Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche - TiHo Bibliothek elib ...

Aus dem Institut für Pathologie
der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
und dem Zentrum für Systemische Neurowissenschaften Hannover
Experimentelle Infektion von
TNF-transgenen Mäusen mit dem
Virus der Bornaschen Krankheit –
Charakterisierung der Entzündungsreaktion
und der Virusreplikation
These zur Erlangung
des Grades eines
Doctor of Philosophy
-Ph.D.im
Fachgebiet Neurowissenschaften
Katharina Kramer

Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek
Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie;
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2006
© 2006 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen
Printed in Germany
ISBN 3-939902-19-5
Verlag: DVG Service GmbH
Frankfurter Straße 89
35392 Gießen
0641/24466
info@dvg.net
www.dvg.net

Aus dem Institut für Pathologie
der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
und dem Zentrum für Systemische Neurowissenschaften Hannover
Experimentelle Infektion von
TNFα-transgenen Mäusen mit dem
Virus der Bornaschen Krankheit –
Charakterisierung der Entzündungsreaktion
und der Virusreplikation
These
zur Erlangung des Grades eines
DOCTOR OF PHILOSOPHY
- Ph.D.-
im Fachgebiet
Neurowissenschaften
durch die Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Katharina Kramer
aus Hannover
Hannover 2006

Supervisor: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D.
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D.
Univ.-Prof. Dr. Claudia Grothe
Univ.-Prof. Dr. Andrea Tipold
1. Gutachter/in: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D.
Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
2. Gutachter/in: Univ.-Prof. Dr. Claudia Grothe
Institut für Neuroanatomie der Medizinischen Hochschule Hannover
3. Gutachter/in: Univ.-Prof. Dr. Andrea Tipold
Klinik für Kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover
4. Gutachter/in: Univ.-Prof. Dr. Felix Ehrensperger
Institut für Veterinärpathologie der Universität Zürich, Schweiz
Tag der mündlichen Prüfung: 20.10.2006
gefördert durch ein Georg-Christoph-Lichtenberg-Promotionsstipendium
des Zentrums für Systemische Neurowissenschaften Hannover

Meinen Eltern
und Geschwistern,
in Erinnerung an meine Oma Bill

Teile der hier vorliegenden Arbeit wurden bereits als Kongressbeiträge präsentiert bzw.
eingereicht:
Kramer K, Schaudien D, Marchetti L, Eisel U, Richt JA, Baumgärtner W, Herden C (2004).
Effect of TNFα-overexpression in the CNS of mice infected with the neurotropic Borna
Disease Virus. Acta Neuropathol, 108/4: 364
Kramer K, Porombka D, Schaudien D, Eisel U, Baumgärtner W, Herden C (2006).
Effect of TNF-overexpression on Borna disease viral spread in TNF-transgenic mice brains.
Posterabstrakt angenommen für die Jahrestagung der Deutsche Gesellschaft für
Neuropathologie und Neuroanatomie (DGNN) im Rahmen der Neurowoche 2006, Mannheim

Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ...................................................................................................... 1
2 Literaturübersicht........................................................................................ 3
2.1 Die Bornasche Erkrankung ...................................................................... 3
2.1.1 Experimentelle Infektion von Ratten..................................................................4
2.1.2 Experimentelle Infektion von Mäusen .............................................................10
2.1.3 Natürliche Infektion..........................................................................................14
2.1.4 Borna disease virus (BDV)...............................................................................17
2.2 Tumor Nekrose Faktor-α (TNF) ............................................................ 24
2.2.1 TNF und TNF- vermittelte Signalwege............................................................24
2.2.2 Funktionen des TNF im ZNS ...........................................................................26
2.2.3 Rolle des TNF bei viralen Erkrankungen.........................................................30
2.2.4 TNF-transgene Mausmodelle ...........................................................................31
3 Material und Methoden ............................................................................. 33
3.1 Mäuse ..................................................................................................... 33
3.1.1 Tierhaltung .......................................................................................................33
3.1.2 Analyse des transgenen Status der Mäuse mittels quantitativer Polymerase
Kettenreaktion (qPCR) .....................................................................................34
3.2 Viruspräparation..................................................................................... 37
3.3 Versuchsdurchführung und Versuchsablauf .......................................... 38
3.3.1 Infektion ...........................................................................................................40
3.3.2 Klinische Untersuchung und statistische Auswertung .....................................40
3.3.3 Probenentnahme und untersuchte Gehirnregionen...........................................42
3.4 Histopathologische Präparation ............................................................. 44
3.4.1 Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung ...................................................................44
3.4.2 Auswertung und Statistik .................................................................................44
3.5 Immunhistologie..................................................................................... 46
3.5.1 Antikörper und Seren .......................................................................................46
3.5.2 Protokolle der immunhistologischen Färbungen (ABC-Methode) ..................49
3.5.3 Kontrollen.........................................................................................................52
3.5.4 Auswertung und Statistik .................................................................................52
3.6 In situ Hybridisierung (ISH) .................................................................. 55
3.6.1 Sonden ..............................................................................................................55
3.6.2 Protokoll der in situ Hybridisierung (ISH).......................................................57
3.6.3 Kontrollen.........................................................................................................59
3.6.4 Auswertung und Statistik .................................................................................59
3.7 Doppelmarkierungen.............................................................................. 60
3.7.1 Immunhistologie und in situ Hybridisierung....................................................60
3.7.2 Kontrollen.........................................................................................................61
3.7.3 Auswertung.......................................................................................................61

II Inhaltsverzeichnis
3.8 Quantitative RT-Polymerase Kettenreaktion (qRT-PCR) .....................62
3.8.1 RNA-Isolierung................................................................................................ 62
3.8.2 Aufreinigung der RNA .................................................................................... 63
3.8.3 Reverse Transkription (RT) ............................................................................. 64
3.8.4 Primer und Sonden........................................................................................... 67
3.8.5 Standardreihen ................................................................................................. 69
3.8.6 Reaktionsansatz qRT-PCR .............................................................................. 69
3.8.7 Kontrollen ........................................................................................................ 71
3.8.8 Auswertung und Statistik................................................................................. 72
3.9 Serologische Untersuchung....................................................................73
3.10 Nachweis von infektiösem Virus ...........................................................74
4 Ergebnisse....................................................................................................75
4.1 Klinik......................................................................................................75
4.1.1 Krämpfe ........................................................................................................... 75
4.1.2 Gewichtsverlauf ............................................................................................... 77
4.1.3 Aktivität ........................................................................................................... 79
4.1.4 Lauf auf einem Gitter....................................................................................... 80
4.1.5 Lauf auf einem Plexiglasuntergrund................................................................ 82
4.1.6 Balancieren auf einem Stab.............................................................................. 83
4.1.7 Hängtest ........................................................................................................... 85
4.1.8 Radlauf............................................................................................................. 87
4.1.9 Weitere Tests.................................................................................................... 88
4.2 Charakterisierung der Virusreplikation..................................................89
4.2.1 Immunhistologischer Nachweis viraler Proteine im Gehirn............................ 89
4.2.2 Nachweis viraler RNA im Gehirn.................................................................... 96
4.2.3 Nachweis von infektiösem Virus im Gehirn.................................................. 112
4.3 Histopathologische Befunde.................................................................113
4.3.1 Enzephalitis.................................................................................................... 113
4.3.2 Degenerative Veränderungen......................................................................... 117
4.4 Nachweis infiltrierender Entzündungszellen .......................................118
4.5 Nachweis aktivierter Astrozyten und Mikroglia/ Makrophagen..........123
4.5.1 Nachweis aktivierter Mikroglia ..................................................................... 123
4.5.2 Nachweis aktivierter Astrozyten.................................................................... 126
4.6 Serologie...............................................................................................129
4.7 Untersuchung der Augen......................................................................131
4.7.1 Immunhistologie ............................................................................................ 131
4.7.2 In situ Hybridisierung .................................................................................... 132
4.7.3 Korrelation der immunhistologischen Ergebnissen mit den Ergebnissen
der in situ Hybridisierung .............................................................................. 133
4.7.4 Histopathologische Befunde .......................................................................... 133
4.8 Fotografische Dokumentation der Ergebnisse .....................................134

Inhaltsverzeichnis III
5 Diskussion.................................................................................................. 151
5.1 Charakterisierung der Virusreplikation................................................ 155
5.1.1 Immunhistologischer Nachweis viraler Proteine im Gehirn ..........................155
5.1.2 Morphologischer und qualitativer Nachweis viraler RNA im Gehirn ...........159
5.1.3 qRT-PCR zum Nachweis viraler RNA im Gehirn .........................................163
5.2 Nachweis von infektiösem Virus im Gehirn........................................ 166
5.3 Histopathologische Befunde ................................................................ 166
5.4 Nachweis infiltrierender Entzündungszellen ....................................... 168
5.5 Nachweis aktivierter Astrozyten und Mikroglia/ Makrophagen ......... 171
5.5.1 Aktivierte Mikroglia/ Makrophagen...............................................................171
5.5.2 Aktivierte Astrozyten .....................................................................................172
5.6 Serologie............................................................................................... 173
5.7 Histologische Untersuchung und Nachweis von BDV-spezifischen
Protein und RNA in den Augen ................................................... 174
6 Zusammenfassung.................................................................................... 177
7 Summary ................................................................................................... 181
8 Literaturverzeichnis................................................................................. 185
9 Anhang ...................................................................................................... 213
9.1 Tabellen................................................................................................ 213
9.1.1 Klinik..............................................................................................................213
9.1.2 Charakterisierung der Virusreplikation ..........................................................220
9.1.3 Histopathologische Befunde...........................................................................227
9.1.4 Nachweis infiltrierender Entzündungszellen..................................................229
9.1.5 Nachweis aktivierter Astrozyten und Mikroglia/ Makrophagen ....................230
9.1.6 Serologie.........................................................................................................234
9.2 Mäusehaltung ....................................................................................... 235
9.3 Lösungen und Puffer ............................................................................ 236
9.3.1 Immunhistologie.............................................................................................236
9.3.2 In situ Hybridisierung.....................................................................................236
9.3.3 RNA-Isolierung, RT-PCR, qRT-PCR und Gelelektrophorese.......................242
9.4 Bezugsquellen für Chemikalien und Antikörper ................................. 244
9.5 Bezugsquellen für Geräte und Einmalartikel ....................................... 248
9.6 Abkürzungen ........................................................................................ 253

Einleitung 1
1 Einleitung
Die experimentelle Infektion mit dem Virus der Bornaschen Krankheit (Borna disease virus,
BDV) führt zu einer virusinduzierten, immunpathologisch bedingten Erkrankung mit
Viruspersistenz im zentralen Nervensystem (ZNS). Histologisch findet sich eine nichteitrige
Meningoenzephalitis. Die experimentelle Infektion von Lewis Ratten galt lange Zeit als eines
der geeignetesten Modelle zum Studium der zugrunde liegenden Pathogenitätsmechanismen.
Mäuse hingegen wurden für wenig oder nicht empfänglich gehalten. Erst in jüngerer Zeit
konnten durch Verwendung einer mausadaptierten Viruspräparation auch bei Mäusen
entzündliche Veränderungen und klinische Erkrankungen induziert werden. Dieses eröffnete
die Möglichkeit, spezielle Fragestellungen der Immunpathogenese und des Virusverhaltens an
genetisch veränderten Tieren zu untersuchen, wie z.B. den Einfluss einzelner Zytokine auf die
Virusausbreitung und -persistenz sowie das Entzündungsgeschehen. Bisher ist bekannt, dass
an den immunpathogenen Mechanismen Zytokine, Chemokine und andere Entzündungsmediatoren
maßgeblich beteiligt sind. Tumor Nekrose Faktor-α (TNF) spielt als proinflammatorisches
Zytokin eine wichtige Rolle bei der BDV-Infektion. Untersuchungen zur
Modulation der TNF-Expression nach BDV-Infektion liegen derzeit nicht vor. Es ist jedoch
allgemein bekannt, dass TNF je nach exprimierter Menge neurodegenerative, aber auch
neuroprotektive Wirkungen haben kann. Weiterhin sind Interaktionen zahlreicher Viren mit
TNF und seinen Rezeptoren beschrieben.
Die vielfältige Wirkungsweise des TNF bei virusinduzierten immunpathogenen Vorgängen
im ZNS soll im Rahmen dieser Studie anhand der experimentellen BDV-Infektion einer
transgenen Mauslinie mit neuronaler TNF-Überexpression näher charakterisiert werden. Die
Expression des TNF über den N-methyl-D-aspartat (NMDA)-Glutamatrezeptor bewirkt eine
moderate Überexpression in Ammonshorn, Cortex cerebri, Thalamus und Striatum. In diesen
Lokalisationen ist schon zu frühen Zeitpunkten nach der Infektion Virus konstant vorhanden,
so dass eine Wechselwirkung von TNF-Überexpression und Virusreplikation und
-ausbreitung sowie Entwicklung der entzündlichen Infiltrate zu erwarten ist. Die moderate
TNF-Überexpression per se führt bei nicht-infizierten Tieren zu keinen spontanen
entzündlichen oder degenerativen Veränderungen im ZNS. Durch den Einsatz homo- und

2 Einleitung
heterozygoter Tiere kann weiterhin der Einfluss verschieden hoher TNF-Level untersucht
werden.
Das Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss der TNF-Überexpression auf die klinische
Symptomatik, Entzündungsreaktion und Virusausbreitung mittels klinischer Untersuchungen,
Histologie, Immunhistologie, in situ Hybridisierung und quantitativer Reverser Transkriptase-
Polymerase Kettenreaktion zu analysieren. Die gewonnenen Erkenntnisse können dadurch
einen wesentlichen Beitrag zum besseren Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen
virusinduzierter immunpathogener Prozesse und viraler Ausbreitungs-, Replikations- und
Persistenzstrategien im ZNS liefern.

Literaturübersicht 3
2 Literaturübersicht
2.1 Die Bornasche Erkrankung
Die Bornasche Krankheit (Borna disease, BD) ist eine sporadisch auftretende, infektiös
bedingte Meningopolioenzephalomyelitis (ZWICK, 1939; HEINIG, 1969; DANNER, 1982;
ROTT und BECHT, 1995), die auf die Infektion mit dem neurotropen Borna disease Virus
(BDV), Familie Bornaviridae, Ordnung Mononegavirales zurückzuführen ist (ZWICK et al.,
1927; BRIESE et al., 1994; CUBITT und DE LA TORRE, 1994; PRINGLE, 1996). Die
ersten Beschreibungen der BD finden sich 1823 von AUTHENRIETH als „Hitzige Kopf-
Krankheit der Pferde“ und 1858 von WÖRZ als „halb-acute Gehirn-Entzündung oder Kopf-
Krankheit der Pferde“. In den Jahren 1894 und 1896 kam es zu verheerenden, endemischen
Ausbrüchen der damals als „Seuchenhafte Gehirn-Rückenmarksentzündung“ bezeichneten
Erkrankung unter Kavalierpferden in der sächsischen Stadt Borna, welche letztendlich der
Krankheit den heutigen Namen „Bornasche Krankheit“ gaben. Natürliche Infektionen werden
vor allem bei Pferden und Schafen beobachtet (2.1.3; ZWICK 1939; HEINIG 1969; ROTT
und BECHT 1995).
Die mögliche Bedeutung der BDV-Infektion im Rahmen von psychiatrischen Erkrankungen
des Menschen wird nach wie vor kontrovers diskutiert. Verschiedene Studien fanden
signifikant höhere BDV-spezifische Antikörper Titer bei Patienten, die an psychiatrischen
oder neurologischen Erkrankungen wie Schizophrenie und Depressionen litten
(AMSTERDAM et al., 1985; ROTT et al., 1985; BECHTER et al., 1992a,b; BODE et al.,
1996; CHALMERS et al., 2005). Jedoch konnten in späteren Studien auch bei einem geringen
Prozentsatz klinisch gesunder Menschen BDV-spezifische Antikörper gefunden werden
(Übersicht bei SCHWEMMLE et al., 1999). Diese Untersuchungen weisen darauf hin, dass
Menschen sich mit BDV oder einem BDV-ähnlichen Agens infizieren können (STAEHELI
und LIEB, 2001). Erst in jüngster Zeit konnte geklärt werden, dass die BDV-spezifischen
Serumantikörper keine kreuzreaktiven, sondern BDV-spezifische Antikörper sind
(ALLMANG et al., 2001; BILLICH et al., 2002). Der derzeitige Erkenntnisstand lässt noch
keine endgültige Aussage zur Bedeutung der BDV-Infektion im Rahmen von psychiatrischen
Erkrankungen zu (LIEB und STAEHELI, 2001; STAEHELI et al., 2001; CHALMERS et al.,
2005; HOFER et al., 2006).

4 Literaturübersicht
2.1.1 Experimentelle Infektion von Ratten
Der Krankheitsverlauf experimentell infizierter Ratten ist abhängig von der verwendeten
Viruspassage und dem Rattenstamm. Aufgrund ihrer Empfänglichkeit stellen Lewis Ratten
das klassische Tiermodell zum Studium der Pathogenese und der Immunpathogenese der
BDV-Infektion dar (NITZSCHKE, 1963; NARAYAN et al., 1983a,b; HERZOG et al., 1984).
Adult infizierte Lewis Ratten entwickeln typischerweise eine persistierende Infektion mit
biphasischer Enzephalitis, klinischen und neurologischen Symptomen, während bei Infektion
von neonatalen Ratten eine persistierende Infektion ohne auffallende klinische und
neurologische Symptome beobachtet wird. Die klinischen Symptome sind auf
immunpathogenetische Prozesse zurückzuführen (RICHT et al., 1989; STITZ et al., 1993).
2.1.1.1 Klinik und Epidemiologie
Bei adult BDV-infizierten Lewis Ratten wird nach intrazerebraler Infektion eine
persistierende Infektion mit einer nichteitrigen Meningoenzephalitis und einem typischen
biphasischen Verlauf der klinischen Erkrankung beobachtet. Sie überleben gewöhnlich die
durch Hyperaktivität, Aggressivität, Desorientierung und fehlende Koordination
gekennzeichnete, akute Phase und zeigen in der zweiten, späteren Phase ab etwa 60 Tage
nach der Infektion (post infectionem, p.i.) Apathie bis hin zur Somnolenz (NARAYAN et al.,
1983 a, b; KOMPTER et al., 1987; DESCHL et al., 1990; HERDEN et al., 2000). Bis 100
Tage p.i. kann in einer steigenden Anzahl von Ratten eine Erblindung festgestellt werden
(NARAYAN et al., 1983a). Je nach verwendeter Viruspräparation können im Anschluss an
die akute Phase auch Paralysen der Hintergliedmaßen (BIESENBACH, et al., 1990;
BIESENBACH, 1994) oder eine Obesitas (NARAYAN et al., 1983a; KAO, 1985,
KOMPTER, 1987; BREDTHAUER et al., 1990; GOSZTONYI und LUDWIG, 1995; ROTT
und BECHT, 1995; HERDEN et al., 2000) beobachtet werden. Eine Obesitas kann auch ohne
vorangehende neurologische Symptome auftreten (HERDEN et al., 2000).
Im Gegensatz dazu verläuft die experimentelle BDV-Infektion von neonatal infizierten Lewis
Ratten als tolerierte, persistierende Infektion ohne auffällige entzündliche Veränderungen im
zentralen Nervensystem (ZNS) und ohne deutliche klinische und neurologische Symptome
(HIRANO et al., 1983; NARAYAN et al., 1983a). Es wurden jedoch Störungen der

Literaturübersicht 5
emotionalen und kognitiven Funktion sowie der physiologischen und neurologischen
Entwicklung festgestellt (MORALES et al., 1988; RUBIN et al., 1999; PLETNIKOV et al.,
1999; PLETNIKOV et al., 2001; PLETNIKOV et al., 2002).
Die Morbidität beträgt in Abhängigkeit vom verwendeten Rattenstamm und der eingesetzten
Viruspräparation bis zu 100%.
2.1.1.2 Pathogenese
Als natürliche Transmissionsroute wird eine nasale Aufnahme, zentripetale Ausbreitung über
intraaxonalen Transport und eine Ausbreitung innerhalb des Gehirns ausgehend von N.
olfactorius postuliert (MORALES et al., 1988; GOSZTONYI und LUDWIG, 1995; SAUDER
und STAEHELI 2003). Ausgehend von der intrazerebralen disseminierten Ausbreitung folgt
schließlich eine weitere Expansion in die peripheren Nerven und die Retina (KREY et al.,
1979a,b; NARAYAN et al., 1983b). Die horizontale Übertragung konnte für Ratten nachgewiesen
werden und findet vermutlich über Urin, Tränenflüssigkeit und Speichel statt
(NITZSCHKE, 1963; MORALES et al., 1988; RICHT et al., 1993; SAUDER und
STAEHELI, 2003). Im Gehirn finden sich in derartig horizontal infizierten Ratten im frühen
Infektionsstadium virusantigenhaltige Zellen vor allem im Bulbus olfactorius. In adult
infizierten, immunkompetenten Ratten zeigt das BDV einen strengen Neurotropismus und in
Abhängigkeit der verwendeten BDV-Präparation eine starke Präferenz für Neurone des
Ammonshorns und des limbischen Systems (GOSZTONYI et al., 1993; GOSZTONYI und
LUDWIG, 1984). Vorwiegend betroffene Gehirnareale sind das Ammonshorn, der
Hypothalamus, Thalamus und Cortex cerebri, sowie zu späteren Zeitpunkten der Infektion
auch Cerebellum und Medulla oblongata. Das BDV war in Neuronen, Astrozyten,
Oligodendrozyten, Schwann Zellen und Ependymzellen nachweisbar (NARAYAN et al.,
1983b; CARBONE et al., 1989; DESCHL et al., 1990; CARBONE et al., 1991; CARBONE
et al., 1993).
Die klinischen Symptome bei adult infizierten Lewis Ratten beginnen zeitgleich mit dem
Auftreten der Entzündungsreaktion im Gehirn je nach verwandter Viruspräparation etwa um
den 20. Tag p.i. Die Enzephalitis erreicht ihr Maximum zwischen 30 und 40 Tagen p.i.,
typischerweise tritt eine massive perivaskuläre, parenchymatöse und meningeale Infiltration
von Makrophagen und CD4 + und CD8 + T-Zellen auf, an der in späteren Stadien der Infektion

6 Literaturübersicht
auch Plasmazellen beteiligt sind (NARAYAN et al., 1983a,b; DESCHL et al., 1990; STITZ et
al., 1991; HERDEN et al., 2000). Interessanterweise konnte bei adulten Lewis Ratten in der
späten Phase der BD (nach ca. 42 Tage p.i.) ein Rückgang der entzündlichen Infiltration ohne
Rückgang der nachweisbaren Antigenmenge beobachtet werden, auch infektiöses Virus und
eine Astrogliose waren weiterhin zu finden (NARAYAN et al., 1983a,b; HIRANO et al.,
1983; DESCHL et al., 1990; GOSZTONYI und LUDWIG, 1995; HERDEN et al., 2000). Im
Verlauf der BDV-Infektion können je nach verwendeter Viruspräparation bei der adult
infizierten Lewis Ratte mit Aufregulierung der entzündlichen Infiltrate auch neuronale
Nekrosen auftreten, die vorwiegend in frontalem und parietalem Cortex, der CA3-Region
oder im Gyrus dentatus des Ammonshorn zu finden sind (DESCHL et al., 1990; HERDEN et
al., 2000).
Im Gegensatz dazu verläuft die experimentelle BDV-Infektion von neonatal infizierten
immuninkompetenten Lewis Ratten als tolerierte, persistierende Infektion ohne auffällige
entzündliche Veränderungen im ZNS. Es wurden jedoch Degenerationen der Neurone des
Gyrus dentatus und des Cerebellum (NARAYAN et al., 1983a,b; MORALES et al., 1988;
CARBONE et al., 1991; HORNIG et al., 1999; RUBIN et al., 1999) und eine Ausbreitung des
BDV in die Peripherie mit Nachweis von infektiösem Virus auch in parenchymalen Zellen
beobachtet (HERZOG et al., 1984; MORALES et al. 1988). Weiterhin konnte in diesen
persistierend infizierten Tieren das Virus in zahlreichen Sekreten gefunden werden. Diese
Beobachtung stützt die Hypothese, dass persistierend infizierte Ratten ein natürliches
Virusreservoir darstellen könnten.
2.1.1.3 Immunpathogenese
Die klinische Erkrankung korreliert mit dem Auftreten der entzündlichen Infiltrate und wird
auf virusinduzierte, immunpathologische Mechanismen zurückgeführt, wobei der Hypersensibilitätsreaktion
vom verzögerten Typ eine zentrale Rolle zugesprochen wird (RICHT et
al., 1989, 1994; PLANZ et al., 1993; RICHT und ROTT, 2001; STITZ et al., 2002). Dies
konnte anhand von zahlreichen experimentellen Studien an Lewis Ratten gezeigt werden, da
nur immunkompetente Tiere nach BDV-Infektion eine klinisch manifeste Erkrankung
entwickeln. Neugeborene, athymische Tiere, Cyclosporin-A-, Cyclophosphamid- und
Dexamethason-immunsupprimierte Ratten zeigten nach BDV-Infektion keine klinischen

Literaturübersicht 7
Symptome, trotz nachweisbarer Virusausbreitung im Gehirn (MORALES et al., 1988; STITZ
et al., 1991; MORIMOTO et al., 1996; RICHT und ROTT, 2001). Den Beweis der zentralen
Bedeutung der T-Zellen für die Immunpathogenese der BD brachten Transferstudien. Die
Übertragung von Milzzellen immunkompetenter, BDV-infizierter Spendertiere auf
immuninkompetente BDV-infizierte Tiere rief ZNS-Läsionen und klinische Symptome
hervor, während die Übertragung von Seren BDV-infizierter Spendertiere auf
immuninkompetente BDV-infizierte Tiere keine Wirkung zeigte (NARAYAN et al., 1983a,b;
HERZOG et al., 1985; STITZ et al., 1989; SOBBE et al., 1997).
Durch weitere Studien wurden die am Entzündungsgeschehen beteiligten Zellen näher
charakterisiert. Bei adulten und immunkompetenten Ratten waren CD4 + und CD8 + T-Zellen,
Makrophagen, B-Zellen und Plasmazellen an der entzündlichen Reaktion beteiligt
(NARAYAN et al., 1983b; DESCHL et al., 1990). Antigenspezifität für das virale
Nukleoprotein konnte sowohl für CD4 + T-Zellen (RICHT et al., 1994; SCHMEEL et al.,
1995), als auch für CD 8 + T-Zellen (PLANZ et al., 1993, 1995; STITZ et al., 1995, 2002)
gezeigt werden. In zwei weiteren Studien wurde die Rolle der CD8 + T-Zellen für die
Entstehung der klinischen Erkrankung dargestellt. Die Infiltration von CD8 + T-Zellen ins
Gehirn zeigte einen direkten Zusammenhang mit der Schwere des Krankheitsverlaufes
(FURRER et al., 2001). Auch der Einsatz monoklonaler Antikörper gegen CD8 + T-Zellen
konnte den Einfluss dieser Zellen auf den Verlauf der Erkrankung bekräftigen. Wurden diese
Antikörper kurz vor oder nach der BDV-Infektion immunkompetenter Ratten verabreicht, trat
die Erkrankung verzögert ein oder es entwickelten sich deutlich verringerte Symptome und
eine weniger stark ausgeprägte Enzephalitis (STITZ et al., 1992). Die Studie von NÖSKE et
al. (1998) konnte ebenfalls die protektive Wirkung von BDV-spezifischen CD4 + T-Zellen
zeigen, wenn sie vor einer BDV-Infektion appliziert werden. In dieser Studie fanden sich
weiterhin Hinweise darauf, dass CD8 + T-Zellen über Perforin durch die CD4 + T-Zellen
aktiviert zu der Viruseliminierung führen. Ein adoptiver Transfer von BDV-spezifischen
T-Zellen vor einer BDV-Infektion konnte adult infizierte Ratten vor der Entwicklung
klinischer Symptome und der chronischen Infektion schützen, es kam lediglich zu einer
transienten BDV-Replikation. Ein Transfer der gleichen T-Zellen kurz nach der BDV-
Infektion führte bei adult infizierten Tieren dagegen zu einem vorzeitigen Einsetzen der
klinischen Symptome (RICHT et al., 1994; SCHMEEL et al., 1995).

