöhter Temperatur von 31,5°C großgezogen, dann sind im
Mutantenthymus in Abb. 6.30. immer noch Ikaros-gefärbte T-Zellen zu erkennen.
In Abb. 6.27. und Abb. 6.28. wie auch in Abb. 6.29. und Abb. 6.30. können einwandernde
T-Zellen, vor allem im Bereich um den Thymus, als kleine blaue Pünktchen beobachtet werden.
79

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
Abb. 6.27. Abb. 6.28.
Briesle, WT. Briesle, Mutante.
Ikaros-ISH, 28,5°C, d5.0. Die Ikarosfärbung ergibt Ikaros-ISH, 28,5°C, d5.0. Bei der Mutante ergibt sich
eine deutliche Färbung im Thymusbereich. eine schwächere Färbung im Thymus.
Werden die Embryonen unter Einfluss einer erhöhten Temperatur von 31,5°C großgezogen, ist
die Veränderung des Mutantenphänotyps nicht so stark wie bei der rag1-Färbung. 25% der
Embryonen eines Geleges weisen eine schwache Färbung auf, die im Vergleich zum
Mutantenphänotyp bei 28,5°C in Abb. 6.28. in noch weiter abgeschwächter Form auftritt. Dies
wird in Abb. 6.29. und Abb. 6.30. gezeigt.
Abb. 6.29. Abb. 6.30.
Briesle, WT. Briesle, Mutante.
Ikaros-ISH, 31,5°C, d5.0. Die Färbung ist am WT- Ikaros-ISH, 31,5°C, d5.0. Der Mutantenphänotyp weist
Embryo deutlich zu erkennen (Pfeil). einen schwächeren Phänotyp als in Abb. 6.28. auf,
jedoch ist noch Färbung zu erkennen.
Um die Ikaros-Färbung, die in vorliegender Arbeit mit dem frühesten Marker in der T-
Zellentwicklung für T-Lymphozyten im Thymus hergestellt wurde, genauer betrachten zu
können, wurden jeweils WT- und Mutantenembryonen der drei Mutanten nach der Ikaros-ISH in
Paraffin eingebettet, 5 µm dicke Schnitte hergestellt und diese anschließend mit Fuchsin gefärbt.
Ikaros ist ein Prothymozytenmarker, der im Thymus von frisch eingewanderten Lymphozyten
exprimiert wird.
80

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
Die Analyse soll zeigen, ob die Beobachtung der Schnitte an ungefärbten Embryonen im
Abschnitt 6.4. auch an Embryonen gemacht werden kann, an denen erstmals die eingewanderten
T-Lymphozyten detektiert werden können.
Dabei wird beobachtet, dass T-Zellen im WT-Embryo in Abb. 6.31., die Ikaros exprimieren, vor
allem in der äußeren Region auftreten. Beim Mutantenembryo in Abb. 6.32. ist diese
Beobachtung nicht mehr vorhanden, sondern es tritt eine flache Ansammlung an Ikarosgefärbten
T-Lymphozyten auf.
Abb. 6.31. Abb. 6.32.
Briesle, WT. Briesle, Mutante.
Ikaros-ISH, 28,5°C, d5.0, 5 µm-Paraffinschnitt, Fuchsin. Ikaros-ISH, 28,5°C, d5.0, 5 µm-Paraffinschnitt, Fuchsin
Die Ikaros-Färbung erscheint im äußeren Bereich des Beim Mutantenembryo treten weniger T-Zellen im
normal großen Thymus. flachen Thymus auf.
An den Schnitten der Embryonen aus 31,5°C ist beim Mutantenphänotyp ebenfalls noch eine
Färbung erkennbar. Es erscheinen jedoch weniger T-Lymphozyten als beim Mutantenphänotyp
bei 28,5°C in Abb. 6.32., die ebenfalls in einem flachen Thymus angeordnet sind.
Abb. 6.33. Abb. 6.34.
Briesle, WT. Briesle, Mutante,
Ikaros-ISH, 31,5°C, d5.0, 5 µm-Paraffinschnitt, Fuchsin. Ikaros-ISH, 31,5°C, d5.0, 5µm-Paraffinschnitt, Fuchsin.
Der Thymus ist mit vielen T-Zellen gefüllt, was durch Der flache Thymus der Mutante enthält nur noch
den Pfeil markiert ist. vereinzelt T -Zellen.
81

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
6.6.2.2.2. Minibries
Auch die Analyse mit einem Gelege der minibries-Mutante zeigte einen Mutantenphänotyp, der
im Vergleich zum WT-Embryo eine schwächere Färbung im Thymus aufweist und mit einem
Anteil von ca. 25% eines Geleges auftritt.
Abb. 6.35. Abb. 6.36.
Minibries, WT. Minibries, Mutante.
Ikaros-ISH, d5.0. Der gefärbte Thymus ist mit einer Ikaros-ISH, d5.0. Es sind weniger T-Zellen im
Pfeilspitze markiert und es sind deutlich die Mutantenthymus zu erkennen.
gefärbten T-Zellen zu erkennen.
Es wurden je WT- und Mutantenembryonen in Paraffin eingebettet, 5 µm dicke Schnitte
angefertigt und diese mit Fuchsin gefärbt.
Abb. 6.37. Abb. 6.38.
Minibries, WT. Minibries, Mutante.
Ikaros-ISH, 5 µm-Paraffinschnitt eines d5.0-Embryos. Ikaros-ISH, 5 µm-Paraffinschnitt eines d5.0-Embryos.
Der WT-Thymus zeigt deutlich viele Ikaros-gefärbte Im Mutantenembryo erscheint der Thymus flach mit
T-Lymphozyten. wenigen T-Lymphozyten.
82

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
6.6.2.2.3. Briessche
Die Charakterisierung der briessche-Mutante mit der Ikaros-AS-RNA-Sonde zeigte ebenfalls bei
einem Viertel eines Geleges einen Mutantenphänotyp, der eine geringere Ikaros-Färbung im
Thymus aufweist. In Abb. 6.39. ist dazu der WT- und in Abb. 6.40. der Mutantenphänotyp
gezeigt.
Abb. 6.39. Abb. 6.40.
Briessche, WT. Briessche, Mutante.
Ikaros-ISH, d5.0. Im WT-Thymus ist eine deutliche Ikaros-ISH, d5.0. Im Mutantenembryo hingegen ist nur
Färbung zu erkennen, markiert mit einer Pfeilspitze. noch eine abgeschwächte Färbung vorhanden.
Es wurden WT- und Mutantenembryonen isoliert, getrennt in Paraffin eingebettet, 5µm dicke
Schnitte angefertigt und einer Fuchsinfärbung unterzogen. Die Ergebnisse davon sind in den
Abb. 6.41. und 6.42. dargestellt.
Abb. 6.41. Abb. 6.42.
Briessche, WT. Briessche, Mutante.
Ikaros-ISH, 5 µm-Paraffinschnitt, d5.0. Der Thymus Ikaros-ISH, 5 µm-Paraffinschnitt, d5.0. Der Mutantenzeigt
viele T-Zellen im großen WT-Thymus. thymus hingegen enthält nur noch wenige
T-Lymphozyten und er erscheint flacher.
83

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
6.6.2.3. Gata3
Die Expression von Gata3 erfolgt in der T-Zellentwicklung später als Ikaros, wenn die
Entscheidung in der lymphoiden Linie zur Differenzierung zur T-Zelllinie getroffen wird.
Ho et al. (1991) konnte Gata3 in menschlichen T-Zellen identifizieren. Auch im Zebrafisch wird
Gata3 in T-Zellen exprimiert, so dass die Expression durch eine ISH mit einer Gata3-AS-Sonde
nachgewiesen werden kann. Die erste Expression von Gata3 wird in den Vornierengängen an
24 h alten Embryonen beobachtet (Neave et al. 1995).
Es wurden je zwei heterozygote Träger der Mutanten verpaart, die Embryonen der Gelege am
Tag d5.0 fixiert und eine ISH mit einer Gata3-AS-Sonde durchgeführt.
Die Gata3-Färbung ist im Vergleich zur rag1-Färbung größer und flächiger, nicht so zentral
gefärbt. Gata3 wird ebenfalls auch schon in T-Zellen außerhalb, in der Umgebung des Thymus
exprimiert, wie in den folgenden Abbildungen zu sehen ist.
6.6.2.3.1. Briesle
Bei den Embryonen der Kreuzung zweier Träger von briesle und Aufziehen des Geleges bei
28,5°C Normaltemperatur ist ein Mutantenphänotyp vorhanden, der im Vergleich zu
WT-Embryonen weniger Färbung im Thymus aufweist.
Dies wird in Abb. 6.43. und Abb. 6.44. demonstriert.
Abb. 6.43. Abb. 6.44.
Briesle, WT. Briesle, Mutante.
Gata3-ISH, 28,5°C, d5.0. Beim WT-Embryo wird im Gata3-ISH, 28,5°C, d5.0. Es tritt eine schwächere
Vergleich zum Mutantenembryo in Abb. 6.44. ein Färbung im Vergleich zu Abb. 6.43. auf.
größerer Bereich angefärbt.
Werden die Embryonen bei 31,5°C inkubiert, verschwindet bei den Mutanten im Gelege die
Gata3-Färbung im Thymus vollständig. Diese Beobachtung ist analog zu den Ergebnissen der
rag1-ISH-Färbung in Abb. 6.11.. Auch die außerhalb liegenden Gata3-exprimierenden T-Zellen,
84

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
die den Thymus umgeben, treten so gut wie nicht mehr auf. Dies kann in Abb. 6.46. gezeigt
werden.
Abb. 6.45. Abb. 6.46.
Briesle, WT. Briesle, Mutante.
Gata3-ISH, 31,5°C, d5.0. Im WT-Embryo lassen sich Gata3-ISH, 31,5°C, d5.0. Im Mutantenembryo hingegen
deutlich die T-Zellen im Thymus erkennen, die durch sind keine Gata3-gefärbten T-Lymphozyten mehr im
eine Pfeilspitze angezeigt sind. Thymus vorhanden.
6.6.2.3.2. Minibries
Auch bei der Charakterisierung von minibries mit der Gata3-AS-Sonde erscheint ein
Mutantenphänotyp (Abb. 6.48.), der im Vergleich zum WT-Embryo in Abb. 6.47. eine
schwächere Färbung im Thymus aufweist.
Abb. 6.47. Abb. 6.48.
Minibries, WT. Minibries, Mutante.
Gata3-ISH, d5.0. Gezeigt ist ein WT-Embryo, bei dem Gata3-ISH, d5.0. Der Mutantenembryo zeigt einen
die Thymusfärbung mit einer Pfeilspitze markiert ist. weniger stark gefärbten Thymus.
85

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
6.6.2.3.3. Briessche
Bei der Analyse der briessche-Mutante erscheint ein Mutantenphänotyp, der im Vergleich zum
WT-Fisch eine schwächere Gata3-Färbung im Thymus aufweist. In Abb. 6.49. ist im Thymus
des WT-Embryos eine deutliche Färbung zu erkennen. Abb. 6.50. zeigt die zugehörige Mutante,
bei der die Färbereaktion deutlich schwächer ausfällt.
Abb. 6.49. Abb. 6.50.
Briessche, WT. Briessche, Mutante.
Gata3-ISH an d5.0-Embryo. Die Pfeilspitze markiert den Gata3-ISH an d5.0-Embryo. Der Mutantenthymus zeigt
WT-Thymus mit Gata3-Färbung. eine geringere Färbung im Thymusbereich auf.
6.6.3. Pharynxmorphologie
Um auszuschließen, dass eine generelle Deformation in Kopf und Pharynx vorhanden ist, welche
eine korrekte Entwicklung des Thymus verhindert, wird durch diese Analyse die Entwicklung
der Kiemen- und Kieferbögen und des Zungenbeins genauer untersucht.
Sind diese Knorpelstrukturen normal entwickelt, scheidet der Aspekt der Fehlentwicklung durch
die Beeinflussung einer fehlerhaften Pharynxmorphologie der drei Mutantenthymi weitestgehend
aus.
6.6.3.1. Dlx3
Dlx3 (distal-less homolog) wird unter anderem in Zellen der Neuralleiste exprimiert, die die
Knorpel der Kiemenbögen bilden. Es wurde vom Zebrafisch erstmals von Akimenko et al.
(1994) kloniert. Damit kann die Entwicklung der 5 Kiemenbögen der Mutanten in der
vorliegenden Arbeit untersucht werden.
86

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
Dazu wurden je zwei heterozygote Fische verpaart, die Embryonen unter PTC-Behandlung groß
gezogen, nach 2 Tagen fixiert und eine ISH mit einer dlx3-AS-Sonde durchgeführt.
Bei allen Gelegen der drei Mutanten konnte kein Mutantenphänotyp ermittelt werden. Die
vollständige Anzahl der Kiemenbögen ist bei allen vorhanden.
Stellvertretend für die Färbungen der drei Mutanten wird in Abb. 6.51. ein d2.0-Embryo gezeigt,
an dem die Anfärbung der 5 Kiemenbögen gut zu erkennen ist.
Abb. 6.51.
Dlx3-ISH, d2.0 Embryo.
Die WT-dlx3-Färbung ist hier am Beispiel eines Embryos
aus einem briesle-31,5°C-Gelege gezeigt. Die Pfeilspitzen
zeigen auf die 5 Kiemenbögen.
6.6.3.2. Alcianblau
Die Anwendung der Alcianblau-Anfärbetechnik ermöglicht es, die gesamten Knorpelstrukturen
im Kopfbereich des Embryos sichtbar zu machen.
Dadurch können zusätzlich zu den 5 Kiemenbögen auch die 2 Kieferbögen und das Zungenbein
im Embryo analysiert werden.
Diese Färbung ermöglicht nicht nur die Anzahl der Bögen zu ermitteln, sondern es lässt sich
zusätzlich die Form der Knorpelstrukturen eindeutig erkennen, so dass eine Missbildung der
vorhandenen Kiemen-und Kieferbögen erkannt werden kann.
Es wurden jeweils zwei Träger miteinander gekreuzt, die Embryonen unter PTC-Behandlung
großgezogen und am Tag 5.0 der Alcianblau-Färbung unterzogen. Bei allen drei Mutanten
konnte keine veränderte Anzahl der Kiemen- und Kieferbögen und keine Veränderung in der
Form ermittelt werden. Auch das Zungenbein zeigte keine Abnormalitäten auf.
Die Alcianblau-Färbung in Abb. 6.52. steht stellvertretend für die Ergebnisse dieser Analyse der
drei Mutanten.
87

