Dokument 1.pdf - RWTH Aachen University
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III Material und Methoden 19<br />
Abkühlungszeit von 20 Minuten werden die Schnitte in PBS (Phophate buffered Saline<br />
Dulbecco’s, Life Technologies, Ltd. Paisley Scotland #14190-9) gespült und<br />
weiterbehandelt.<br />
Zum Abblocken von endogenen Peroxydasen werden die Schnitte 15 Minuten in 3%<br />
H2O2/ Methanol1 inkubiert und zweimal 5 Minuten in PBS gespült.<br />
Die Objektträger werden aus der Küvette genommen, die Gewebeschnitte mit einem<br />
Paraffinstift umkreist und in einer feuchten Kammer weiterbehandelt.<br />
Endogenes Avidin und Biotin werden durch jeweils 10 Minuten Inkubation mit Avidinund<br />
Biotinlösung (Vector Blockingkit, Vector Burlingame USA #SP-2001) blockiert.<br />
Beide Lösungen werden mit PBS abgespült.<br />
Unspezifischer Bindungsstellen werden durch Rattenserum (Sigma- Aldrich Chemie<br />
GmbH, Deisenhofen #S7648), welches 1:2 in PBS verdünnt wird, auf die Schnitte<br />
getropft. Die Inkubationszeit beträgt 30 Minuten in der feuchten Kammer. Das Serum<br />
wird anschließend abgeklopft.<br />
Der c-fos Primärantikörper (Calbiochem, Cambridge USA #HCS17) und ein<br />
unspezifischer Kaninchenantikörper (normales Kaninchen IgG, Calbiochem‚<br />
Cambridge USA #HCS17) als Negativkontrolle werden in einer Verdünnung von 1:100<br />
(1 µg/ml) für den c-fos Antikörper und 1:10 ( 10 µg/ml) für die Negativkontrolle in 1%<br />
BSA (Rinderserumalbumin Fraktion V Powder, Sigma-Aldrich Chemie GmbH,<br />
Deisenhofen #A2153)/PBS auf die Schnitte getropft. Als Positivkontrolle wird ein<br />
Schnitt mit humanem Kolonkarzinomgewebe (Calbiochem ‚ Cambridge USA #HCS17)<br />
mitgeführt. Die Inkubationszeit in der feuchten Kammer beträgt eine Stunde bei<br />
Raumtemperatur. Anschließend werden die Schnitte mit PBS abgespült und zweimal<br />
fünf Minuten in PBS/0.2% Tween 20 (aequous solution 10% (w/v), Böhringer<br />
Mannheim, #1332465) gespült.<br />
Ein Tropfen des biotinylierten Sekundärantikörpers (anti Rabbit IgG aus der Ziege,<br />
Calbiochem, Cambridge USA #HCS17) wird in 1 ml PBS verdünnt und eine Stunde bei<br />
Raumtemperatur in der feuchten Kammer auf den Schnitten inkubiert.<br />
1 Methanol Merck KGaA, Darmstadt
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