8 Literaturübersicht
Zu der Rolle neutralisierender Antikörper liegen verschiedenen Beobachtungen vor. Untersuchungen
von STITZ et al. (1998) deuten darauf hin, dass neutralisierende Antikörper
möglicherweise eine generalisierte Infektion verhindern, da nach Transfer von Serum
chronisch infizierter Ratten in immunsupprimierte, BDV-infizierte Ratten das Virus nur im
ZNS nachweisbar war. Ohne Serumapplikation konnte das Virus auch in extraneuralen
Geweben, wie Haut, Leber- und Nierenparenchym, sowie Herz- und glatten Muskelzellen des
Dünndarms gefunden werden. In anderen Studien wurden neutralisierende Antikörper nicht
regelmäßig und erst zu späten Zeitpunkten nach der Infektion beobachtet (RICHT und ROTT,
2001). Eine weitere Untersuchung konnte die Beteiligung von Komplementfakoren an der
Immunpathogenese zeigen. Die mRNA des C1q, einer Untereinheit des Komplementsystems
der Ratte, zeigte einen parallel zum Entzündungsgeschehen verlaufenden Anstieg
(DIETZSCHOLD et al., 1995).
Zytokine spielen in der Pathogenese der BD unumstritten eine zentrale Rolle. Hinweise auf
eine Aufregulierung von mRNA spezifisch für die proinflammatorischen Zytokine TNF,
Interleukin (IL)-1α und IL-6 fanden STITZ et al. (1995) in Gehirnen BDV-infizierter Ratten.
SHANKER et al. (1992) konnten eine Korrelation zwischen der nachweisbaren mRNA
spezifisch für TNF, IL-1α und IL-6 und der Stärke der Enzephalitis feststellen. Weiterhin
fanden sie eine Korrelation der mRNA spezifisch für IL-2 und Interferon (INF)γ mit der
nachweisbaren Menge an mRNA spezifisch für CD4 + bzw. CD8 + T-Zellen. Beide T-Zellsubpopulationen
waren in der akuten und chronischen Phase der Erkrankung nachweisbar.
HATALSKI et al. (1998) fanden ebenfalls in der frühen Phase der BDV-Infektion zahlreiche
CD4 + und CD8 + T-Zellen, sowie hohe mRNA-Level von IL-1α, IL-2, IL-6, TNF und IFNγ. In
der chronischen Phase der Infektion waren vermehrt natürliche Killerzellen (NK)-Zellen,
B-Zellen und aktivierte Mikroglia sowie hohe Mengen von IL-4 spezifischer mRNA nachweisbar.
Diese Beobachtungen sprechen für den Wechsel der Th1-abhängigen zu einer Th2abhängigen
Immunantwort, die auf die Abnahme der entzündlichen Reaktion zurückzuführen
sein könnte (HATALSKI et al., 1998). In Abwesenheit von infiltrierenden Immunzellen bei
Dexamethason-immunsupprimierten Ratten, ließen sich nach einer BDV-Infektion erhöhte
mRNA-Level von TNF, IL-6, macrophage inflammatory protein (MIP)-1β und dem CXC
Chemokin mob-1 nachweisen. Dieses wird als initiale Zytokinantwort der ZNS-residenten
Zellen bewertet (MORIMOTO et al., 1996). Andere Studien konnten zeigen, dass eine

Literaturübersicht 9
Behandlung von BDV-infizierten Ratten mit transforming growth factor (TGF)-β2 zu einer
Reduktion der CD8 + T-Zellen und der MHC II-Expression führte und die Erkrankung bei den
Tieren verzögert auftrat (STITZ et al., 1991). KOPROWSKI et al. (1993) und AKAIKE et al.
(1995) konnten einen möglichen Zusammenhang zwischen der Neuropathogenese und der
Veränderung der nitric oxide synthetase (NOS) zeigen. Nach BDV-Infektion konnte eine
verminderte NO-Synthese in Neuronen und eine vermehrte iNO-Synthese in aktivierten
Makrophagen und Mikroglia gefunden werden. Weiterhin sollen Entzündungsmediatoren wie
Peroxinitrite (HOOPER et al., 2001), Cyclooxygenase (RÖHRENBECK et al., 1999) und
macrophage migration inhibitory factor (MIF, BACHER et al., 2002) ebenfalls an der
Entstehung der entzündlichen Veränderungen im Gehirn beteiligt sein.
In der chronischen Phase der BDV-Infektion wird bei adult infizierten Lewis Ratten trotz
Viruspersistenz im ZNS ein Rückgang der entzündlichen Veränderungen beobachtet. Zu
diesem Zeitpunkt sollen niedrigere Werte proinflammatorischer Zytokine wie beispielsweise
TNF vorliegen (HATALSKI et al., 1998). Da jedoch auch in dieser Phase der BDV-Infektion
eine anhaltende Mikrogliaaktivierung und Astrogliose zu beobachten ist, können auch andere
Zytokine wie IL-1 und TNF weiterhin eine Rolle spielen. Detaillierte Untersuchungen zum
Einfluss des TNF auf das biphasische Krankheitsgeschehen der experimentell infizierten
Lewis Ratte liegen derzeit nicht vor.
Ein weiterer Ansatz zu Klärung der Pathogenese der BD stellte die Untersuchung des
Einflusses der BDV-Infektion auf zelluläre Signalwege dar, wie beispielsweise den nerve
growth factor (NGF). In neuronalen und glialen Zellkulturen soll NGF die Replikation des
BDV steigern (CARBONE et al., 1993; IBRAHIM et al., 2002). Weiterhin konnte ein
positiver Einfluss von Neurotropinen auf die BDV-Replikation in infizierten Neuronen
festgestellt werden. Umgekehrt hemmten Inhibitoren des Ras/MEK/ERK-Signalwegs die
Virusausbreitung (CARBONE et al., 1993; HANS et al., 2001; PLANZ et al., 2001; HANS et
al., 2004).

10 Literaturübersicht
2.1.2 Experimentelle Infektion von Mäusen
Mäuse galten lange als ungeeignete Modelltiere, da adult infizierte Tiere keine Enzephalitis
und keine klinischen Symptome entwickeln (KAO et al., 1984; RUBIN et al., 1993).
HALLENSLEBEN et al. (1998) konnte in neonatal mit einer mausadaptierten BDV-
Präparation infizierten Mäusen eine schwere neurologische Erkrankung zu erzeugen. Im
Gegensatz zu dem Rattenmodell, wo die Erkrankung ausschließlich bei adult infizierten
Ratten auftritt, erkranken Mäuse nur, wenn sie neonatal infiziert werden. Worauf der
unterschiedliche Verlauf der Erkrankung bei neonatal und adult infizierten Mäusen und
Ratten beruht, ist bislang nicht bekannt (Übersichten bei HALLENSLEBEN et al., 1998;
BRAYTON et al., 2001).
Durch den Einsatz transgener Mäuse ist es heutzutage möglich, die Mechanismen der
Immunpathogenese, insbesondere den Effekt einzelner Zytokine und Entzündungsmediatoren
im Verlauf der BDV-Infektion zu analysieren.
2.1.2.1 Klinik und Epidemiologie
Neonatal mit einer mausadaptierten BDV-Präparation infizierte Mäuse entwickelten nach vier
bis sechs Wochen erste neurologische Symptome, ähnlich denen der akut erkrankten Ratten.
Sie zeigten stumpfes Fell, Kopfschiefhaltung, kümmerten und verloren etwa 20% an
Körpergewicht innerhalb von vier Tagen (HALLENSLEBEN et al., 1998). Erkrankte Tiere
konnten leicht an einer typischen, unphysiologischen Hinterbeinhaltung identifiziert werden,
sie verschränkten ihre Gliedmaßen vor dem Körper, wenn sie am Schwanz angehoben wurden
(HALLENSLEBEN et al., 1998). Wurden dagegen adulte Mäuse mit BDV infiziert,
verhielten sie sich klinisch unauffällig und zeigten histologisch nur minimale entzündliche
Veränderungen im Gehirn (KAO et al., 1984; RUBIN et al. 1993). Die Inzidenz und Schwere
der Erkrankung neonatal infizierter Mäuse variierte zwischen verschiedenen Mausstämmen,
obwohl bei allen untersuchten Mauslinien eine ähnliche Ausbreitung des BDV im Gehirn
beobachtet wurde (HALLENSLEBEN et al.; 1998). Besonders deutliche Krankheitszeichen
und eine deutliche Empfänglichkeit für die BDV-Infektion fand man bei MRL Mäusen,
während C57BL/6 und SJL Mäuse klinisch nur eine dezente Symptomatik zeigten und nur
wenige Tiere erkrankten. Von den CBA und C3H Mäusen entwickelte ebenfalls nur ein

Literaturübersicht 11
geringer Prozentsatz der Tiere klinische Symptome, die betroffenen Tiere zeigten jedoch mit
MRL Mäusen einen vergleichbar schwerwiegenden Krankheitsverlauf (RUBIN et al., 1993;
HALLENSLEBEN et al., 1998). BALB/c Mäuse zeigten eine vergleichbare Inzidenz der
Erkrankung wie CBA und C3H Mäuse, entwickelten jedoch nur moderate klinische
Veränderungen, während die erkrankten CBA und C3H Mäuse deutliche neurologische
Symptome zeigten (HALLENSLEBEN et al., 1998).
Die Morbidität beträgt, wie bei den Ratten, in Abhängigkeit vom Mausstamm und der BDV-
Präparation, bis zu 100%.
2.1.2.2 Pathogenese
Bisher liegen keine Studien zu der horizontalen Übertragung zwischen Mäusen vor. Dagegen
beschrieben OKAMOTO et al. (2003) eine vertikale Übertragung in BALB/c Mäusen nach
intraperitonealer Infektion und anschließender Bedeckung. Bei experimentell BDVinfizierten,
neonatalen Mäuse war bis 15 Tage p.i. nur sehr wenig oder keine BDVspezifische
RNA im Gehirn nachweisbar, ab 20. Tag p.i. konnte virale RNA regelmäßig
nachgewiesen werden. Um 28 Tage p.i. erreichte die Menge an viraler RNA ihr Maximum
(HALLENSLEBEN et al., 1998). Die ersten klinischen Symptome treten bei erkrankten
Mäusen, wie bei den Ratten, parallel mit der Infiltration der Entzündungszellen im Gehirn
auf. Histologisch zeigen die Mäuse eine mononukleäre, perivaskuläre, parenchymatöse und
meningeale Infiltration im Gehirn. Vor allem in Neokortex und Ammonshorn wurde eine
massive Infiltration von vorwiegend T-Zellen beobachtet. Cerebellum und Thalamus wiesen
meist geringer ausgeprägte entzündliche Infiltrate auf (HALLENSLEBEN et al., 1998;
FREUDE et al., 2002).
2.1.2.3 Immunpathologie
Die Mäuse zeigten ebenfalls eine positive Korrelation zwischen der Ausprägung der
klinischen Symptome und der Stärke der Entzündungsreaktion. Auch im Mausmodell liegen
virusinduzierte, immunpathologische Mechanismen der Entstehung der Erkrankung zu
Grunde. Wie schon von der Ratte bekannt, konnte für die Maus gezeigt werden, dass nicht das
Virus, sondern die infiltrierenden Entzündungszellen über eine Hypersensibilitätsreaktion

12 Literaturübersicht
vom Typ IV die Entstehung der BD auslösen (HALLENSLEBEN et al., 1998). Es konnte
weiterhin festgestellt werden, dass die Schwere der Erkrankung an das MHC I-Allel
gekoppelt ist, während die Empfänglichkeit für die Erkrankung auf andere, unbekannte
genetische Faktoren zurückzuführen ist (HALLENSLEBEN et al., 1998). Alle Mausstämme,
die schwere klinische Symptome entwickelten, gehören dem H-2 k Haplotyp an. Ursächlich
wurde dieser Unterschied auf die Erkennung eines spezifischen T-Zellepitops (TELEISSI) des
BDV-Nukleoproteins, zurückgeführt. Dieses Epitop wurde von den meisten infiltrierenden
zytotoxischen CD8 + T-Zellen in Mäusen des H-2 k Haplotyps erkannt (SCHAMEL et al.,
2001). Die zentrale Rolle des TELEISSI-Epitops bei der Entwicklung der BD wurde
weiterhin durch die Beobachtung unterstützt, dass eine periphere Immunisierung mit
dendritischen Zellen, die mit dem TELEISSI-Epitop ummantelt waren, die immunologische
Toleranz einer persistierenden BDV-Infektion des ZNS beendeten und die Tiere schwere
neurologische Symptome entwickelten (FASSNACHT et al., 2004). In einer weiteren Studie
konnte gezeigt werden, dass eine transgene Expression des BDV-N in Neuronen oder
Astrozyten bei Mäusen mit einem B10.BR-Hintergrund per se zu keiner Erkrankung oder
Verhaltensänderungen führte (RAUER et al., 2004). Nach BDV-Infektion dieser BDV-Ntransgenen
Mäuse verhinderte die neuronale BDV-N Expression eine Infektion der transgenen
Neuronen, dagegen hatte die transgene Expression des BDV-N in Astrozyten keinen Einfluss
auf die Virusausbreitung. Weiterhin konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass die CD8 + T-
Zell-vermittelte Immunantwort gegen das BDV-N durch die transgene Expression des
BDV-N in Neuronen und Astrozyten beeinträchtigt wurde (RAUER et al., 2004). Bei
experimentell BDV-infizierten MRL-Mäusen waren sowohl aktivierte CD4 + T-Zellen, als
auch aktivierte CD8 + T-Zellen im Gehirn nachweisbar (HAUSMANN et al., 1999). CD8 + T-
Zellen zeigen vor allem Antigenspezifität für das BDV-N (HAUSMANN et al., 1999,
PLANZ und STITZ, 1999). Untersuchungen an neonatal intra cerebral (i.c.) infizierten, CD8 +
T-Zell-defizienten Mäusen zweier verschiedener Mausstämme (MRL und C57Bl/6), zeigten,
dass die neurologischen Symptome der BDV-Infektion vorwiegend auf einen CD8 + T-Zellvermittelten
Prozess zurückzuführen waren (HALLENSLEBEN et al., 1998; HAUSMANN et
al., 2005a). HAUSMANN et al. (2001) konnte jedoch anhand von perforindefizienten Mäusen
keinen Einfluss des Perforins auf die Kinetik der Virusausbreitung oder die Ausprägung der
Krankheitssymptome nach BDV-Infektion finden. Interessanterweise konnten auch in

Literaturübersicht 13
persistierend BDV-infizierten Mäusen weiterhin BDV-N spezifische CD8 + T-Zellen
nachgewiesen werden, diese T-Zellen zeigten jedoch eine verminderte funktionale Avidität
(ENGELHARDT et al., 2005).
BDV-infizierte Neurone werden bei der Maus (HAUSMANN et al., 2001), wie schon von der
Ratte bekannt (NARAYAN et al., 1983; RICHT et al., 1989; DESCHL et al., 1990; HERDEN
et al., 2000), nicht von T-Zellen lysiert. Vielmehr scheinen, wie bei der Ratte,
proinflammatorische Zytokinen und andere Entzündungsmediatoren eine wichtige Rolle bei
der Entstehung der entzündlichen Veränderungen im Gehirn zu spielen. SAUDER et al.
(2000) konnten eine starke Aufregulierung von TNF in Gehirnen BDV-infizierter Mäuse
(MRL und AGR) beobachten. Weiterhin soll IL-12 eine wichtige Rolle in der
Immunpathogenese der BD bei der Maus spielen. Die Überexpression von IL-12 vermochte in
Mäusen mit einem BDV-resistenten genetischen Hintergrund (C57Bl/6 x SJL) eine klinisch
manifeste Erkrankung zu induzieren (FREUDE et al., 2002), dieser Effekt wurde jedoch
vermutlich über die Induktion von IFNγ vermittelt. IFNγ alleine konnte keine Erkrankung
auslösen, erst die Anwesenheit von IFNγ-sezernierenden Lymphozyten führte zu klinischen
Symptomen (HOFER et al., 2004). Anhand von slide culture-Untersuchungen konnte der
Effekt von IFNγ auf die BDV-Infektion unabhängig von Lymphozyten betrachtet werden.
Hier zeigte sich, dass IFNγ noch nicht infizierte Zellen in BDV-infizierten Kulturen des
Ammonshorns und des Cerebellum vor der Infektion schützen konnte. IFNγ war jedoch nicht
in der Lage, in den bereits BDV-infizierten slide-Kulturen das Virus zu eliminieren (FRIEDL
et al., 2004). Eine weitere Studie lieferte Hinweise auf eine mögliche neuroprotektive
Wirkung des IFNγ. IFNγ-defiziente Mäuse (MRL und BALB/c) entwickelten, auch wenn sie
adult infiziert wurden, neurologische Symptome, wohingegen adult infizierte Tiere des
jeweiligen Wildtyps (wt) keine Symptome einer BD zeigten (HAUSMANN et al., 2005a).
Auch die Untersuchung von HAUSMANN et al. (2004) unterstützt die Beobachtung der
möglichen neuroprotektiven Wirkung des IFNγ. Bei IFNγ-defizienten Mäusen konnte eine
leicht erhöhte Inzidenz und Schwere der Erkrankung im Vergleich zu wt-Kontrolltieren
festgestellt werden.
Die Ausschaltung der Gene für Fas/FasL, Chemokinrezeptor CXCR3 und induzierbare NO-
Synthetase zeigten keinen Einfluss auf den Verlauf der Virusausbreitung und Erkrankung
nach BDV-Infektion in MRL Mäusen. Ebenso wenig konnte eine CXCL10-Expression

14 Literaturübersicht
(T-Zell anlockendes Chemokin) in Astrozyten den Krankheitsverlauf in MRL Mäusen
beeinflussen. In allen diesen Modellen zeigte die Virusausbreitung keine Unterschiede
zwischen transgenen und wt Mäusen (HAUSMANN et al., 2004).
Die bisher durchgeführten Untersuchungen konnten für einige Chemo- und Zytokine (IL-12,
IFNγ) eine Beteiligung an der Immunpathogenese der BDV zeigen, zahlreiche andere
(Fas/FasL, CXCR3, NO-Synthetase) scheinen keine Rolle bei der Verhinderung der
Virusausbreitung zu spielen. Für das TNF liegen derzeit noch keine detaillierten Untersuchungen
zur Rolle bei der Immunpathogenese der BDV-Infektion vor.
2.1.3 Natürliche Infektion
2.1.3.1 Klinik und Epidemiologie
Natürliche Infektionen sind schon seit langem bei Pferd und Schaf bekannt (Übersichten bei
ZWICK, 1939; HEINIG, 1969; DANNER, 1982; ROTT und BECHT, 1995). Die Mehrheit
der infizierten Tiere entwickelt eine klinisch inapparente Infektion (HERZOG et al., 1994;
ROTT und BECHT, 1995; GRABNER et al., 2002). Klinische manifeste Erkrankungen
verlaufen perakut, akut oder subakut und enden in der Regel nach ein bis vier Wochen
Krankheitsdauer in 80% der Fälle letal (SCHMIDT, 1912, 1952; GRABNER und FISCHER,
1991; DÜRRWALD und LUDWIG, 1997; RICHT et al., 2001, 2006). Nur ca. 10 % der Tiere
überleben die akute Phase und sollen einen chronischen, z.T. rekurrierenden Krankheitsverlauf
entwickeln (SCHMIDT, 1952; MAYR und DANNER, 1974; GRABNER et al., 1998;
UHLIG und KINNE, 1998; GRABNER et al., 2002). Daneben sind milde Enzephalitisformen
ohne klinische Symptome beschrieben (GRABNER et al., 1991). Die Inkubationszeit ist
variabel und hängt von der Eintrittspforte des Virus ab, sie soll zwischen zwei Wochen und
mehreren Monaten liegen (SCHMIDT, 1912, 1952). Klinisch zeigen erkrankte Tiere schon in
frühen Stadien der Erkrankung Verhaltensänderungen und Bewusstseinstrübungen. Als erste
Symptome fallen verlangsamte Nahrungsaufnahme und rekurrierendes Fieber auf
(GRABNER und FISCHER, 1991; DÜRRWALD und LUDWIG, 1997; RICHT et al., 2001,
2006). Weiterhin folgen motorische Störungen und Aggressivität oder Lethargie, Somnolenz
und Stupor sowie abnorme Körperhaltungen und ein herabgesetztes Sensorium (GRABNER
und FISCHER, 1991; BILZER et al., 1996). Im fortgeschrittenen Stadium fallen

Literaturübersicht 15
Hyporeflexie, Hypoästhesie, Ataxie und Überreaktion auf exogene Reize auf. Die auftretende
Pharynxparalyse zeigt sich in Form von Dysphagie und Salivation. Das so genannte
„Pfeiferauchen“ bezeichnet Heuwickel, die aufgrund von fehlendem Kauen und Abschlucken
den erkrankten Pferden aus dem Maul hängen. Weiterhin werden eine gesenkte Kopfhaltung,
teils gesteigerter Bewegungsdrang mit Kreisbewegungen, Hyperästhesien, Zittern und
Inkoordination beobachtet. Im Endstadium zeigen die Pferde einen neurogenen Torticollis,
Konvulsionen mit charakteristischem Kopfpressen an Wände und schließlich Festliegen mit
Ruderbewegungen und finalem Koma.
Erkrankte Schafe zeigen ähnliche Symptome wie die Pferde, aber die neurologischen
Ausfallserscheinungen sollen geringer ausgeprägt sein als bei Equiden. (HIEPE, 1958;
LUDWIG et al., 1988; CAPLAZI und EHRENSPERGER, 1998; BODE et al., 1994; ROTT
und BECHT, 1995). Nach natürlicher Infektion ist auch bei Schafen eine Persistenz der BDV
möglich (VAHLENKAMP et al., 2002).
Natürliche Infektionen mit dem BDV scheinen weltweit verbreitet zu sein. Bei Pferden
konnten BDV-spezifische Serumantikörper in vielen Ländern Europas, in den USA, in Israel,
Indien, Japan und im Iran nachgewiesen werden (Übersicht bei RICHT et al., 2006; HERDEN
et al., 1999). Klinische Erkrankungen werden jedoch nur in den endemischen Gebieten
beschrieben, als solche gelten derzeit Hessen, Baden-Württemberg, Bayern und Sachsen
(HERZOG et al., 1994), sowie die Schweiz (METZLER et al., 1979), Lichtenstein
(CAPLAZI et al., 1999) und Österreich (WEISSENBÖCK et al., 1998b). Daneben gibt es
neuerdings unbestätigte Berichte von klinisch manifesten Erkrankungen von Pferden in Japan
(TANIYAMA et al., 2001; WEISSENBÖCK et al., 2002). Vermutlich steht diese
geografische Verbreitung im Zusammenhang mit dem Vorkommen eines Nagerreservoirs
(DÜRRWALD et al., 2006). HILBE et al. (2006) konnten zeigen, dass möglicherweise
Spitzmäuse dieses Reservoir bilden.
Neueren Untersuchungen zufolge ist von einem breiten Wirtsspektrum auszugehen. So kann
die Erkrankung auch bei Rindern, Katzen, Hunden, Ziegen, Kaninchen, Luchsen, Gerbilen,
Lamas, Alpakas, Zwergflusspferden, Faultieren, Rhesusaffen und Vari-Äffchen auftreten.
(KREY et al., 1979a,b; LUNDGREN et al., 1993; CAPLAZI et al., 1994; SCHÜPPEL et al.,
1994; ROTT und BECHT, 1995; JAUNIN et al., 1998; WEISSENBÖCK et al., 1998a;
NAKAMURA et al., 1999; DEGIORGIS et al., 2000; RICHT und ROTT, 2001).

16 Literaturübersicht
2.1.3.2 Pathogenese
Als wahrscheinliche Eintrittspforte des BDV gelten die offenen Nervenendigungen in der
Riechschleimhaut der Nase mit nachfolgender retrograder axonaler Ausbreitung über den
N. olfactorius (RICHT et al., 1993; BILZER et al., 1995; LEBELT und HANAU, 1996). Eine
weitere mögliche Transmissionsroute stellt die orale Aufnahme mit Ausbreitung über den
N. trigeminus dar (BILZER et al., 1996). Die Inkubationszeit variiert je nach Infektionsroute,
sie ist umso länger, je weiter die Eintrittspforte vom ZNS entfernt ist (RICHT et al., 2001). In
einer Studie konnte BDV-spezifische RNA in allen infizierten Tieren (18 Pferde, 1 Esel, 1
Schaf) im Bulbus olfactorius, Striatum, Ammonshorn und cerebralen Cortex nachgewiesen
werden. In einigen Tieren war zusätzlich in Rückenmark, Augen, Nasenschleimhaut, Parotis,
Herz, Lunge, Nieren, Harnblase und Ovarien virale RNA nachweisbar (LEBELT und
HAGENAU, 1996). Diese positiven PCR Ergebnisse sind wahrscheinlich auf die, nach
zentrifugaler Ausbreitung in den Nerven der jeweiligen Organe lokalisierte Virus RNA
zurückzuführen.
Wie bei der Ratte beschrieben, kann auch nach natürlicher Infektion BDV-spezifisches
Antigen in Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten, Schwann Zellen und Ependymzellen
nachgewiesen werden (LUDWIG et al., 1985; LUDWIG et al., 1988; GOSZTONYI et al.,
1993). Infektiöses Virus konnte bei einigen BD-erkrankten Pferden aus Tränen- und
Speicheldrüsen isoliert werden (HERZOG, persönliche Mitteilung), virusspezifische RNA
war in Nasensekret, Tränenflüssigkeit und Speichel dieser Tiere zu finden (LEBELT und
HAGENAU, 1996). Histopathologisch findet sich eine nichteitrige Meningopolioenzephalomyelitis
mit perivaskulären, parenchymalen und leptomeningealen Infiltraten vor allem in
Ammonshorn und Cortex cerebri (HEINIG, 1969; ROTT und BECHT, 1995; BILZER et al.,
1995; CAPLAZI und EHRENSPERGER, 1998; HERDEN et al., 1999).
2.1.3.3 Immunpathologie
Die klinischen Symptome sind auch bei natürlich infizierten Tieren auf eine virusinduzierte
immunpathologische Reaktion im ZNS zurückzuführen (STITZ et al., 2002). Bei
experimentell infizierten Ponies konnte gezeigt werden, dass die Stärke der Symptome mit der
inokulierten Virusmenge korreliert (KATZ et al., 1998). Bei BDV-infizierten, erkrankten
Pferden findet sich eine Infiltration mit mononukleären Entzündungszellen (BILZER et al.,

Literaturübersicht 17
1995; CAPLAZI und EHRENSPERGER, 1998; HERDEN et al., 1999), wie sie auch für die
Nagermodelle beschrieben ist, daher werden vergleichbare immunpathologische
Mechanismen angenommen.
2.1.4 Borna disease virus (BDV)
2.1.4.1 Virus
Das BDV besitzt ein lineares, nicht segmentiertes, einzelsträngiges RNA-Genom mit
negativer Polarität (-ssRNA, Abb. 1). Mit einer Größe von etwa 8,9 kb ist es das kleinste
Genom unter den Viren der Mononegavirales (BRIESE et al., 1992; BRIESE et al., 1994;
CUBITT und DE LA TORRE et al., 1994). Es enthält sechs offene Leserahmen (ORFs, open
reading frames, Abb. 1), die für die Proteine p40 (Nukleoprotein, BDV-N), p24
(Phosphoprotein, BDV-P), p10 (X-Protein, BDV-X), p16 (Matrixprotein, BDV-M), gp94
(Glykoprotein, BDV-GP) und p180 (RNA-abhängige RNA-Polymerase, L-Protein, BDV-L)
kodieren (BRIESE et al., 1994; CUBITT et al., 1994; DE LA TORRE, 2002; TOMONAGA
et al., 2002). Insgesamt wurden drei Transkriptionsinitiationssignale (S1-S3) und fünf
Transkriptionsterminationssignale (T1-T4, t6) beschrieben (BRIESE et al., 1994;
SCHNEEMANN et al., 1994; CUBITT und DE LA TORRE, 2001). Bisher wurden drei
Introns gefunden, die alle in der dritten Transkriptionseinheit liegen. (CUBITT et al., 1994;
SCHEIDER et al., 1994; TOMONAGA et al., 2000; CUBITT und DE LA TORRE, 2001).
Am 3’- und 5’-Ende des BDV-Genoms finden sich kurze nicht kodierende Regionen von 43
bzw. 52 Nukleotiden (BRIESE et al., 1994; CUBITT et al., 1994; PLESCHKA et al., 2001;
SCHNEIDER et al., 2005), in denen Promotoren zur Regulierung der Transkription und
Replikation des positiv orientierten Antigenoms aus dem negativen genomischen RNA-Strang
und vice versa lokalisiert sind. Die letzten 20 Nukleotide des Genoms des BDV sind, wie bei
anderen -ssRNA Viren, hochkonserviert und haben eine zentrale Rolle bei der Initiierung und
Regulierung der viralen Replikation (SCHNEIDER et al., 2005). Das BDV scheint über die
Verkürzung der jeweiligen 5’-Enden, sowohl der genomischen RNA als auch des
Antigenomstranges, die Effizienz der Replikation zu reduzieren (ROSARIO et al., 2005;
SCHNEIDER, 2005; SCHNEIDER et al., 2005).