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
Abb. 6.52. Abb. 6.53.
Schematische Darstellung der Kiemen- und Kiefer- Alcianblau-Färbung, d5.0.
bögen nach Gaiano et al. (1996b). Die WT-Färbung ist hier am Beispiel eines Embryos aus einem
1-5: Kiemenbögen; Mandibular, Hyoid: Kiefer- briesle-31,5°C-Gelege gezeigt.
bögen; Ethmoid: Zungenbein.
6.6.4. Zusammenfassung der Charakterisierung der Mutanten
Bei allen drei Mutanten konnte keine Fehlentwicklung oder veränderte Anzahl der
Kiemenbögen, Kieferbögen und des Zungenbeins festgestellt werden. Ebenso zeigten die beiden
Endodermmarker (s. 6.3.2.) bei allen drei Mutanten kein verändertes Erscheinungsbild.
Somit konnte mit den Markern in der vorliegenden Arbeit keinen Hinweis darauf gefunden
werden, dass die Phänotypen der Mutanten durch eine gestörte Thymusepithelentwicklung oder
durch eine Fehlentwicklung des Pharynx oder Kopfes verursacht werden.
Die ISH mit der frühesten Sonde der Hämatopoese, SCL, zeigte bei allen drei Mutanten keine
Auffälligkeiten. So kann angenommen werden, dass die Hämatopoese bis zu diesem Zeitpunkt
noch nicht gestört wird.
Bei der Analyse mit den weiteren T-Zell Marken Ikaros, Gata3 und auch rag1, das für den
Screen selber benutzt wurde, konnte jedoch bei allen drei Mutanten bei 25% eines Geleges
zweier heterozygoter Fische eine Veränderung der Färbung im Thymus beobachtet werden.
Der Screen mit rag1 ergab bei den Mutanten eine schwächere Färbung im Thymus, bei briesle
verschwindet sogar die Färbung, wenn die Embryonen bei erhöhter Temperatur von 31,5°C groß
gezogen werden. Dieselbe Beobachtung kann auch mit der Gata3-AS-Sonde gemacht werden.
88

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
Auch die ISH mit Ikaros ergab bei den Mutanten eine schwächere Färbung im Thymus, jedoch
verschwindet die Färbung bei briesle bei 31,5°C nicht vollständig.
Hinsichtlich der Ergebnisse der Charakterisierung kann festgehalten werden, dass bei allen drei
Mutanten in der Hämatopoese ab dem Stadium der Ikaros-Expression bei normaler
Aufzuchttemperatur von 28,5°C eine geringere Färbung im Thymus zu erkennen ist. Aus den
transversalen Schnitten von 6.4.2. und 6.6.2.2. lässt sich schließen, dass diese schwache Färbung
auf eine geringere Anzahl an T-Zellen im Thymus zurückzuführen ist, die ihn dadurch flacher
erscheinen lässt.
Diese Ergebnisse geben jedoch keinen Hinweis auf die Wirkung der Mutation. So dass trotz der
Ergebnisse der Charakterisierung bei 28,5°C nicht ermittelt werden konnte, ob die Mutationen
die Entwicklung des Thymusepithels, der Zellen der Neuralleiste oder der T-Zellen
beeinträchtigen.
Eine zusätzliche Information über die Wirkung der Mutation kann bei der briesle-Mutante durch
die Temperatursensitivität ermittelt werden. Bei der Inkubation der Embryonen bei 31,5°C fehlt
bei einem Viertel der Fische im Thymus die Färbung von rag1 und von Gata3. Bei einer ISH mit
Ikaros ist jedoch noch Färbung im Thymus zu erkennen.
Dies lässt den Schluss zu, dass vermutlich der Übergang von Ikaros-postiven nach Gata3positiven
T-Zellen in der Differenzierung beeinträchtigt ist.
Bei der erhöhten Temperatur von 31,5°C treten bei den Mutantenembryonen nach der Ikaros-
ISH noch T-Lymphozyten in der Umgebung des Thymus auf. Da jedoch bei den 31,5°C-
Embryonen in der Umgebung des Thymus so gut wie keine Gata3-exprimierenden T-Zellen
mehr vorhanden sind, ist anzunehmen, dass ein intrinsischer lymphoider Defekt vorliegt.
Diese Beobachtungen der ISH mit Ikaros und Gata3 deuten ebenfalls darauf hin, dass die Ikarospositiven
T-Zellen zwar noch in den Thymus einwandern können, sie die späteren Stadien der
Entwicklung jedoch nicht mehr erreichen. Um dies genauer zu analysieren, müsste ein TUNEL-
Assay durchgeführt werden, bei dem apoptotische Zellen detektiert werden können.
89

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
Briesle Minibries Briessche
Temperatursensitiv? ja: keine Färbung nein nein
Komplementär? zu minibries: nein zu briesle: nein zu briesle: nein
zu briessche: nein zu briessche:nein zu minibries: nein
Defekte derPharynxmorphologie?
28,5°C 31,5°C
Dlx3-ISH nein nein nein nein
Alcianblau nein nein nein nein
Defekte in Endodermentwicklung?
Pax9a-ISH nein nein nein nein
Gata3-ISH nein nein nein nein
Defekte in T-Zellentwicklung?
SCL-ISH nein nein nein nein
Ikaros-ISH schwache sehr schwache schwache
Färbung schwache Färbung Färbung
Färbung
Gata3-ISH schwache keine schwache schwache
Färbung Färbung Färbung Färbung
Rag1-ISH schwache keine schwache schwache
(Screen) Färbung Färbung Färbung Färbung
Auswirkung der Ikaros // Gata3 nicht bestimmbar nicht bestimmbar
Mutation
Abb. 6.54.
Tabellarische Zusammenfassung der Ergebnisse der Charakterisierung der Mutanten, beschrieben in den
Abschnitten 6.3. bis 6.6.
90

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
6.7. Kinetische Studien mit der briesle-Mutante
Mit Hilfe der temperatursensitiven Mutante briesle konnten Versuche durchgeführt werden, die
über den kritischen Zeitpunkt Aufschluss geben, an dem die erhöhte Temperatur die Funktion
des veränderten Proteins verhindert. Dadurch kann der Zeitpunkt ermittelt werden, an dem das
betroffene Gen in der Entwicklung wichtig ist.
Dazu wurden Embryonen eines Geleges von zwei heterozygoten Trägern zu den verschiedenen
Zeitpunkten d1.0, d1.5, d2.0, d2.5 und d3.0 von 28,5°C auf 31,5°C überführt, nach 5 Tagen
fixiert und eine rag1-ISH durchgeführt. Zur Kontrolle wurde je ein Teil des Geleges bei 28,5°C
(28,5-K) und bei 31,5°C (31,5-K) bis d5.0 inkubiert und ebenfalls der rag1-ISH unterzogen.
Die Ergebnisse dieses Versuches sind im Diagramm in Abb. 6.55. dargestellt. Es zeigt, dass der
temperatursensitive Effekt nur dann auftritt, wenn die Embryonen bis ca. d1.5 auf 31,5°C
überführt werden. Zum späteren Zeitpunkt tritt der Effekt nicht mehr ein.
Das bedeutet, dass das exprimierte Protein des betroffenen Gens bis zu diesem Zeitpunkt aktiv
sein muss, bei erhöhter Temperatur blockiert wird und dadurch die rag1-Expression unterdrückt.
Zum späteren Zeitpunkt ab ca. d1.5 ist das betroffene Protein nicht mehr aktiv und es tritt durch
die erhöhte Temperatur keinen Effekt mehr auf.
Anzahl der Embryonen (%)
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1 1,5 2 2,5 3 28,5-K 31,5-K
Zeitpunkt der Überführung von 28,5°C auf 31,5°C (d)
Abb. 6.55.
Darstellung des Verhaltens der T-Zellen, wenn die Embryonen der briesle-Mutante zu verschiedenen Zeitpunkten
von 28,5°C auf 31,5°C überführt werden. 28,5-K: Ergebnis der 28,5°C-Kontrolle, 31,5-K: Ergebnis der 31,5°C-
Kontrolle.
91
%WT
%Mutanten/
schwacher
Thymus
%Mutanten/
ohne Thymus

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
In Willett et al. (1999) wird beschrieben, dass im Zebrafischthymus erste lymphoide Vorläufer
nach 65 hpf mit dem EM detektiert werden können. Das bedeutet, dass das für die Blockade der
rag1-Expression letztlich verantwortliche Ereignis schon vor der Einwanderung der
Lymphozyten in den Thymus geschehen muss.
Dies ist in Übereinstimmung mit der Tatsache, dass wichtige Schritte der T-Zellentwicklung, wie
der Beginn der Gata3-Expression, schon vor Einwanderung in den Thymus ablaufen
(s. Abb. 6.43.), die bei der briesle-Mutante offensichtlich ebenfalls schon gestört sind.
Damit erscheint es möglich, dass der Differenzierungsschritt von Ikaros-positiven zu Gata3positiven
T-Zellvorläufern in der briesle-Mutante behindert wird. Die Ikaros-Expression tritt in
der Embryogenese erstmals nach 24 hpf in der ICM auf (Trede et al. 1998).
Diese gestörte Differenzierung verhindert jedoch nicht, dass Ikaros-positive lymphozytäre
Vorläufer in den Thymus einwandern können. Wie in Abb. 6.32. gezeigt, kommt es jedoch
offensichtlich nicht zur Proliferation dieser Zellen, wofür vermutlich die fehlende Gata3-
Expression mit verantwortlich ist.
6.8. Mapping, das Kartieren von Genen
Unter Mapping versteht man das Lokalisieren einer Mutation im Genom mit Hilfe polymorpher
Marker, mit denen die Rekombinationsfrequenz zwischen den Markern und der Mutation
ermittelt und somit der Ort der Mutation auf einem Chromosom bestimmt werden kann.
Während der Prophase der Meiose I lagern sich die Paare homologer Chromosomen zusammen.
Es kommt dabei zu einem Austausch von DNA-Abschnitten, dem Crossing-over, wodurch eine
Rekombination stattfindet.
Je weiter zwei Loci auf einem Chromosom voneinander entfernt sind, umso größer ist die
Wahrscheinlichkeit, dass sie durch ein Crossing-over voneinander getrennt werden. Deshalb ist
die Rekombinationshäufigkeit zwischen zwei Loci ein Maß für deren genetischen Abstand.
Der Abstand auf einer Genkarte zwischen zwei Loci, die eine Rekombination von einem Prozent
zeigen, beträgt per Definition ein Centimorgan (cM).
Die Voraussetzung für eine Genkartierung sind genügend polymorphe Marker, die über das
gesamte Genom verteilt sind und die gekoppelten Marker sollten eine sehr geringe
Rekombinationsfrequenz zur Mutation aufweisen, damit die Eingrenzung eines engen Bereiches
auf dem Chromosom möglich ist.
In vorliegender Arbeit wurden sogenannte SSLP (simple sequence length polymorphism)-
Marker verwendet, bei denen DNA-Stücke mit unterschiedlich langen CA-Repeats mit Hilfe der
PCR amplifiziert werden.
Um informative Marker zu erhalten, wurden heterozygote Träger der Mutanten im
AB-Hintergrund, in dem die Mutagenisierung stattgefunden hat, mit polymorphen Wik-Fischen
92

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
ausgekreuzt. Dadurch kann in der anschließenden Analyse mit der Rekombinationsfrequenz die
genetische Distanz der einzelnen Marker zur Mutation errechnet werden.
Für die Kartierung wurde pro Mutation ein AB-Trägerfisch mit einem Wik-Fisch ausgekreuzt
und jeweils ca. 150 Fische großgezogen. Aus der entstandenen AB/Wik-F1-Generation wurden
Trägerfische durch zufälliges Kreuzen der Geschwister untereinander und anschließender ISH
der d5.0-Embryonen mit rag1 identifiziert.
Bei jedem Fisch der ISH sind zwei Meiosen vorausgegangen, die je zu einem
Rekombinationsereignis führen können.
Das Prinzip der Auswertung beruht darauf, dass die Kopplung der Marker an die Mutation durch
die Analyse der PCR-Produkte der Marker mit der DNA von Mutantenembryonen überprüft
wird.
Je näher ein Marker an der Mutation liegt, desto geringer ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine
Rekombination zwischen Marker und Mutation in den Nachkommen der Kreuzung zweier
AB/Wik-Fischen stattgefunden hat und desto weniger PCR-Produkte des Wik-Allels ergeben
sich aus der DNA der Mutantenembryonen.
6.8.1. Grobkartierung durch Poolanalyse
Bei der Grobkartierung wurde die Kopplungspruppe (LG) ermittelt, auf der sich die Mutation
befindet. Dafür wurde in vorliegender Arbeit ein Panel von 240 Markern verwendet, die unter
4.4.1. aufgelistet sind.
Für die Grobkartierung wurde die Technik der Poolanalyse angewendet. Es wurden je zwei
Merkmalsträger der AB/Wik-F1-Generation gekreuzt, mit den Embryonen eine rag1-ISH
durchgeführt und davon 48 Mutanten- und 48 WT-Embryonen isoliert. Bei den WT-Embryonen
befinden sich sowohl homozygote WT-Embryonen ohne Mutation und auch heterozygote
Träger, bei denen der Phänotyp der rezessiven Mutation nicht zum Vorschein kommt.
Es wurde von jedem Fisch DNA präpariert (s. 5.1.21.1.) und anschließend je ein Pool der
Mutanten-DNA und der WT-DNA der Embryonen hergestellt (s. 5.1.21.2.).
Für die Poolanalyse wurde nun jeder Marker der Grobkartierung auf dem WT-DNA-Pool und
dem Mutanten-DNA-Pool in einem 10 µl PCR-Ansatz nach 5.1.21.3. getestet. Nur informative,
das heisst polymorphe Marker, bei denen im WT-DNA-Pool mindestens zwei Banden auftreten,
sind für eine Auswertung nützlich.
Die entstandenen Banden, die für das gleiche Primerpaar im WT- und Mutanten-DNA-Pool
auftreten, wurden miteinander verglichen. Erscheint eine Bande im Mutanten-DNA-Pool im
Vergleich zum WT-DNA-Pool schwächer, so handelt es sich um einen gekoppelten Marker,
wobei die Bande, die im Mutanten-DNA-Pool schwächer wird, der Bande des Wik-Allels
entsprechen sollte.
93

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
Je näher ein Marker an der Mutation lokalisiert ist, desto schwächer erscheint die Wik-Allel-
Bande im Mutanten-DNA-Pool, da die Rekombinationsfrequenz zwischen Marker und Mutation
abnimmt. Ist sie vollständig verschwunden, so liegt sie so dicht an der Mutation, dass zwischen
der Mutation und dem Marker im untersuchten DNA-Pool keine Rekombination mehr
stattgefunden hat.
Die Poolanalyse wird am Beispiel des Markers z22270 an der Mutante minibries in Abb. 6.57.
gezeigt.
1 2
Kann diese Beobachtung bei mehreren Markern gemacht werden, die der gleichen
Kopplungsgruppe angehören, so ist die Wahrscheinlichkeit groß, dass sich die Mutation auf
dieser LG befindet.
Um diese Vermutung zu verifizieren, wird die Poolanalyse der interessanten Marker wiederholt
und anschließend die Kopplung der Marker durch Einzelembryoanalysen (s. 6.8.3.) und durch
die Analyse von weiteren Markern (s. 6.8.2.) überprüft.
6.8.1.1. Briesle
Abb. 6.57.
Demonstration der Pool-Analyse anhand des Markers z22270 auf
einem 3% Agarosegel/TBE. In Spur 1 sind die PCR-Produkte des
WT-DNA-Pools, in Spur 2 die Amplifizierungen des Mutanten-
DNA-Pools aufgezeigt. Der untere Pfeil der Abbildung zeigt auf die
Wik-Bande, die obere auf die AB-Bande. Es ist deutlich zu
erkennen, dass die Wik-Bande im Mutantenpool im Vergleich zum
WT-Pool schwächer wird und dafür die AB-Bande an Stärke
zunimmt.
Die weiteren zusätzlichen Banden, die im Gel auftreten, lassen sich
auf unspezifische Banden und auf Heteroduplexe zurückführen und
sind nicht zu beachten.
Die Poolanalyse mit briesle ergab die Lokalisation der Mutation auf LG5.
Bei den folgenden 4 Primern der LG5 ergab sich eine Kopplung beim Vergleich der PCR-
Produkte des WT-DNA-Pools und des Mutanten-DNA-Pools.
In Abb. 6.58. sind die PCR-Ergebnisse für die gekoppelten Marker z10456, z11496, z14143 und
z3804 der Mutante briesle gezeigt.
94