18 Literaturübersicht
Sequenzanalysen verschiedener Isolate aus Pferden, Eseln und Schafen zeigen eine hohe
Konservierung des Genoms auch bei Vergleich der Isolate aus den verschiedenen Spezies
(SCHNEIDER et al., 1994; BINZ et al., 1994; PLESCHKA et al., 2001; KOLODZIEJEK et
al., 2005). Dieses ist für RNA-Viren sehr ungewöhnlich, üblicherweise besitzen sie eine hohe
Mutations- und Replikationsrate (HOLLAND et al., 1982).
Abb. 1: BDV-Genom (8,9 kb)
S1-3: Transkriptions-Initiationsstellen, T1-4, t6: Transkriptions-Terminationsstellen, die ORFs des BDV sind als
Boxen dargestellt, N: BDV-Nukleoprotein, X: BDV-X-Protein, P: BDV-Phosphoprotein, M: BDV-Matrixprotein,
GP: BDV-Glykoprotein, L: Large Protein, RNA abhängige RNA-Polymerase; : posttranskritionelles
Spleißen, ⌃: durch Spleißen entferne RNA-Abschnitte

Literaturübersicht 19
2.1.4.2 Virusproteine
Das BDV-N ist das Transkriptionsprodukt der einzigen monocistronischen, subgenomischen
RNA. Das Protein existiert in zwei Isoformen von 40 kDa bzw. 38 kDa (PYPER und
GARTNER, 1997). Bei der leichteren Isoform fehlt das nuclear loclization signal (NLS),
welches bei p40 am N-terminalen Ende lokalisiert ist (KOBAYASHI et al., 1998). Dennoch
können beide Isoformen im Nukleus infizierter Zellen gefunden werden. Daneben besitzt das
BDV-N ein nuclear export signal (NES), welches den Export aus dem Nukleus ermöglicht.
Das NES überlappt mit der P-bindenden Region (KOBAYASHI et al., 1998) und enthält die
TELEISSI-Region, welche das immundominante Epitop des BDV-N für CD8 + T-Zellen
darstellt (SCHAMEL et al., 2001). Bei beiden Isoformen konnten die NES gefunden werden
(BERG et al., 1998). Der nukleäre Export des BDV-N wird durch eine Koexpression von
BDV-P behindert (TOMONAGA et al., 2002). BDV-N wird bei experimentell infizierten
Tieren in vielen Zellen disseminiert im ZNS in relativ hohen Konzentrationen pro Zellen
gefunden und ist sowohl im Nukleus als auch im Zytoplasma der infizierten Zelle zu finden
(SCHNEEMANN et al., 1994; DESCHL et al., 1990; HERDEN et al., 2000). In Zellkulturen
konnten beide Isoformen des BDV-N nur im Nukleus gefunden werden (PYPER und
GARTNER, 1997; KOBAYASHI et al., 1998).
BDV-N stellt die Hauptkomponente des aktiven Polymerase-Komplex (ribonucleoprotein
complex, RNP, 2.1.4.3, SCHNEIDER et al., 2004b) dar. BDV-N und BDV-P zeigen eine
vergleichbare Verteilung in infizierten Zellen. Allerdings war nur das BDV-N auf der
Oberfläche infizierter Zellen zu finden (THIEDEMANN et al., 1992).
Das ORF II, das für das BDV-P kodiert, überlappt mit dem für das BDV-X kodierenden ORF
X (WEHNER et al., 1997). Beide werden aus einer 0,8 kb bzw. 3,5 kb großen mRNA
translatiert, die dem Genomabschnitt zwischen S2 und T2 bzw. T3 entspricht. Wie das
BDV-N existiert das BDV-P in zwei Isoformen, p24 und p16 (KOBAYASHI et al., 2000;
TOMONAGA et al., 2002). Das BDV-P soll einen nukleären Retentionsfaktor für das
BDV-N darstellen (KOBAYASHI et al., 2001) und eine stabile Expression des BDV-P soll
für eine starke Reduktion der viralen Proteinexpression in der persistierend infizierten Zelle
verantwortlich sein (GEIB et al., 2003).

20 Literaturübersicht
Das 10 kDa große BDV-X ist vermutlich ein potenter negativer Regulationsfaktor des viralen
Polymerase-Komplexes (PEREZ et al., 2003; SCHNEIDER et al., 2003). Es wirkt
inhibitorisch auf BDV-P, indem es durch Interaktion mit BDV-P Monomeren die Bildung
aktiver BDV-P Trimere verhindert (KOBAYASHI et al., 1998). Im Minireplikon Model
inhibierte ein X/P-Verhältnis von 1:5 die virale Replikation (SCHNEIDER et al., 2003). Das
BDV-X wird in vitro ebenfalls im Nukleus infizierter Zellen gefunden.
Beginnend an S3 werden zwei subgenomische RNAs transkribiert, von denen BDV-M, BDV-
GP und BDV-L synthetisiert werden können. Das ORF III codiert für das BDV-M und zeigt
am 5’ Ende mit dem ORF IV des BDV-GP eine Überlappung von 84 Nukleotiden. Das BDV-
M ist an der inneren Schicht der Virushülle lokalisiert und verantwortlich für Virusaufbau und
budding. Es handelt sich um ein nicht-glykolisiertes Membran-assoziiertes Protein (KRAUS
et al., 2001) und ist das kleinste Matrixprotein der -ssRNA Viren. An rekombinantem
BDV-M konnte gezeigt werden, dass es stabile Tetramere formt. Daher wird dem BDV-M
eine zentrale Rolle bei der Reifung der Viruspartikel zugeschrieben (KRAUS et al., 2001).
Virale Matrixproteine verbinden das Nukleokapsid mit dem zytoplasmatischen Anteil der
Glykoproteinspikes und sollen für die virale Replikation eine Rolle spielen. In infizierten
Zellkulturen konnte ungespleißte und gespleißte mRNA, welche für BDV-M kodieren,
zahlreicher im Zytoplasma infizierter Zellen gefunden werden, als Intron I gespleißte mRNA,
die für BDV-GP kodiert (JEHLE et al., 2000). Die spatiotemporale Ausbreitung des BDV-M
ist bisher noch nicht näher untersucht worden.
Das BDV-GP ist das einzige Oberflächenprotein des BDV (GONZALES-DUNIA et al.,
1997). Es wird als 57 kDa großes Polypeptid synthetisiert und erreicht nach N-Glykolisierung
eine Molekularmasse von 94 kDa (GONZALES-DUNIA et al., 1997; RICHT et al., 1998). Es
wird außergewöhnlich früh im Übertragungsweg gespalten und akkumuliert im Golgiapparat
(EICKMANN et al., 2005). In der Virushülle ist BDV-GP in Form von Spikes angeordnet
(KOHNO et al., 1999; KIERMAYER et al., 2002). Das BDV-GP wird durch Endoproteasen
wie Furin in einen N-terminalen Anteil und einen C-terminalen Anteil gespalten und erhält
erst durch die Spaltung seine volle biologische Aktivität (RICHT et al., 1998). Nur geringe
Mengen des C-terminalen Anteils (43 kDa) werden an die Zelloberfläche transportiert, wo

Literaturübersicht 21
dieser akkumuliert und eine zentrale Funktion in der Fusion der Virushülle mit der
Zellmembran des Wirtes hat (GONZALES-DUNIA et al., 1997; KOHNO et al., 1999;
KIERMAYER et al., 2002; EICKMANN et al., 2005). Der N-terminale Anteil (51 kDa) ist
stark glykolisiert und verantwortlich für die Rezeptorbindung (GONZALES-DUNIA et al.,
1998; PEREZ et al., 2001). In aufgereinigten Viruspartikeln war kein ungespaltenes BDV-GP
nachweisbar, es konnten nur die beiden Untereinheiten gefunden werden (EICKMANN et al.,
2005). In vivo wurde das BDV-GP ebenfalls vorwiegend im Zytoplasma der infizierten Zellen
gefunden (RICHT et al., 1998; HERDEN, 1997).
Die virale RNA abhängige RNA-Polymerase (BDV-L) ist auf der 7,2 kb großen mRNA
kodiert. Die Startstelle liegt, wie für die Transkription des BDV-M und BDV-GP, bei S3, die
Terminationsstelle bei T4, dabei werden T3 und 6 überlesen. Das Überlesen von T3 geschieht
in vitro nur bei ca. jeder 20. Transkription. Posttranskriptionell wird meistens sowohl Intron I
und Intron II gespleißt, seltener fungiert nur die Intron II-gespleißte mRNA als Matrize
(SCHNEIDER et al., 1997). Die katalytische Domäne des BDV-L ist ähnlich wie bei anderen
Mononegavirales stark konserviert (BRIESE et al., 1994; CUBITT et al., 1994;
TOMONAGA et al., 2002).
2.1.4.3 Transkription
Die Transkription des BDV-Genoms erfolgt vom 3’ zum 5’- Ende und führt zu einem
Transskriptionsgradienten, der jedoch weniger deutlich ausgeprägt ist als bei den anderen
Mononegavirales (RICHT et al., 1998; DE LA TORRE et al., 2002a,b). Das BDV wurde
aufgrund seiner untypischen Replikationsstrategie (intranukleäre Transkription und
Replikation, alternatives splicing, read through) als Prototyp der neuen Familie Bornaviridae
innerhalb der Ordnung der Mononegavirales eingeordnet (PRINGLE, 1996). Als einziges
animales Virus der Ordnung transkribiert und repliziert es sich im Zellkern (BRIESE et al.,
1992; DE LA TORRE, 1994; SCHNEEMANN et al., 1995). Wie alle negativ-orientierten
einzelsträngigen RNA-Viren mit linearem Genom besitzt das BDV einen aktiven Polymerase-
Komplex (RNP). Dieser besteht aus den Proteinen BDV-L, BDV-P und BDV-N und viraler
RNA. Der RNP wird streng über zahlreiche virale Faktoren, wie das Verhältnis von BDV-P
zu BDV-X, reguliert (SCHNEIDER et al., 2004a). Der RNP variiert durch die Einbindung

22 Literaturübersicht
unterschiedlicher Isoformen des BDV-N und BDV-P in seiner Funktion (SCHNEIDER et al.,
2003).
2.1.4.4 Persistenz
An der Etablierung der viralen Persistenz sind vermutlich mehrere Mechanismen beteiligt, die
eine Viruseliminierung durch die antivirale Immunantwort verhindern.
Einen möglichen Persistenzmechanismus stellt die für Mononegavirales außergewöhnlich
strenge Regulierung der Replikation dar. Diese Limitierung der Genomsynthese wird zu
einem durch das Kürzen des BDV-Genoms am 5’-Ende erreicht (SCHNEIDER et al., 2005),
wodurch die Vervielfältigung des Gemons reduziert wird. Zum anderen wird die Replikation
über das Verhältnis von BDV-N zu BDV-P reguliert. Für eine optimale virale Vermehrung ist
ein N/P-Verhältnis von 1:20 notwendig, bei einem Verhältnis von 1:1 wird die Replikation
behindert (SCHNEIDER et al., 2003; SCHNEIDER 2005). In persistierend infizierten Zellen
konnte eine vermehrte Menge an BDV-P festgestellt werden konnte (WATANABE et al.,
2000). Auch das BDV-X wirkt als negativ-regulierender Transskriptionsfaktor, wobei das
Verhältnis zum BDV-P entscheidend ist. Ein Verhältnis von 1:5 von BDV-X zu BDV-P
hemmt die RNA Synthese um 30%, bei einem Verhältnis von 1:1 stagniert die Synthese
(SCHNEIDER et al., 2003).
Die Akkumulation der BDV-GP Spaltprodukte im ER/cis-Golgiapparat stellt ebenfalls einen
möglichen Persistenzmechanismus dar (EICKMANN et al., 2005), wie auch die Regulierung
der Expression des BDV-GP an der Zelloberfläche. Dadurch kann die Effizienz beeinflusst
werden, mit der Viruspartikel freigesetzt werden (EICKMANN et al., 2005). Weiterhin
erscheint es möglich, dass durch eine starke Glykolisierung des BDV-GP antigenetische
Strukturen abgeschirmt werden (KIERMAYER et al., 2002). Diese nicht exprimierten oder
maskierten Epitope werden vom Immunsystem nicht erkannt und die Induktion einer
antiviralen Immunantwort bleibt aus.
In persistierend infizierten Mäusen konnte eine verminderte Avidität von CD8 + T-Zellen
gefunden werden. Dieses auf einem noch unbekannten Mechanismus beruhende Phänomen
trägt sehr wahrscheinlich ebenfalls zur Persistenz bei (ENGELHARDT et al., 2005). Die bei
der BDV-Infektion vorliegende Zytokinexpression scheint ebenfalls die virale Persistenz nicht
zu beeinflussen, wie für einige Zytokine, Chemokine und Chemokinrezeptoren bereits gezeigt

Literaturübersicht 23
werden konnte (2.1.1.3 und 2.1.2.3.). In wieweit modulierte Spiegel des Zytokins TNF, das
eine Rolle bei der Viruseliminierung spielen kann (2.2.3), die virale Persistenz unterbindet, ist
derzeit nicht bekannt.
In Zellkulturen und in Gehirnen BDV-infizierter Ratten fiel eine negative Korrelation
zwischen NF-κB Aktivierung und viraler Replikation auf (BOURTEELE et al., 2005). In
einer anderen Studie konnte gezeigt werden, dass BDV-P der Expression des antiviralen
Zytokins IFNβ entgegenwirkt und die Aktivierung zellulärer Zielproteine hemmt
(UNTERSTAB et al., 2005). Die Rolle des TNF im Rahmen der Persistenz einer BDV-
Infektion ist bisher noch nicht untersucht worden.

24 Literaturübersicht
2.2 Tumor Nekrose Faktor-α (TNF)
2.2.1 TNF und TNF- vermittelte Signalwege
TNF ist Mitglied einer großen Familie von Proteinen mit unterschiedlichsten Funktionen, die
von der Regulation der Lymphozytenproliferation bis hin zur Induktion der Apoptose reicht
(VASSALLI, 1992; WARE et al., 1995). Als Hauptmediator der akuten Entzündungsreaktion
spielt TNF sowohl in der viralen, als auch bakteriellen und parasitären Abwehr eine zentrale
Rolle (ABBAS et al., 2004).
Innerhalb des ZNS kann TNF von aktivierten Makrophagen und Mikroglia, Astrozyten und
einigen Neuronen, sowie unter pathologischen Bedingungen von infiltrierenden Lymphozyten
und Makrophagen exprimiert werden (LEE et al., 1993; HOPKINS et al., 1995). TNF wird als
nicht-glykolisiertes, menbrangebundenes, 26 kDa Transmenbranprotein synthetisiert und
bildet stabile, in der Zellmembran verankerte Homotrimere. Nach Spaltung durch eine
membran-assoziierte Metalloproteinase entsteht ein 17 kDa schweres Polypeptid
(LOCKSLEY et al., 2001). Drei dieser 17 kDa Polypeptide lagern sich zusammen und bilden
das lösliche TNF (51 kDa). Sowohl membrangebundene als auch die lösliche Form des TNF
können an die spezifischen TNF-Rezeptoren binden.
Bisher sind zwei verschiedene TNF-Rezeptoren (TNFR) beschrieben. TNFR1 (CD120a,
p55/60) wird konstitutiv in fast allen Zellen und Gewebetypen exprimiert. Die Bindung von
TNF an TNFR1 triggert zahlreiche intrazelluläre Reaktionen, die einerseits über die
Aktivierung der zwei Haupttranskriptionsfaktoren (NF-κB, c-Jun) die Transkription
proinflammatorischer und immunmodulierender Gene induzieren können (Abb. 2). Über die
Caspase-8-Kaskade kann andererseits die Apoptose ausgelöst werden (KUMAR et al., 1999;
HERBEIN und O’BRIEN, 2000; CHEN und GOEDDEL, 2002). In Neuronen finden sich die
gleichen grundlegenden Apoptoseprogramme wie in anderen Zellen, die verschiedenen Typen
von Neuronen zeigen lediglich unterschiedliche Kombinationen von Bcl-2 und Enzymen der
Caspasekaskade (YUAN und YANKNER, 2000). Nach Bindung des TNF an den TNFR1
beginnt die Apoptose mit der Ablösung des inhibitorischen Proteins silencer of death domain
(SODD) von der inneren Membranseite der Zielzelle. Nachfolgend können sich
Adapterproteine wie TNF receptor-associated death domain (TRADD), TNF-R-associated

Literaturübersicht 25
factor 2 (TRAF2), receptor-interacting protein (RIP) und Fas-associated death domain
(FADD) anlagern. Die Bindung weiterer Schlüsselenzyme wie Caspase-8 an die Adapterproteine
(Übersicht bei BAUD und KARIN, 2001) führt im weiteren Verlauf zur Aktivierung
von Caspase-3, wodurch die Fragmentierung der DNA und Apoptose initiiert wird (Übersicht
bei HERBEIN und O´BRIEN, 2000). Eine weitere Signalkaskade, an deren Ende NF-κB
steht, verläuft über die Phosphatidylinositol (PI)3-Kinase. Die PI3-Kinase stellt ein wichtiges
Überlebenssignal der Zelle dar (CANTLEY, 2002). Sie sorgt über die Serin/Threoninkinase
(Akt, Proteinkinase B) für die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB
(ROMASHKOVA und MAKAROV, 1999). Eine über den TNFR1 vermittelte
antiapoptotische Signalkaskade verläuft via Proteinkinase RIP und TRAF2, die
Schlüsselrollen bei der Aktivierung des nukleären Faktors κB (NF-κB) besitzen sollen
(KELLIHER et al., 1998; Übersicht bei HERBEIN und O´BRIEN, 2000). Durch
Phosphorilierung der Inhibitorproteine IκB wird NF-κB im Zytoplasma aktiviert und gelangt
in den Zellkern, wo es als Transkriptionsfaktor die Expression diverser Gene steuern kann.
Weiterhin soll die Aktivierung der PI3-Kinase über den TNFR1 als silencer of survival
signals verhindert werden, dieses wird wahrscheinlich über die Hemmung des wichtigen
Überlebenssignals Insulin growth factor (IGF)-1 vermittelt. (VENTERS et al., 2000).
Über den zweiten TNF-Rezeptor TNFR2 (CD120b, p75/80) ist TNF in der Lage, direkt
TRAF2 und damit NF-κB zu aktivieren (Abb. 2). Eine weitere über den TNFR2 stimulierte
Signalkaskade, an deren Ende NF-κB steht, verläuft ebenfalls über die PI3-Kinase.
TNF kann somit gleichzeitig zelluläre Überlebens- und Todessignalkaskaden einleiten. Das
Verhältnis der Aktivierung dieser Wege, insbesondere die Aktivierung von NF-κB,
entscheidet zwischen Überleben und Untergang/Apoptose der Zelle. Bezogen auf das
neuronale Gewebe wirkt TNF neurotoxisch, wenn die NF-κB Aktivität unterdrückt wird
(BOTCHKINA et al., 1999; FRIDMACHER et al., 2003) bzw. neuroprotektiv (FONTAINE
et al., 2002; VENTERS et al., 2001) über die Aktivierung von NF-κB. Es scheint, dass die
Übermittlung neuroprotektiver Signale über den TNFR2 und die Aktivierung von Akt
vermittelt werden können (FONTAINE et al., 2002). Beide TNFR sind in der Lage, NF-κB
zu aktivieren und damit die Zelle vor der Apoptose zu schützen, dabei kommt es über den
TNFR2 zu einer länger andauernden Aktivierung von NF-κB als über den TNFR1
(MARCHETTI et al., 2004).

26 Literaturübersicht
Abb. 2: TNF-vermittelte Signalwege
a) TNFR1-vermittelte Apoptose via TRADD, FADD and Caspase8
b) TNFR1-vermittelter, antiapoptotischer Übertragungsweg via TRAF2 oder RIP
c) TNFR1 Wirkung als silencer of survival signals über Inhibitierung der PI3-kinase
d) TNFR2-vermittelter, antiapoptotischer Übertragungsweg via TRAF2 and NF-κB und
vermuteter antiapoptotischer Effekt via PI3-Kinase und Phospho-Akt-Aktivierung
2.2.2 Funktionen des TNF im ZNS
Im ZNS sind Mikroglia, Astrozyten und einige Neurone in der Lage, TNF zu sezernieren
(LEE et al., 1993; HOPKINS et al., 1995). TNF wiederum induziert die Proliferation von
Astrozyten (SELMAJ et al., 1990). Rezeptoren für TNF finden sich auf Mikroglia,
Astrozyten, Neuronen und Oligodendrozyten (DOPP et al., 1997). Bei Mäusen konnte eine
konstitutive TNF-Expression in Neuronen, Glia und Mikroglia-ähnlichen Zellen im Gehirn
nachgewiesen werden, welche durch extrinsische und intrinsische Faktoren beeinflusst wurde
(GAHRING et al., 1996).
Bei einer Reihe von neurodegenerativen Erkrankungen wird eine Überproduktion von TNF
im ZNS beobachtet. Eine Übersicht über die vielfältigen neurotoxischen und neuroprotektiven
Effekte einer verstärkten TNF-Synthese am Beispiel einer HIV-Infektion des ZNS gibt

Literaturübersicht 27
Abb. 3. Deutlich erhöhte Werte von TNF und anderen proinflammatorischen Zytokinen
werden bei dem AIDS-Dementia-Komplex, Schlaganfall, Trauma, bei cerebraler Malaria,
Multipler Sklerose und Alzheimer-Krankheit beobachtet (TYOR et al., 1992; MINAGAR et
al., 2002; NELSON et al., 2002; WILLIAMS und HICHKEY, 2002). Bei transgenen
Mausmodellen mit einer TNF-Überexpression im ZNS, kann die Überproduktion von TNF
auch zu progressiven neurodegenerativen Erkrankungen führen (PROBERT et al. 1995;
AKASSOGLOU et al. 1997; TAUPIN et al., 1997).
Der neurotoxische Effekt des TNF kann über zahlreiche Mechanismen vermittelt werden.
Zum einen erhöht TNF an den Endothelzellen des Gehirns die Expression des vascular
adhesion molecule (VCAM)-1, an das aktivierte T-Zellen binden, bevor sie in das ZNS
einwandern können, und ermöglicht somit den Influx von Immunzellen (LIEBERT, 2001;
NOTTET, 2005). Zum anderen konnte gezeigt werden, dass TNF die Glutamat-Aufnahme der
Astrozyten inhibiert und über einen erhöhten extrazellulären Glutamatspiegel neurotoxisch
wirkt (FINE et al., 1996). Ein weiterer Weg, auf dem TNF neurodegenerativ wirken kann,
verläuft über die Aktivierung von Astrozyten, Makrophagen und Mikroglia. In Astrozyten
wird beispielsweise über die Aktivierung des NF-κB die Synthese von proinflammatorischen
Zytokinen angeregt (HAN et al., 2001).
Neben diesen schon lange bekannten neurotoxischen Effekten von TNF, konnte in jüngeren
Studien ebenfalls ein neuroprotektiver Effekt des TNF in ZNS nachgewiesen werden. So
konnte CHENG et al. (1994) in Gehirnzellkulturen von embryonalen Ratten eine TNFabhängige
Stabilisierung der Ca 2+ -Homöostase nachweisen, welche der Ca 2+ -abhängigen
Neurotoxizität entgegenwirkt. Eine Vorbehandlung mit TNF schützte neuronale Zellkulturen
auch vor NMDA-induzierter Exzitotoxizität (HOUZEN et al., 1997). Diesen Beobachtungen
konnten in vivo bestätigt werden. Bei TNF-transgenen Mäusen mit neuronaler TNF-
Überexpression konnte ein deutlicher Schutz der Neuronen gegen Glutamat-induzierte
Neurotoxizität in Abhängigkeit der TNF-Spiegel nachgewiesen werden (MARCHETTI et al.,
2004). Nach intrazerebraler Mikroinjektion von TNF in SJL und BALB Mäuse waren erhöhte
Werte der proinflammatorischen Mediatoren RANTES, MIP-1α und MIP-1β nachweisbar,
interessanterweise wurde nach dieser lokalen TNF-Applikation jedoch keine Infiltration von
Lymphozyten ins Gehirn beobachtet (GLABINSKI et al., 2003). TNFR-knockout Mäuse,
denen beide TNF-Rezeptoren fehlten, zeigten nach zerebraler Ischämie und Kainic-Säure

28 Literaturübersicht
induzierten Verletzungen vermehrt oxidativen Stress und reduzierte Mengen an antioxidativen
Enzymen im Vergleich zu Kontrolltieren, welches auf die fehlende neuroprotektive Wirkung
des TNF zurückzuführen ist. Weiterhin war bei diesen TNFR-knockout Mäusen die
Mikrogliaaktivierung reduziert, was die Bedeutung des TNF auf die Immunreaktion
unterstreicht (BRUCE et al., 1996).