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
z10456 z11496 z14143 z3804
WT Mut WT Mut WT Mut WT Mut
Abb. 6.58.
Ergebnis der Poolanalyse von briesle. Es sind je die gesamten PCR-Ansätze eines Markers mit dem WT-DNA-Pool
und dem Mutanten-DNA-Pool nebeneinander auf einem 3% Agarosegel/TBE aufgetragen. Die Pfeilspitzen deuten
je auf die Wik-Bande, die im WT-Pool stärker als im Mutantenpool auftritt.
6.8.1.2. Minibries
Das Ergebnis der Poolanalyse der minibries-Mutante ergab die Lokalisation der Mutation auf
LG8.
In Abb. 6.59. sind die 4 gekoppelten Marker z1068, z1634, z21115 und z7819 gezeigt, welche
bei der Grobkartierung ermittelt werden konnten.
z1068 z1634 z21115 z7819
WT Mut WT Mut WT Mut WT Mut
Abb. 6.59.
Ergebnis der Poolanalyse von minibries. Es sind je die gesamten PCR-Ansätze eines Markers mit dem WT-DNA-
Pool und dem Mutanten-DNA-Pool nebeneinander auf einem 3% Agarosegel/TBE aufgetragen. Die Pfeilspitzen
deuten je auf die Wik-Bande, die im Mutantenpool an Stärke abnimmt.
95

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
6.8.1.3. Briessche
Die Grobkartierung für die briessche-Mutante war mit dem Marker-Panel von 4.4.1. nicht
eindeutig. Es ergaben sich für die Kopplungsgruppen 5, 6, 9 und 20 eventuelle Kopplungen, die
jedoch alle nicht eindeutig ausfielen.
Im Zuge der Feinkartierung (s. 6.8.2.) wurde von diesen LGs neue Primer bezogen. Durch die
Anwendung der Poolanalyse wurde versucht, diejenigen Marker zu isolieren, die eine eindeutige
Kopplung aufweisen. Die dafür benutzten Primer sind in 4.4.2. aufgeführt.
Dies ist jedoch im Rahmen dieser Arbeit mit den benutzten Primern nicht gelungen. Weitere
LGs, an denen zusätzliche Marker ausgetestet werden könnten, konnte durch die Poolanalyse des
Grobmappings nicht ermittelt werden, so dass die Bestimmung der LG noch aussteht.
6.8.2. Feinkartierung
Bei der Feinkartierung wird ein engerer Bereich bestimmt, in dem die Mutation lokalisiert ist.
Dazu wurden in zielgerichteter Weise weitere Marker für das Chromosom benutzt, welches
durch die Grobkartierung als Ort der Mutation ermittelt werden konnte.
Durch die Verwendung von zusätzlichen Markern kann überprüft werden, ob auch diese das
Ergebnis der Grobkartierung bestätigen. Desweiteren wird durch eine große Anzahl an
polymorphen Markern auf einer Kopplungsgruppe die folgende Eingrenzung des Bereiches, in
der die Mutation zu finden ist, erleichtert.
Solche zusätzliche Marker wurden zuerst einer Poolanalyse (s. 6.8.1.) unterzogen, um
polymorphe Marker zu identifizieren. Diese wurden anschließend bei einer Einzelembryoanalyse
(s. 6.8.3.) eingesetzt, um die Entfernung des Markers zur Mutation quantitativ zu bestimmen.
Die PCR wurde in 10 µl-Ansätzen durchgeführt, wie in 5.1.21.3.beschrieben ist.
6.8.2.1. Briesle
Für die Identifizierung von zusätzlichen informativen Markerm auf der LG5 wurden die unter
4.4.2.1. angegebenen 28 Marker benutzt. Davon konnte bei den Markern z6371, z7339, z23491,
z1454, z7685, z21290, z31983, z7428 und z9871 eine Minderung der Wik-Bande im Mutanten-
DNA-Pool beobachtet werden.
96

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
z6371 z7339 z23491 z1454 z7685 z21290 z31983 z7428 z9871
WT Mut WT Mut WT Mut WT Mut WT Mut WT Mut WT Mut WT Mut WT Mut
Abb. 6.60.
Darstellung der positiven Primer der LG5 der Feinkartierung der briesle-Mutante.
Es wurde je das gesamte 10 µl PCR-Volumen auf ein 3% Agarosegel/TBE aufgetragen. Die Pfeilspitzen markieren
die Wik-Banden, die im WT-DNA-Pool mehr Amplifikate aufweisen als im Mutanten-DNA-Pool.
6.8.2.2. Minibries
Für die Identifizierung von zusätzlichen Markern auf der LG8 wurden die unter 4.4.2.3.
angegebenen 41 Marker benutzt. Davon konnten die in Abb. 6.61. dargestellten Marker als
gekoppelt identifiziert werden.
z11148 z170 z22270 z15045 z24511 z34962 z25335 z11623
WT Mut WT Mut WT Mut WT Mut WT Mut WT Mut WT Mut WT Mut
Abb. 6.61.
Darstellung der positiven Primer der LG8 der Feinkartierung der minibries-Mutante.
Es ist je das gesamte 10 µl PCR-Volumen auf ein 3% Agarosegel/TBE aufgetragen. Die Pfeilspitzen markieren die
Wik-Banden, die im WT-DNA-Pool mehr Amplifikate aufweisen als im Mutanten-DNA-Pool.
97

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
6.8.3. Einzelembryoanalyse
Die Einzelembryoanalyse ist essentiell, um gekoppelte Marker eindeutig zu identifizieren und
den genetischen Abstand zwischen Marker und Mutation zu ermitteln.
Dazu wurde zuerst die DNA der 48 Mutantenembryonen, die für den Mutanten-DNA-Pool der
Grobkartierung eingesetzt wurden, benutzt.
Es wurde pro Mutantenembryo eine PCR nach 5.1.21.4. mit dem entsprechenden Marker
durchgeführt, der komplette PCR-Ansatz auf ein 3% Agarosegel/TBE aufgetragen und die
Banden analysiert. Es treten dabei nun entweder homozygote AB, homozygote Wik oder
heterozygote AB/Wik Embryonen auf.
Von den PCR-Ergebnissen der Embryonen wurde die Anzahl der Wik-Allele ermittelt und der
prozentuale Anteil der Wik-Allele zur Gesamtallelzahl errechnet. Je geringer dieser Prozentsatz
ist, desto weniger Rekombinationen haben zwischen Marker und Mutation stattgefunden und
desto näher liegt der Marker an der Mutation.
Die Berechnung der Rekombinationsfrequenz (FR) in % wurde über die Anzahl der Wik-Allele
in einer bestimmten Anzahl von Mutantenembryonen durchgeführt, wobei ein Prozent 1 cM
entspricht.
Es wird davon ausgegangen, dass Crossing-over bei gepaarten Chromosomen rein zufällig
auftreten und sich nicht gegenseitig beeinflussen.
Formel zur Bestimmung der Rekombinationsfrequenz, wie sie in vorliegender Arbeit
angewendet wurde:
2 x (homozygote Wik-Embryonen) + heterozygote Wik/AB-Embryonen
FR (%) = x 100
2 x (Anzahl der gesamt getesteten Embryonen)
Dieses Vorgehen wird in Abb. 6.62. verdeutlicht, wo am Beispiel des Markers z22270 der
Mutante minibries eine solche Auswertung an 8 ausgewählten Embryonen gezeigt wird.
98

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
M 1 2 3 4 5 6 7 8 M
Abb. 6.62.
Darstellung der Einzelembryoanalyse am Marker z22270 der minibries-Mutante und Berechnung der
Rekombinationsfrequenz. In Spur 1, 2, 5, 7 und 8 tritt eine homozygote AB-Bande auf und in Spur 3 eine
homozygote Wik-Bande. In Spur 4 und 6 sind beide Banden der heterozygoten AB/Wik-Embryonen zu erkennen
und zusätzlich eine hochmolekulare Bande, die wahrscheinlich einem Heteroduplex aus den beiden verschiedenen
Fragmenten entspricht.
Die Einzelembryoanalyse wurde mit allen Markern durchgeführt, die bei der Poolanalyse als
gekoppelt identifiziert werden konnten.
Die Analyse wurde zuerst jeweils mit den 48 Embryonen, die für den Mutanten-DNA-Pool
benutzt wurden, durchgeführt. Mit den Markern, die am nächsten zur Mutation liegen wurden
mit weiteren 96 Mutantenembryonen Einzelembryoanalysen durchgeführt, um die
Prozentangaben der Einzelembryoanalysen der 48 Embryonen zu bestätigen und die Entfernung
noch genauer zu bestimmen.
Durch die erhöhte Anzahl der Embryonen können die natürlichen Schwankungen verringert und
die Genauigkeit der Rekombinationsfrequenz-Angaben gesteigert werden.
Bei der Einzelembryoanalyse musste berücksichtigt werden, dass die eingekreuzten Wik-Fische
von beiden Mutanten jeweils für einen Teil der Marker kein vom AB-Allel unterscheidbares
Allel (“Allel-Sharing”) trugen, bzw. heterozygot für ein Wik- und ein AB-Allel waren. Deshalb
konnten nur die Marker ausgewertet werden, bei denen innerhalb eines Geleges Fische mit
homozygoten Wik-Banden auftraten. Nur in diesem Fall ist sicher gestellt, dass das Gelege aus
einer Kreuzung von zwei heterozygoten AB/Wik-Fischen entstanden ist.
Es konnte so der Bereich bestimmt werden, in dem die Mutation der briesle- und der minibries-
Mutanten liegen muss. Bei beiden Mutanten konnte der Ort der Mutationen näher eingegrenzt
werden.
99
Berechnung von FR am Beispiel
der 8 gezeigten Embryonen:
2 x (1) + 2
FR = x 100 = 25%
2 x (8)

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
6.8.3.1. Briesle
Bei der Einzelembryoanalyse der briesle-Mutante stammten die Gelege der 48 Mutantenembryonen
und der 96 Mutantenembryonen vom gleichen Elternpaar.
In Abb. 6.63. sind alle Marker aufgeführt, mit denen die Analyse durchgeführt wurde.
Marker Position FR aus 48 FR aus 96 FR aus 48 und nicht auswert-
(cM) Embryonen Embryonen 96 Embryonen bar, da nicht
zusammen homozygot Wik
z10456 35.7 35,4% --- --z14143
74.3 26% --- --z23491
63.8 48
z31983 52.3 10,4% 14,1% 12,8%
z3804 61.5 11% 9,4% 9,9%
z7339 47.4 48
z7685 48+96
z9871 51.1 7,4% 12,5% 10,8%
Abb. 6.63.
Zusammenfassung der Einzelembryoanalysen der briesle-Mutante.
Mit den fett markierten Markern konnte eine eindeutige Prozentzahl der Rekombinationsfrequenz ermittelt werden.
Bei den kursiv gedruckten Markern ergaben sich keine homozygoten Wik-Genotypen. Nicht verwertbar waren die
Ergebnisse der Marker z11496, z1454, z21290, z6371, z7428.
Wie schon oben erwähnt, musste bei der Auswertung berücksichtigt werden, dass der Wik-Fisch,
der eingekreuzt wurde, nicht für alle Marker homozygote Wik-Allele besaß.
Deshalb konnte nur bei den Gelegen, bei denen bei der Einzelembryoanalyse mindestens ein
Fisch mit einem homozygoten Wik-Genotyp identifiziert werden konnte, eindeutig die
Rekombinationsfrequenz nach 6.8.3. errechnet werden. Dadurch wurde sicher gestellt, dass das
Gelege von einem Elternpaar stammt, das je ein Wik-Allel trägt. Diese Marker sind in Abb. 6.63.
fett markiert.
Traten keine homozygoten Wik-Genotypen auf, so konnte die Rekombinationsfrequenz nur
näherungsweise errechnet werden und war somit für die Bestimmung des Ortes der Mutation
unbrauchbar. Diese Marker sind kursiv gedruckt.
100

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
6.8.3.2. Minibries
Für die Bestimmung der Rekombinationsfrequenz über die Einzelembryoanalyse wurden bei der
minibries-Mutante Embryonen aus Gelegen von zwei verschiedenen Pärchen benutzt.
Marker Position FR aus 48 FR aus 96 nicht auswertbar,
(cM) Embryonen Embryonen da nicht
homozygot Wik
z11148 44.4 9,3% --z15045
48+96
z22270 44.4 9,3% --- 96
z24511 27.9 --- 7,3% 48
z34962 22.4 --- 8,8%
Abb. 6.64.
Darstellung der Rekombinationsfrequenzen der Marker für die Mutante minibries.
Die fett markierten Primer ergaben ein eindeutig auswertbares Ergebnis, da bei der Einzelembryoanalyse
homozygote Wik-Genotypen auftraten. Bei den kursiv gedruckten Daten ergaben sich keine homozygoten Wik-
Embryonen. Nicht verwertbar waren die Marker z1068, z1634, z170, z21115, z25335, z7819.
Auch bei der minibries-Mutante enthielt der zugehörige Wik-Fisch, mit dem der AB-Träger für
das Mapping ausgekreuzt wurde, nicht zwei Wik-Allele sondern für einen Teil der Marker
jeweils ein Wik- und ein AB-Allel.
Bei den fett markierten Markern traten homozygote Wik-Genotypen auf, so dass bei diesen
Markern ein eindeutig auswertbares Ergebnis zustande gekommen ist.
Anhand dieser Ergebnisse konnte der Bereich um die Mutation eingegrenzt werden.
6.8.4. Haplotypanalyse
Durch die Einzelembryoanalysen im vorausgegangenen Abschnitt 6.8.3. konnte der Abstand
zwischen Marker und Mutation berechnet werden. Durch die Haplotypanalyse kann nun
zusätzlich die genaue Orientierung der Marker zur Mutation ermittelt werden.
Bei der Haplotypanalyse wird die Chromosomenstruktur der einzelnen Embryonen genauer
analysiert. Durch das unterschiedliche Auftreten von Wik- und AB-Bereichen kann der Bereich
des Chromosoms ermittelt werden, in dem das Crossing-over stattgefunden haben muss.
Zusätzlich können durch diese Methode einzelne Embryonen ermittelt werden, die für spätere
Schritte mit neuen Markern in der Feinkartierung noch zu gebrauchen sind, da sie in dem
Bereich des Crossing-overs nur AB-Allele besitzen.
101