Literaturübersicht 29
Abb. 3: Überblick über die neuroprotektiven und neurodegenerativen Eigenschaften des TNF
am Beispiel einer HIV-Infektion
Grüne Pfeile: neuroprotektive Effekte; rote Pfeile: neurodegenerative Effekte; orange Pfeile: neuroprotektive und
-degenerative Effekte; nach BRABERS und NOTTET (2006)

30 Literaturübersicht
2.2.3 Rolle des TNF bei viralen Erkrankungen
TNF gilt als eine wichtige Komponente der antiviralen Abwehr. Zum einen induziert TNF die
Expression der IFNα und IFNβ, zum anderen entfaltet es direkte antivirale Aktivität.
Gemeinsam mit den Interferonen trägt es zur selektiven Viruseliminierung durch eine direkte
Interaktion mit infizierten Gehirnzellen bei. Direkt kann TNF vor allem auf der Ebene der
Absorption und Penetration des Virus in die Wirtszelle interferieren. Einige Viren haben
jedoch Strategien entwickelt, die Signalkaskade zu manipulieren, so dass eine verstärkte TNF-
Expression die Virusreplikaktion steigert (Übersichten bei LIEBERT 2001; HERBEIN und
O’BRIEN 2000). Die Interaktion mit TNF und seinen Rezeptoren wird für zahlreiche Viren
beobachtet, wobei für beide TNF-Rezeptoren eine Beteiligung an der antiviralen Aktivität
gezeigt werden konnte (RUBY et al., 1997).
Eine antivirale Wirkung von TNF wurde für die experimentelle Masernvirus (MV)-induzierte
Enzephalitis im Mausmodell beschrieben. Die MV-induzierte Enzephalitis konnte durch
virusspezifische T-Zellen über einen synergistischen Effekt von TNF mit IFNγ kontrolliert
werden (FINKE et al., 1995). Auch für Influenzaviren wurde in der Zellkultur eine starke
antivirale Wirkung des TNF über einen noch unbekannten Mechanismus gegen aviäre,
porcine und humane Influenza Viren nachgewiesen. Die Vorbehandlung der Zellkulturen mit
TNF führte zu einer deutlichen Reduktion der viralen Replikation (SEO und WEBSTER,
2002). In Untersuchungen, die genetisch verändertes Tollwut-Virus (Rabies Virus, RV)
verwendeten, das TNF-überexprimiert, konnten ebenfalls Hinweise auf einen direkten
antiviralen Effekt des TNF unabhängig von IFNα und IFNβ nachgewiesen werden. Weiterhin
soll eine indirekte antivirale TNF-Wirkung über die Induktion der Entzündungsreaktion
vermittelt werden (FABER et al., 2005). In einer weiteren Studie mit experimentell RVinfizierten
neonatalen Mäusen konnte eine Aufregulierung von TNF-Rezeptoren und sowohl
apoptotischen als auch antiapoptotischen Genen beobachtet werden (UBOL et al., 2005).
Experimentell intraperitoneal mit West Nile Virus infizierte Mäuse ließen ebenfalls einen
Zusammenhang der Virulenz und Neuroinvasion mit dem TNF-Spiegel erkennen (SHIRATO
et al., 2006). Ferner sind immunmodulierende Effekte für γ-Herpesviren beschrieben. Sie
sollen den apoptotischen Weg der TNF-Kaskade blockieren und somit eine Aktivierung des
protektiv wirkenden Transkriptionsfaktors NF-κB bewirken, wodurch ein Überleben der

Literaturübersicht 31
virusinfizierten Zelle erzielt wurde (BERTIN et al., 1997). Auch bei der experimentellen
Infektion mit dem Respiratorischen Synzytial-Virus konnte gezeigt werden, dass eine
überschießende T-Zellreaktion über die TNF-Produktion zu einer immunpathologischen
Erkrankung führt (RUTIGLIANO und GRAHAM, 2004).
Für einige Viren ist die Interaktion mit der TNF-Signalkaskade en detail aufgeklärt worden.
MATSUMOTO et al. (1997) konnten beispielsweise zeigen, dass das Hüllprotein des
Hepatitis C-Virus an TNFR1 und Fas bindet und so die TNF-Signalkaskade moduliert.
Poxviren produzieren ein TNFR-Homolog, welches TNF mit einer hohen Affinität binden
konnte, und somit die Initiierung der TNF-Kaskade verhinderte (SCHREIBER et al., 1996,
1997).
Im Rahmen der BDV-Infektion ist bisher eine starke Aufregulierung des TNF in
experimentell infizierten Mäusen und Ratten beschrieben (SHANKAR et al., 1992; SAUDER
et al., 2000). Inwieweit diese Aufregulierung mit dem Verlauf der Entzündungsreaktion
korreliert oder eine Wechselwirkung mit der viralen Ausbreitungs- und Persistenzmechanismen
bewirkt, ist derzeit nicht bekannt.
2.2.4 TNF-transgene Mausmodelle
Zum Studium einer TNF Überexpression im Gehirn sind bereits einige TNF-transgene
Mausmodelle etabliert. In diesen TNF-transgenen Mäusen wird TNF über Promotoren der
Gene für myelin basic protein (MBP), glial fibrillary acidic protein (GFAP) und Neurofilament
(NF) sowie über den endogenen TNF-Promotor exprimiert und führt bei einigen
Mauslinien schon im Alter von weniger als zwei Monaten, bei anderen nach etwa einem Jahr
zum Auftreten spontaner pathologischer Veränderungen (PROBERT et al., 1997; TAUPIN et
al. 1997; AKASSOGLOU et al., 1998).
In den Mäusen, die das TNF über MBP exprimieren, konnten in einer Linie spontane
Demyelinisierungen beobachtet werden. Zwei andere Linien zeigten keine spontane
Pathologie, erwiesen sich jedoch empfänglicher für die Induktion einer experimentellen
autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE, TAUPIN et al., 1997). Bei einer Überexpression des
TNF unter dem GFAP-Promotor wird ebenfalls eine Demyelisierung, sowie zusätzlich
Mikroglia- und Makrophagenaktivierung beschrieben (PROBERT et al., 1997). Bei einer

32 Literaturübersicht
Expression des löslichen TNF unter dem NF-Promotor konnte ebenfalls eine
Demyelinisierung beobachtet werden. Eine Überexpression des membrangebundenen TNF
unter dem gleichen Promotor führte zu keinen spontanen Veränderungen (PROBERT et al.,
1997). Die Expression des TNF unter dem endogenen TNF-Rezeptor bewirkte eine
Demyelinisierung und Immunzellinfiltration (AKASSOGLOU et al., 1998).
Die in der vorliegenden Studie eingesetzten TNF-transgenen Mäuse exprimieren das TNF
unter dem NMDA-Promotor (3.1). Sie zeigen keine spontanen entzündlichen oder
degenerativen Veränderungen im ZNS, lediglich eine Mikrogliaaktivierung konnte in den
Gehirngebieten mit der höchsten TNF-Expression beobachtet werden (MARCHETTI et al.,
2004).

Material und Methoden 33
3 Material und Methoden
3.1 Mäuse
Die Ausgangszuchtpaare der TNF-transgenen und nicht-transgenen Mäuse mit C57Bl/6 x
BDF Hintergrund wurden freundlicherweise von PD Dr. Ulrich L. M. Eisel, Institut für
Zellbiologie und Immunologie der Universität Stuttgart, zur Verfügung gestellt. Die weitere
Nachzucht erfolgte im Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.
In den transgenen Tieren wurde das murine TNF unter der Kontrolle der NR2B Untereinheit
des NMDA-Glutamatrezeptors exprimiert (bei der Maus auch als ε2-Untereinheit bezeichnet,
Abb. 4), welche zu einer selektiven TNF-Überexpression vor allem im Ammonshorn, Cortex
cerebri, Thalamus und Striatum führte (MARCHETTI et al., 2004), was dem Verteilungsmuster
des Promotors entspricht (WATANABE et al., 1993). Die nicht-transgenen Mäuse
stammten aus der Verpaarung von heterozygot transgenen Tieren oder aus Einkreuzung von
C57Bl/6 Wildtyp (wt) Mäusen in die transgene Mauslinie.
Die Tierversuche dieser Arbeit wurden gemäß den tierschutzrechtlichen Bestimmungen für
genehmigungspflichtige Tierversuche durchgeführt (AZ. 509.6-42502-03/679).
Abb. 4: Schema des NR2B-Promotor-murinen TNF-Konstruktes
Die Exone der Promotorregion sind als weiße Kästen 1-3 angegeben. Die translatierten Exons des murinen
TNF-cDNA-Fragmentes sind als schwarze Kästen dargestellt. Am 3’- Ende befindet sich die 3’UTR des
humanen β-Globulin.
3.1.1 Tierhaltung
Kontrolltiere, BDV-infizierte und mock-infizierte Mäuse wurden unter standardisierten
Bedingungen im Tierstall des Institutes für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule

34 Material und Methoden
Hannover in einem individuell belüfteten Käfigsystem (Tecniplast Deutschland GmbH,
Hohenpeißenberg) gehalten. In jedem Käfig befand sich zusätzlich ein Mouse House TM
(Tecniplast). Die Zuchttiere wurden getrennt in einem Zuchtstall gehalten, während BDVund
mock-infizierte Tiere im Infektionsstall untergebracht wurden. Im Zuchtstall wurden die
Tiere im Überdrucksystem gehalten, während im Infektionsstall ein Unterdrucksystem
eingesetzt wurde (9.2). In beiden Räumen erfolgte die Beleuchtung durch Neonröhren in
einem 12 Stunden Tag-Nachtzyklus. Die Raumtemperatur betrug 20-24°C, bei einer relativen
Luftfeuchte von 50-60%. Als Einstreu wurde Sägemehl (ssniff bedding ¾ Faser, ssniff, Soest)
verwandt. Während der ersten 21 Lebenstage wurde energetisch hochwertiges pelletiertes
Futter (ssniff M-Z, Ereich, 15 mm energiereich) angeboten, nach dem Absetzten wurde auf
energieärmeres Futter umgestellt (ssniff R/M-Haltung, 10 mm). Wasser und Futter standen ad
libitum zur Verfügung. Alle Arbeiten mit und an den Versuchtieren wurden mit Einweghandschuhen
unter einer Sicherheitswerkbank (HeraSafe Heraeus, Kendro Laboratory
Products GmbH, Hanau) durchgeführt. Zur Desinfektion der Werkbank und als
Zwischendesinfektion aller Materialien, die mit den Tieren in Kontakt kamen, wurde 1%iges
VennoVet 1 super (Menno Chemie- Vertriebsgesellschaft mbH, Norderstedt) verwandt, die
Einwirkzeit betrug 2 Stunden bei Raumtemperatur, anschließend wurde die Werkbank für 2
Stunden mit UV-Licht bestrahlt. Die Käfige wurden nach Benutzung wöchentlich bei 123°C
und 1,15 bar für 20 Minuten autoklaviert.
3.1.2 Analyse des transgenen Status der Mäuse mittels quantitativer
Polymerase Kettenreaktion (qPCR)
Die DNA zur Analyse des transgenen Status wurde aus Mäuseschwänzen mittels des
E.N.Z.A. ® Tissue DNA Mini Kits (PEQLAB, Erlangen) gemäß dem Herstellerprotokoll
isoliert. Zur Ermittlung des transgenen Status der Tiere wurde das Comparative Quantitation
Protocol des Mx 4000 Multiplex Quantitativen Polymerase Kettenreaktion (PCR) Systems
(Stratagene ® Europe, Amsterdam, Niederlande) gewählt und SYBR-Green ® I (Stratagene ® ) als
Farbstoff eingesetzt.
DNA eines im Herkunftsbestand homozygot getesteten Tieres wurde als Kalibrator benutzt,
das Housekeeping-Gen Glyceraldehyd-3-phosphat Dehydrogenase (GAPDH) fungierte als

Material und Methoden 35
Normalizer. Zur weiteren Normalisierung wurde der passive Referenz-Farbstoff ROX
verwendet. Je ein definiertes Tier der drei unterschiedlichen Mausgruppen (homozygot,
heterozygot und nicht-transgen) wurde in jedem Lauf als Kontrolle mitgeführt. Alle Proben
wurden in einem Doppelansatz gemessen. Tiere mit einer relativen Quantität (dRN) von 0,0
wurden als nicht-transgen bewertet. Eine dRN von 0,3 – 0,7 wurde als heterozygot und eine
dRN größer oder gleich 0,8 als homozygot transgen eingestuft.
Die verwendeten Primer sind in Tab. 1 aufgeführt. In Tab. 2 findet sich der PCR-Ansatz, das
Temperaturprofil ist im Anschluss an den Ansatz angegeben. TNF und der Normalizer
wurden unter der gleichen Reaktions- und Temperaturbedingungen inkubiert.
Das Prinzip der Comperative Quantitation basiert darauf, dass die Differenz des
Schwellenwertes (threshold cycle, Ct) des interessierenden Gen (gene of interest, GOI, hier
TNF) und der Ct eines Normalizer (ein Housekeeping-Gen, hier GAPDH) gebildet wird (∆Ct,
Abb. 5). Diese wird sowohl für die unbekannten Proben, als auch für den Kalibrator (in
diesem Fall: DNA eines im Herkunftsbestand homozygot getesteten Tieres), durchgeführt.
Anschließend wird für jede unbekannte Probe die Differenz des berechneten ∆Ct mit dem ∆Ct
des Kalibrators gebildet (∆∆Ct). Unter der Vorraussetzung, dass die Effizienz der PCR für das
GOI und den Normalizer, als auch die Menge des GOI und des Normalizers in den Proben
annährend gleich sind, und unter der Annahme, dass die Effizienz der PCR gegen 2 geht, d.h.
dass sich die Anzahl der Amplifikate bei jedem Lauf verdoppelt, berechnet sich die relative
Quantität nach folgender Formel:
relative Quantität = 2 -∆∆Ct (Abb. 5)
Abb. 5: Berechnung der relativen Quantität eines Genes
Ct GOI - Ct norm
∆Ct Probe - ∆Ct Kalibrator
= ∆Ct
= ∆∆Ct
Relative Quantität = 2 -∆∆Ct
Ct: Schwellenwert (threshold cycle), GOI: gene of interest (TNF),
norm: Normalizer (GAPDH), Kalibrator: sicher homozygotes Tier

36 Material und Methoden
Tab. 1: Primer zur Analyse des transgenen Status der Mäuse
Gen
Acc.-No
Primer Sequenz 5’-3’
TNF-transgen
Konstrukt
sense
(NMDA tg42)
CTG GAT ATT CCC AAC ATG CG
keine Acc.-No
antisense
(mTNFseq3)
CCC CGA ACG TCA GTA GAC AG
Murines
GAPDH
sense
GAG GCC GGT GCT GAG TAT GT
GI: 6679936
antisense
GGT GGC AGT GAT GGC ATG GA
TNF: Tumor Nekrose Faktor, GAPDH: Glyceraldehyd-3-phosphat Dehydrogenase,
Acc.-No: GenBank ® -Accession-Nummer, bp: Basenpaare
Tab. 2: Herstellung eines 25µl qPCR-Reaktionsansatzes (qPCR-Mastermix)
Reagenz
qPCR-Mastermix
Konz. Stamm-
Lsg.
Volumen
DEPC-Aqua bidest. ad 24,00 µl
Länge des
Amplikons
251 bp
288 bp
Konz.
25µl-qPCR-MM
Core PCR buffer 10 x 2,50 µl 1 x
MgCl2 50 mM 1,25 µl 2,5 mM
dNTP-Mix 20 mM 1,00 µl 800 µM
s Primer 15 µM 0,25 µl 150 nM
as Primer 15 µM 0,25 µl 150 nM
Glycerol 50% 4,00 µl 8%
DMSO 100% 0,75 µl 3%
Sybr ® Green I dye 5 x 2,50 µl 0,5 x
Rox reference dye 2 µM 0,38 µl 30 nM
SureStart ® Taq DNA
Polymerase
25 µl qPCR-Ansatz
5 U/µl 0,25 µl 1,25 U/25µl
Mastermix 24 µl
DNA (aus Mäuseschwänzen) 1 µl
Gesamt 25 µl
dNTP-Mix: Desoxynukleotid-Mix, Konz. Stamm-Lsg: Konzentration der Stammlösung,
Konz. 25µl qPCR-MM: Konzentration im q-PCR Mastermix, s: sense, as: antisense
Die qPCR wurde für TNF und GAPDH nach folgendem Temperaturprofil durchgeführt:

Material und Methoden 37
Denaturierung & Aktivierung der SureStart ® Taq: 95°C für 10 Minuten
40 Zyklen Denaturierung: 95°C für 30 Sekunden
Annealing: 55°C für 1 Minute
Elongation: 72°C für 30 Sekunden
41 Zyklen
Ende
Schmelzkurve 55°C ↑ für 30 Sekunden
Zur Erstellung der Schmelzkurve wurde mit jedem Zyklus die Temperatur um 0,5° C erhöht.
Anhand der Schmelzkurve konnte die Spezifität der Primerbindung überprüft werden. Eine
spezifische Schmelzkurve war Vorraussetzung für die Auswertung der qPCR-Analyse.
3.2 Viruspräparation
Die verwendete mausadaptierte BDV-Präparation wurde freundlicherweise von Prof. Dr.
Peter Staeheli, Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Abt. Virologie, Albert-
Ludwigs-Universität Freiburg, zur Verfügung gestellt. Sie wurde für weitere Versuche
entsprechend vermehrt und passagiert. Die steril entnommenen BDV-infizierten
Mäusegehirne wurden in Baby Hamster Kidney (BHK)-21 Medium (Glasgow-MEM,
Invitrogen TM ehem. Gibco, Karlsruhe) durch Ultraschall homogenisiert, aliquotiert und bei
-80°C gelagert. Der Virustiter wurde freundlicherweise von Frau Dr. Sibylle Herzog, Institut
für Virologie der Justus-Liebig-Universität, Gießen bestimmt und lag bei 6 x 10 5 ID50/ml.
Unmittelbar vor der Infektion wurde die Virussupension in BHK-21 Medium 1:10 verdünnt.

38 Material und Methoden
3.3 Versuchsdurchführung und Versuchsablauf
Die im Versuch eingesetzten Mäuse wurden gemäß ihrem transgenen Status (3.1.2) in die drei
Gruppen nicht-transgen (ntg), heterozygot transgen (tg+/-) und homozygot transgen (tg+/+)
unterteilt. Aus diesen drei Gruppen wurden pro Untersuchungszeitraum jeweils 5 Tiere BDVinfiziert
und 2 Tiere mock-infiziert. Weiterhin wurden aus jeder Gruppe 4 Kontrolltiere
rekrutiert.
Tragende Zuchtmäuse wurden geburtsnah zweimal täglich kontrolliert und neugeborene
Würfe innerhalb der ersten 24 Lebensstunden in den Infektionsstall verbracht. Als Kontrollen
dienten mock-infizierte und nicht-infizierte Mäuse. Alle Tiere wurden mit 21 Tagen (d) von
den Müttern abgesetzt, nach Geschlechtern getrennt, per Ohrloch markiert und auf ihren
transgenen Status getestet (3.1.2). Die Tötung fand am 7., 14., 21., 28., 35., 42., 49. Tag nach
der Infektion (post infectionem, p.i.) in tiefer Injektionsnarkose (Trapanal ® , Thiopental-
Natrium) statt. Die Blutentnahme erfolgte aus den Schwanzgefäßen mit Hilfe einer
Mikrovette (Sarstedt AG & Co, Nümbrecht) ab 21 Tage p.i. in der tiefen Narkose unmittelbar
vor der Tötung. Eine Übersicht über die zu den jeweiligen Zeitpunkten durchgeführten Untersuchungen
geben Tab. 3 und Tab. 4.

Material und Methoden 39
Tab. 3: Durchgeführte Untersuchungen an Gehirnen BDV-infizierter Mäuse und Kontrolltieren
Tage p.i. 7 14 21 28 35 42 49
Histologie HE HE HE HE HE HE HE
Immun- GFAP GFAP GFAP GFAP GFAP GFAP GFAP
histologie
Mac-1alpha Mac-1alpha
CD3 CD3
CD4 CD4
CD8 CD8
CD25 CD25
CD45R CD45R
BDV-N BDV-N BDV-N BDV-N
BDV-GP
BDV-M
BDV-N BDV-N BDV-N
Doppel-
-ssBDV-N/ GFAP
markierung
+ssBDV-N/ GFAP
+ssBDV-GP/
GFAP
+ssBDV-I I/
GFAP
-ssBDV-N/
CNPase
+ssBDV-N/
CNPase
+ssBDV-GP/
CNPase
+ssBDV-I I/
CNPase
ISH
+ssBDV-N
+ssBDV-N
+ssBDV-N
-ssBDV-N
-ssBDV-N
-ssBDV-N
(Nachweis
+ssBDV-GP
+ssBDV-GP
+ssBDV-GP
von +ssRNA
-ssBDV-GP
-ssBDV-GP
-ssBDV-GP
und
+ssBDV-I I
-ssRNA)
-ssBDV-I I
qRT-PCR
+ssBDV-N +ssBDV-N
+ssBDV-GP +ssBDV-GP
(Nachweis
+ssBDV- I I +ssBDV-I I
von +ssRNA) +ssBDV-AG +ssBDV-AG
Nachweis
inf.Virus
IIFT IIFT
p.i.: post infectionem, HE: Hämatoxylin-Eosin-Färbung, ISH: in situ Hybridisierung, qRT-PCR: quantitative Reverse
Transkriptase-Polymerase Kettenreaktion, GFAP: saures Gliafaserprotein, CD: cluster of differentiation, Oberflächenantigene,
BDV-N: BDV-Nukleoprotein, BDV-GP: BDV-Glykoprotein, BDV-M: BDV-Matrixprotein, BDV-I I: BDV-
Intron I, BDV-AG: BDV-Antigenom, IIFT: Indirekter Immunfluoreszenz-Test
Tab. 4: Übersicht über die weiteren durchgeführten Untersuchungen
Tage p.i. 7 14 21 28 35 42 49
Klinische
Untersuchung
alle Tests alle Tests alle Tests alle Tests alle Tests
Serologie
ntg
tg+/-, tg+/+ tg+/- tg+/tg+/+
tg+/+
tg+/+ tg+/+
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgen, tg+/-: heterozygot transgen, tg+/+: homozygot transgen

40 Material und Methoden
3.3.1 Infektion
Transgene und nicht-transgene Mäuse der Infektionsgruppe wurden innerhalb der ersten 24
Stunden post natum intra cerebral (i.c.) in die linke Großhirnhemisphäre infiziert. Dazu
wurden ca. 10 µl der 10%igen BDV-haltigen Gehirnsuspension (3.2) mit einer Hamilton-
Spritze (Hamilton, Bonaduz, Schweiz) inokuliert. Den Tieren der mock-Infektionsgruppe
wurde eine gleichartige Gehirnsuspension, welche aus Gehirnen nicht-infizierter Kontrolltiere
hergestellt wurde, i.c. injiziert.
3.3.2 Klinische Untersuchung und statistische Auswertung
Die Tiere wurden einmal wöchentlich klinisch untersucht. Das Untersuchungsprotokoll
umfasste die Erhebung von Gewicht, Aktivität, Bewegung auf Käfiggitter und Plexiglas,
Balancierfähigkeit, Hängtest, Lauf auf einem in der Luft schwebenden Hamsterlaufrad,
Provokationsproben, Greifreflex und Flexorreflex, Aufrichtungsreaktion, Tischkantenprobe
sowie die Beurteilung von Fell und Haltung. Weiterhin wurden die Tiere nach dem von
HAUSMANN et al. (2001) beschriebenen Score bewertet (Tab. 5). Das Gewicht wurde mit
einer digitalen Laborwaage (PC180, Mettler-Toledo GmbH, Gießen) erhoben. Zur Bewertung
der Gewichtsentwicklung wurden die Gewichte der Tiere aufgetragen, die 42 und 49 Tage p.i.
seziert wurden. In allen Gruppen war die Anzahl der weiblichen und männlichen Tiere
zufällig verteilt. Die Aktivität der Tiere wurde anhand einer semiquantitativen
Schätzwertskala bewertet, dabei bedeutete 0=normal aktiv, 1=geringgradig hyperaktiv,
2=mittelgradig hyperaktiv und 3=hochgradig hyperaktiv, -1=geringgradig hypoaktiv,
-2=mittelgradig hypoaktiv, -3=apathisch. Das Laufen auf dem Gitter und Plexiglas wurde
anhand einer semiquantitativen Schätzwertskala, von 0=sicher, 1=geringgradig unsicher,
2=mittelgradig unsicher bis 3=hochgradig unsicher, bewertet. Das Balancieren auf einem
Stab wurde ebenfalls anhand einer semiquantitativen Schätzwertskala, von 0=sicher,
1=geringgradig unsicher, 2=mittelgradig unsicher, 3=hochgradig unsicher bis 4=Balancieren
aufgrund höchstgradiger Unsicherheit nicht möglich, bewertet. Beim Hängtest wurde mit
einer Stoppuhr die Zeit gemessen, die die Mäuse benötigten um aus einer über Kopf
hängenden Position ins Innere eines Hamsterrades zu klettern. Während des Laufens auf

Material und Methoden 41
einem in der Luft schwebenden Hamsterlaufrad wurde die Aktivität, Sicherheit des Ganges,
sowie die Art der Fußung deskriptiv erfasst, während sie auf dem sich kontrolliert drehenden
Hamsterrad nahezu senkrecht nach oben laufen mussten. Dabei wurde auch bewertet ob sie
alle vier Gliedmaßen benutzten oder sich teilweise nur mit den Vordergliedmaßen hochzogen.
Weiterhin wurde die Aktivität auf dem Rad bewertet. Zur Beurteilung der
Provokationsproben der N. trigeminus und N. facialis wurde eine semiquantitative Schätzwertskala
angewandt, dabei bedeutete 0=Reaktion unverändert, 1=geringgradige Hyperästhesie,
2= hochgradige Hyperästhesie, -1=geringgradige Hypoästhesie, -2=geringgradige
Hypoästhesie. Die Beurteilung des Flexor- und des Greifreflexes wurde ebenfalls anhand
einer semiquantitativen Schätzwertskala von 0=normaler Reflex, 1=gesteigerter Reflex,
2=Klonus, -1=herabgesetzter Reflex, -2=Reflex abwesend, durchgeführt. Auch die
Aufrichtereaktion und die Tischkantenprobe wurden mittels semiquantitativer
Schätzwertskala beurteilt, welche in 0=Reaktion unverändert, 1=verminderte Reaktion,
2=abwesende Reaktion unterteilt wurde. Abschließend wurde das Fell der Tiere auf seine
Beschaffenheit (glatt, glänzend, rau, stumpf, struppig) beurteilt, sowie die Körperhaltung
begutachtet, mit besonderem Augenmerk auf abnorme Kopfhaltungen und Gliedmaßenstellungen.
Tab. 5: Grad zur Bewertung der klinischen Symptome nach HAUSMANN et al. (2001)
Grad Symptome
0 keine Symptome
1 geringgradige Ataxie
2 deutliche Ataxie, Torticollis, raues Fell oder aufgekrümmter
Rücken, Anheben am Schwanz: charakteristische
Hinterbeinhaltung (Beine vor dem Bauch verschränkt)
3 Gewichtsverlust, schwere Ataxie und Torticollis, Parese, Apathie,
moribunder Zustand
Die statistische Aufarbeitung der erhobenen Daten erfolgte in Zusammenarbeit mit dem
Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung der Stiftung
Tierärztlichen Hochschule Hannover. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung des
Programms SAS (Statistical Analysis System, Version 9.1, SAS Institute Inc., 1999) mit dem

42 Material und Methoden
Kruskal-Wallis-Test und dem Wilcoxon Zwei Stichproben-Test paarweise verglichen.
Ergebnisse mit p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Die Gewichtsdaten
wurden zuerst mittels Kolmogorov-Smirnov-Test auf Normalverteilung untersucht und
anschließend mit Varianzanalysen (Prozedure MIXED) auf Unterschiede zwischen den
Mausgruppen, den Infektionsgruppen und den Infektionszeitpunkten geprüft.
3.3.3 Probenentnahme und untersuchte Gehirnregionen
Je eine Gehirnhälfte wurde für ca. 24 Stunden in gepuffertem 10%igem Formalin fixiert und
anschließend in Paraffin eingebettet, die jeweils andere Hälfte wurde in Tissue-Tek ®
O.C.T. TM -Compound (OCT, Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Niederlande) eingebettet
und nach Schockgefrierung bei -80°C gelagert. Die Gewebeproben wurden für die
histologischen und immunhistologischen Untersuchungen, sowie die in situ Hybridisierung
(3.6) und die quantitative reverse Transkriptase-PCR (qRT-PCR, 3.8) verwandt.
Die Formalin-fixierten Gehirnhälften wurden auf Höhe der Ebene 1, 2 und 3 transversal
geschnitten (Abb. 6 und Abb. 7). Die OCT-eingebettete Gehirnhälfte wurde in der Ebene 2
und 3 transversal geschnitten und die drei resultierenden Hirnteile separat schockgefroren.
Abb. 6: Aufsicht auf ein Mäusegehirn
(nach Neurogenetics at UT Health Science Center ©1999 RW Williams, design by
AG Williams, atlas by T Capra http://www.mbl.org/atlas170/atlas170_frame.html)
Balken = 1 mm; : Bregmapunkt.