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
Dazu wird der Haplotyp (Wik/Wik, Wik/AB oder AB/AB) der Marker von jedem einzelnen
Embryo aus der Einzelembryoanalyse in der Reihenfolge der Marker, wie sie auf dem
Chromosom lokalisiert sind, in ein Diagramm eingetragen. Der AB-Bereich des Chromosoms,
der von beiden Seiten von Wik-Allelen umgeben ist, enspricht dem Ort der Mutation.
6.8.4.1. Briesle
In Abb. 6.65. wird ein Auszug aus der Haplotypanalyse anhand einzelner Embryonen gezeigt,
die durch Rekombinationen entstanden sind und identifiziert werden konnten.
Bei der briesle-Mutante ergibt sich dadurch der Bereich zwischen den Markern z31983 und
z3804, in dem sich die Mutation befinden muss.
Marker mit cM-Angabe
Embryonen z10456 z9871 z31983 z3804 z14143
35.7 51.1 52.3 61.5 74.3
F5 x x x x x
o o o x x
D3 o o o x x
o o o o o
A5 x x x o o
o o o o o
Abb. 6.65.
Auszug der Haplotypanalyse der briesle-Mutante. Es werden verschiedene Chromosomen der Embryonen gezeigt,
die durch Rekombinationen entstanden sind. Der Bereich, in dem sich die Mutation befinden muss, liegt zwischen
den Markern z3804 und z31983. o: AB-Allel, x: Wik-Allel
6.8.4.2. Minibries
Ein Auszug aus der Haplotypanalyse der minibries-Mutante (s. Abb. 6.66.) demonstriert
verschiedene Chromosomen mit unterschiedlichen Rekombinationen. Die Haplotypanalyse der
minibries-Mutante zeigt, dass sich die Mutation zwischen den Markern z24511 und z22270
befinden muss.
102

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
Marker mit cM-Angabe
Embryonen z34962 z24511 z22270
22.4 27.9 44.4
D1x x o
o o o
H2 o o x
o o o
G3 x o o
o o o
C6 x x x
o o x
Abb. 6.66.
Auszug der Haplotypanalyse der minibries-Mutante. Es werden verschiedene Embryonen gezeigt, die durch
Rekombinationen entstanden sind. Der Bereich, in dem sich die Mutation befindet, liegt zwischen den Markern
z24511 und z22270. o: AB-Allel, x: Wik-Allel
6.9. Zusammenfassung der Mappingergebnisse
Wie in den Abschnitten 6.8.1. bis 6.8.3. beschrieben wurde, konnte bei der briesle- und der
minibries-Mutante die Kopplungsgruppe bestimmt und der Ort der Mutation näher eingegrenzt
werden.
Die Zusammenfassung dieser Ergebnisse wird in den Abbildungen 6.67. und 6.68. mit Angabe
der cM-Werte und die ermittelten Rekombinationsfrequenzen für die einzelnen Marker gezeigt.
Die Mutation der briesle-Mutante liegt auf LG5 im Bereich zwischen den Markern z31983 und
z3804. Dieser Bereich beinhaltet einen Abschnitt von 9,2 cM.
Die Mutation der minibries-Mutante befindet sich auf LG8. Der Abstand der flankierenden
Marker z24511 und z22270 beträgt 16,5 cM.
103

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
LG5 LG8
cM cM
0 0
35.7 - z10456: 35,4% 22.4 - z34962: 8,8%
51.1 - z9871: 13,5%
52.3 - z31983: 12,8% 27.9 - z24511: 7,3%
9.2
61.5 - z3804: 9,9% 16.5
74.3 - z14143: 26% 44.4 - z22270: 9,3%
104-114-X 88-98-X
164 142
Abb. 6.67. Abb. 6.68.
Briesle-Mutante, LG5. Minibries-Mutante, LG8.
Schematische Zusammenfassung der Mappingergebnisse. Schematische Zusammenfassung der Ergebnisse.
Die Eingrenzung des Bereiches, in der sich die Mutation Der Bereich, in dem die Mutation zu finden ist, ist fett
befindet, ist fett markiert. Die Lage des Zentromers ist markiert. Die Lage des Zentromers ist mit einem roten
mit einem roten X markiert und die cM-Angabe X markiert und die cM-Angabe nach Johnson et al.
nach Johnson et al. (1996) dazu notiert. (1996) mit angegeben.
6.10. Kanditatengenanalyse
Aufgrund der Mappingergebnisse der briesle- und minibries-Mutante konnte die Lage der
Mutationen auf der Kopplungsgruppe bestimmt werden, wie in den Abbildungen 6.67. und 6.68.
zusammengefasst ist.
Obwohl das endgütlige Ziel dieser Arbeit darin bestand, neue, noch nicht bekannte Gene zu
identifizieren, ist es trotzdem möglich, dass die Mutationen in Genen stattgefunden haben, deren
Sequenz und Funktion bereits bekannt sind.
Deshalb wurden im Rahmen dieser Arbeit Gene ermittelt, die sich in der eingegrenzten Region
der Mutation befinden und eine Funktion ausüben, bei deren Ausfall ein Phänotyp entstehen
könnte, den die isolierten Mutanten des Screens aufweisen.
104

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
Mit Hilfe verschiedener Webseiten, in denen Genorte mit SSLP-Markern korreliert aufgezeigt
werden wie http://wwwmap.tuebingen.mpg.de und http://134.174.23.167/zonrhmapper/maps.htm
konnte für beide Mutanten je ein Kandidatengen ermittelt werden.
Die Analyse der Gene wurde auf genomischer Ebene durchgeführt, indem aus dem Mutanten-
DNA-Pool, der für die Mapping-Poolanalyse benutzt wurde, die Kandidatengene amplifiziert
und die PCR-Fragmente sequenziert (5.1.10.) wurden. Dadurch konnte die Exon-Intron-
Grenzen-Struktur des Gens untersucht werden, was durch die Sequenzierung der entsprechenden
cDNA nicht möglich ist.
Gleichzeitig wird dadurch das Problem umgangen, dass mutierte cDNA eventuell degradiert
wird und somit die cDNA mit der Mutation nicht mehr amplifiziert werden kann.
Im Falle dieser Arbeit lassen sich die Mutantenembryonen erst nach einer ISH von den
WT-Embryonen unterscheiden. Nach einer ISH-Prozedur kann jedoch keine intakte mRNA mehr
aus den Mutantenembryonen isoliert werden, um sie anschließend zu amplifizieren und
sequenzieren. Um intakte mRNA zu erhalten, müsste deshalb die RNA von einem ganzen
Gelege zweier heterozygoter Fische präpariert werden. Dadurch würde jedoch die WT- wie auch
die Mutanten-mRNA isoliert.
Wird nun aus diesem Pool cDNA hergestellt und diese mit Primern für das Kandidatengen
amplifiziert und sequenziert, so können die Daten wegen der oben erwähnten Problem unter
Umständen nicht mehr sinnvoll ausgewertet werden.
Deshalb wurden in dieser Arbeit die Exon-Sequenzen der Kandidatengene aus genomischer
DNA amplifiziert und die PCR-Fragmente sequenziert. Dabei wurde jeweils von der Exon-
Intron-Struktur der Maussequenz ausgegangen und von dieser Primer aus der jeweiligen
Zebrafisch cDNA-Sequenz abgeleitet.
6.10.1. Cathepsin L, das Kandidatengen der briesle-Mutante
Das Kandidatengen, das bei der briesle-Mutante identifiziert wurde, ist Cathepsin L. Es befindet
sich auf Chromosom 5, an der Position 54.7 cM.
Cathepsin L ist wichtig für den Abbau der invarianten Kette (Ii-Kette) in den Epithelzellen des
Thymuscortex (Nakagawa et al. 1998). Die Ii-Ketten sind für den Transport von
neusynthetisierten MHCII-Molekülen an die Zelloberfläche notwendig und werden anschließend
wieder abgebaut.
Die mögliche Exon-Intron-Struktur des Zebrafisch-Cathepsin L wurde von der Maussequenz
(NM009984) und Menschsequenz (M20496) abgeleitet. Davon ausgehend wurden Primer aus
der Referenz-Sequenz aus dem Alignment der Zebrafisch-Cathepsin L-Sequenzen AW153879,
AW134154, AW153582, AW174883, AW421582, AW419903, AW280988, BE016767,
AW454288, AI354203, AW116484, AW154342, AW154163, AW281727, AI545568 abgeleitet,
105

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
mit denen fast alle Exons aus dem Mutanten-DNA-Pool intronübergreifend amplifiziert werden
konnten.
ATG TGA
1 2 3 4 5 6 / 8
1 2 4 7 13 8 12
Abb. 6.69.
Schematische Darstellung der Exon-Intron-Struktur des Zebrafisch-Cathepsin L-Gens mit den erwarteten 8 Exons
und den eingezeichneten Primern, die für die Amplifizierung und Sequenzierung benutzt wurden. Grau schattierte
Bereiche in Exon 4, 5 und 7 entsprechen nicht analysierten Gensequenzen.
: Sense-Primer, : AS-Primer
Es konnten die kompletten Exons 2, 3, 6 und 8, sowie ein Großteil der Exons 4 und 5 erfolgreich
amplifiziert und sequenziert werden. Dabei konnten keine Basenunterschiede zur Referenz-
Cathepsin L-Sequenz identifiziert werden. Auch die jeweiligen Sequenzen der Exon-Intron-
Grenzen stimmten mit der WT-Sequenz von AG-Exon-GT überein.
Von Exon 4 konnten die letzten 22 Basen am 3´-Ende sowie die zugehörige Exon-Intron-
Struktur, von Exon 5 die ersten 31 Basen am 5´-Ende mit der zugehörigen Exon-Intron-Struktur
und das Exon 7 mit beine Exon-Intron-Grenzen nicht sequenziert und analysiert werden (s. 9.3.).
6.10.2. Pim1, das Kandidatengen der minibries-Mutante
Das Gen, welches bei der minibries-Mutante als Kandidatengen in Frage kommt, ist pim1.
Pim1 ist eine Serin/Threonin-Kinase, die für die β-Selektion der T-Zellen benötigt wird (Pearson
et al. 2000) und befindet sich auf Chromosom 8 bei 30.3 cM.
Die vermutete genomische Struktur der Zebrafisch pim1-Sequenz wurde von der, aus 6 Exons
bestehenden, Maus-Gensequenz abgeleitet (M13945). Anhand der erhaltenen Exon-Intron-
Struktur wurden Primer aus der Zebrafisch pim1-cDNA-Sequenz (AF062643) generiert.
Mit den in Abb. 6.70. gezeigten Primern konnte das gesamte Gen mit allen Exons und Introns
amplifiziert und sequenziert werden.
Die Sequenzierung der erhaltenen Fragmente ergab, dass im Zebrafischgenom im pim1-Gen ein
Exon mehr (entspricht Exon 4/5 in Abb. 6.70.) als in der Maus vorhanden ist. Das Exon 4/5 des
Zebrafisch ist aus dem 3´-Bereich des Exons 4 und dem 5´-Bereich des Exons 5 der Maus
zusammengesetzt (s. 9.1.).
106

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
ATG TGA
1 2 3 4 4/5 5 6
1 3 5 4 7 6 18 9 13 10
Abb. 6.70.
Schematische Darstellung der Exon-Intron-Struktur des Zebrafisch-pim1-Gens mit den 7 Exons und den
eingezeichneten Primern, die für die Amplifizierung und Sequenzierung benutzt wurden.
: Sense-Primer, : AS-Primer
Die Ergebnisse der Sequenzierung ergaben, dass alle Exon-Intron-Grenzen korrekt mit der
Sequenz AG-Exon-GT vorhanden sind.
Die Exons 1, 2, 3, 4/5, 5 und 6 stimmen mit der Referenz-Zebrafisch-pim1-cDNA-Sequenz
weitestgehend überein. Es treten vereinzelt andere Basen auf, die jedoch keine Änderung der
Funktion des Proteinsequenz ergeben (s. 9.1. und 9.2.).
In Exon 4 ist die 70. Base des Exons, ein G, durch ein T ersetzt. Dies ergibt eine Änderung des
Tripletts von GTA nach TTA, was zu einer Änderung der Aminosäure (AS) von Valin nach
Leucin bewirkt. Dieser AS-Austausch dürfte jedoch keine Beeinträchtigung des Proteins
bewirken. Beide gehören zu den hydrophoben AS, besitzen ähnliche Seitenketten und die
veränderte AS dürfte somit zu keiner gravierenden Änderung der Proteinstruktur führen. Auch
scheint das Valin mit den umgebenen AS in der Evolution nicht konserviert worden zu sein, so
dass davon ausgegangen werden kann, dass das Valin keine grundlegend spezifische Funktion
für das Protein besitzt und somit ein solcher AS-Austausch keine gravierenden Folgen hat.
In Exon 4 tritt eine weitere Änderung der Sequenz auf. An Position 126 kann die Base G und an
Position 127 die Base C ermittelt werden. In der Zebrafisch-Referenz-cDNA-Sequenz werden
die Positionen jedoch bei 126 mit C und bei 127 mit G angegeben, was eine Veränderung des
Tripletts von CGT nach GCT ergibt und eine Änderung der AS von Arginin nach Alanin
bewirkt. Die Vermutung liegt hier nahe, dass in der cDNA-Referenz die beiden Basen vertauscht
worden sind.
107

6. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________
6.11. Überlebensfähigkeit von homozygoten Mutantenfischen
Um zu testen, ob homozygote Mutantenfische über das Embryonalstadium hinaus überleben und
das adulte Stadium erreichen können, wurden je zwei Merkmalsträger aus der AB/Wik-F1-
Generation (s. 6.8.) miteinander gekreuzt und das Gelege großgezogen. Bei minibries erfolgte
die Aufzucht bei 28,5°C. Bei der briesle-Mutante wurden die Embryonen bis Ende d1.0 bei
28,5°C, ab Ende d1.0 bis Ende d5.0 bei 31,5°C und ab d6.0 bei 28,5°C gehalten. Im Alter von
etwa 3 Monaten wurde von den einzelnen Fischen DNA durch “Fin-Clips” präpariert und davon
je mit den zwei am nächsten zur Mutation liegenden Markern eine PCR-Reaktion (s. 5.1.21.7.)
durchgeführt.
Tritt bei einem Embryo bei beiden Markern nur die AB-Bande auf, so ist er für beide Marker
homozygot AB und es handelt sich sehr wahrscheinlich um einen, bezüglich der Mutation,
homozygoten Trägerfisch.
Diese Analyse konnte bei der briessche-Mutante nicht durchgeführt werden, da es nicht möglich
war, die Mutation zu kartieren und dadurch keine flankierenden Marker der Mutation vorhanden
waren.
6.11.1. Briesle
Es wurde die DNA von 35 Fischen präpariert und die PCR mit den flankierenden Primern
z31983 und z3804 durchgeführt. Die Gelanalyse zeigte, dass bei keinem der Fische bei beiden
Markern je Homozygotie für das AB-Allel auftritt.
Da von 35 Fischen kein homozygoter Trägerfisch das adulte Stadium erreicht, muss die
Mutation der briesle-Mutante eine Verkürzung der Lebensdauer bewirken, die sehr
wahrscheinlich auf einen Defekt des Immunsystems zurückzuführen ist. Die T-Zellen können
sich nicht normal entwickeln und somit keine ausreichende Immunfunktion ausüben.
6.11.2. Minibries
Die Überlebensfähigkeit der minibries-Mutanten wurde an 35 Fischen mit den flankierenden
Markern z24511 und z22270 getestet.
Bei 5 Fischen trat bei beiden Markern je nur die Bande des AB-Allels auf, so dass diese, für die
Mutation, homozygote Trägerfische sein müssen, die das adulte Stadium erreicht haben. Es muss
dabei jedoch in Betracht gezogen werden, dass aufgrund des relativ großen Abstandes der zwei
Marker von 16,5 cM ein Doppel-Crossing-over möglich ist, der die Anzahl an homozygoten
Fischen leicht verfälschen kann.
Diese Anzahl von 14,3% überlebenden homozygoten Individuen lässt jedoch vermuten, dass die
Mutation der minibries-Mutante keinen großen Einfluss auf die Lebensdauer der Fische hat.
108