Material und Methoden 43
Ebene 1: Ebene 2: Ebene 3:
Bregma: 1.34 mm Bregma: -2.18 mm Bregma: -5.88 mm
Interaural: 5.14 mm Interaural: 1.62 mm Interaural: -2.08 mm
Abb. 7: Transversale Schnittebenen
Bregma bezeichnet den Schnittpunkt der Sutura coronaria mit der Sutura sagittalis. Interaural bezieht sich auf
eine Linie zwischen den beiden äußeren Gehörgängen. Nach PAXINOS und FRANKLIN, 2001 und
Neurogenetics at UT Health Science Center ©1999 RW Williams, design by AG Williams, atlas by T Capra,
http://www.mbl.org/atlas170/atlas170_frame.html
Damit konnten Cortex cerebri, Striatum, Ammonshorn, Thalamus, Hypothalamus,
Cerebellum und Medulla oblongata in die Untersuchung einbezogen werden.
Aus dem Formalin-fixierten Gehirngewebe der entsprechenden Ebenen wurden nach Paraffin-
Einbettung 4 µm dicke Serienschnitte hergestellt und auf SuperFrost ® Plus Objektträger
aufgezogen. Die OCT-eingebetteten Gehirnscheiben wurden zur RNA-Isolierung (3.8.1) und
zur Herstellung von 5 µm dicken Gefrierschnitten für die Immunhistologie (3.5) verwandt.
Diese wurden ebenfalls auf SuperFrost ® Plus Objektträger aufgezogen und nach ca. 30
minütiger Lufttrocknung 10 Minuten in Aceton fixiert und nach erneuter Trocknung bei
-80°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.

44 Material und Methoden
3.4 Histopathologische Präparation
Die histologische Untersuchung wurde zum Nachweis der Entzündungszellinfiltration, der
Aktivierung von Mikroglia und Astrozyten, sowie zur Bewertung der Satellitose verwandt.
3.4.1 Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung
Die Färbung der Paraffinschnitte erfolgte automatisiert in einem Färbecenter Leica ST 4040
(Leica Mikrosystems Nussloch GmbH, Nussloch) nach einem standardisierten Laborprotokoll
mit Hämatoxylin und Eosin.
3.4.2 Auswertung und Statistik
Die Auswertung der Gehirnschnitte erfolgte semiquantitativ und berücksichtigte Anzahl und
Stärke der Entzündungszellinfiltrate, Grad der Mikroglia-Aktivierung, der Aktivierung der
Astrozyten.
Das Ausmaß der histopathologischen entzündlichen Veränderungen wurde bei 200-facher
Gesamtvergrößerung nach folgendem Schlüssel bewertet:
obb = keine Veränderungen
+ = vereinzelte Infiltrate (max. 4), nur wenige Gehirngebiete betroffen, perivaskulär
maximal eine Schicht von Entzündungszellen, bis zu 5 aktivierte Mikroglia das
Entzündungszellinfiltrat umgebend
++ = sieben oder mehr Infiltrate, verschiedene Gehirnregionen betroffen, perivaskulär
überwiegend ein bis zwei Zellschichten, bis zu 20 aktivierte Mikroglia das
Entzündungszellinfiltrat umgebend
+++ = in vielen Gehirnregionen perivaskuläre Entzündungszellinfiltrate mit drei und mehr
Zelllagen und parenchymaler Infiltration in der Umgebung der perivaskulären
Infiltrate, deutliche Mikrogliaaktivierung mit mehr als 20 aktivierte Mikroglia das
Entzündungszellinfiltrat umgebend

Material und Methoden 45
In einigen Fällen waren auch Übergänge zwischen dieser Einteilung vorhanden, diese wurden
als (+), +(+) oder ++(+) angegeben. Weiterhin wurden die Augen nach dem gleichen
Schlüssel auf das Vorhandensein von entzündlichen Veränderungen beurteilt.
Zur Auswertung der Mikrogliaaktivierung wurde jeweils ein, das Zentrum eines
Entzündungszellinfiltrat beinhaltendes, Gesichtsfeld bei 400-facher Vergrößerung ausgezählt
und aus den einzelnen Werten eines Tieres ein arithmetischer Mittelwert gebildet. Aus diesen
tierspezifischen Werten wurde wiederum für jede Infektionsgruppe der arithmetische
Mittelwert gebildet.
Der Grad der Astrozytenaktivierung wurde bei 200-facher und 400-facher Gesamtvergrößerung
nach folgendem Schlüssel bewertet:
obb = keine Veränderungen
+ = vereinzelte aktivierte Astrozyten in der Umgebung der Entzündungszellinfiltrate
++ = zahlreiche aktivierte Astrozyten in der Umgebung der Entzündungszellinfiltrate,
teilweise mit degenerierten Zellkernen
+++ = zahlreiche aktivierte Astrozyten in der Umgebung der Entzündungszellinfiltrate,
häufig mit degenerierten Zellkernen,
In einigen Fällen waren auch Übergänge zwischen dieser Einteilung vorhanden, diese wurden
als (+), +(+) oder ++(+) angegeben.
Weitere Kriterien zur Beurteilung der Astrogliose sind in dem Kapitel zur Immunhistologie
(3.5.4) beschrieben.
Die statistische Aufarbeitung der bei der Untersuchung erhobenen Daten erfolgte in
Zusammenarbeit mit dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung
der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung des
Programms SAS (Statistical Analysis System, Version 9.1, SAS Institute Inc., 1999) auf
Gruppenunterschiede mit dem Kruskal-Wallis-Test verglichen. Anschließend wurde als nichtparametrische
Ein-Weg-Varianzanalyse der Wilcoxon Zwei Stichproben-Test zum
paarweisen Gruppenvergleich angewandt, da die Daten nicht normalverteilt waren.
Ergebnisse mit p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

46 Material und Methoden
3.5 Immunhistologie
Die Immunhistologie wurde zum einen zum Nachweis der BDV-spezifischen Proteine, zum
anderen zur Differenzierung der in das Gehirn einwandernden Entzündungszellen eingesetzt.
Weiterhin konnte mittels Immunhistologie die Astrogliose und die Mikrogliaaktivierung
zusätzlich beurteilt werden.
3.5.1 Antikörper und Seren
Die primären Antikörper wurden, soweit nichts anderes angegeben ist, in PBS mit einem
Zusatz von 1%igem bovinen Serumalbumin (BSA) verdünnt, in Einzelfällen wurde zur
Verdünnung PBS mit 20%igem Schweinenormalserum (SNS) verwandt (Tab. 6).
3.5.1.1 BDV-Antikörper
Der gegen das BDV-Nukleoprotein (BDV-N, 38/40 kDa) gerichtete monoklonale Antikörper
Bo18 wurde freundlicherweise von Frau Dr. Sibylle Herzog, Institut für Virologie der Justus-
Liebig-Universität, Gießen, zur Verfügung gestellt.
Die polyklonalen Antikörper gegen das BDV-Matrixprotein (BDV-M, 16 kDa) und das BDV-
Glykoprotein (BDV-GP, 94 kDa) wurden freundlicherweise von Herrn PD Dr. Jürgen A.
Richt, National Animal Disease Center, Ames, USA, zur Verfügung gestellt (Tab. 6).
3.5.1.2 Saures Gliafaserprotein (glial fibrillary acidic protein, GFAP)-Antiserum
Zum Nachweis des zytoplasmatischen GFAPs in Astrozyten wurde ein polyklonales Rinder-
Gliafaserprotein-Antiserum aus dem Kaninchen verwandt (DakoCytomation, Hamburg, Tab.
6).

Material und Methoden 47
3.5.1.3 CNPase (2’,3’-cyclic nucleotide 3’-Phoshodiesterase)
Zum Nachweis von Oligodendrozyten im Rahmen der Doppelmarkierungen (3.7.1) wurde ein
monoklonaler Antikörper gegen CNPase eingesetzt (Maus-anti-CNPase, CHEMICON ®
International, Ltd, Hampshire, United Kingdom). Dieses Enzym befindet sich im Myelin der
Oligodendrozyten und Schwann Zellen. Um den Antikörper auf Mausgewebe einsetzen zu
können, wurde das DakoCytomation Animal Research Kit ARK TM Peroxidase angewandt.
Das Prinzip des Kits beruht auf einer initialen in vitro Bindung von Erst- und Zweitantikörper
(Tab. 6).
3.5.1.4 Mac-1 alpha
Aktivierte Mikroglia und Makrophagen wurden mittels eines monoklonalen Antikörpers
gegen das Mac-1 alpha (CD11b)-Antigen (eBioscience, San Diego, USA) markiert (Tab. 6).
3.5.1.5 Lymphozytenmarker
Als Pan-T-Zellmarker wurde das polyklonale Antiserum gegen CD3 (DakoCytomation)
verwendet. Subpopulationen, wie Th1-Helferzellen, zytotoxische T-Zellen und regulatorische
T-Zellen wurden mit monoklonalen Antikörpern gegen CD4 (BD Biosciences, Heidelberg),
CD8 (BD Biosciences) und CD25 (BD Biosciences) bestimmt. Als Marker für B-Zellen
wurde ein monoklonaler Antikörper gegen CD45R (BD Biosciences) angewandt. Dieser
Antikörper ist biotiniliert und wurde daher ohne Zweitantikörper eingesetzt. Von dem
Antikörper gegen CD45R werden reife und unreife B-Zellen erkannt, auf Plasmazellen und
einer Subpopulation der B-Gedächtniszellen ist die Expression allerdings vermindert (Tab. 6).
3.5.1.6 Kontrollseren
Als Kontrolle für die monoklonalen Antikörper wurde Aszites nicht immunisierter Balb/cJ-
Mäuse (Biologo, Kronshagen) eingesetzt. Als Negativkontrolle für die polyklonalen
Antikörper wurde das Serum gesunder Kaninchen (Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen)
verwendet, das nach dreistündiger Sedimentation durch Zentrifugation für 10 Minuten bei
1500 x g gewonnen wurde.

48 Material und Methoden
3.5.1.7 Sekundäre Antiseren
Als Zweitantikörper bei Verwendung monoklonaler Antikörper wurde ein biotinilierter Ziegeanti-Maus-Antikörper
(Vector Laboratories, Burlingame, USA) oder ein biotinilierter
Kaninchen-anti-Ratte Antiserum (Vector Laboratories) verwendet (Tab. 6). Bei Verwendung
eines polyklonalen Primärantikörpers aus dem Kaninchen diente ein biotinilierter Ziege-anti-
Kaninchen-Antikörper (Vector Laboratories) als sekundäres Antiserum.
3.5.1.8 Blockseren
Zum Blockieren unspezifischer Bindungsstellen im Gewebe wurde standardmäßig Ziegennormalserum
(ZS) eingesetzt. Das Serum wurde von gesunden Tieren der Klinik für kleine
Klauentiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover gewonnen (9.4).
Tab. 6: Spezifität, Klon, Vorbehandlung und Verdünnung der verwendeten Primärantikörper
Primärantikörper
zum
Nachweis von
Klonalität und
Spezifität des
Primärantikörpers
Vorbehandlung
Formalin-fixiertes Paraffin-eingebettes Gewebe
BDV-N
BDV-GP
BDV-M
GFAP
CNPase
Monoklonal,
Maus-anti-BDV-N
(Bo18)
Polyklonal,
Kaninchen-anti-BDV-GP
Polyklonal,
Kaninchen-anti-BDV-M
Polyklonal,
Kaninchen-anti-Rind
Monoklonal,
Maus-anti-Human
OCT-eingebettetes Gewebe
Mac-1 alpha
(CD11b)
CD3
CD4
Monoklonal,
Ratte-anti-Maus
Polyklonal,
Kaninchen-anti-Human
Monoklonal,
Ratte-anti-Maus
Verdünnung
keine 1:500
keine 1:800
keine 1:200
keine 1:1000
Target retrival
solution 15’,
95°C
1:200
keine 1:3000
keine 1:3000
keine 1:2000
Puffer
PBS
1% BSA
PBS mit
20% SNS
PBS mit
20% SNS
PBS mit
20% SNS
PBS
1% BSA
PBS
1% BSA
PBS
1% BSA
PBS
1% BSA
Blocking-
Serum
ZS
ZS
ZS
ZS
ZS
ZS
ZS
ZS
Sekundärantikörper
(biotiniliert)
Ziege-anti-
Maus
Ziege-anti-
Kaninchen
Ziege-anti-
Kaninchen
Ziege-anti-
Kaninchen
Ziege-anti-
Kaninchen
Kaninchenanti-Ratte
Ziege-anti-
Kaninchen
Kaninchenanti-Ratte

Material und Methoden 49
CD8
CD25
CD45R
Monoklonal,
Ratte-anti-Maus
Monoklonal,
Ratte-anti-CD25
biotiniliert
Monoklonal,
Ratte-anti-CD45R
biotiniliert
keine 1:6000
keine 1:1200
keine 1:2000
PBS
1% BSA
PBS
1% BSA
PBS
1% BSA
ZS
Kaninchenanti-Ratte
/ /
/ /
ZS: Ziegennormalserum, PBS: phosphat buffered saline, BSA: Bovines Serumalbumin, GFAP: saures Gliafaserprotein,
CNPase: 2’,3’-cyclic nucleotide 3’-Phoshodiesterase, CD: cluster of differentiation, Oberflächenantigene,
BDV-N: BDV-Nukleoprotein, BDV-GP: BDV-Glykoprotein, BDV-N: BDV-Nukleoprotein
3.5.2 Protokolle der immunhistologischen Färbungen (ABC-Methode)
Der Nachweis der Antigene erfolgte in Anlehnung an die von HSU et al. (1981) beschriebene
und von WÜNSCHMANN et al. (1997) modifizierte Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex
(ABC)- Methode:
3.5.2.1 Protokoll für Formalin-fixierte und in Paraffin-eingebettete Schnitte
1. Aufziehen der Paraffinschnitte auf Superfrost ® plus Objektträger, anschließend im
Wärmeschrank bei 57°C mindestens 30 Minuten trocknen lassen.
2. Entparaffinierung der Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe: Rotihistol ® (2 x 5
Minuten), Isopropylalkohol (5 Minuten), 96%iger Alkohol (3 Minuten).
3. Hemmung der endogenen Peroxidase mittels 197 ml Alkohol + 3 ml 30% H2O2 für 30
Minuten bei Raumtemperatur auf einem Magnetrührer.
4. Dreimaliges Waschen der Schnitte in PBS (9.3.1) für je 5 Minuten.
5. Demaskierung der Antigene je nach verwendetem Primärantikörper (Vorbehandlung,
Tab. 6)
6. Dreimaliges Waschen der Schnitte in PBS für je 5 Minuten.
7. Verbringen der Schnitte in Coverplates TM und Sequenza ® -Einsätze (Thermo Electron,
Dreieich) und Auftragen von 100 µl Blocking-Serum (Tab. 6) zum Blockieren
unspezifischer Bindungsstellen.
8. Auftragen von je 100 µl verdünntem (Tab. 6) Primärantikörper bzw. Kontrollserum
und Inkubation der Schnitte über Nacht bei 4°C im Kühlschrank.

50 Material und Methoden
9. Schnitte auf Zimmertemperatur erwärmen (mind. 30 Minuten), dann dreimaliges
Waschen der Schnitte in PBS für je 5 Minuten.
10. Auftragen von je 100 µl 1:200 verdünntem Sekundärantikörper (Tab. 6), Inkubation
für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
11. Dreimaliges Waschen der Schnitte in PBS für je 5 Minuten.
12. Inkubation der Schnitte mit je 100 µl Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC-Elite
Standard (PK-6100), Vector Laboratories) für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
(Herstellung des ABC-Komplexes mindestens 30 Minuten vor Gebrauch).
13. Dreimaliges Waschen der Schnitte in PBS für je 5 Minuten, anschließend Umsetzen
der Schnitte in TBS-gefüllte Glasküvetten.
14. Inkubation der Schnitte mit 3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB, 9.3.1) für
10 Minuten auf dem Magnetrührer bei Raumtemperatur.
15. Waschen der Schnitte zweimal in PBS für je 5 Minuten, einmal 5 Minuten unter
fließendem Leitungswasser.
16. Gegenfärbung der Schnitte für ca. 15- 30 Sekunden bis zur gewünschten Farbintensität
in Hämalaun nach Mayer (Carl Roth KG, Karlsruhe).
17. Bläuen der Schnitte unter fließendem Leitungswasser für 10 Minuten.
18. Dehydrieren der Schnitte in aufsteigender Alkoholreihe: 50%iger, 70%iger, 96%iger
Alkohol für jeweils 3 Minuten, Isopropylalkohol (5 Minuten), Essigsäure-butylester
(EBE, 2 x 5 Minuten).
19. Maschinelles Eindecken der Schnitte mit Hilfe eines Eindeckautomaten (Promounter
RCM 2000, Medite Medizintechnik, Burgdorf).
Für den Nachweis des BDV-GP und BDV-M wurden die Schnitte ab Schritt 7 liegend in
feuchten Kammern inkubiert anstatt Coverplates TM zu verwenden. Dazu wurde das Gewebe
mit einem Fettstift (DakoCytomation Pen, DakoCytomation) umrandet.

Material und Methoden 51
3.5.2.2 Protokoll für unfixierte in OCT-eingebettete Gefrierschnitte
1. Aufziehen der Gefrierschnitte auf Superfrost ® Plus Objektträger, anschließend bei
Raumtemperatur 30-45 Minuten trocknen lassen.
2. Schnitte 10 Minuten in Aceton fixieren, danach 60-90 Minuten bei Raumtemperatur
trocknen lassen.
3. Gewebe mit Fettstift (DakoCytomation Pen, DakoCytomation) umranden und Schnitte
in PBS-gefüllte Glasküvetten (9.3.1) einsetzen.
4. Hemmung der endogenen Peroxidase mittels 197 ml PBS + 3 ml 30% H2O2 für 30
Minuten bei Raumtemperatur auf einem Magnetrührer.
5. Dreimaliges Waschen der Schnitte in PBS für je 5 Minuten.
6. Verbringen der Schnitte in Coverplates TM und Sequenza ® -Einsätze (Thermo Electron)
und Auftragen je 100 µl verdünntem Primärantikörper (Tab. 6) bzw. Kontrollserum
und Inkubation der Schnitte eine Stunde bei Raumtemperatur.
7. Dreimaliges Waschen der Schnitte in PBS für je 5 Minuten.
8. Auftragen von je 100-200 µl 1:200 verdünntem Sekundärantikörper (Tab. 6),
Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
9. Dreimaliges Waschen der Schnitte in PBS für je 5 Minuten.
10. Inkubation der Schnitte mit je 100-200 µl Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC-
Elite Standart (PK-6100), Vector Laboratories) für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
(Herstellung des ABC-Komplexes mindestens 30 Minuten vor Gebrauch).
11. Dreimaliges Waschen der Schnitte in PBS für je 5 Minuten.
12. Inkubation der Schnitte mit 3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB, 9.3.1),
für 10 Minuten auf dem Magnetrührer bei Raumtemperatur.
13. Waschen der Schnitte dreimal in PBS für je 5 Minuten, einmal 5 Minuten unter
fließendem Leitungswasser.
14. Gegenfärbung der Schnitte für ca. 15-30 Sekunden bis zur gewünschten Farbintensität
in Hämalaun nach Mayer (Roth).
15. Bläuen der Schnitte unter fließendem Leitungswasser für 10 Minuten.
16. Waschen der Schnitte in Aqua dest. für 5 Minuten.

52 Material und Methoden
17. Dehydrieren der Schnitte in aufsteigender Alkoholreihe: 50%iger, 70%iger, 96%iger
Alkohol für jeweils 3 Minuten, Isopropylalkohol (5 Minuten), Essigsäure-butylester
(EBE, 2 x 5 Minuten).
18. Maschinelles Eindecken der Schnitte mit Hilfe eines Eindeckautomaten (Promounter
RCM 2000, Medite Medizintechnik).
Für den Nachweis von CD45R und CD25 entfielen die Inkubation mit dem
Sekundärantikörper (Schritt 8 und 9), da es sich um biotinilierte Erstantikörper handelt. Die
weiteren Schritte erfolgten nach dem oben aufgeführten Protokoll.
3.5.3 Kontrollen
Die Spezifität der immunhistologischen Reaktionen wurde anhand folgender Kontrollen
überprüft:
Folgeschnitte der zu untersuchenden Gewebeschnitte wurden mit den jeweiligen Kontrollseren
(3.5.1.6) anstelle des Primärantikörpers inkubiert (Negativkontrolle).
Zur Kontrolle der Immunreaktion der gegen die BDV-spezifischen Proteine gerichteten
Antikörper wurden Schnitte von Gewebeblöcken, bei denen der BDV-Antigen Nachweis aus
früheren Untersuchungen bekanntermaßen positiv war, mit dem entsprechenden BDV-
Antikörper inkubiert (Positivkontrolle).
Zur Kontrolle der Immunreaktion der Entzündungszellmarker wurde eine Milz eines
Kontrolltieres mit dem jeweiligen Antikörper inkubiert (Positivkontrolle).
3.5.4 Auswertung und Statistik
Generell wurden braune DAB-Präzipitate, die sich in einer Ebene mit dem Gewebeschnitt
befanden und in den Negativkontrollen nicht vorhanden waren, als positiv bewertet. Die
Bewertung der immunhistologischen Reaktionsstärke erfolgte semiquantitativ. In die
Untersuchung wurden die unter 0 genannten Gehirnareale einbezogen. Bei dem BDVspezifischen
Antikörpern konnten intranukleäre, zytoplasmatische und Neuropilreaktionen
unterschieden werden.

Material und Methoden 53
Die Antikörper gegen die BDV-spezifischen Proteine (BDV-N, BDV-GP und BDV-M)
wurden in Hinblick auf die intrazelluläre Verteilung des Antigens, die betroffenen
Gehirnareale und die Anzahl der positiven Zellen semiquantitiativ nach folgendem Schema
bei 100-facher und 400-facher Gesamtvergrößerung ausgewertet:
obb = kein Nachweis von BDV-spezifischem Protein
+ = in Herden < 80 Zellen/Gesichtsfeld bei 400-facher Gesamtvergrößerung (HPF)
positive Zellen in einzelnen Gehirngebieten, keine Neuropilreaktion
++ = zahlreiche positive Zellen (< 150 Zellen/HPF), deutliche Neuropilreaktion,
viele bis alle Gehirnregionen betroffen
+++ = zahlreiche positive Zellen (> 150 Zellen/HPF), ausgeprägte Neuropilreaktion,
alle untersuchten Gehirnregionen betroffen
In einigen Fällen waren Übergänge zwischen dieser Einteilung vorhanden, diese wurden als
(+), +(+) oder ++(+) angegeben.
Die immunhistologische Untersuchung zum Nachweis von GFAP wurde ebenfalls
semiquantitativ bei 100-facher und 400-facher Gesamtvergrößerung nach folgendem Schema
beurteilt:
+ = < 30 positive Zellen/HPF, positive Reaktion vor allem in Cortex, Ammonshorn und
Striatum
++ = 30 - 60 positive Zellen/HPF, einige Astrozyten mit deutlich vergrößertem Zellkern
+++ = > 60 positive Zellen /HPF, einige Astrozyten mit deutlich vergrößertem Zellkern
In einigen Fällen waren Übergänge zwischen dieser Einteilung vorhanden, diese wurden als
(+), +(+) oder ++(+) angegeben.
Die Auswertung der Entzündungszellmarker (CD3, CD4, CD8, CD25, CD45R) wurde bei
400-facher Gesamtvergrößerung durchgeführt. Es wurden die perivaskulären Entzündungszellen
ausgezählt und ihr jeweiliger Anteil am Gesamtinfiltrat errechnet. Mit den perivaskulär
gelegenen rundovalen Mac-1 alpha positiven Zellen wurde gleichermaßen verfahren.

54 Material und Methoden
Die Intensität der immunhistologischen Reaktionen wurde nicht bewertet. War eine
Gehirnregion in mehreren Anschnitten getroffen, so wurde ein Mittelwert aus den
Immunreaktionen in diesen Gehirnregionen angegeben.
Die statistische Aufarbeitung der bei der Untersuchung der Gruppen erhobenen Daten
erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung
der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Die Ergebnisse der
semiquantitativ ausgewerteten immunhistologischen Untersuchungen (BDV-N, BDV-M,
BDV-GP und GFAP) wurden unter Verwendung des Programms SAS (Statistical Analysis
System, Version 9.1, SAS Institute Inc., 1999) auf Gruppenunterschiede mit dem Kruskal-
Wallis-Test verglichen. Anschließend wurde als nicht-parametrische Ein-Weg-Varianzanalyse
der Wilcoxon Zwei Stichproben-Test zum paarweisen Gruppenvergleich angewandt, da die
Daten nicht normalverteilt waren. Ergebnisse mit p < 0,05 wurden als statistisch signifikant
angesehen. Die Anzahlen der perivaskulären Entzündungszellen wurden mit dem gepaarten
T-Test untereinander verglichen. Es wurden ebenfalls Ergebnisse mit p < 0,05 als statistisch
signifikant angesehen.

Material und Methoden 55
3.6 In situ Hybridisierung (ISH)
Die ISH wurde zum Nachweis der verschiedenen viralen RNA-Spezies verwandt. Die
jeweilige sense-Sonde (s) detektierte die genomische virale RNA (-ssRNA), während die
antisense-Sonden (as) die positiv orientierten RNAs (+ssRNA) nachwiesen. Zu den +ssRNAs
zählt neben den spezifischen mRNAs auch das so genannte Antigenom (BDV-AG). Die ISH
wurde mittels Digoxigenin (DIG)-markierter RNA-Sonden durchgeführt und wurde zum
Nachweis von RNA spezifisch für das BDV-N, BDV-GP und das BDV-Intron I verwandt.
3.6.1 Sonden
Das Sondenpaar (as, s) zur Detektion des BDV- N wurde im Rahmen dieser Dissertation
etabliert und auf seine Spezifität getestet. Das für die in vitro Transkription verwendete
Plasmid wurde freundlicherweise von Frau Doris Porombka zur Verfügung gestellt. Das
Sondenpaar zur Detektion BDV-GP spezifischen RNAs stand bereits zur Verfügung, es
wurde im Rahmen der Dissertation von Frau Nicole Werner-Keišs hergestellt und auf ihre
Spezifität überprüft. Das Sondenpaar zur Detektion der BDV-Intron I-haltigen RNA stand
ebenfalls bereits zur Verfügung, es wurden im Rahmen der Dissertation von Frau Doris
Porombka hergestellt und auf seine Spezifität überprüft. Die BDV-Intron I spezifische RNA
kodiert für das BDV-M. Um die Sonden zum Nachweis der mausadaptierten BDV-RNA
Sequenzen anwenden zu können, wurden die spezifischen Abschnitte des mausadaptierten
BDV-Gemons sequenziert und die Sequenzierergebnisse mit den Sondensequenzen mit Hilfe
der Align Funktion des BLAST-Programmes der Gendatenbank (Gen ® Bank:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) verglichen. Die Homologien der Sonden mit dem
mausadaptierten BDV-Gemons sind in Tab. 7 aufgeführt. Die Positionen der Sonden sind
zusammenfassend in Tab. 7 aufgelistet und in Abb. 8 graphisch dargestellt.