7. Diskussion
_____________________________________________________________________________
7. Diskussion
7.1. Thymusscreen
Die Suche nach Thymusmutanten wurde in der vorliegenden Arbeit an gynogenetisch diploiden
Embryonen durchgeführt, die mit Hilfe der Early Pressure-Methode generiert wurden, wie in
Streisinger et al. (1981) näher beschrieben ist. Diese Vorgehensweise ermöglicht im Vergleich
zum klassischen Zwei-Generationen-Screen eine Verkürzung des Screens um eine
Generationsdauer. Durch die Einwirkung des hydrostatischen Druckes auf die noch sehr jungen
Embryonen können jedoch in einem Gelege bis zu 20% der Embryonen geschädigt werden
(Driever et al. 1994). Dadurch können auch Deformationen im Kopfbereich entstehen, durch die
sich die Thymi nicht normal entwickeln können.
Aus diesem Grund wurden im vorliegenden Screen beim ersten Screendurchgang (s. Abschnitt
6.1.) nur solche Gelege weiterbearbeitet, bei denen mehr als 20% der Embryonen eines Geleges
einen Thymusmutantenphänotyp aufweisen. Somit wurde weitestgehend vermieden, dass
vermeintliche Phänotypen isoliert wurden, die nicht durch eine Mutation sondern durch
Artefakte aufgrund der Early Pressure-Methode induziert worden sind.
Durch dieses Vorgehen jedoch können Mutationen, die sich weit weg vom Zentromer befinden,
nicht erfasst werden, da bei diesen der Prozentsatz an Mutantenphänotypen unter 20% liegen
kann. Zum Beispiel sind nur 3% der Embryonen eines Early Pressure-Geleges einer
heterozygoten golden-Mutante homozygot (Streisinger et al. 1986). Zur Erklärung ist folgendes
zu bedenken: je weiter weg sich eine Mutation vom Zentromer befindet, desto größer ist die
Wahrscheinlichkeit eines Crossing-overs zwischen Zentromer und Mutation und desto geringer
wird die Anzahl der Mutanten in einem Gelege sein.
In vorliegender Arbeit wurde deshalb in Kauf genommen, dass nicht alle möglichen
vorhandenen Mutanten isoliert werden können; es wurde dadurch vermieden, eine große Anzahl
an Artefakt-Mutanten unnötigerweise weiter zu bearbeiten.
Die Mutagenisierung der Zebrafische für den Screen wurde mit ENU durchgeführt. Dies führt zu
Punktmutationen in den Spermatogonien und somit zu nicht-mosaiken Nachkommen, die in der
folgenden Generation leicht auffindbar sind (Solnica-Krezel et al. 1994).
Die Insertionsmutagenese, bei der die mutierten Sequenzen anschließend durch die
Sequenzierung der flankierenden Bereichen einfach identifiziert werden können, wurde nicht für
den vorliegenden Screen benutzt. Diese Art der Mutagenese ist beim Zebrafisch zwar möglich
(Lin et al. 1994), jedoch ist sie bisher zu wenig etabliert, so dass sie für diese Arbeit nicht in
Betracht kam.
Die Mutagenese von Spermien, wie z. B. mit 4,5,8-Trimethyl-Psoralen und UV-Strahlung (Ando
et al. 1998) bringt den großen Nachteil mit sich, dass dadurch mosaike Individuen entstehen und
die Mutanten in der folgenden Generation sehr schwer wieder auffindbar sind. Diese Form der
Mutagenese wurde aus diesem Grund in vorliegender Arbeit nicht angewendet.
109

7. Diskussion
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Der Screen wurde, wie oben erwähnt, an gynogenetisch diploiden Embryonen durchgeführt.
Eine weitere Möglichkeit einen verkürzten Screen durchzuführen, ist die Verwendung von
haploiden Embryonen, die durch Befruchtung von Eiern der F1-Weibchen mit UV-inaktivierten
Spermien entstehen. Haploide Embryonen entwickeln zwar anfänglich noch die Grundstruktur
des Körpers, jedoch entstehen nach etwa 2 Tagen sehr gravierende Defekte, wie ein kurzer
Schwanz, ein deformiertes Notochord und Ödeme. Sie sterben schon nach etwa 4 Tagen, da die
späteren Entwicklungsstadien nicht normal ablaufen (Streisinger et al. 1981). Haploide
Embryonen sind deshalb nur für Sreens nach Defekten in frühen Stadien nützlich und somit für
einen Thymusscreen an 5 Tage alten Embryonen, wie er in vorliegender Arbeit durchgeführt
wurde, nicht geeignet.
Für die Identifizierung der Mutanten wurden Hybridisierungen an Gesamtembryonen, sog.
whole mount in situ Hybridisierungen, an 5 Tage alten Embryonen mit einer rag1-AS-Sonde
durchgeführt. Rag1 wird in der Embryogenese erst spät ab ca. 92 hpf exprimiert (Willett et al.
1997), so dass mit dieser Sonde nicht nur frühe Mutanten sondern auch späte Defekte isoliert
werden können. Ein weiterer Vorteil ist die Robustheit der Sonde, mit der sehr starke und
deutliche Signale produziert und somit Thymusmutanten leicht identifiziert werden können.
Bei der Durchführung des Screens wurden anfänglich 1413 F1-Weibchen für den ersten
Screendurchgang benutzt. Davon ergaben sich jedoch nur von 281 Weibchen Gelege, die einer
rag1-ISH unterzogen wurden und von denen die Färbungen ausgewertet werden konnten. Dafür
gibt es mehrere Gründe, die dieses Ergebnis näher erläutern können.
Da sich die Dauer des Screens über ein Jahr erstreckte, wurden auch die F1-Weibchen
entsprechend älter und es ließen sich aus diesem Grund die Eier immer schlechter gewinnen. Zu
Beginn des Screens waren die Fische ca. 12 Monate alt und es konnte eine Erfolgsrate beim
Abstreifen der Eier von 40-60% erreicht werden. Diese ist jedoch nach etwa. einem halben Jahr
zuerst allmählich und dann stark auf bis zu nur mehr 10% gesunken. Das Ende der Fruchtbarkeit
von Zebrafischweibchen, welche sich auch in der Produktion von Eiern widerspiegelt, ist nach
etwa 2 Jahren erreicht (Westerfield M. 1995).
Konnten die Eier eines Weibchens ausgestrichen werden, so konnte es trotzdem passieren, dass
eine Auswertung des Geleges nicht möglich war. Gründe dafür waren zu kleine Gelege,
schlechte Qualität der Eier, die somit nicht für eine Befruchtung tauglich waren oder dass
während des Druckes der French-Press ein Teil der Eier zerstört wurde. Ebenfalls führten das
Absterben von einem Teil der Embryonen bis zum Tag 5 und das Auftreten von einer
unterschiedlichen Anzahl an nicht brauchbaren, haploiden Embryonen nach der
Druckeinwirkung zur Reduktion der Embryonen eines Geleges.
Werden diese Faktoren zusammengefasst, so wird deutlich, dass sich auch bei den erfolgreich
abgestreiften Weibchen die Anzahl der Embryonen stark verringern kann, so dass bei einigen
F1-Fischen eine eindeutige Auswertung des Geleges nach einer rag1-ISH aufgrund zu weniger
Embryonen nicht mehr möglich war. Nach der ISH sollten noch etwa 40-50 Embryonen
110

7. Diskussion
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vorhanden sein, damit aus statistischen Gründen eine eindeutige Aussage über den Phänotyp
getroffen werden kann.
Von F1-Weibchen, von denen anfangs genügend befruchtete Eier vorhanden waren, die jedoch,
wie oben beschrieben, im Laufe des Screens reduziert wurden oder die Färbung nach der ISH
nicht ausgewertet werden konnte, wurden die Eier nochmals ausgestrichen. Dabei konnte nicht
von allen F1-Weibchen beim zweiten Mal die Eier gewonnen werden.
Bei F1-Weibchen, die beim ersten Mal nicht abstreifbar waren oder die unreife Eier enthielten,
wurde noch einmal versucht, die Eier auszustreichen. Dieser wiederholte Vorgang war jedoch in
den wenigsten Fällen erfolgreich, da von vielen Weibchen des ersten Durchgangs auch beim
weiteren Versuch keine oder keine brauchbaren Eier isoliert werden konnten.
Somit kann festgehalten werden, dass die Ausbeute von weiteren Screendurchgängen mit
F1-Weibchen, die beim ersten Screendurchgang keine Eier oder Eier von schlechter Qualität
ergaben, sehr gering ist und sich diese wiederholten Squeezversuche im Verhältnis zum
Aufwand nicht besonders lohnen.
Von den 281 F1-Weibchen wurde bei 25 Weibchen ein mutmaßlicher Thymusmutantenphänotyp
gefunden. Diese 25 F1-Weibchen wurden im Rescreen eingesetzt, um den Phänotyp wiederholt
zu identifizieren und somit Artefakte auszuschließen. Im Rescreen konnten die drei Mutanten
briesle, minibries und briessche bestätigt werden.
Weshalb nur 3 der 25 Mutanten bestätigt werden konnten, könnte einerseits daran liegen, dass in
Gelegen, bei denen die Anzahl der Mutanten knapp über 20% lag, die Phänotypen durch die
Einwirkung des Druckes entstanden sind und beim zweiten Durchgang deshalb nicht
wiedergefunden werden konnten.
Es ist ebenfalls denkbar, dass sich nicht alle Embryonen eines Geleges synchron entwickeln und
sich somit Embryonen mit geringen Entwicklungsunterschieden in einem Gelege befinden. Da
die ersten lymphoiden Zellen erst nach 65 hpf im Thymusprimordium auftreten und sich der
Thymus in Fischen im Alter von 4-5 Tagen noch stark im Wachstum befindet (Willett et al.
1999), sind bei gering unterentwickelten Embryonen Thymi mit weniger T-Zellen vorhanden.
Dadurch entsteht eine veränderte rag1-Färbung, was zu der falschen Annahme führen kann, dass
es sich dabei um Mutantenembryonen handelt.
Beim Fixieren der Embryonen wurde zwar darauf geachtet, dass sie sich alle im gleichen
Entwicklungsstadium befinden, so dass offensichtliche frühe Defekte ausgeschlossen werden
können. Jedoch sind Embryonen im Stadium von ca. d4.0-d5.0 nicht immer eindeutig zu
unterscheiden, so dass sie äußerlich zwar gleich erscheinen, die Thymi sich jedoch noch in
unterschiedlichen Entwicklungsstadien befinden. Ein geringer Entwicklungsunterschied in
diesem Altersbereich ist jedoch schon ausreichend, damit dies zu unterschiedlich starken ISHrag1-Signalen
führt.
111

7. Diskussion
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Dieser Anteil von ca. 1% echten Mutanten, die im Screen im Verhältnis zu den auswertbaren
Gelegen isoliert werden konnten ist jedoch durchaus als normal zu betrachten, da auch schon in
einem anderen, vergleichbaren Screen (N.Trede, mündliche Mitteilung) ebenfalls 1% Mutanten
im Rescreen wiedergefunden wurden.
Die Anzahl an isolierten Mutanten kann sehr unterschiedlich sein, je nachdem, nach welchen
Kriterien die Mutanten isoliert werden. In Mullins et al. (1994) wurden in einem ENU-
Pilotscreen z. B. 16% Mutantenembryonen mit Gehirn-Nekrosen und 1% Mutanten mit Defekten
in der Muskelentwicklung identifiziert.
Die isolierten Phänotypen der drei Mutanten sind einander sehr ähnlich. Die Thymi der
Mutantenembryonen weisen nach der ISH mit rag1 eine schwächere Färbung als im WT-
Embryo auf.
Im durchgeführten Screen konnte bei normaler Aufzuchttemperatur keine Null-Mutante isoliert
werden, bei der keine rag1-Färbung im Thymus mehr nachzuweisen ist.
Punktmutationen, wie sie durch ENU induziert werden, können stille, Nonsense- oder Missense-
Mutationen hervorrufen. Stille Mutationen bewirken keine Änderung der Aminosäure (AS),
Nonsense-Mutationen führen zu einem Stop-Codon und Missense-Mutationen führen zu einem
veränderten spezifischen Triplett und somit zu einem AS-Austausch (Knippers 1997). Missense-
Mutationen führen oftmals zu einem Genprodukt, das nur noch ein Teil seiner Aktivität besitzt,
was somit zu einem schwächeren hypomorphen Phänotyp anstelle eines Null-Phänotyps führt
(Mullins et al. 1994).
Andererseits ist deshalb ein schwacher Phänotyp immer ein guter Hinweis auf eine
Punktmutation. Auch Mullins et al. (1994) fanden in ihrem ENU-Screen von 50 isolierten
Mutanten 16 Mutanten mit einem schwachen Phänotyp, so dass das häufige Auftreten von
hypomorphen Mutanten in der vorliegenden Arbeit durchaus den Erwartungen eines ENU-
Screens entspricht.
Dass im vorliegenden Screen jedoch keine Null-Mutanten isoliert werden konnten, liegt
sicherlich an statistischen Gründen aufgrund der geringen Anzahl von insgesamt drei Mutanten.
7.2. Charakterisierung der Mutanten
Die isolierten Thymusmutanten wurden, wie in 6.3. beschrieben, zuerst auf Temperatursensitivität
getestet.
Dies ist eine geeignete Methode, um Phänotypen zu verstärken oder überhaupt einen
Mutantenphänotyp entstehen zu lassen, der bei normaler Aufzuchttemperatur von 28,5°C nicht
zum Vorschein kommt.
Dabei wurde die Temperaturstabilität des betroffenen Proteins bei einer Temperatur von 31,5°C
überprüft. Durch die erhöhte Temperatur kann die veränderte Aminosäure zu einer falschen
Faltung des Proteins führen und das Protein dadurch die Funktion nur noch in weiter
abgeschwächter Form oder gar nicht mehr ausüben.
112