56 Material und Methoden
Tab. 7: Zusammenfassung der verwendeten ISH-Sonden
Sonde zum
Nachweis von
Sondenlänge
Homologie mit
mausadaptiertem
BDV-Genom
Position der
Sonde auf dem
BDV-Genom
Acc.-No.
Homologie mit
Acc.-No.
+ssBDV-N
-ssBDV-N
342 bp 96% 141-482 AJ311522 100%
+ssBDV-GP
-ssBDV-GP
316 bp 95% 358-673 AF158633 99%
+ssBDV-Intron I
-ssBDV-Intron I
88 bp 99,5% 39-126 AF158632 100%
Acc.-No: GenBanK ® -Accession-Nummer, bp: Basenpaare, +ss: positiv orientierte RNA, -ssRNA: negative
orientierte RNA, BDV-N: BDV-Nukleoprotein, BDV-GP: BDV-Glykoprotein
Abb. 8: Position der BDV-spezifischen in situ Hybridisierungs-Sonden
auf a) dem BDV-Genom (-ssRNA) und b) der BDV-spezifischen mRNA (+ssRNA)

Material und Methoden 57
3.6.2 Protokoll der in situ Hybridisierung (ISH)
Für die ISH zum Nachweis der BDV-N, BDV-GP und BDV-Intron I-spezifischen +ssRNA
und -ssRNA wurden Formalin-fixierte und Paraffin-eingebettete Gehirnschnitte von BDVinfizierten
Mäusen aller drei Gruppen am 14, 28 und 42 Tage p.i. verwendet. Die
Durchführung der ISH erfolgte nach dem Protokoll von GRÖTERS et al. (2005).
Folgende Sondenkonzentrationen wurden eingesetzt:
antisense-Sonde/
sense-Sonde/
100 µl Hybridisierungsmix 100 µl Hybridisierungsmix
ssBDV-N 3 µl 3 µl
ssBDV-GP 2 µl 3 µl
ssBDV-Intron I 5 µl 5 µl
Sofern nicht anders angegeben, erfolgten die einzelnen Arbeitsschritte bei Raumtemperatur.
Für von der Raumtemperatur abweichende Inkubationstemperaturen wurden die Lösungen im
Wasserbad vorgewärmt und die Inkubation der Schnitte fand ebenfalls im Wasserbad statt.
Alle verwendeten Puffer und Lösungen (9.3.2) wurden vor Gebrauch autoklaviert bzw. im
Versuch jeweils frisch angesetzt.
1. Aufziehen der Paraffinschnitte auf SuperFrost ® Plus Objektträger, anschließend im
Wärmeschrank bei 57°C mindestens 30 Minuten trocknen lassen.
2. Entparaffinierung der Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe: Rotihistol ® (3 x
5 Minuten), Isopropylalkohol (5 Minuten), 96%iger Alkohol (5 Minuten), 70%iger
Alkohol (5 Minuten).
3. Anschließend Waschen der Schnitte in einer Standküvette mit DEPC-Aqua bidest.
1 x 5 Minuten und 1 x 1 Minute, anschließend 1 x 5 Minuten in PBS inkubieren.
4. Aufschluss der Zellmembran mit 0,2 M HCl für 20 Minuten.
5. Anschließend zweimal Waschen in 2 x SSC + 5 mM EDTA bei 50°C für je 30
Minuten.

58 Material und Methoden
6. Proteolytische Vorbehandlung des Gewebes mit 4 µg/ml Proteinase K (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim) für 15 Minuten bei 37°C.
7. Abstoppen der enzymatischen Reaktion durch 0,2%iges Glycin-PBS für 5
Minuten.
8. Nachfixierung in 4%igem Paraformaldehyd (PFA) für 4 Minuten.
9. Schnitte 2 x für 1 Minute mit PBS waschen, anschließend 15 Minuten in PBS + 5
mM MgCl2 waschen.
10. Azetylierung der Schnitte in 0,25%igem Acetanhydrid in 0,1 M Triethanolamin,
pH 7,5 für 10 Minuten.
11. Zweimaliges Waschen der Schnitte in PBS für eine Minute, anschließend
Inkubation in PBS für 15 Minuten.
12. Prähybridisierung für mindestens eine Stunde bei 52°C mit Prähybridisierungspuffer
(PHB-Puffer, 9.3.2).
13. Hybridisierung über Nacht bei 52°C im Wärmeschrank in einer feuchten Kammer
mit Hybridisierungsmix (HB-Mix, 9.3.2). Dazu wurden die Schnitte horizontal in
die Kammer gelegt, mit 20-30 µl HB-Mix überschichtet, mit Gel-bond ® Film
(Biozym, Hessisch Oldenburg) bedeckt und mit Fix-o-gum ® (Marabu Werke,
Tamm) abgedichtet.
14. Posthybridisierung: Gel-bond ® Film und Fix-o-gum ® entfernen und Schnitte in der
Standküvette mit 6 x SSC + 45%igem Formamid 2 x für 15 Minuten bei 42°C
waschen, anschließend 2 x 5 Minuten mit 2 x SSC waschen.
15. RNase-Behandlung bei 37°C für 30 Minuten zum Verdau nicht gebundener RNA-
Sonden.
16. Zweimal für 5 Minuten mit 2 x SSC und anschließend 2 x 15 Minuten mit 0,2 x
SSC bei 50°C waschen.
17. Schnitte eine Minute in Puffer 1 (9.3.2) waschen.
18. Inkubation in Puffer 2 (Blocking-Lösung, 9.3.2) für 30 Minuten.
19. Färbung: Auftragen der Anti-DIG-Antikörper-Lösung (Roche Diagnostics), in
einer Verdünnung von 1:200, 200-400 µl pro Objektträger (OT): dazu die Schnitte
horizontal in die Kammer legen und die OTs abtrocknen, ohne das Gewebe zu
verletzen; anschließend mit dem DakoCytomation Pen (DakoCytomation) das

Material und Methoden 59
Gewebe umrahmen, Antikörper auftragen, Inkubation für 2 Stunden in der
feuchten Kammer bei Raumtemperatur.
20. Zweimal in der Standküvette für je 15 Minuten in Puffer 1 waschen.
21. 2 Minuten in Puffer 3 waschen.
22. Inkubation der Schnitte in der NBT/X-Phosphat-Farblösung (9.3.2) über Nacht im
Dunkeln für 18-21 Stunden.
23. Abstoppen der Färbereaktion nach mikroskopischer Kontrolle der Farbintensität
durch zweimaliges Waschen in Puffer 4 (9.3.2) für je 10 Minuten.
24. Wässern der Schnitte für 2 x 1-2 Minuten in Aqua bidest., anschließend im
lauwarmen Leitungswasser waschen.
25. Eindecken der Schnitte: Glycergel ® Aqueous Mounting Medium (DakoCytomation),
bei ca. 50°C im Wasserbad vorwärmen, auf Gewebe auftragen und
Deckglas andrücken.
26. Schnitte bis zur mikroskopischen Auswertung im Dunkeln lagern.
3.6.3 Kontrollen
Die Spezifität der Reaktionen wurde anhand folgender Kontrollen überprüft:
Folgeschnitte der zu untersuchenden Gewebeschnitte wurden mit reinem HB-Mix ohne
Sondenzusatz inkubiert (Negativkontrolle).
Nicht-infizierte Kontrolltiere wurden ebenfalls mit allen verwendeten Sonden inkubiert.
3.6.4 Auswertung und Statistik
Als positiv wurden dunkelblaue bis braune Reaktionsprodukte bewertet, die sich in einer
Ebene mit dem Gewebeschnitt befanden und in den Kontrollschnitten nicht zu finden waren.
Die Ergebnisse wurden in intranukleäre und zytoplasmatische Reaktionen unterteilt.
Intranukleäre Präzipitate stellen sich zellkerngebunden und in Form eines bis mehrere
rundliche Granular dar, in den meisten Fällen war eine diffuse, feingranulierte Reaktion des
Karyoplasmas vorhanden. Granuläre oder diffuse Reaktionen im Zytoplasma wurden als
zytoplasmatische Reaktion angesprochen. Die Bewertung der Farbreaktion erfolgte gemäß

60 Material und Methoden
dem Schema der immunhistologischen Auswertung (3.5.4) bei 400-facher Gesamtvergrößerung:
obb = kein Nachweis von BDV-spezifischer RNA
+ = herdförmig (< 80 Zellen/Gesichtsfeld bei 400-facher Gesamtvergrößerung (HPF)
ausfüllend), positive Zellen in einzelnen Gehirngebieten, keine Neuropilreaktion
++ = zahlreiche positive Zellen (< 150 Zellen/HPF), deutliche Neuropilreaktion,
fast alle bis alle Gehirnregionen betroffen
+++ = zahlreiche positive Zellen (> 150 Zellen/HPF), ausgeprägte Neuropilreaktion,
alle untersuchten Gehirnregionen betroffen
In einigen Fällen waren Übergänge zwischen dieser Einteilung vorhanden, diese wurden als
(+), +(+) oder ++(+) angegeben.
Die statistische Aufarbeitung der bei der Untersuchung der Gruppen erhobenen Daten
erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung
der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Die Ergebnisse wurden unter
Verwendung des Programms SAS (Statistical Analysis System, Version 9.1, SAS Institute
Inc., 1999) auf Gruppenunterschiede mit dem Kruskal-Wallis-Test verglichen. Anschließend
wurde als nicht-parametrische Ein-Weg-Varianzanalyse der Wilcoxon Zwei Stichproben-Test
zum paarweisen Gruppenvergleich angewandt, da die Daten nicht normalverteilt waren.
Ergebnisse mit p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.
3.7 Doppelmarkierungen
3.7.1 Immunhistologie und in situ Hybridisierung
Zur Darstellung viraler RNA in unterschiedlichen Zellpopulationen des Gehirns wurden
Doppelmarkierungen durchgeführt. Hierzu wurden die Schnitte initial gemäß dem ISH-
Protokoll (3.6.2) mit den Sonden zum Nachweis von -ssBDV-N, +ssBDV-N, +ssBDV-GP,
+ssBDV-Intron I inkubiert. Nach dem Abstoppen der Färbereaktion (Schritt 23) wurde die
Hemmung der endogenen Peroxidase für die immunhistologische Reaktion mittels 99,5 ml

Material und Methoden 61
Methanol + 0,5 ml 30% H2O2 für ca. 15 Minuten unter regelmäßiger mikroskopischer
Kontrolle durchgeführt. Anschließend folgte die immunhistologische Reaktion zum Nachweis
von CNPase und GFAP entsprechend dem Protokoll für Formalin-fixierte und Paraffineingebettete
Schnitte (3.5.2.1). Abweichend von dem angegebenen Protokoll wurden nach der
DAB-Reaktion (Schritt 11) die Schnitte dreimal fünf Minuten in PBS gewaschen und
anschließend per Hand mit Glycergel ® (DakoCytomation) eingedeckt.
3.7.2 Kontrollen
Die Spezifität der Reaktionen wurde anhand folgender Kontrollen überprüft:
Folgeschnitte der zu untersuchenden Gewebeschnitte wurden entweder mit den
virusspezifischen Sonden inkubiert und im Rahmen der Immunhistologie mit den
Kontrollseren (3.5.1.6, Negativkontrolle der Immunhistologie) oder in der ISH mit reinem
HB-Mix ohne Sondenzusatz inkubiert, in der Immunhistologie wurde das spezifische
Antiserum verwandt (Negativkontrolle der ISH). Schließlich wurden Schnitte in der ISH mit
reinem HB-Mix ohne Sondenzusatz und im Rahmen der Immunhistologie mit dem
Kontrollseren (3.5.1.6) inkubiert (Doppelt-Negativkontrolle).
3.7.3 Auswertung
Die Auswertung der Doppelmarkierung kombinierte die in 3.5.4 und 3.6.4 beschriebenen
Auswertungskriterien. Besonderes Augenmerk wurde auf den qualitativen Nachweis von
doppelt markierten Zellen in den auch in der Immunhistologie und ISH untersuchten
Gehirnregionen (3.3.3) geworfen. Eine Quantifizierung wurde nicht vorgenommen.

62 Material und Methoden
3.8 Quantitative RT-Polymerase Kettenreaktion (qRT-PCR)
Die qRT-PCR wurde zur Quantifizierung der viralen mRNA-Spezies im Gehirn verwandt.
Nach der Isolierung aus nativem Gehirnmaterial und anschließender Aufreinigung wurde die
RNA mittels Reverser Transkription (RT) in cDNA umgeschrieben, welche in die qRT-PCR
eingesetzt wurde.
3.8.1 RNA-Isolierung
Für die RNA-Isolierung wurden tief gefrorene, in OCT-eingebettete Gehirne von BDVinfizierten
Mäusen und Kontrolltieren aller drei Gruppen 21 und 42 Tage p.i. verwendet. Es
wurden von der Gehirnebene 2 (3.3.3) Transversalschnitte nach kaudal angefertigt. Die
Isolation erfolgte auf Basis der single-step-Methode (CHOMCZYNSKI und SACCHI, 1987,
FRISK et al., 1999) unter Verwendung von Trizol ® -Reagenz wie folgt:
1. Herstellung einer ≤ 0,5 mm dicken Gewebescheibe mit sterilem Besteck, Gewebe mit
einer sterilen Pinzette in ein 2 ml Eppendorfgefäß mit 1 ml Trizol ® -Reagenz
(Invitrogen TM , Karlsruhe) überführen.
2. Eppendorfgefäß vortexen, bis das Gewebe vollständig lysiert ist.
3. Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
4. Zugabe von 300 µl Chloroform (Roth) und 15 Sekunden kräftig schütteln.
5. Inkubation für 3 Minuten bei Raumtemperatur.
6. Zur Trennung des Lysats in eine obere, wässrige Phase (mit darin gelöster RNA) und
eine untere organische Phase (enthält die DNA), den Ansatz bei 11.000 x g und 4°C
für 15 Minuten zentrifugieren.
7. Obere wässrige Phase in ein neues 2 ml Eppendorfgefäß überführen, ohne diese dabei
mit der organischen Phase zu kontaminieren.
8. Zugabe von 700 µl Isopropanol (Roth), gut mischen und Präzipitation der RNA bei
-20°C über Nacht.
9. Erneut Zentrifugation bei 11.000 x g und 4°C für 10 Minuten, Überstand vorsichtig
dekantieren.

Material und Methoden 63
10. Zum Waschen des RNA-Pellets dieses mit 70%igem Ethanol überschichten.
11. Vorsichtiges Schütteln für einige Sekunden, danach erneut 10 Minuten bei 4°C und
11.000 x g zentrifugieren.
12. Ethanol vorsichtig abgießen und zum Trocknen der RNA das Eppendorfgefäß über
Kopf auf ein sauberes Zellstofftuch stellen.
13. Resuspension durch Zugabe von 100 µl DEPC-Aqua bidest.
Die gewonnene RNA wurde direkt im Anschluss aufgereinigt (3.8.2).
3.8.2 Aufreinigung der RNA
Zur Reinigung der RNA von Proteinen und kleineren RNA-Bruchstücken wurde das RNeasy ®
Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden) verwendet. Zusätzlich erfolgte eine Behandlung mit
RNAse-free DNase I (Qiagen), um eine potentielle Kontamination mit genomischer DNA
auszuschließen. Die Aufreinigung der Gesamt-RNA wurde folgendermaßen durchgeführt:
1. Für jede RNA-Probe 350 µl buffer RCT, 3,5 µl β-Mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)
und 250 µl reinen Ethanol (Roth) vermischen.
2. Die resuspendierte RNA in das Puffer-Ethanol-Gemisch pipettieren.
3. 700 µl Puffer-Ethanol-RNA-Gemisch auf die im Kit enthaltene Silicagel-Säule
pipettieren.
4. 15 Sekunden zentrifugieren bei 20.800 x g, Überstand verwerfen, die Silicagel-Säule
auf ein neues Auffanggefäß setzen.
5. 350 µl buffer RW1 auf die Silicagel-Membran pipettieren.
6. 15 Sekunden zentrifugieren bei 20.800 x g, Überstand verwerfen.
7. DNase I-Verdau: zu 70 µl buffer RDD jeweils 10 µl (27,3 U) RNase-Free DNase I
hinzugeben, den Reaktionsansatz vorsichtig durch Invertieren mischen, den DNase I-
Ansatz auf Eis stellen.
8. 80 µl DNase I-Mix direkt auf die Silicagel-Membran pipettieren und 15 Minuten bei
Raumtemperatur inkubieren.
9. 350 µl buffer RW1 auf die Silicagel-Membran pipettieren.

64 Material und Methoden
10. 15 Sekunden zentrifugieren bei 20.800 x g, Überstand verwerfen.
11. 500 µl buffer RPE auf die Silicagel-Membran geben.
12. 15 Sekunden zentrifugieren bei 20.800 x g, Überstand verwerfen.
13. Erneut 500 µl buffer RPE auf die Säule geben.
14. 2 Minuten bei 20.800 x g zentrifugieren, Überstand verwerfen und die Säule in ein
neues Auffanggefäß setzen.
15. Zur vollständigen Trocknung der Silicagel-Membran die Proben ohne Zugabe eines
Puffers 1 Minute bei 20.800 x g zentrifugieren.
16. RNA-Elution: Die Silicagel-Säule in ein entsprechend beschriftetes 1,5 ml
Eppendorfgefäß setzen, 30 µl RNase freies Wasser direkt auf die Membran pipettieren
und eine Minute bei 20.800 x g zentrifugieren.
5 µl der RNA-Lösung wurden zur photospektrometrischen Messung der optischen Dichte bei
260 nm (Verdünnung 1:15) eingesetzt. Die restliche RNA wurde direkt in flüssigem
Stickstoff eingefroren und bis zur weiteren Verwendung bei -80°C asserviert.
3.8.3 Reverse Transkription (RT)
Die cDNA Synthese mittels RT erfolgte unter Verwendung des Omniskript ® RT Kit (Qiagen)
und spezifischen antisense Primern in dem Peltier Thermal Cycler PTC-200 (MJ Research,
Waltham, USA). Der Einsatz der antisense Primer garantiert die selektive Umschreibung der
+ssRNA. Dadurch wird die genomische virale RNA (-ssRNA) nicht umgeschrieben. Der für
die RT verwendete antisense Primer (Tab. 8) wurde ebenfalls in der qRT-PCR verwendet.
Für jede in der qPCR zu untersuchende RNA musste daher separat ein entsprechender RT-
Reaktionsansatz hergestellt werden. Die jeweils verwendeten antisense Primer wurden in
einer Konzentration von 7,5 pmol/µl eingesetzt und sind in Tab. 8 aufgeführt. Jeweils 6 µl
RNA aus Schritt 3.8.2 wurden benötigt, um für jede zu quantifizierende RNA je 10 µl
spezifische cDNA zu synthetisieren. Der entsprechende Reaktionsansatz ist in Tab. 9 zu
finden.

Material und Methoden 65
Tab. 8: Primer zur Durchführung der RT-Reaktion
Bezeichnung Acc.-No. Primersequenz 5’ → 3’
BDV-spezifische RNA
Position des
Primers
BDV-N as AF158629 CAA GGC TGG GCG TTA CTG TAT G 229-208
BDV-GP-N as AF158633 CAT TGC CTT TCC ACT CTC TAG CTC 516-493
BDV-Intron I as AF158632 TTC CGT GAA GTC CCT CCT ACA AA 104-82
BDV-AG as AJ311522 GGG TTC ATA TAA ATC TTG GTC CTC C 120-96
Zelluläre mRNA
SDHA as AB072907 CAA GGT GTG TAA GAG TGA GTG GC 629-607
HPRT as X62085 CCA GCA GGT CAG CAA AGA ACT TAT A 264-240
GAPDH as NM_017008 GTT GAT GAC CAG CTT CCC ATT CT 1053-1031
Acc.-No.: GenBank ® -Accession-Nummer, as: antisense Primer, BDV-N: BDV-Nukleoprotein, BDV-GP: BDV-
Glykoprotein, BDV-AG: BDV-Antigenom (+ssRNA), SDHA: Succinat Dehydrogenase Komplex, Untereinheit
A, HPRT: Hypoxanthine Phosphoribosly Transferase I, GAPDH: Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase
Die einzelnen Arbeitsschritte der spezifischen RT wurden auf Eis wie folgt durchgeführt:
1. Von jeder RNA-Probe wurden 7 Aliquotes zu je 6 µl RNA in jeweils ein 0,5 ml
Eppendorfgefäß pipettiert.
2. Zugabe von je 1 µl spezifischem Primer (7,5 pmol/µl) in jedes RNA-Aliquot, Ansatz
vortexen und kurz anzentrifugieren.
3. Primer-Anlagerung und Aufschmelzen möglicher Sekundärstrukturen der RNA:
RNA-Primer-Mix in einem Eppendorf Thermomixer comfort (OMNILAB-
LABORZENTRUM, Gehrden) 5 Minuten bei 70°C und 300 rpm inkubieren.
4. Ansatz sofort wieder auf Eis transferieren.
5. Nach Abkühlen des RNA-Primer-Mixes jeweils 3 µl Mastermix (Tab. 9) hinzufügen.
6. Reaktionsansatz vorsichtig mischen und anzentrifugieren.

66 Material und Methoden
7. RT-Reaktionsansatz im Thermocycler unter folgenden Temperaturbedingungen
inkubieren:
25 °C für 10 Minuten
37 °C für 1 Stunde
93 °C für 5 Minuten
4 °C bis zur Entnahme der Proben
Nach Beendigung der spezifischen RT wurden die cDNA-Proben sofort bei –80°C bis zur
weiteren Verwendung asserviert.
Tab. 9: Ansatz zur Herstellung eines 10µl cDNA-Reaktionsansatzes (RT-Mastermix)
Reagenz
A) RNA-Primer-Mix
Konz. Stamm-
Lsg.
Volumen
RNA aus 3.8.2 6 µl
Konz.
10 µl-RT-MM
spezifischer as-Primer 7,5 pmol/µl 1 µl 0,75 µM
B) RNaseOUT-Mix, 10 µl-Ansatz (für 20 RT-Reaktionen)
DEPC-Aqua bidest. 6,5 µl
RT Puffer 10 x 1 µl 1 x
RNaseOUT TM Recombinant
Ribonuclease Inhibitor
C) RT-Mastermix
40 U/µl 2,5 µl 10 U/µl
RT Puffer 10 x 1 µl 1 x
dNTP-Mix 5 mM 1 µl 0,5 mM
RNaseOUT TM -Mix aus B 10 U/µl 0,5 µl 5 U/10 µl
Omniskript ®
Reverse Transkriptase
D) 10 µl RT-PCR-Reaktionsansatz
4 U/µl 0,5 µl 2 U/10 µl
RT-Mastermix (C) 3 µl
RNA-Primer-Mix aus A 7 µl
Gesamt 10 µl
Konz. Stamm-Lsg: Konzentration der Stammlösung, Konz. 10 µl RT-PCR-Mix: Konzentration im
RT-PCR-Mastermix; dNTP-Mix: Desoxynukleotid-Mix;

Material und Methoden 67
3.8.4 Primer und Sonden
Die Primerpaare (Tab. 10, Abb. 9) zum Nachweis BDV-spezifischer RNA und
zellspezifischer mRNA wurden im Rahmen der Dissertation von Frau Doris Porombka
hergestellt und auf ihre Spezifität überprüft. Um alle Primer und TaqMan ® -Sonden für die
mausadaptierte BDV-Präparation anwenden zu können, wurden die spezifischen Abschnitte
des BDV-Gemons sequenziert und die Sequenzierergebnisse mit den TaqMan ® -
Sondensequenzen mit Hilfe der Align Funktion des BLAST-Programmes der Gen ® Bank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) verglichen. Dabei wurde eine 100% Homologie der
TaqMan ® -Sonden für +ssBDV-N, +ssBDV-GP, +ssBDV-Intron I, sowie eine 88%
Homologie mit der TaqMan ® -Sonde für die BDV-Antigenom RNA festgestellt.
Primer und Sonden wurden mit Hilfe der Beacon Designer 2 TM -Software (Premier Biosoft
International, vertrieben durch PE Biosystems, Weiterstadt) ermittelt. Bei den TaqMan ® -
Sonden handelt es sich um 5’-FAM-3’-TAMRA-markierte Oligonukleotid-Sonden der Firma
Eurogentec SA, Seraing, Belgien. Die Sonden-Lyophilisate wurden mit TE-Puffer (pH 8,0,
9.3.3) auf eine Konzentration von 50 µM eingestellt und in lichtundurchlässigen 0,5 ml
Eppendorfgefäßen (Brand, Wertheim) bei -20°C aufbewahrt. Die Primer wurden ebenfalls als
Lyophilisat (MWG Biotech AG, Ebersberg) bezogen. Durch Zugabe von DEPC-Aqua bidest.
wurde die Primerkonzentration auf 15 µM eingestellt und die Gebrauchslösung bei -20°C
gelagert.