7. Diskussion
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Nur briesle zeigte ein positives Ergebnis durch die Veränderung des hypomorphen Phänotyps
zum Null-Phänotyp, bei dem im Thymus eines 5 Tage alten Embryos keine rag1-Färbung mehr
zu erkennen ist.
Das Hauptaugenmerk beim Test auf Temperatursensitivität liegt auf der Auswirkung der
Mutation auf das Protein. Eventuelle Auswirkungen auf die betroffene mRNA sind nicht in
Betracht gezogen worden, da es sehr unwahrscheinlich ist, dass auf Grund einer veränderten
Base die mRNA durch eine erhöhte Temperatur degradiert wird. Im Gegensatz dazu ist es sehr
viel wahrscheinlicher, dass sich ein Protein aufgrund einer veränderten Aminosäure falsch faltet
und seine Funktion schlechter oder nicht mehr ausüben kann.
Die Temperatursensitivität einer Mutante ist eine weitere Bestätigung dafür, dass es sich um eine
tatsächliche Mutation handelt, die im exprimierten Protein bei erhöhter Temperatur zu einer
geringeren Stabilität führt und es sich nicht um einen methodischen Artefakt handelt.
Es ist jedoch nicht notwendig, dass eine Mutante temperatursensitiv sein muss, um als “echte”
Mutante bestätigt zu werden.
Die Thymi der drei Mutanten wurden anhand histologischer Schnitte einer näheren Betrachtung
unterzogen (6.4.2.). Dabei ließ sich der Thymus als eine Anhäufung von Zellen erkennen. Bei
den WT-Fischen der drei Mutanten befindet sich dort eine große Anzahl von Zellen, in den
jeweiligen Mutantenfischen hingegen nur noch wenige.
Die meisten Zellen im Zebrafischthymus sind nach einer HE-Färbung stark gefärbt, so dass
ziemlich sicher angenommen werden kann, dass es sich dabei um T-Lymphozyten mit einem
großen Zellkern handelt, die sich im Thymus zwischen den Epithelzellen befinden (Willett et
al.1997). Der positiv geladene Farbstoff Hämalaun färbt selektiv den Kern von Zellen an,
wodurch eindeutig im Thymus der Mutantenfischen eine geringere Anzahl an T-Lymphozyten
identifiziert werden konnten.
Diese reduzierte Anzahl von T-Zellen in den Thymi der Mutantenembryonen spiegelt die
hypomorphen Phänotypen, die im Screen mit der rag1-Sonde isoliert werden konnten, wieder.
Die Vermutung, dass es sich dabei um T-Zellen handelt, kann jedoch anhand dieser Schnitte
nicht näher überprüft werden, so dass zur endültigen Identifizierung der einzelnen Zellen
Schnitte der Thymi unter dem Elektronenmikroskop (EM) analysiert werden müssten.
Diese EM-Analyse ist jedoch erst dann vom Aufwand her vertretbar, wenn die Mutanten vorher
durch Genotypisierung identifiziert werden können, was erst ganz zum Schluss vorliegender
Arbeit möglich gewesen wäre und somit nicht mehr durchgeführt wurde.
Um zu testen, ob bei den drei Mutanten dasselbe Gen betroffen ist, wurde eine
Komplementationsanalyse durchgeführt. Beim Auskreuzen von heterozygoten Trägern der drei
Mutanten untereinander und anschließender ISH mit rag1 konnten nur WT-Embryonen isoliert
werden, so dass angenommen werden kann, dass es sich um drei verschiedene
Komplementationsgruppen handelt.
Es ist jedoch nicht ausgeschlossen, dass, wenn verschiedene Bereiche des gleichen Gens der drei
Mutanten betroffen sind, sich die Defekte im Protein wieder aufheben können, wodurch daraus
kein Phänotyp entsteht. Dies ist jedoch relativ unwahrscheinlich und es ist die Regel, dass sich
113

7. Diskussion
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zwei Mutationen im selben Gen nicht aufheben (Winnier et al. 1999). Somit kann angenommen
werden, dass bei den drei Mutanten unterschiedliche Gene betroffen sind.
Die drei Thymusmutanten briesle, minibries und briessche, die im Screen isoliert werden
konnten, wurden anschließend näher charakterisiert, um herauszufinden, welche Komponente
der Thymusentwicklung, wie zum Beispiel T-Zellentwicklung, Thymusepithelentwicklung oder
Entwicklung der Neuralleistenzellen, betroffen ist. Dazu wurden Versuche durchgeführt, die
diese Aspekte näher beleuchten, da die Interaktionen von Mesoderm, Endoderm und Ektoderm
für die Entwicklung des Thymus notwendig sind.
Die Notwendigkeit des Schlundendoderms für die Bildung des Thymusrudiments wurde schon
durch die Inaktivierung von pax9 in Mäusen gezeigt, wodurch eine schwere Störung der
Thymusentwicklung hervorgerufen wird (Peters et al. 1998).
Bei allen drei Mutanten konnte mit den Sonden pax9a und Gata3, die für die Entwicklung des
Schlundendoderms essentiell sind, keine Auffälligkeit gefunden werden (s. 6.6.1.). Da nur zwei
Sonden für diesen Aspekt in vorliegender Arbeit benutzt wurden, ist anzunehmen, dass die
Entwicklung des Schlundendoderms und somit des Thymusepithels nicht gestört ist. Jedoch
müssten zusätzliche Marker, die mit in die Entwicklung des Schlundendoderms involviert sind,
wie z. B. Gata5 (Reiter et al. 2001), getestet werden, um diese Beobachtung weiter zu bestätigen.
Die Schwierigkeit dieser Analyse liegt jedoch in der geringen Zahl an spezifischen Markern für
das Zebrafischendoderm.
Spezifische Marker für das Zebrafisch-Thymusepithel wären ein idealer Bestandteil der
Charakterisierung, da sie genauere Aufschlüsse über die Entwicklung der Thymusepithelzellen
geben könnten. In der Maus konnte das sogenannte whn-Gen (winged-helix-nude) identifiziert
werden, das spezifisch im Thymusepithel exprimiert wird und unentbehrlich für die
Differenzierung der Thymusepithelzellen ist. In nude-Mäusen, in denen whn mutiert ist und zu
einer “Loss-of-function” Mutation führt, ist nur noch ein Thymusrudiment zu beobachten (Nehls
et al. 1996).
Das whn-Homolog im Zebrafisch konnte bereits kloniert werden (Schlake et al.1997), jedoch
konnte bisher noch keine spezifische Expression im Thymusepithel nachgewiesen werden.
Zum Zeitpunkt dieser Arbeit existierten noch keine Marker, die spezifisch am
Zebrafischthymusepithel eingesetzt werden konnten, so dass auf diese Analyse verzichtet werden
musste.
Die Inaktivierung von Genen, die für die frühe T-Zellentwicklung wichtig sind, kann zu
schweren Störungen in der Embryonalentwicklung führen. Die Inaktivierung von Gata3 in der
Maus zum Beispiel führt zum Tod der Embryonen im frühen Embryonalstadium (Ting et al.
1996).
Für die Hämatopoese und die Entwicklung zur T-Zelllinie standen die Marker SCL, Ikaros,
Gata3 und rag1 zur Verfügung (s. 2.6.). Diese wurden ausgewählt, da sie für die Differenzierung
zu bestimmten spezifischen Entwicklungsstadien notwendig sind (6.6.2.).
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7. Diskussion
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Da für den Zebrafisch noch keine Standard T-Zell-Marker, wie z. B. CD4 oder CD8 vorhanden
sind, ist es nicht möglich die lymphoiden Zellen im Thymus definitiv der T-Zelllinie
zuzuordnen. Jedoch spricht die Expression von Gata3 und rag1 sehr stark dafür, dass diese
Zellen der T-Zelllinie angehören. In einem vergleichbaren Screen von Trede et al. (2001) spricht
noch zusätzlich die Expression von TCRα (T-Zell Rezeptor α) für diese Annahme.
Beim frühesten Marker SCL konnte bei den drei Mutanten bei einer ISH mit 20,5 h alten
Embryonen kein Phänotyp entdeckt werden. Es kann somit angenommen werden, dass die frühe
Hämatopoese nicht gestört ist (6.6.2.1.).
Mit den Markern Ikaros und Gata3 an 5 Tage alten Embryonen zeigte sich bei 28,5°C bei allen
drei Mutanten dasselbe Bild wie beim Screen mit der rag1-Sonde, mit der bei einer
Aufzuchttemperatur von 28,5°C ein schwächerer Phänotyp identifiziert werden konnte.
Aus diesen Ergebnissen kann die Schlussfolgerung gezogen werden, dass sich sehr
wahrscheinlich weniger T-Lymphozyten im Thymus der Mutantenembryonen befinden und
dadurch die Färbung im Vergleich zu den WT-Fischen schwächer wird.
Bei der temperatursensitiven Mutante briesle erschien beim Mutantenphänotyp bei einer
Aufzuchttemperatur von 31,5°C bei rag1 und Gata3 keine Färbung mehr im Thymus. Bei der
ISH mit Ikaros hingegen wurde die Färbung der Mutantenfische bei 31,5°C zwar schwächer als
bei 28,5°C, jedoch war sie noch deutlich im Thymus erkennbar.
Beim Vergleich der Mutantenembryonen bei 31,5°C nach der ISH mit Ikaros und Gata3 konnte
beobachtet werden, dass bei der Ikaros-Färbung T-Lymphozyten in der Umgebung des Thymus
detektiert werden konnten und dass diese bei der Gata3-Färbung weitestgehend nicht mehr
nachzuweisen waren. Dies lässt vermuten, dass es sich bei der Mutation der briesle-Mutante um
einen intrinsischen lymphoiden Defekt handelt, der die Differenzierung von Ikaros-positiven zu
Gata3-positiven T-Lymphozyten beeinflusst.
Aufgrund der Temperatursensitivität konnte bei der briesle-Mutante die zusätzliche Information
erhalten werden, dass ein Teil der Prothymozyten zwar noch in den Thymus einwandern kann,
dass jedoch die späteren Stadien der T-Zell-Entwicklung nicht mehr erreicht werden und die
T-Lymphozyten sehr wahrscheinlich im Thymus absterben.
Um darüber eine genauere Aussage treffen zu können, müsste z. B. anhand eines TUNEL-
Assays die Anzahl der apoptotischen Zellen im Thymus bestimmt werden.
Aus den Ergebnissen der transversalen Schnitte in 6.4.2. von WT- und Mutantenembryonen, die
keiner ISH unterzogen worden waren und aus der Charakterisierung der Mutanten mit Markern
für die T-Zellentwicklung in 6.6.2. kann gefolgert werden, dass bei normaler
Aufzuchttemperatur von 28,5°C die schwächere Färbung der Ikaros-, Gata3- und rag1-AS-
Sonde durch eine geringere Anzahl an T-Lymphozyten im Thymus entsteht.
Ob der Grund dafür in einer gestörten T-Zell- oder Thymusepithelentwicklung liegt, kann jedoch
mit den Methoden und der Anzahl der Marker, die in dieser Arbeit verwendet wurden, nicht
geklärt werden. Was jedoch ausgeschlossen werden kann, sind Defekte in der frühen
Blutentwicklung und in der frühen Endodermentwicklung.
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7. Diskussion
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Im ersten Stadium der Thymusentwicklung wandern Neuralleistenzellen, die vom
Neuroektoderm abstammen, zur 3. und 4. Schlundtasche, wo sie mit dem Endoderm interagieren.
Dieser Vorgang ist unentbehrlich für die Entwicklung des Thymusprimordiums. Im Hühnchen
zum Beispiel führt ein Verlust der Neuroektodermzellen zu einem athymischen Phänotyp
(Bockman et al. 1984). Ähnliche Ergebnisse lieferten Versuche an pax3-defizienten Mäusen, in
denen eine defekte Neuralleistenzellmigration zu Thymusdefekten führt (Conway et al. 1997,
Franz et al. 1989).
Da die Entwicklung der Schlundbögen auf intakte Neuralleistenzellen und intaktes Endoderm
angewiesen ist, ist die Untersuchung der Mutanten auf abnormale Schlundbögen angebracht, da
die Fehlentwicklung ein Grund dafür sein könnte, dass die anfängliche Bildung des
Thymusrudiments gestört ist.
Für die Ermittlung eines Defekts in der Entwicklung der Neuralleistenzellen wurde jeweils eine
ISH mit der Sonde dlx3 durchgeführt (6.6.3.1.), die in den Knorpeln der Kiemenbögen
nachweisbar ist. Die Ergebnisse der ISH-Färbungen ergaben keine Phänotypen, bei denen eine
veränderte Expression von dlx3 aufgetreten ist. Um diese Aussage weiter zu bestätigen, wäre es
notwendig, die Mutanten mit weiteren Markern für die Entwicklung der Neuralleistenzellen, wie
z. B. mit crestin (Luo et al. 2001) zu testen.
Mit Hilfe einer Anfärbung mit Alcianblau, das Glykosaminoglykane färbt, konnten die gesamten
Knorpelstrukturen im Kopf- und Kieferbereich der drei Mutanten analysiert werden. Dabei
wurde überprüft, ob die allgemeine Entwicklung der Kopfskelettstrukturen gestört ist, so dass
außer dem Thymus auch noch andere Bereiche von der Mutation in ihrer Entwicklung betroffen
sind. Wäre dies der Fall, so würden die Mutanten keinen spezifischen Defekt in der
Thymusentwicklung aufweisen und wären für den weiteren Verlauf der Arbeit nicht besonders
interessant. Diese Analyse wurde durchgeführt, obwohl beim Fixieren der Embryonen schon auf
normale morphologische Entwicklung geachtet wurde, denn die exakte Betrachtung der Kiemenund
Kieferbögen ist erst dann möglich, wenn sie durch eine Anfärbung deutlich sichtbar gemacht
werden.
Nach Durchführung der Alcianblaufärbung konnte eindeutig ermittelt werden, dass die Kiemenund
Kieferbögen und das Zungenbein der drei Mutanten keine Defekte aufweisen und diese
Ergebnisse somit darauf hindeuten, dass es sich bei den Mutantenphänotypen um spezifische
Defekte in der Thymusentwicklung handeln muss.
Die transversalen Schnitte der Thymi der 5 Tage alten Embryonen der Ikaros-gefärbten
Embryonen in 6.6.2.2. ergaben eine zusätzliche interessante Beobachtung. Obwohl in der
Literatur beschrieben ist, dass im Thymus von Zebrafischen im Alter von bis zu einem Monat
noch keine Aufteilung in Cortex und Medulla vorhanden ist (Willett et al. 1997), erscheinen die
frühen T-Lymphozyten in den Schnitten vorliegender Arbeit eher im äußeren Bereich des
Thymus. Diese Beobachtung kann auch an den whole mount ISH-Embryonen gemacht werden,
bei denen die Ikaros-Färbung nicht zentral, wie die rag1-Färbung, vorkommt, sondern mehr
wolkig und großflächiger erscheint.
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7. Diskussion
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Dies lässt vermuten, dass sich die eingewanderten Prothymozyten im äußeren Bereich des
Thymus aufhalten, obwohl noch keine Auftrennung des Thymus in Cortex und Medulla
vorhanden ist.
Diese Aufteilung ist vergleichbar mit dem Vorkommen von Prothymozyten im Säugerthymus, in
dem sich die unreifen T-Zellen im Cortex befinden und erst im Laufe der Reifung in die Medulla
wandern (Übersicht in Moroy et al. 2000).
Die Charakterisierung der Mutanten in der vorliegenden Arbeit wurde anhand von wenigen
ausgewählten Markern und Merkmalen durchgeführt und muss als Annäherung an eine
gesamtheitliche Charakterisierung betrachtet werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nicht auf
alle Aspekte eingegangen werden, die als Ursache für das Auftreten der vorhandenen
Phänotypen in Betracht gezogen werden könnten.
Dazu gehört z. B. der Aspekt der Chemokine, wie beispielsweise TECK (Thymus expressed
chemokine) bei Säugern, die die Prothymozyten anlocken und dazu führen, dass sie in den
Thymus einwandern (Bleul et al. 2000). Chemokine sind im Zebrafisch bisher noch wenig
untersucht. Da jedoch bereits die Existenz von Chemokinen beim Zebrafisch nachgewiesen
werden konnte (Long et al. 2000), ist die Wahrscheinlichkeit sehr groß, dass ebenfalls
Chemokine vorhanden sind, die für das Homing der T-Lymphozyten in den Thymus
verantwortlich sind.
Ist die Produktion der verantwortlichen Chemokine und somit das Homing der Prothymozyten
gestört und wandern dadurch weniger T-Lymphozyten in den Thymus ein, könnten ebenfalls
Phänotypen entstehen, wie sie in vorliegender Arbeit isoliert wurden.
Mit der Durchführung des Screens dieser Arbeit sollten Mutanten mit gestörter
Thymusentwicklung isoliert werden, um dadurch neue Gene identifizieren zu können, die für die
Organogenese des Thymus notwendig sind.
Aus der Gesamtheit aller Ergebnisse der Charakterisierung konnte jedoch im Rahmen
vorliegender Arbeit bei den Mutanten minibries und briessche kein Hinweis darauf gefunden
werden, ob tatsächlich die Entwicklung des Thymusepithels behindert wird, die zu den
jeweiligen Mutantenphänotypen führt, oder ob der Defekt in anderen Bereichen der Entwicklung
liegt. Anhand der Ergebnisse ist eine gestörte Thymusepithelentwicklung jedoch auch nicht
auszuschließen, so dass bei der detaillierteren Weiterführung der Charakterisierung Hinweise für
eine solche Mutation gefunden werden könnten.
Bei der briesle-Mutante kann anhand der Ergebnisse durch die Temperatursensitivität vermutet
werden, dass die Auswirkung der Mutation das Entwicklungsstadium der T-Lymphozyten nach
der Ikaros-Expression und vor der Gata3-Expression betreffen muss und es sich sehr
wahrscheinlich um einen intrinsischen lymphoiden Defekt handelt.
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7. Diskussion
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7.3. Kartierung
Im Jahre 1994 wurde erstmals von Postlethwait et al. (1994) die erste genetische Karte mit
ungefähr 400 Markern in insgesamt 29 Kopplungsgruppen (LG) erstellt. Weitere Analysen
erbrachten der Karte insgesamt 652 Marker, die auf 25 Kopplungsgruppen vereinigt werden
konnten, was der Anzahl an Chromosomen des Zebrafisches entspricht (Johnson et al. 1996).
Shimoda et al. (1999) veröffentlichten im Jahre 1999 eine genetische Karte mit schon 2000
Markern und durch die ständige Zunahme der Markerdichte können immer mehr Marker auf der
genetischen Karte des Zebrafisches definiert werden, die unter http://zfin.org aktualisiert
aufgelistet sind und daraus entnommen werden können.
Um die Effizienz der genetischen Kartierung zu maximieren, wurde von Haffter und anderen der
hochpolymorphe Wik-Stamm in den ursprünglichen Hintergrund, in dem sich die Mutation
befindet, eingekreuzt (zitiert nach Beier 1998).
Dieses Vorgehen wurde auch beim Kartieren der 3 Mutanten dieser Arbeit gewählt, um eine
möglichst hohe Anzahl an polymorphen Markern zu erhalten, die für das Kartieren nützlich sind.
Der erste Schritt der Kartierung in vorliegender Arbeit bestand in der Grobkartierung durch die
Poolanalyse mit 240 SSLP-Markern, die über das gesamte Genom verteilt vorkommen (6.8.1.).
Die Verwendung der SSLP-Markern ist sehr hilfreich, da sie hoch polymorph sind. Codominante
SSLP-Allele, Allele, die in heterozygoten Tieren gleichermaßen detektierbar sind,
vereinfachen zusätzlich die Analyse von diploiden Kreuzungen (Postlethwait et al. 1997).
Durch diese Analyse konnte der briesle-Mutante die Kopplungsgruppe 5 und der minibries-
Mutante die Kopplungsgruppe 8 zugeordnet werden. Bei beiden Mutanten konnten je 4 eindeutig
gelinkte Marker isoliert werden.
Dieses Ergebnis bestätigt die Ergebnisse der Komplementationsanalysen, bei denen die
Kreuzungen von je einem heterozygoten Träger der briesle- und minibries-Mutante keine
Besonderheiten nach der ISH mit rag1 ergaben. Somit kann angenommen werden, dass die
beiden Mutationen auf verschiedenen Chromosomen liegen müssen.
Mit den Markern des Panels zur Grobkartierung konnte für die briessche-Mutante kein Ergebnis
erzielt werden, das eindeutig die Kopplung von bestimmten Markern zur Mutation zeigt. Die
Vermutung auf Kopplung für die Kopplungsgruppen 5, 6, 9 und 20 durch nicht sehr eindeutige
Ergebnisse konnte nicht bestätigt werden.
Beim nächsten Schritt des Mappings, der Feinkartierung, wurden neue Marker der zugeordneten
Kopplungsgruppen der Mutanten zuerst anhand der Poolanalyse überprüft, ob weitere Marker an
die Mutation gekoppelt sind (6.8.2.), womit das Ergebnis der Grobkartierung weiter bestätigt
werden konnte.
Bei der Feinkartierungs-Analyse der briessche-Mutante wurden von den 4 Kopplungsgruppen,
die nach der Grobkartierung in Betracht kommen könnten, weitere Marker bezogen und diese
der Poolanalyse unterzogen. Dadurch konnte jedoch ebenfalls keine eindeutige
Kopplungsgruppe ermittelt werden.
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7. Diskussion
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Weitere Kopplungsgruppen kamen für die Feinkartierung aufgrund der Ergebnisse der
Grobkartierung nicht in Betracht, so dass die Mutation der briessche-Mutante bislang keinem
Chromosom zugeordnet werden konnte.
Für die Identifizierung der betroffenen Kopplungsgruppe müsste ein anderes Primer-Panel mit
neuen Markern erstellt und damit die Grobkartierungsanalysen wiederholt werden.
Von der Gesamtzahl der Marker, die für die Kartierungsanalysen eingesetzt wurden und die
dadurch für die Auswertung benutzt werden konnten, waren etwa 60% der Marker polymorph.
Nach Beier (1998) sind bei einer Kreuzung eines AB-Fisches mit einem IN(India)-Fisch (Knapik
et al. 1996) 40-50% der Marker polymporph, so dass die 60% an polymorphen Markern in
vorliegender Arbeit durchaus einem zu erwartenden Prozentsatz entspricht.
Um die genetische Distanz der gekoppelten Marker zur Mutation bestimmen zu können, wurden
Einzelembryoanalysen (s. 6.8.3.) mit den Markern, die in der Grob- und Feinkartierung isoliert
werden konnten, durchgeführt.
Werden dafür 1000 haploide Embryonen benutzt, so können genetische Marker definiert werden,
die bis zu nur mehr 0,1 cM voneinander getrennt sind, was einem physikalischen Abstand von
ca. 60 kb entspricht (Postlethwait el al. 1994).
In vorliegender Arbeit wurden bis zu 144 diploide Einzelembryonen für die Ermittlung des
Abstandes benutzt, so dass der geringstmöglich zu berechnende Abstand bei 0,35 cM liegt.
Die Auswertung der Einzelembryoanalyse (6.8.3.) wurde jedoch dadurch erschwert, dass jeweils
der ausgewählte polymorphe Wik-Fisch, der zuvor mit heterozygoten Trägern von briesle und
minibries gekreuzt wurde, nicht für alle Marker zwei Wik-Allele, sondern zum Teil ein Wik- und
ein AB-Allel besaß.
Das bedeutet, dass die Ergebnisse der Einzelembryoanalyse eines Geleges nur eindeutig
ausgewertet werden konnten, wenn bei einem Fisch ein homozygoter Wik-Genotyp aufgetreten
ist. Denn nur dann ist gewährleistet, dass das Gelege aus der Kreuzung von zwei heterozygoten
Fischen entstanden ist und der Abstand der Marker zur Mutation über die
Rekombinationsfrequenz berechnet werden kann.
Tritt bei einem Marker bei der Einzelembryoanalyse kein homozygoter Wik-Genotyp auf, so ist
die Distanz nicht zu bestimmen. Grund dafür ist, dass nicht sicher angenommen werden kann,
dass zwei, für diesen Marker heterozygote Träger miteinander gekreuzt wurden. Solche
Ergebnisse wurden deshalb nicht mit in den Ergebnisteil aufgenommen.
Bei Markern, die ganz eng an die Mutation gekoppelt sind, kann ebenfalls kein homozygoter
Wik-Genotyp auftreten, obwohl das Gelege aus zwei heterozygoten Trägern entstanden ist. In
vorliegender Arbeit war dies jedoch nicht der Fall, da die Analyse der am nächsten zur Mutation
liegenden Marker jeweils homozygote Wik-Genotypen ergaben.
119