68 Material und Methoden
Tab. 10: Darstellung der Bezeichnung, Sequenz, Amplikongröße, Acc.-No. und Position der
verwendeten Primer und TaqMan ® -Sonden
Bezeichnung Sequenz 5’ – 3’
BDV-N s CGG GTA TAG GGC ATG AGA AGG ATA
BDV-N as CAA GGC TGG GCG TTA CTG TAT G
BDV-N Sonde CGC CGT GAC TGG TCT AAC AAT GCC ACT
BDV-GP s AAT CTG CCG ATG CTC TAT CAC AAA T
BDV-GP as CAT TGC CTT TCC ACT CTC TAG CTC
BDV-GP Sonde TGC TGA CTC ACG GTG CTA CAG TCC GC
Intron I s ATT CAA AGC ATT CCT ATG TGG AGC T
Intron I as TTC CGT GAA GTC CCT CCT ACA AA
Intron I Sonde AGG TAA TCG TCC CTG GAT GGC CCA CAC
BDV-AG s ACA ACA AAC CAA TCA TTA TCC TTC T
BDV-AG as GGG TTC ATA TAA ATC TTG GTC CTC C
BDV-AG Sonde AAT ACA CGC AAT GCC ACC CAA GAG ACG
BDV S1 s AAC AAA ATG AAT ACA CGC AAT G
BDV S1 as CAG GCG TCG ACA GGT AAG AT
SDHA s TTG GTG GAC AGA GCC TCA AGT
SDHA as CAA GGT GTG TAA GAG TGA GTG GC
SDHA Sonde TCC GAT CAG CGA CAC AGC AAC ACC GA
HPRT s AGA TGT CAT GAA GGA GAT GGG AGG
HPRTas CCA GCA GGT CAG CAA AGA ACT TAT A
HPRT Sonde CCT TCA GCA CAC AGA GGG CCA CAA TGT
Länge des
Amplikons
96 bp
124 bp
100 bp
110 bp
332 bp
95 bp
86 bp
Acc.-No.
Position
AF158629
134-229
AF158633
393-516
AF158632
5-104
AJ311522
11-120
AJ311522
36-367
AB072907
535-629
X62085
179-264
GAPDH Taq s GGT CTA CAT GTT CCA GTA TGA CTC T
NM_017008
GAPDH Taq as GTT GAT GAC CAG CTT CCC ATT CT
82 bp
GAPDH Sonde CGG CAA GTT CAA CGG CAC AGT CAA GGC
972-1053
Acc.-No: GenBanK ® -Accession-Nummer, s: sense Primer, as: antisense Primer, bp: Basenpaare,
BDV-N: BDV-Nukleoprotein, BDV-GP: BDV-Glykoprotein, BDV- AG: BDV-Antigenom (+ssRNA),
BDV-S1: Negativkontrolle zu BDV-AG, SDHA: Succinat Dehydrogenase Komplex, Untereinheit A,
HPRT: Hypoxanthin Phosphoribosyl Transferase I, GAPDH: Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase

Material und Methoden 69
Abb. 9: Position der in der qRT-PCR amplifizierten Abschnitte auf der BDV-spezifischen
RNA/cDNA
3.8.5 Standardreihen
Zur absoluten Quantifizierung der viralen und genomischen Gene in der qRT-PCR war der
Einsatz spezifischer Standardreihen notwendig. Dazu wurden für jedes Gen log10-Mengenstandards
verwendet, die aus Verdünnungsreihen entsprechend klonierter Genabschnitte
hergestellt wurden. Für die Quantifizierung der cDNA spezifisch für BDV-N, BDV-GP,
BDV-Intron I, SDHA, HPRT und GAPDH wurden die Verdünnungstufen 10 2 - 10 8 eingesetzt.
Zur Quantifizierung der cDNA spezifisch für das BDV-AG wurden die Verdünnungstufen
10 1 - 10 7 verwandt, da Ergebnisse aus Vorversuchen auf sehr geringe Mengen an BDV-AG in
den Gehirnen hindeuteten.
3.8.6 Reaktionsansatz qRT-PCR
Die Quantifizierung BDV-spezifischer und zellulärer cDNAs fand unter Verwendung des
Brilliant ® QPCR Core Reagent Kit (Stratagene ® ) und 5’-FAM-3’-TAMRA-markierten
TaqMan ® -Sonden (Eurogentec SA) statt. Als passiver Referenz-Farbstoff wurde das
Fluophore ROX eingesetzt. Jede cDNA-Probe aus 3.8.3, die Standard-Verdünnungsreihe und

70 Material und Methoden
die Negativkontrolle (no template control, NTC) wurden grundsätzlich als Duplikate in der
qPCR eingesetzt und amplifiziert. Die Durchführung der qRT-PCR erfolgte im Thermocycler
Mx3005P TM qPCR System (Stratagene ® ). Der Reaktionsansatz wurde, wie in Tab. 11
aufgeführt, hergestellt.
Tab. 11: Herstellung eines 25µl qPCR-Reaktionsansatzes (qPCR-Mastermix)
Reagenz
qPCR-Mastermix
Konz. Stamm-
Lsg.
Volumen
DEPC-Aqua bidest. ad 24 µl
Konz. 25µl-
qPCR-Mastermix
Core PCR buffer 10 x 2,5 µl 1 x
MgCl2 50 mM 2,5 µl 5 mM
dNTP-Mix 20 mM 1 µl 800 µM
s Primer 15 µM
as Primer 15 µM
TaqMan ® -Sonde 50 µM
s.
Tab. 10
Rox reference dye 5 µM 0,38 µl 76 nM
SureStart ® Taq DNA
Polymerase
25 µl qRT-PCR-Ansatz
5 U/µl 0,13 µl 0,65 U/25µl
Mastermix 24 µl
cDNA aus 3.8.3 1 µl
Gesamt 25 µl
dNTP-Mix: Desoxynukleotid-Mix, Konz. Stamm-Lsg.: Konzentration der Stammlösung,
Konz. 25µl qPCR-Mix: Konzentration im qRT-PCR Mastermix
Die qPCR wurde als two-step-PCR durchgeführt, wobei das Primer-Annealing und die
Elongation der DNA-Matrize in einem Schritt durchgeführt wurden. Die Amplifikation fand
für jedes Primer- und Sonden-Paar unter Verwendung der jeweils spezifischen Annealing-
Temperatur, Primer- und Sondenkonzentration (Tab. 12) wie folgt statt:
Denaturierung & Aktivierung der SureStart ® Taq: 95°C für 10 Minuten
40 Zyklen Denaturierung: 95°C für 15 Sekunden
Ende
Annealing/Elongation s. Tab. 12 für 1 Minute

Material und Methoden 71
Tab. 12: Verwendete Konzentrationen von Primern, TaqMan ® -Sonden und jeweils spezifische
Annealing-Temperatur
Bezeichnung
Konz.
Primer
BDV-N s 200 nM
BDV-N as 300nM
BDV-GP-N s 200 nM
BDV-GP-N as 300 nM
BDV-Intron I s 300 nM
BDV-Intron I as 300 nM
BDV-AG s 200 nM
BDV-AG as 300 nM
SDHA s 300 nM
SDHA as 300 nM
HPRT s 300 nM
HPRT as 300 nM
GAPDH s 100 nM
GAPDH as 100 nM
Konz.
TaqMan ® -Sonde
Annealing-
Temperatur
200 nM 63°C
200 nM 60°C
100 nM 60°C
300 nM 60°C
200 nM 61°C
200 nM 61°C
100 nM 62°C
Konz.: Konzentration, s: sense Primer, as: antisense Primer, nM: Nanomol, BDV-N: BDV-Nukleoprotein,
BDV-GP: BDV-Glykoprotein, BDV- AG: BDV-Antigenom (+ssRNA), SDHA: Succinat Dehydrogenase
Komplex, Untereinheit A, HPRT: Hypoxanthin Phosphoribosly Transferase I, GAPDH: Glyceraldehyd-3-
Phosphat Dehydrogenase
3.8.7 Kontrollen
Als Kontrollen wurden fünf Gehirne nicht infizierter Kontrolltiere mit allen spezifischen
antisense Primern umgeschrieben und als Doppelansatz in der qRT-PCR eingesetzt.
Weiterhin wurde je eine no template control (NTC) als Doppelansatz mitgeführt.
Zum Ausschluss eines falsch positiven Nachweises von BDV-Antigenom-spezifischer RNA
wurde eine DNA-Matrize benutzt (BDV-S1), welches Bindungsstellen für die BDV-AG
spezifische TaqMan ® -Sonde und den antisense Primer, aber keine Bindungsstelle für den
sense Primer besitzt, so dass eine Amplifikation und Sonden-Hydrolyse ausbleibt. Diese
Negativkontroll-cDNA wurde im Rahmen der Dissertation von Frau Doris Porombka
hergestellt und auf ihre Spezifität überprüft.

72 Material und Methoden
3.8.8 Auswertung und Statistik
Während der Amplifikation im Thermocycler Mx3005P TM Real-time PCR System
(Stratagene ® ) wurde die vom Reporter-Farbstoff (FAM) und Referenz-Farbstoff (ROX)
emittierte Fluoreszenz von dem Gerät aufgenommen und mit Hilfe der Software der Quotient
beider Farbstoffe berechnet und so die Hintergrundfluoreszenz bestimmt. Die drei
Housekeeping Gene (GAPDH, HPRT, SDHA) wurden zur Normalisierung der viralen Gene
mittels geNorm (http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/) herangezogen. Die ausgewählten
Housekeeping-Gene werden im neuronalen Gewebe sehr stabil exprimiert (VANDE-
SOMPELE et al., 2002) und wurden daher verwendet. Die Normalisierung war notwenig, um
Mengenunterschiede zwischen den Proben in RNA-Isolierung und RT-Reaktion auszugleichen.
Das Verfahren basiert auf der Bildung eines geometrischen Mittelwertes aus den
Housekeeping-Genen (Normalisierungsfaktor). Die viralen Gene wurden im Folgenden durch
diesen Normalisierungsfaktor dividiert. Vorher wurde die Stabilität jedes Housekeeping-Gen
bestimmt, indem die paarweise Abweichung von den anderen Kontrollgenen als Standardabweichung
des logarithmisch transformierten Expressionsquotient gebildet wurde (interne
Kontrollgenstabilität, M). Je kleiner M ist, desto stabiler wird das Gen exprimiert. Nur
Housekeeping-Gene mit M < 1,5 wurden in die Berechnung des Normalisierungsfaktor
einbezogen. Die zugrunde liegenden Prinzipien sind detailliert bei VANDESOMPELE et al.,
2002 beschrieben.
Die statistische Aufarbeitung der bei der Untersuchung der Gruppen erhobenen Daten
erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung
der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Die Ergebnisse wurden unter
Verwendung des Programms SAS (Statistical Analysis System, Version 9.1, SAS Institute
Inc., 1999) zuerst mittels Kolmogorov-Smirnov-Test auf Normalverteilung untersucht und
anschließend mit einer Varianzanalyse (General Lineal Model) auf Unterschiede zwischen
den Gruppen und den Infektionszeitpunkten geprüft. Um die Kopienzahlen der verschiedenen
Transkripte innerhalb einer Gruppe und eines Infektionszeitpunktes miteinander zu
vergleichen, wurden die Daten logarithmisch transformatiert und anschließend mittels oneway
Analyse mit Tukey’s post-hoc Test für multiple paarweise Vergleiche untersucht.
Ergebnisse mit p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Material und Methoden 73
3.9 Serologische Untersuchung
Der Nachweis BDV-spezifischer Serumantikörper wurde freundlicherweise von Frau Dr.
Sibylle Herzog, Institut für Virologie der Justus-Liebig-Universität, Gießen durchgeführt. Der
Nachweis erfolgte mittels indirektem Immunfluoreszenztest (IIFT). Nach einer Ausgangsverdünnung
der zu untersuchenden Mäuseseren von 1:10 in PBS erfolgte eine weitere
Verdünnung in Zweierpotenzstufen. Die entsprechenden Verdünnungen wurden auf Acetonfixierte
Präparationen von MDCK-Zellen, die zu über 90% mit BDV infiziert waren,
aufgetragen und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Anschließend wurden die Objektträger
mit PBS gewaschen und ein Fluoreszein-gekoppeltes Antiserum Ziege-anti-Maus zugegeben.

74 Material und Methoden
3.10 Nachweis von infektiösem Virus
Die Untersuchung zum Nachweis von infektiösem Virus wurde ebenfalls freundlicherweise
von Frau Dr. Sibylle Herzog, Institut für Virologie der Justus-Liebig-Universität, Giessen
durchgeführt.
Der Nachweis von infektiösem BDV aus OCT-eingebettetem Gehirnmaterial infizierter
Mäuse und die Ermittlung des Virustiters erfolgte mittels empfänglicher embryonaler
Kaninchen-Gehirnzellen nach HERZOG und ROTT (1980). Dazu wurden die steril aus dem
OCT entnommenen Gewebeproben in Glasgow-Modifikation von Eagle’s Medium (GMEM,
Invitrogen TM ) mit einem 2%igem Zusatz von fetalem Kälberserum (FKS) und Bykomycin
verbracht. Anschließend erfolgte der Gewebeaufschluss durch Ultraschallbehandlung. Die
darauf folgende zehnminütige Zentrifugation bei 1000 x g diente der Entfernung des
Zelldetritus. Die Suspension wurde nun in log10–Verdünnungsstufen in GMEM mit 10%igem
FKS verdünnt. 50 µl jeder Verdünnungsstufe wurden in zwei Kammern eines
Zellkulturobjektträgers gegeben, je 50 µl einer Suspension embryonaler
Kaninchengehirnzellen (REB) zugesetzt und anschließend zehn bis zwölf Tage im CO2-
Brutschrank bei 37°C inkubiert. Darauf folgend wurden die Zellen auf den Objektträgern bei -
20°C für 20 Minuten in Aceton fixiert, luftgetrocknet und mit 1:40 verdünntem
Kaninchenserum inkubiert. Das Kaninchenserum wies einen BDV-spezifischen
Antikörpertiter von 1:2560 auf.
Die Visualisierung der infektiösen Viruspartikel erfolgte mittels indirektem Immunfluoreszenztest
(IIFT). Nach Waschen der Objektträger in PBS wurde ein Fluoreszeingekoppeltes
Anti-Kaninchen-Serum aus der Ziege (Dianova, 111-095-003) zugegeben. Die
Titerhöhe wurde nach REB-ID50/ml (infektiöse Dosis 50 für embryonale Kaninchen-
Gehirnzellen) bestimmt, dies entspricht einer Virusverdünnung, bei der eine Fluoreszenz bei
50% aller infizierten Zellen nachweisbar war. Die anschließende Berechung des Virustiters
erfolgte nach REED und MÜNCH (1938).

Ergebnisse 75
4 Ergebnisse
4.1 Klinik
Die Mäuse aus allen BDV-infizierten Gruppen (nicht-transgen [ntg], heterozygot [tg+/-] und
homozygot transgen [tg+/+]) wurden einer Vielzahl klinisch-neurologischer Untersuchungen
unterzogen. Sowohl in diesen Untersuchungen als auch in der Bewertung der Tiere nach dem
von HAUSMANN et al. (2001) beschriebenen Score (3.3.2, Tab. 5) konnten meist nur geringgradige
klinische Befunde erhoben werden, die z.T. nur bei einzelnen Tieren vorkamen.
Auffällig waren jedoch epileptiforme Krämpfe in beiden BDV-infizierten transgenen
Mausgruppen (tg+/-, tg+/+) ab 21 Tage p.i.
Die Tiere der mock-infizierten Mausgruppen und der nicht-infizierten Kontrollgruppen
zeigten keine klinischen Symptome. Eine Übersicht über alle Untersuchungsbefunde und die
Ergebnisse der statistischen Auswertung findet sich in Abschnitt 9.1.1 des Anhangs.
4.1.1 Krämpfe
Die Krämpfe der transgenen BDV-infizierten Mäuse ließen sich in drei verschiedene Formen
klassifizieren. Generalisierte Krampfanfälle waren durch eine initiale Phase (Aura)
gekennzeichnet, in der die Maus plötzlich verharrte, sich auf die Hinterbeine setzte und mit
den Vordergliedmaßen mechanisch die Nase wischte, diese ging fließend in eine Tremorphase
über, in der die Maus Zuckungen des Kopfes, der Gesichtsmuskulatur und der Vorderbeine
zeigte. Während des Iktus zeigten die Mäuse nach 10-20 Sekunden eine so genannte
Sprungphase, die durch eine schnelle Folge bis zu 25 cm hoher Sprünge gekennzeichnet war.
Diese Phase dauerte bis zu 30 Sekunden und endete in einem finalen Streckkrampf (tonische
Phase), der regelmäßig zum Tod der Tiere führte. Solchermaßen verendete Tiere lagen mit
ausgestreckten Gliedmaßen im Käfig. Auch alle lediglich tot aufgefundene Tiere befanden
sich in dieser Haltung.
Komplex fokale Anfälle waren gekennzeichnet durch die initiale Phase sowie die
Tremorphase, wie sie beim generalisierten Krampfanfall beschrieben wurden, ohne in die
Sprungphase überzugehen. Alle Tiere überlebten die komplex fokalen Anfälle, die eine
maximale Dauer von 30 Sekunden aufwiesen.

76 Ergebnisse
Während einer kürzer verlaufenden zweiten Form komplex fokaler Anfälle waren die Tiere
stuporös, verharrten auf den Hintergliedmaßen und zeigten Ansätze von feinem Tremor der
Gesichts- und Kopfmuskulatur, ohne deutliche Zuckungen von Kopf- und Vordergliedmaßen
oder das mechanische Wischen der Nase zu entwickeln. Die Dauer dieser Krampfanfälle
betrug meist weniger als 20 Sekunden.
Die Krämpfe wurden während der Manipulation der Tiere bei den Untersuchungen
beobachtet. Komplex fokale Anfälle konnten durch Beruhigung der Tiere (Zurücksetzen in
den Käfig) frühzeitig beendet werden.
Bei BDV-infizierten ntg Mäusen konnten im Untersuchungszeitraum bis 49 Tage p.i. keine
Krämpfe beobachtet werden. Von den tg+/- BDV-infizierten Mäusen zeigten 25% der
untersuchten Tiere eine Form der beschriebenen Krämpfe (Tab. 13). In dieser Gruppe zeigten
vier Tiere 42 Tage p.i. komplex fokale Anfälle. 49 Tage p.i. konnten bei drei tg+/- Tieren
komplex fokale Anfälle beobachtet werden, ein tg+/- Tier zeigte 49 Tage p.i. einen
generalisierten Krampfanfall. In der tg+/+ Gruppe waren bei 42% der untersuchten BDVinfizierten
Tiere Krämpfe zu beobachten. 21 Tage p.i. zeigte eine tg+/+ Maus einen
komplexen fokalen Anfall, 35 und 42 Tage p.i. war bei je zwei Tieren ebenfalls komplex
fokale Anfälle zu beobachten. 42 Tage p.i. zeigten zwei weitere Mäuse generalisierte
Krampfanfälle. 49 Tage p.i. war bei einer Maus ein komplex fokaler Anfall, bei einer anderen
ein generalisierter Krampfanfall zu beobachten. Dabei war auffällig, dass die tg+/+ Mäuse
schon 21 und 35 Tage p.i. Krämpfe zeigten, während in der tg +/- Gruppe Krämpfe generell
erst ab 42 Tage p.i. auftraten (Tab. 13). Im Vergleich zu den ntg Mäusen traten bei tg+/+
Tieren 35 Tage p.i. (p=0,0468) und 42 Tage p.i. (p=0,0171) statistisch signifikant häufiger
Krämpfe auf.

Ergebnisse 77
Tab. 13: Auftreten der Krämpfe bei BDV-infizierten Mäusen
Tage
p.i.
n
ntg tg+/- tg+/+
Komplex
fokaler
Anfall
Gen.
Krampf-
anfall
n
Komplex
fokaler
Anfall
Gen.
Krampfanfall
n
Komplex
fokaler
Anfall
Gen.
Krampfanfall
21 25 0 0 32 0 0 22 4,5 % 0
28 20 0 0 26 0 0 18 0 0
35 15 0 0 21 0 0 13 15,4 % 0
42 10 0 0 15 26,7 % 0 8 25,0 % 25,0 %
49 5 0 0 10 30,0 % 10,0 % 3 33,3 % 33,3 %
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgen; tg+/-: heterozygot transgen, tg+/+: homozygot transgen, n: Anzahl der
klinisch untersuchten Tiere, Gen. Krampfanfall: Generalisierter Krampfanfall
4.1.2 Gewichtsverlauf
Die Gewichtsentwicklung der BDV- und mock-infizierten Tiere im Zeitraum von 21 bis 49
Tage p.i. ist in Abb. 10 wiedergegeben. Es sind die arithmetischen Mittelwerte der Gruppen
dargestellt. Alle Gruppen zeigten einen Anstieg des durchschnittlichen Körpergewichts bis 42
Tage p.i. Bis 49 Tage p.i. stiegen die Gewichte der drei mock-infizierten Gruppen und der ntg
BDV-infizierten Tiere weiter an, dagegen nahmen die tg+/- und tg+/+ Tiere nicht weiter zu.
Die Mittelwerte der Körpergewichte der BDV-infizierten Tiere aller drei Mausgruppen und
der drei mock-infizierten Gruppen zeigten ab 28 Tage p.i. einen divergierenden Verlauf.
Dabei waren die BDV-infizierten Tiere grundsätzlich leichter als die vergleichbare mockinfizierte
Gruppe. Signifikante Unterschiede zwischen ntg BDV-infizierten Tieren und ntg
mock-infizierten Tieren ergaben sich 28 Tage p.i. (p=0,0051), 35 Tage p.i. (p=0,0019), 42
Tage p.i. (p=0,0008) und 49 Tage p.i. (p=0,0025). In der Gruppe der tg+/- Tiere waren
signifikante Unterschiede 28 Tage p.i. (p=0,0089), 35 Tage p.i. (p

Gewicht [g]
78 Ergebnisse
Mäusen (p=0,0166). In der Gruppe der mock-infizierten Mäuse waren 35 Tage p.i.
(p=0,0290), 42 Tage p.i. (p

Ergebnisse 79
4.1.3 Aktivität
Die Aktivität der Tiere wurde anhand einer semiquantitativen Schätzwertskala bewertet. Zur
Betrachtung der Ergebnisse wurde der Median der jeweiligen Gruppe herangezogen.
BDV-infizierte Mäuse aller drei Gruppen wiesen eine normale Aktivität auf, lediglich 49
Tage p.i. zeigten sich deutliche individuelle Schwankungen innerhalb der Gruppen (Abb. 11,
Tab. 24). Die mock-infizierten Mäuse aller drei Gruppen (ntg, tg+/-, tg+/+) zeigten eine
normale bis teilweise geringgradig vermehrte Aktivität (Abb. 12). Es konnten keine
signifikanten Unterschiede zwischen den BDV-infizierten Gruppen und im Vergleich
zwischen BDV- und mock-infizierten Mäusen während des Untersuchungszeitraumes
festgestellt werden.
Semiquantitative Schätzwerte
3
2
1
0
-1
-2
-3
21 28 35 42 49
Tage p.i.
ntg
tg+/-
tg+/+
Abb. 11: Aktivität der BDV-infizierten Mäuse
Rangsummenskala (-3: Apathie bis +3: hochgradige Hyperaktivität), p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene
Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, Median, Fehlerbalken:
Minimaler/ Maximaler Wert

80 Ergebnisse
Semiquantitative Schätzwerte
3
2
1
0
-1
-2
-3
21 28 35 42 49
Tage p.i.
ntg
tg+/-
tg+/+
Abb. 12: Aktivität der mock-infizierten Mäuse
Rangsummenskala (-3: Apathie bis +3: hochgradige Hyperaktivität), p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene
Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, Median, Fehlerbalken:
Minimaler/ Maximaler Wert
4.1.4 Lauf auf einem Gitter
Der Lauf auf dem Gitter wurde anhand einer semiquantitativen Schätzwertskala bewertet. Zur
Betrachtung der Ergebnisse wurde der Median der jeweiligen Gruppe herangezogen.
Transgene BDV-infizierte Mäuse liefen 28 Tage p.i. gering- bis mittelgradig unsicher auf dem
Gitter. Am 42. Tag p.i. konnte bei allen BDV-infizierten Gruppen eine geringgradige
Unsicherheit auf dem Gitter festgestellt werden, 49 Tage p.i. waren alle BDV-infizierten Tiere
mittelgradig unsicher (Abb. 13, Tab. 24). Die Tiere aller drei mock-infizierten Gruppen
zeigten 21 Tage p.i. geringgradige Unsicherheit, ab dem 35. Tag p.i. konnte in allen Gruppen
keine oder geringgradige Unsicherheiten festgestellt werden (Abb. 14). Zwischen den drei
BDV-infizierten Mausgruppen konnten untereinander, wie auch im Vergleich der drei mockinfizierten
Mausgruppen untereinander keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden.
Im Vergleich der BDV-infizierten tg+/- Gruppe mit der mock-infizierten tg+/- Mausgruppe
fanden sich am 49. Tag p.i. statistisch auffällige Unterschiede (p=0,0715) zwischen BDVinfizierten
und mock-infizierten Tieren. Die BDV-infizierten Mäuse waren gering- bis mittelgradig
unsicher, während die mock-infizierten Mäuse sicher bis geringgradig unsicher auf
dem Gitter liefen.

Ergebnisse 81
Semiquantitative Schätzwerte
3
2
1
0
21 28 35
Tage p.i.
42 49
ntg
tg+/tg+/+
Abb. 13: Unsicherheit beim Laufen auf einem Gitter, BDV-infizierte Mäuse
Rangsummenskala (0: sicher bis 3: hochgradig unsicher), p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse,
tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse,
Median, Fehlerbalken: Minimaler/ Maximaler Wert
Semiquantitative Schätzwerte
3
2
1
0
21 28 35
Tage p.i.
42 49
ntg
tg+/tg+/+
Abb. 14: Unsicherheit beim Laufen auf einem Gitter, mock-infizierte Mäuse
Rangsummenskala (0: sicher bis 3: hochgradig unsicher), p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse,
tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse,
Median, Fehlerbalken: Minimaler/ Maximaler Wert

82 Ergebnisse
4.1.5 Lauf auf einem Plexiglasuntergrund
Der Lauf auf einem Plexiglasuntergrund wurde anhand einer semiquantitativen
Schätzwertskala bewertet. Zur Betrachtung der Ergebnisse wurde der Median der jeweiligen
Gruppe herangezogen.
Am 42. und 49. Tag p.i. waren bei einigen Tieren der BDV-infizierten Gruppe Unsicherheiten
zu erkennen (Abb. 15, Tab. 24). Bei je einem BDV-infizierten tg+/+ Tier 35, 42 und 49 Tage
p.i. konnte bei diesem Test eine geringgradige Ataxie festgestellt werden (Hausmann
Score=1). Am 42. Tag p.i. liefen BDV-infizierte tg+/+ Tiere statistisch signifikant unsicherer
auf dem Plexiglas als BDV-infizierte tg+/- Tiere (p=0,0416). In den drei mock-infizierten
Gruppen waren, mit Ausnahme einer geringgradigen Unsicherheit der tg+/- Tieren 21 Tage
p.i., keine Unsicherheiten feststellbar (Abb. 16). Zwischen den jeweiligen BDV- und mockinfizierten
Tieren eines transgenen Status ließen sich zwar keine signifikanten Unterschiede
feststellen, dennoch scheinen die BDV-infizierten Tiere tendenziell unsicherer auf dem
Plexiglas zu laufen als die mock-infizierten Tiere.
Semiquantitative Schätzwerte
3
2
1
0
21 28 35
Tage p.i.
42 49
*
ntg
tg+/tg+/+
Abb. 15: Unsicherheit beim Laufen auf einer Plexiglasfläche, BDV-infizierte Mäuse
Rangsummenskala (0: sicher bis 3: hochgradig unsicher), p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse,
tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, Median, Fehlerbalken: Minimaler/
Maximaler Wert, *: p< 0,05 (statistisch signifikanter Unterschied im Vergleich zu BDV-infizierten tg+/-
Mäusen)

Ergebnisse 83
Semiquantitative Schätzwerte
3
2
1
0
21 28 35
Tage p.i.
42 49
ntg
tg+/tg+/+
Abb. 16: Unsicherheit beim Laufen auf einer Plexiglasfläche, mock-infizierte Mäuse
Rangsummenskala (0: sicher bis 3: hochgradig unsicher), p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse,
tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse,
Median, Fehlerbalken: Minimaler/ Maximaler Wert
4.1.6 Balancieren auf einem Stab
Das Balancieren auf einem Stab wurde anhand einer semiquantitativen Schätzwertskala
bewertet. Zur Betrachtung der Ergebnisse wurde der Median der jeweiligen Gruppe
herangezogen.
Die BDV-infizierten Mäuse aller drei Gruppen zeigten ab dem 35. Tag p.i. geringgradige, in
Einzelfällen bis höchstgradige Unsicherheiten beim Balancieren auf dem Stab (Abb. 17, Tab.
24). Im Gegensatz konnten die mock-infizierten Tiere aller drei Gruppen ohne
Schwierigkeiten über den Stab laufen (Abb. 18). 35 Tage p.i. war ein signifikanter
Unterschied zwischen BDV-infizierten tg+/- Mäusen und mock-infizierten tg+/- Tiere
auffällig (p=0,0416). Im Vergleich der BDV-infizierten und mock-infizierten Gruppen
untereinander konnten keine Unterschiede festgestellt werden.

84 Ergebnisse
Semiquantitative Schätzwerte
4
3
2
1
0
*
21 28 35 42 49
Tage p.i.
ntg
tg+/tg+/+
Abb. 17: Unsicherheit beim Balancieren auf einem Stab, BDV-infizierte Mäuse
Rangsummenskala (0: sicher bis 3: hochgradig unsicher, 4: balancieren nicht möglich), p.i.: post infectionem,
ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse,
Median, Fehlerbalken: Minimaler/ Maximaler Wert, *: p< 0,05 (statistisch signifikanter Unterschied im
Vergleich zu mock-infizierten tg+/- Mäusen)
Semiquantitative Schätzwerte
4
3
2
1
0
21 28 35 42 49
Tage p.i.
ntg
tg+/tg+/+
Abb. 18: Unsicherheit beim Balancieren auf einem Stab, mock-infizierte Mäuse
Rangsummenskala (0: sicher bis 3: hochgradig unsicher, 4: balancieren nicht möglich), p.i.: post infectionem,
ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse,
Median, Fehlerbalken: Minimaler/ Maximaler Wert

Ergebnisse 85
4.1.7 Hängtest
Beim Hängtest wurde mit einer Stoppuhr die Zeit gemessen, die die Mäuse benötigten, um
aus einer über Kopf hängenden Position ins Innere eines Hamsterrades zu klettern. Zur
Darstellung wurde der arithmetische Mittelwert verwandt. In diesem Test benötigten die
BDV-infizierten Mäuse aller drei Gruppen an den frühen Infektionszeitpunkten bis 35 Tage
p.i. 5-24 Sekunden. 42 und 49 Tage p.i. konnten die ntg und tg+/- in 12-22 Sekunden in das
Rad klettern, während die tg+/+ Tiere am 42. Tag p.i. 68 Sekunden und am 49. Tag p.i. 46
Sekunden benötigten (Abb. 19, Tab. 24). Die mock-infizierten Tiere aller drei Gruppen
benötigten an allen untersuchten Zeitpunkten 5 bis 25 Sekunden, am 35 Tage p.i. bis zu 42
Sekunden (Abb. 20).
Bis 35 Tage p.i. ließen sich keine Unterschiede zwischen den BDV-infizierten Mausgruppen
feststellen, 42 und 49 Tage p.i. benötigten die tg +/+ BDV-infizierten Tiere deutlich länger
um ins Hamsterrad zu klettern, als die ntg und tg+/- des jeweiligen Infektionstages. In der
Gruppe der mock-infizierten Tiere ließen sich keine Unterschiede zwischen den Gruppen
feststellen. Im Vergleich der BDV-infizierten mit den mock-infizierten Tieren fiel wiederum
die tg+/+ BDV-infizierte Mausgruppe am 42. und 49. Tag p.i. auf, die deutlich mehr Zeit
brauchte, um in das Rad zu klettern. Diese Unterschiede zwischen BDV- und mockinfizierten
Tieren waren bei tg+/- Mäusen 42 Tage p.i. statistisch auffällig (p=0,0809). Bei
den anderen Gruppen und Infektionszeitpunkten ließen sich keine signifikanten Unterschiede
feststellen.