7. Diskussion
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Das Mappingergebnis der briesle-Mutante ergab die Lage der Mutation auf Kopplungsgruppe 5
und eine Eingrenzung im Bereich von 52.3 und 61.5 cM, was einer Distanz von 9.2 cM
entspricht.
Die Mutation der minibries-Mutante befindet sich auf Kopplungsgruppe 8 zwischen zwei
Markern an den Positionen 27.9 und 44.4 cM. Dieser Bereich umfasst 16.5 cM (s. 6.9.).
Eine genauere Eingrenzung der beiden Mutanten in einen kleineren Bereich auf der jeweiligen
Kopplungsgruppe war nicht möglich. Weitere Marker, die sich in dem eingegrenzten Bereich
befanden und einen kleineren Abschnitt definieren könnten, ergaben keinen Polymorphismus
und konnten somit nicht für die Auswertung benutzt werden.
Eine Möglichkeit, dieses Problem zu umgehen wäre, wie in Förnzler et al. (1998) erwähnt wird,
polymorphe Marker selbst herzustellen, was jedoch im zeitlichen Rahmen der vorliegenden
Arbeit nicht durchzuführen war.
Für beide kartierten Mutationen konnten Kandidatengene ermittelt werden, welche sich ungefähr
auf den zu erwartenden Positionen befinden und deren Ausfall zu den vorhandenen Phänotypen
führen könnten: Cathepsin L für briesle und pim1 für minibries.
Cathepsin L liegt auf Chromosom 5 an der Position 54.7 cM und hat die Funktion, die li-Ketten,
die für den Transport von neusynthetisierten MHCII-Molekülen an die Zelloberfläche notwendig
sind, wieder abzubauen (Nakagawa et al. 1998). Ist dieser Abbauprozess gestört, so ist durchaus
vorstellbar, dass die wichtigen Interaktionen der T-Lymphozyten mit den MHCII-Molekülen für
die positive Selektion gestört werden, was zum Tod der T-Lymphozyten führen kann (Viret et al.
1999). Obwohl bei briesle ein Defekt in der Lymphozytenentwicklung vermutet wurde, kann
eine andere Ursache nicht 100%ig ausgeschlossen werden, und da Cathepsin L ein relevantes
Gen in der Nähe des Ortes der Mutation darstellte, wurde die Sequenzanalyse der Mutanten-
Cathepsin L-Gensequenz durchgeführt. Der letztendliche Beweis für einen intrinschen
lymphoiden Defekt kann nur über Transplantationsexperimente von Mutantenzellen in WT-
Embryonen erbracht werden, was im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht durchführbar war.
Durch die genomische Sequenzierung von Cathespsin L aus dem Mutanten-DNA-Pool der
briesle-Mutante, der auch für die Mappinganalysen benutzt wurde, konnte das Exon 2 ab dem
Start-Codon und die Exons 3, 6 und 8 komplett mit der Exon-Intron-Grenze sequenziert werden.
Exon 1 wurde nicht sequenziert, da sich das Start-Codon erst in Exon 2 befindet.
Ein kleiner 3´-Bereich des Exons 4 und ein kleiner 5´-Bereich von Exon 5 mit insgesamt 53
Basen Länge und die zugehörigen Exon-Intron-Grenzen, sowie das gesamte Exon 7 konnten
nicht sequenziert werden. Der Grund dafür könnte in der DNA-Struktur liegen, die das
Amplifizieren der DNA-Sequenzen und das Sequenzieren der Fragmente sehr erschwert.
Die erhaltenen Sequenzen wurden mit dem Alignment der Zebrafisch-Cathepsin L-Sequenz
verglichen (s. 9.3.). Die Sequenzierungen entsprachen dem Alignment, so dass in der DNA des
Mutanten-Pools keine Mutation gefunden werden konnte. Auch die Exon-Intron-Grenzen wiesen
die Sequenz AG-Exon-GT auf und entsprachen somit der WT-Sequenz. Da jedoch die
Sequenzierung der restlichen Sequenz des Gens noch aussteht, kann nicht ausgeschlossen
werden, dass sich eine Mutation im Gen von Cathepsin L befindet, die zu dem briesle-
Mutantenphänotyp führt.
120

7. Diskussion
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Pim1 befindet sich auf Chromosom 8 an der Position 30.3 cM und ist für die β-Selektion der
T-Zellen notwendig. Die β-Selektion ist ein Prozess, bei dem den T-Zellen, die eine erfolgreiche
Umlagerung der β-Kette abgeschlossen haben, eine Reifung zu doppelpositiven CD4 + /CD8 + -
Thymozyten erlaubt wird (Pearson et al. 2000).
Bei einer defekten β-Selektion kann die Reifung der T-Lymphozyten blockiert werden, so dass
dadurch der minibries-Phänotyp zustande kommen könnte.
Durch die genomische Sequenzierung von pim1 aus dem Mutanten-DNA-Pool der minibries-
Mutante, der auch für die Mappinganalysen benutzt wurde, konnten die Exons 1, 2, 3, 4, 4/5, 5
und 6 vollständig mit den Exon-Intron-Grenzen sequenziert werden.
Die erhaltenen Sequenzen wurden mit der Referenz-Zebrafisch-pim1-mRNA-Sequenz
(AF062643) verglichen und, wie in 6.10.2. beschrieben, stimmten alle Exon-Intron-Grenzen mit
der Sequenz AG-Exon-GT überein.
In Exon 4 tritt eine Änderung einer Base G nach T auf, was zu einem Austauch der AS Valin zu
Leucin führt. Dadurch ist jedoch keine besondere Auswirkung auf die Struktur und somit auf die
Funktion des Proteins zu erwarten, da Valin und Leucin zur Gruppe der hydrophoben AS
zugeordnet werden und beide eine sehr ähnliche Seitengruppe besitzen (Knippers 1997).
Auch bei der Suche nach konservierten Sequenzen, die dafür sprechen würden, dass das Valin in
der Evolution konserviert wurde und somit für eine Funktion des Enzyms wichtig sein müsste,
konnte nur wenige Hinweise dafür gefunden werden.
Für eine Blast-Suche unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov wurde mit der AS-Sequenz
PNEIALLQSLGGGSGSVPGHRGIIRMLDWFEIP nach weiteren AS-Sequenzen gesucht, in
denen in anderen Enzymen an vergleichbarer Stelle ein Valin vorhanden ist. In nur einem von 12
Treffern tritt an vergleichbarer Stelle ein Valin auf, so dass davon ausgegangen werden kann,
dass das Valin keine spezifische Funktion hat, die für das Enzym wichtig ist und somit eine
Veränderung des Valins zu Leucin keinen großen Einfluss auf das Enzym haben sollte.
Die umgekehrte Reihenfolge der Basen CG zu GC in Exon 4 ist sehr wahrscheinlich auf das
Vertauschen der beiden Basen in der Referenz-Sequenz zurückzuführen, da solch eine Art der
Mutation durch die ENU-Mutagenese sehr unwahrscheinlich ist. ENU führt vor allem zu
Mutationen des G in einer DNA-Sequenz (Mullins et al. 1994), wie auch bei der zuvor
beschriebenen Mutation in Exon 4 der Fall ist, so dass die Mutation von G nach C durchaus
möglich wäre. Jedoch ist die Wahrscheinlichkeit sehr gering, dass das benachbarte C zu einem G
mutiert ist und der Zufall dadurch viel zu groß, dass sich die Basen CG durch die
Mutagenisierung zu einem GC umgewandelt haben. Aus diesem Grund ist es sehr viel
wahrscheinlicher, dass die Basen in der Referenz-Sequenz vertauscht wurden.
Ein weiterer interessanter Aspekt, der an den isolierten Mutanten untersucht wurde, war die
Überlebensfähigkeit von homozygoten Mutantenembryonen.
Eine Möglichkeit, diese Fragestellung zu untersuchen wäre, zwei heterozygote Träger zu
kreuzen, die Embryonen großzuziehen, alle Fische einzubetten, diese zu schneiden und
anschließend die Thymi der Fische zu analysieren. Beim Großziehen von Embryonen, vor allem
in den ersten 3 - 4 Wochen, stirbt jedoch immer ein Anteil der Gelege. Deshalb kann in diesem
121

7. Diskussion
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Falle nicht unterschieden werden, ob das Absterben den normalen Anteil darstellt oder ob dies
homozygote, nicht lebensfähige Embryonen sind.
Werden die Fische des Geleges dann eingebettet, die geschnittenen Thymi analysiert und erhält
man dabei nur WT-Thymi, so kann über ein solches Ergebnis keine Aussage getroffen werden,
ob die homozygoten Mutantenfische alle tot sind oder ob sich ein früher Effekt eventuell in der
späteren Entwicklung wieder ausgleicht und der Thymus dadurch nur verzögert von Thymozyten
besiedelt wird.
Deshalb ist dieser Versuchsansatz erst dann sinnvoll, wenn das mutierte Gen kartiert ist und man
durch Genotypisierung die homozygoten Träger identifizieren kann. Anschließend besteht dann
die Möglichkeit, gezielt die Thymi der Mutantenfische zu analysieren, ob der Phänotyp auch
noch im adulten Stadium auftritt.
Dafür wurden je zwei Wik/AB-Träger gekreuzt, die Embryonen großgezogen und von den
Fischen im Alter von ca. 3 Monaten die DNA durch Fin-Clips präpariert.
Für die Identifizierung von homozygoten Mutantenfischen wurde je mit den zwei am nächsten
zur Mutation liegenden Markern eine PCR durchgeführt. Tritt bei beiden Markern einer Mutante
jeweils eine homozygote AB-Bande auf, so ist die Wahrscheinlichkeit sehr groß, dass es sich
dabei um einen erwachsenen Mutantenfisch handelt.
Diese Analyse konnte bei der briessche-Mutante nicht durchgeführt werden, da beim Mapping
keine naheliegenden Marker identifiziert werden konnten.
Das Ergebnis der briesle-Mutante zeigte keine Fische, die für beide Marker homozygote AB-
Banden ergaben, so dass diese Mutation sehr wahrscheinlich solch gravierende Defekte erzeugt,
dass die T-Zellen ihre Abwehrfunktion nicht mehr ausüben können und die Mutantenfische
dadurch nicht überlebensfähig sind.
Im Gelege der minibries-Mutante konnten 5 von 35 Fischen als Mutantenfische identifiziert
werden, was einem Anteil von 14,3% entspricht. Diese Mutation scheint die Funktion der
T-Zellen und somit der Immunabwehr nicht besonders stark zu beeinträchtigen, so dass noch ein
Großteil der mutmaßlichen Mutanten das adulte Stadium erreicht.
Durch die große genetische Distanz von 16,5 cM der zwei Marker, die sich am nächsten zur
Mutation der minibries-Mutante befinden, ist jedoch nicht auszuschließen, dass in diesem
Bereich ein Doppel-Crossing-over stattfindet und dadurch das Ergebnis nicht exakt der Anzahl
der tatsächlich vorkommenden Mutantenfischen entspricht. Da die Wahrscheinlichkeit eines
Doppel-Crossing-Overs jedoch nur ca. 0,7% beträgt ist es sehr unwahrscheinlich, dass das
Ergebnis dadurch stark verfälscht wurde.
122

7. Diskussion
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7.4. Schlussbetrachtung
Der Zebrafisch entwickelte sich in den letzten Jahren zu einem beliebten Vertebraten-
Modellorganismus, der sich bestens für die Durchführung von genetischen Screens eignet. In den
meisten der bisher durchgeführten Screens wurden Mutanten anhand von morphologischen
Merkmalen isoliert. Die vorliegende Arbeit jedoch zeigt die Durchführung eines Screens, in
welchem Mutanten mit Defekten in der Thymusentwicklung mit Hilfe einer spezifischen rag1-
Sonde erfolgreich isoliert werden konnten.
Die Resultate dieser Arbeit demonstrieren deutlich, dass der Thymus als Organ zur genetischen
Analyse überhaupt zugänglich ist. Anhand der drei isolierten Mutanten konnte gezeigt werden,
dass es möglich ist, Gene durch Mutation so zu verändern, dass sie zu einer Beeinträchtigung der
Thymusentwicklung führen.
Der Screen in vorliegender Arbeit diente als Pilotscreen für die Durchführung eines weiteren
Large-Scale-Screens nach Thymusmutanten an über 4000 Genomen. Durch den Large-Scale-
Screem konnte bereits eine große Anzahl an Mutanten isoliert werden, deren weitere Analyse
und die Identifizierung der betroffenen Gene noch aussteht.
Mit der Durchführung dieses Pilot-Screens konnte somit die Grundlage geschaffen werden,
weitere Thymusmutanten zu identifzieren. Die Analyse dieser Mutanten sowie die vollständige
Analyse der Mutanten, die in vorliegender Arbeit isoliert werden konnten, wird in den folgenden
Jahren die Identifizierung von vielen neuen und wichtigen Genen der Thymusentwicklung
ermöglichen. Somit ist der Grundstein für die Aufklärung der genetischen Programme in der
Thymusorganogenese gelegt worden, wodurch die Existenz von bisher unbekannten aber
relevanten Genen nachgewiesen werden kann, die eine Bereicherung auf diesem Gebiet der
Forschung darstellen werden.
123

8. Literaturverzeichnis
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133

9. Anhang
_____________________________________________________________________________
9. Anhang
9.1 cDNA-Sequenz des Zebrafisch-pim1-Gens
Nach AF062643: codierende pim1-Region. Die angegebene Sequenz wurde vollständig in
6.10.2. sequenziert:
1 ATG TTG GAC AAA CGG ATT GTT GAC GTG CGT TTG GAT CAG CTG
43 GAA ATC CTG AAA GCC AAA AAT G 1 / 2 GC AAA GAG CAT TTT GAG AAG
85 CAG TAT ACT ATG GGA AAT CTT CTG GGA AGC GGT GGT TTC GGT
127 TCA GTT TAC TCC GGG CAT CGG ATT TCA GAC GGA CAA AAG 2 / 3 GTT
169 GCT ATC AAA CAA ATA TCC CGA GAC AGA ATC CAA CAG TGG TCA
211 AAA ATG 3 / 4 CCT GGT GAA GTA AAC CCG GTT CCC AAT GAG ATT GCT
253 CTC CTG CAG AGT CTC GGT GGA GGA TCG GGG TCT GTA CCC GGC
T
295 CAT CGA GGC ATC ATC CGG ATG CTG GAC TGG TTT GAA ATA CCC
337 GGT CAG GAA TAC CTC ATT GTG TTT GAA AAG CCT CAA CAC TGC
379 CAG GAC CTG TTT GAC TTC ATC ACT GAA CGC GGA CGT CTT GAT
GC
421 GAG TCT CTT GCA CGG AG 4 / 4/5 G TTC CTC AAG CAA GTC ATT GAA GCT
463 GCT GTG CAG TTC TGC CAC TCT AAG GGA ATC GTT CAC AGA GAC
505 ATC AAG GAT GAA AAC ATC CTC GTT GAC ACT CGC ACT GGA GAC
547 ATT AAA GTC ATC GAT TTT GGA TCA GGA GCA ACG CTA AAG GAC
589 TCC ATG TAC ACT GAC TTT GAA G 4/5 / 5 GT ACC CGA GTC TAC AGT CCA
631 CCT GAG TGG ATC CTT TAC CAC AAA TAC CAC GCT CTT CCG CTC
673 ACT GTG TGG TCA TTG GGT GTC CTC CTG TAC GAT ATG GTG TGT
715 GGA GAC ATT CCC TTT GAG CAG GAC ACT GAC ATT GTA AAG GCC
134

9. Anhang
_____________________________________________________________________________
757 AAA CCA AGC TTC AAT AAA CGC ATC TCC AAT G 5 / 6 AT TGC CGG TCT
799 CTG ATT TGC TCG TGC CTT TCA TAC AAT CCG GGG GAT CGG CCC
841 AGT TTG GAG CAG ATT TTG CAG CAC CCC TGG ATG ATG GAG AGC
883 TCT GTG GAC AAT GGA GAT TTG CAA GAG GAA AGC AAA ATC AAA
925 CCA AGC CTT TGA
Abb. 9.1.
Basensequenz der kompletten Zebrafisch pim1-cDNA nach AF062643. Fett hervorgehoben sind die Unterschiede
zur Sequenz der minibries-Mutante (6.10.2.), die als einzelne Basen dargestellt sind.
Die roten Querstriche zeigen die Grenzen der Exons 1, 2, 3, 4, 4/5, 5 und 6 an.
9.2. Aminosäuresequenz des Zebrafisch-pim1-Gens
Nach AF062643:
MLDKRIVDVRLDQLEILKAKNGKEHFEKQYTMGNLLGSGGFGSVYSGHRISDGQKVAI
KQISRDRIQQWSKMPGEVNPVPNEIALLQSLGGGSGSVPGHRGIIRMLDWFEIPGQEYLI
L
VFEKPQHCQDLFDFITERGRLDESLARRFLKQVIEAVQFCHSKGIVHRDIKDENILVDTRT
A
GDIKVIDFGSGATLKDSMYTDFEGTRVYSPPEWILYHKYHALPLTVWSLGVLLYDMVC
GDIPFEQDTDIVKAKPSFNKRISNDCRSLICSCLSYNPGDRPSLEQILQHPWMMESSVDNG
DLQEESKIKPSL
Abb.9.2.
AS-Sequenz von Zebrafisch-pim1. Die AS, die in der minibries-Mutantensequenz verändert sind (6.10.2.), sind fett
markiert und die veränderte AS als einzelne AS dargestellt.
135

9. Anhang
_____________________________________________________________________________
9.3. cDNA-Sequenz des Zebrafisch-Cathepsin L-Gens
Cathepsin L-cDNA-Sequenz nach dem erstellten Alignment aus den Sequenzen AW153879,
AW134154, AW153582, AW174883, AW421582, AW419903, AW280988, BE016767,
AW454288, AI354203, AW116484, AW154342, AW154163, AW281727 und AI545568:
1 ATG AGG GTG TTC TTG GCT GCT TTT ACC TTG TGC CTC AGC GCT
GTG TTC GCT GCT CCT ACT TTA GAC CAG CAA TTA AAT GAT CAT
TGG GAT CAG TGG AAG AAA TGG CAC AGT AAA AAA TAC CAT GCA 2 / 3
ACA GAG GAA GGG TGG AGA AGG ATA ATC TGG GAG AAA AAC TTG
AAA AAG ATT GAA ATG CAC AAT CTG GAG CAC TCC ATG GGC ATA
CAC ACC TAC AGA CTC GGA ATG AAC CAC TTT GGA GAC ATG 3 / 4 ACT
CAC GAG GAG TTC AGA CAG GTG ATG AAT GGT TTC AAA CAC AAG
AAA GAC AGA CGA TTC AGA GGA TCC CTG TTC ATG GAG CCC AAC
TTC ATT GAG GTC CCA AAC AAG CTG GAC TGG AGA GAG AAG GGA
TAT GTG ACT CCT GTG AAA GAT CAG G 4 / 5 GG GAG TGT GGT TCT TGC
TGG GCT TTT AGC ACA ACC GGA GCC CTG GAG GGT CAG ATG TTC
AGG AAG ACT GGA AAA TTG GTG TCT TTG AGC GAG CAG AAC CTG
GTG GAC TGC TCC CGT CCT GAA GGC AAT GAG GGC TGC AAC GGA
GGT CTC ATG GAC CAG GCC TTC CAG TAT GTC AAG GAC CAG AAT
GGT CTG GAC TCT GAG GAA TCC TAC CCC TAC CTG GGA ACT 5 / 6 GAC
GAT CAG CCC TGC CAT TTT GAT CCC AAA AAC AGC GCA GCA AAT 6 / 7
GAC ACC GGA TTC GTT GAC ATT CCC AGT GGA AAG GAG CGT GCT CTG
ATG AAA GCT ATA GCT GCT GTG GGA CCT GTC TCT GTG GCT ATT GAT
GCT GGA CAT GAG TCT TTC CAG TTT TAC CAG TCA GGC ATC TAC TAT
GAG AAG GAG TGC AGC AGT GAG GAG CTG GAT CAT GGT GTT CTT GCG
GTC GGT TAT GGT TTT GAG GGT GAG GAT GTT GAT GGC AAG AAG TAT
TGG ATC GTC AAA AAC AG 7 / 8 C TGG AGT GAG AAC TGG GGC GAT AAA
GGA TAC ATC TAC ATG GCC AAG GAC AGA CAC AAT CAC TGT GGT
ATT GCT ACA GCA GCT AGC TAC CCT CTT GTT TAA
Abb.9.3.
Basensequenz der Cathepsin L-cDNA. Kursiv gedruckte Basen entsprechen nicht-sequenzierten Bereichen von
Cathepsin L aus der briesle-Mutante in 6.10.1.. Die restliche Sequenz konnte analysiert werden und stimmt mit der
Alignmentsequenz überein. Die roten Querstriche markieren die Grenzen der Exons 2-8.
136