86 Ergebnisse
Zeit [s]
120
100
80
60
40
20
0
21 28 35 42 49
Tage p.i.
*
ntg
tg+/tg+/+
Abb. 19: Hängtest, BDV-infizierte Mäuse
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot
transgene Mäuse, arithmetischer Mittelwert, Fehlerbalken: Standardabweichung, *: p< 0,05 (statistisch
signifikanter Unterschied im Vergleich zu mock-infizierten tg+/- Mäusen)
Zeit [s]
120
100
80
60
40
20
0
21 28 35 42 49
Tage p.i.
ntg
tg+/tg+/+
Abb. 20: Hängtest, mock-infizierte Mäuse
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse,
tg+/+: homozygot transgene Mäuse, arithmetischer Mittelwert, Fehlerbalken: Standardabweichung

Ergebnisse 87
4.1.8 Radlauf
Bei dem Lauf auf einem in der Luft schwebenden Hamsterlaufrad wurde die Bewegung der
der Mäuse beobachtet, während sie auf dem sich kontrolliert drehenden Hamsterrad nahezu
senkrecht nach oben laufen mussten. Die Beurteilung erfolgte deskriptiv. Die BDV-infizierten
Mäuse aller Gruppen liefen in der Mehrheit vierbeinig, in einzelnen Gruppen (28 Tage p.i.
ntg, 35 Tage p.i. tg+/-, 42 Tage p.i. tg+/-, 49 Tage p.i. ntg) wurden teilweise die
Vordergliedmaßen verstärkt benutzt (Tab. 24). Die mock-infizierten Mäuse aller Gruppen
liefen ebenfalls vierbeinig, 28 Tage p.i. zogen sich die Tiere der tg+/- Gruppe zeitweise vor
allem an den Vordergliedmaßen hoch. Die BDV-infizierten ntg Mäuse waren auf dem Rad am
21., 35. und 49. Tag p.i. aktiv, 28 Tage p.i. zeigten sich die Tiere wenig aktiv, 42 Tage p.i.
waren sie etwas vermindert aktiv. In der Gruppe der BDV-infizierten tg+/- Tiere liefen die
Mäuse am 21., 28. und 49. Tage p.i. aktiv, am 35. Tag p.i. wenig aktiv und 42 Tage p.i.
geringgradig vermindert aktiv. Die tg+/+ BDV-infizierten Mäuse waren 28, 42 und 49 Tage
p.i. aktiv, 21 und 35 Tage p.i. geringgradig vermindert aktiv.
Die Mäuse der mock-infizierten Gruppen waren durchweg aktiv, mit Ausnahme der ntg Tiere
21 Tage p.i., der tg+/+ Mäuse 35 und 49 Tage p.i., die sich wenig aktiv zeigten.
Bei allen drei BDV-infizierten Gruppen fielen 42 und 49 Tage p.i. bei einzelnen Tieren
geringgradige Unsicherheiten beim Laufen auf dem Hamsterrad auf. In der ntg mockinfizierten
Gruppe zeigte lediglich ein Tier 49 Tage p.i. geringgradige Unsicherheiten.

88 Ergebnisse
4.1.9 Weitere Tests
Die Beurteilung der Provokationsproben des N. trigeminus und des N. facialis, sowie die
Beurteilung des Flexor- und des Greifreflexes wurde anhand einer semiquantitativen
Schätzwertskala durchgeführt. Die Aufrichtereaktion und die Tischkantenprobe wurden
ebenfalls mittels semiquantitativer Schätzwertskala beurteilt. Zur Betrachtung der Ergebnisse
wurde der Median der jeweiligen Gruppe herangezogen.
Die Provokationsproben des N. trigeminus und des N. facialis, sowie die Untersuchung des
Flexor- und des Greifreflexes zeigten an allen untersuchten Zeitpunkten keine Unterschiede
zwischen den BDV-infizierten und mock-infizierten Tieren aller drei Gruppen. In der
Aufrichtungsreaktion, sowie der Tischkantenprobe waren an allen untersuchten Zeitpunkten
ebenfalls keine Unterschiede zischen BDV- und mock-infizierten Tieren zu erkennen.

Ergebnisse 89
4.2 Charakterisierung der Virusreplikation
Die Charakterisierung der Virusreplikation erfolgte anhand des Nachweises virusspezifischer
Proteine mit Hilfe der Immunhistologie, sowie mittels Nachweis verschiedener viraler RNA
Spezies durch in situ Hybridisierung (ISH) und quantitativer reverse Transkriptase-
Polymerase Kettenreaktion (qRT-PCR).
4.2.1 Immunhistologischer Nachweis viraler Proteine im Gehirn
Mittels Immunhistologie wurden das virale Nukleoprotein (BDV-N), das Matrixprotein des
BDV (BDV-M), sowie das virale Glykoprotein (BDV-GP) detektiert. Der Nachweis des
BDV-N wurde an allen BDV-infizierten, mock-infizierten und nicht-infizierten
Kontrollmäusen zu allen Untersuchungszeitpunkten durchgeführt (Tab. 3). Zusätzlich wurden
28 Tage p.i. in allen BDV-infizierten Mausgruppen (ntg, tg+/-, tg+/+) die Virusproteine BDV-
M und BDV-GP bei je drei Tieren pro Gruppe untersucht. Zur Betrachtung der Ergebnisse
wurde der Median der jeweiligen Gruppe herangezogen. Eine Übersicht über alle Ergebnisse
sowie über die Daten der statistischen Auswertung findet sich in Abschnitt 9.1.2.1 des
Anhangs.
Die mit Kontrollseren inkubierten Negativkontrollen zeigten keine spezifische Reaktion. In
den Positivkontrollen waren BDV-spezifische Reaktionen zu beobachten.
4.2.1.1 BDV-Nukleoprotein
BDV-N war in Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und in einzelnen Ependymzellen zu
finden. Zu späteren Zeitpunkten war zusätzlich eine starke Neuropilreaktion zu beobachten. In
allen Zellen war das Nukleoprotein sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma lokalisiert
(Abb. 50). Auch die Fortsätze der Neurone und Astrozyten enthielten BDV-N. In der Meninx
fanden sich ganz vereinzelt BDV-N-haltige Zellen unterschiedlicher Morphologie. Zum einen
waren flache meningeale Zellen BDV-N positiv, daneben konnten meistens perivaskulär
große rundliche BDV-N positive Zellen gefunden werden, die nicht mit
Entzündungszellinfiltraten assoziiert waren. In Endothel- und Entzündungszellen aller
Infiltrate war an keinem Infektionszeitpunkt in keiner Mausgruppe BDV-N zu finden.

90 Ergebnisse
Bereits 7 Tage p.i. war in allen infizierten Mausgruppen BDV-N nachweisbar (Abb. 21). Zu
diesem Zeitpunkt wiesen nur einzelne Zellen in Cortex cerebri und Ammonshorn eine
BDV-N spezifische Reaktion auf, bei einigen Tieren waren BDV-N positive Zellen zusätzlich
im Thalamus, im Kleinhirn und/oder in der Medulla oblongata zu finden.
14 Tage p.i. waren BDV-N positive Zellen in allen untersuchten Gehirngebieten vorhanden.
Ab 14 Tage p.i. war neben Astrozyten und Neuronen BDV-N auch in Oligodendrozyten
anzutreffen. Zwischen den infizierten Einzeltieren innerhalb der Infektionsgruppen ließen sich
14 Tage p.i. deutliche individuelle Schwankungen in dem Ausmaß der BDV-N Expression
erkennen. Bei einem tg+/+ BDV-infizierten Tier waren am 14 Tage p.i. nur einzelne Herde,
wie 7 Tage p.i. beschrieben, von BDV-N positiven Zellen zu finden. Bei anderen Tieren
enthielten alle Gehirnareale zahlreiche BDV-N- positive Zellen. Zwischen den BDVinfizierten
Gruppen untereinander ergaben sich zu diesem Zeitpunkt keine Unterschiede.
21 Tage p.i. waren bei allen Tieren aller BDV-infizierten Gruppen in allen untersuchten
Gehirngebieten zahlreiche positive Zellen zu finden und es zeigte sich in allen Regionen eine
Neuropilreaktion. Bei ntg Tieren war am 21. Tag p.i. bereits mit mittelgradig positiven Zellen
die maximale Virusausbreitung, die während des Untersuchungszeitraums festgestellt werden
konnte, erreicht. Die Anzahl positiver Zellen schwankte an den folgenden Infektionszeitpunkten
zwischen mittel- bis hochgradig, wobei der Median ab 35. Tag p.i. bei mittel- bis
hochgradig lag. Die Gruppe der tg+/- Tiere zeigte 21 Tage p.i. deutliche Schwankungen
innerhalb der Gruppe und in den folgenden Zeitpunkten einen wellenförmigen Verlauf der
Anzahl BDV-N positiver Zellen, der 28 bis 49 Tage p.i. zwischen mittel- und hochgradig
schwankte. Die tg+/+ Gruppe erreichte 21 Tage p.i. ein vorläufiges Plateau der BDV-N
Expression mit mittelgradiger Anzahl positiver Zellen. 42 Tage p.i. waren hochgradig BDV-N
haltige Zellen zu finden. 49 Tage p.i. war bei allen tg+/+ Tieren wieder mittelgradig BDV-N
nachweisbar.
Erst ab 21. Tag p.i. konnten in einzelnen Tieren aller drei Infektionsgruppen ganz vereinzelt
positive Ependymzellen nachgewiesen werden. Auch zu späteren Infektionszeitpunkten
fanden sich in allen drei Mausgruppen nur ganz vereinzelt positive Ependymzellen.
Ab 21. Tag p.i. war im Ammonshorn aller BDV-infizierter Mausgruppen ein
charakteristisches Expressionsmuster des BDV-N zu erkennen, das sich auch schon bei
einigen Tieren 14 Tage p.i. abzeichnete (Abb. 48). In allen Schichten, mit Ausnahme der
Molekular- und der Pyramidenzellschicht der CA1-Region war in fast allen Zellen BDV-N zu

Ergebnisse 91
finden. Weiterhin fand sich in allen Schichten, wieder mit Ausnahme der Molekular- und der
Pyramidenzellschicht der CA1-Region, eine ausgeprägte Neuropilreaktion. Im Gyrus dentatus
waren die Zellen der Subgranularschicht bemerkenswerterweise frei von BDV-N. Die
Molekularschicht des Gyrus dentatus zeigte der Granularzellschicht direkt anliegend eine
schwache feingranuläre Neuropilreaktion, welche in der Breite ca. ¼ der Molekularschicht
betraf und abrupt endete.
Auch im Cortex cerebri war ab 21. Tag p.i. eine schichtspezifische, unterschiedliche BDV-N
Immunreaktion in Zellen und im Neuropil nachweisbar (Abb. 49). In der äußeren
Körnerschicht und Pyramidenschicht sowie in der inneren Pyramidenschicht enthielten
zahlreiche Zellen BDV-N, die mit einer deutlichen Neuropilreaktion in diesen Schichten
verbunden war. Die dazwischen liegende innere Körnerschicht enthielt nur einzelne positive
Zellen und zeigte multifokal eine schwache Neuropilreaktion. Die oberflächliche
Molekularschicht und multiforme Schicht in der Tiefe zeigten nur einzelne positive Zellen
und eine schwache Neuropilreaktion.
Zwischen den drei BDV-infizierten Mausgruppen (ntg, tg+/-, tg+/+) ließen sich 7 und 14
Tage p.i. bezüglich der Anzahl und Verteilung der BDV-N positiven Zellen keine
signifikanten Unterschiede feststellen (Abb. 21). 21 Tage p.i. war in ntg und tg+/- Tieren
geringgradig mehr Antigen nachweisbar als in tg+/+ Tieren, wobei in der Gruppe der tg+/-
Tiere eine große Schwankung in der Anzahl der positiven Zellen zu verzeichnen war. 28 Tage
p.i. zeigten die Mediane der Gruppen keine Abweichungen untereinander, wobei in der tg+/-
Gruppe die BDV-N Immunreaktion zwischen mittel- bis hochgradig schwankte. In der
Gruppe der tg+/+ Mäuse war 28 Tage p.i. maximal mittelgradig BDV-N nachweisbar. Am 35.
Tag p.i. lag der Median der ntg Tiere bei mittel- bis hochgradig. Bei den tg+/- Tiere war hochgradig
und bei den tg+/+ Tiere mittelgradig Antigen zu finden. 42 Tage p.i. konnte bei den
ntg Tieren ebenfalls mittel- bis hochgradig BDV-N nachgewiesen werden, während bei tg+/-
Tieren mittelgradig und bei tg+/+ Tiere hochgradig BDV-N zu beobachten war. 49 Tage p.i.
war bei ntg und tg+/- Mäusen mittel- bis hochgradig, bei tg+/+ mittelgradig BDV-N im
Gehirn nachweisbar.
In den Gehirnschnitten der nicht-infizierten Kontrolltiere und mock-infizierten Mäuse konnte
zu keinem Zeitpunkt der Untersuchung BDV-N nachgewiesen werden.

92 Ergebnisse
Immunreaktion
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
7 14 21 28
Tage p.i.
35 42 49
Abb. 21: Semiquantitative Auswertung der BDV-N Expression
Immunreaktion (0: kein, 1: gering-, 2: mittel, 3: hochgradig BDV-Antigen nachweisbar), p.i.: post infectionem,
ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, Median,
Fehlerbalken: Minimaler/ Maximaler Wert
ntg
tg+/-
tg+/+

Ergebnisse 93
4.2.1.2 BDV-Matrixprotein
Eine BDV-M spezifische Reaktion war 28 Tage p.i. in allen untersuchten Gehirnregionen in
zahlreichen Zellen (Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten) nachweisbar. In
Ependymzellen, Endothelzellen und perivaskulären mononukleären Entzündungszellen war
kein BDV-M nachweisbar. Anders als der Nachweis des BDV-N befand sich das BDV-M vor
allem in Zytoplasma und Fortsätzen der Zellen (Abb. 53). Das Antigenverteilungsmuster des
BDV-M war jedoch bezüglich der Ausbreitung in Gehirnareale dem des BDV-N sehr ähnlich
(Abb. 51 und Abb. 52).
Anders als beim Nachweis des BDV-N beobachtet, enthielten in der CA2- und CA3-Region
des Ammonshorns die Neurone nur wenig BDV-M. In der CA3-Region zeigte sich eine
deutliche Reaktion der Moosfasern des Stratum lucidum. Auch die CA1-Region zeigte wie
beim Nachweis des BDV-N nur vereinzelt positive Neurone. Weiterhin waren nur vereinzelte
Neurone des Stratum granulare des Gyrus dentatus positiv markiert. Die Zellen der
Subgranularschicht enthielten kein BDV-M. Direkt angrenzend an die Granularzellschicht des
Gyrus dentatus zeigte sich eine intensive feingranuläre Neuropilreaktion der Molekularschicht.
Diese war, wie bereits für das BDV-N beschrieben, ca. ¼ der Molekularschicht breit
und endete abrupt. Die drei BDV-infizierten Mausgruppen zeigten keine Unterschiede in der
Anzahl und Ausbreitung der BDV-M positiven Zellen. Bei ntg und tg+/+ Tieren konnte
mittelgradig, bei tg+/- mittel- bis hochgradig Antigen nachgewiesen werden (Abb. 22).

94 Ergebnisse
4.2.1.3 BDV-Glykoprotein
Das BDV-GP konnte 28 Tage p.i. in allen drei Mausgruppen nur in einzelnen Neuronen
nachgewiesen werden (Abb. 22). In Astrozyten, Oligodendrozyten, Ependymzellen,
Endothelzellen und Entzündungszellen war kein BDV-GP zu finden. Anders als der Nachweis
des BDV-N war BDV-GP vor allem in Zytoplasma und den Fortsätzen lokalisiert (Abb. 56).
BDV-GP war vor allem in einzelnen Zellen in Cortex cerebri, Thalamus, Cerebellum und
Medulla oblongata zu finden (Abb. 54 und Abb. 55). Nur in einzelnen Tieren war auch in
Neuronen des Ammonshorn und Striatum Glykoprotein nachweisbar. Zwischen den BDVinfizierten
Mausgruppen waren keine Unterschiede hinsichtlich der zellulären Verteilung, der
Anzahl positiver Zellen, sowie der betroffenen Gehirnareale erkennbar.
Immunreaktion
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
ntg tg+/- tg+/+
BDV-N
BDV-M
BDV-GP
Abb. 22: Semiquantitative Auswertung der BDV-N, -M und -GP Expression am 28 Tag p.i.
Immunreaktion (0: kein, 1: gering-, 2: mittel-, 3: hochgradig BDV-Antigen nachweisbar), p.i.: post infectionem,
ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, BDV-N:
BDV-Nukleoprotein, BDV-M: BDV-Matrixprotein, BDV-GP: BDV-Glykoprotein, Median, Fehlerbalken:
Minimaler/ Maximaler Wert

Ergebnisse 95
4.2.1.4 Korrelation der immunhistologischen Ergebnisse
Zusammenfassend waren BDV-N und BDV-M 28 Tage p.i. in Neuronen, Astrozyten und
Oligodendrozyten und in einer vergleichbaren Anzahl von Zellen nachweisbar, während das
BDV-GP an diesem Zeitpunkt nur in Neuronen und nur in einzelnen wenigen Zellen zu
finden war (Abb. 22). Es waren statistisch höchst signifikant mehr Zellen BDV-N
(p=

96 Ergebnisse
4.2.2 Nachweis viraler RNA im Gehirn
Zum Nachweis viraler RNAs wurden die in situ Hybridisierung (ISH) und qRT-PCR
verwandt. Mit Hilfe der ISH wurden qualitativ-morphologische Aspekte wie die intrazelluläre
Verteilung der BDV-spezifischen RNAs, das Auftreten der viralen RNA in verschiedenen
Zelltypen, sowie das topographische Verteilungsmuster innerhalb des Gehirns untersucht. Die
Auswertung erfolgte semiquantitativ. Die Anwendung der qRT-PCR erlaubte eine präzise
Quantifizierung der viralen RNAs. Eine Übersicht über alle Ergebnisse sowie über die Daten
der statistischen Auswertung findet sich in Abschnitt 9.1.2.2 des Anhangs.
4.2.2.1 In situ Hybridisierung zum Nachweis viraler RNA im Gehirn
Mit der ISH wurden genomische virale RNA (-ssRNA) und mRNA (+ssRNA) spezifisch für
das BDV-N (-ssBDV-N, +ssBDV-N) und BDV-GP (-ssBDV-GP, +ssBDV-GP) 14, 28 und 42
Tage p.i. an Gehirngewebe von je drei Tieren jeder BDV-infizierten Mausgruppe
nachgewiesen. Die ISH zum Nachweis BDV-Intron I (-ssBDV-Intron I, +ssBDV-Intron I)
spezifischer RNA wurde 28 Tage p.i. an ebenfalls drei Tieren pro BDV-infizierter Gruppe
durchgeführt. Der Nachweis +ssBDV-Intron I erlaubt einen Rückschluss auf BDV-M
kodierende mRNAs. Die Lage der Sonden ist in Abb. 8 im ‚Material und Methoden’- Kapitel
dargestellt.
An den ausgewählten Zeitpunkten war bei allen Gruppen mittels Immunhistologie das virale
Nukleoprotein BDV-N nachweisbar (4.2.1). Es handelt sich um die Zeitpunkte initialer und
maximaler Virusausbreitung in allen drei Gruppen, wobei zu diesem Zeitpunkt nach Infektion
deutliche graduelle Unterschiede in der Entzündungsreaktion zwischen den Mausgruppen
bestanden (Abb. 37). Zur Betrachtung der Ergebnisse wurde der Median der jeweiligen
Gruppe herangezogen.
Die Schnitte nicht-infizierter Kontrolltiere wiesen mit keiner Sonde eine spezifische Reaktion
auf. Auch die anderen Negativkontrollen zeigten keine spezifische Reaktion.
Mit der Detektion von -ssRNA wurden die jeweils korrespondierenden viralen
Genomabschnitte dargestellt. -ssBDV-N, -ssBDV-GP und -ssBDV-Intron I fanden sich in
Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Der Nachweis der -ssRNA in den

Ergebnisse 97
verschiedenen Zelltypen, wie Astrozyten und Oligodendrozyten, wurde durch Doppelmarkierungen
von -ssBDV-N spezifischer Sonde und immunhistologischem Nachweis von
GFAP bzw. CNPase verifiziert (4.2.2.3). Zu den Untersuchungszeitpunkten fanden sich alle
untersuchten, viralen genomischen RNAs nur im Kern infizierter Zellen. Die Zellkerne
zeigten teils ein bis mehrere blauschwarze punktförmige, teils eine diffuse Reaktion (Abb.
59). Alle -ssRNAs waren in allen untersuchten Gehirnarealen (Cortex cerebri, Striatum,
Ammonshorn, Thalamus, Hypothalamus, Cerebellum, Medulla oblongata) in allen
Mausgruppen zu allen untersuchten Zeitpunkten zu finden. In Ammonshorn und Cortex
cerebri zeigten vergleichbare Zellschichten, wie für das BDV-N beschrieben, eine nukleäre
Reaktion (Abb. 57 und Abb. 58). Bei den ntg BDV-infizierten Tieren nahm die Anzahl der
positiven Zellen kontinuierlich von mittelgradig 14 Tage p.i. über mittel- bis hochgradig 28
Tage p.i. bis hochgradig 42 Tage p.i. zu (Abb. 24 und Abb. 25). Beide transgenen
Mausgruppen wiesen an allen untersuchten Zeitpunkten eine mittelgradige Anzahl positiv
markierter Zellen auf. Der Nachweis der beiden genomischen RNA-Abschnitte (-ssBDV-N
als auch -ssBDV-GP) war bezüglich intranukleärer Lokalisation, Kinetik und betroffener
Gehirnareale vergleichbar. Am 28 Tag p.i. wurde zusätzlich -ssBDV-Intron I untersucht, diese
zeigte ebenfalls eine ausschließlich intranukleäre Reaktion und war in den gleichen
Gehirnarealen zu finden wie -ssBDV-N und -ssBDV-GP.
Im Globalvergleich konnte zwischen den drei BDV-infizierten Mausgruppen 28 Tage p.i. ein
statistisch auffälliger Unterschied sowohl in Bezug auf -ssBDV-N als auch in Bezug auf
-ssBDV-GP festgestellt werden (p=0,0600), wobei die ntg und tg+/- Tiere mehr positive
Zellen aufwiesen als die tg+/+ Tiere. Am 42. Tag p.i. konnte bei diesen beiden RNA Spezies
signifikante Unterschiede zwischen den drei Mausgruppen festgestellt werden (-ssBDV-N:
p=0,0302; -ssBDV-GP: p=0,0457), mit deutlich mehr positiven Zellen bei den ntg Tieren als
in den transgenen Mausgruppen.
Die mittels as-Sonde nachgewiesene +ssRNA (mRNA und Antigenom) gab Aufschluss über
die Transkriptionsaktivität und die Virusausbreitung.
+ssBDV-N fand sich 14 Tage p.i. vor allem im Nukleus und in geringen Mengen im
kernnahen Zytoplasma von Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Der Nachweis der
+ssBDV-N in den verschiedenen Zelltypen wurde durch Doppelmarkierungen von +ssBDV-
N spezifischer Sonde und immunhistologischem Nachweis von GFAP bzw. CNPase

98 Ergebnisse
verifiziert (4.2.2.3). 28 und 42 Tage p.i. war das Signal vor allem im Perikaryon und in den
Fortsätzen infizierter Zellen zu finden (Abb. 62). Nur ganz geringe Mengen RNA lagen, meist
punktförmig, im Nukleus vor. An allen Untersuchungszeitpunkten war bei allen BDVinfizierten
Mausgruppen in allen untersuchten Gehirnarealen +ssBDV-N nachweisbar. In
Ammonshorn und Cortex cerebri zeigten vergleichbare Zellschichten, wie für das BDV-N
beschrieben, eine positive Reaktion (Abb. 60 und Abb. 61). Zwischen den drei BDVinfizierten
Mausgruppen gab es hinsichtlich der intrazellulären Verteilung und Topographie
keine Unterschiede.
Bei den ntg BDV-infizierten Tieren nahm die Anzahl der positiven Zellen kontinuierlich zu.
14 Tage p.i. lag die Anzahl der positiven Zellen bei gering- bis mittelgradig und stieg bis 42
Tage p.i. auf hochgradig positive Zellen an. Beide transgenen BDV-infizierten Gruppen
wiesen 14 Tage p.i. eine mittelgradige, 28 und 42 Tage p.i. eine mittel- bis hochgradige
Anzahl positiv markierter Zellen auf (Abb. 26).
28 Tage p.i. war im Globalvergleich zwischen den drei BDV-infizierten Mausgruppen ein
statistisch auffälliger Unterschied (p=0,0600) zu finden, wobei die ntg und tg+/- Tiere mehr
positive Zellen aufwiesen als die tg+/+ Tiere. 42 Tage p.i. konnte zwischen den ntg und tg+/-
Tieren eine statistisch auffällige Differenz (p=0,0593) beobachtet werden, mit mehr positiven
Zellen in ntg Tieren als in tg+/-. Die tg+/+ wiesen eine noch geringere Anzahl positiver Zellen
auf.
+ssBDV-GP fand sich wie das +ssBDV-N in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten.
Der Nachweis der +ssBDV-GP in den verschiedenen Zelltypen wurde durch Doppelmarkierungen
von +ssBDV-GP spezifischer Sonde und Nachweis von GFAP bzw. CNPase
verifiziert (4.2.2.3).
14 Tage p.i. war +ssBDV-GP vor allem im Nukleus und in geringen Mengen im kernnahen
Zytoplasma lokalisiert. 28 und 42 Tage p.i. war +ssBDV-GP sowohl im Nukleus, Perikaryon
und in den neuronalen Fortsätzen zu finden (Abb. 68). Die Zellkerne waren diffus
blauschwarz gefärbt oder enthielten ein bis zwei punktförmige teilweise mehrere schollige
positive Reaktionen. +ssBDV-GP war zu allen untersuchten Zeitpunkten in allen untersuchten
Gehirnarealen zu finden. In Ammonshorn und Cortex cerebri zeigten vergleichbare
Zellschichten, wie für das BDV-N beschrieben, eine positive Reaktion (Abb. 66 und Abb.

Ergebnisse 99
67). Zwischen den drei BDV-infizierten Mausgruppen gab es hinsichtlich der intrazellulären
Verteilung und Topographie des +ssBDV-GP Nachweises keine Unterschiede.
Die Gruppe der ntg Tiere zeigte eine kontinuierliche Zunahme positiver Zellen, von geringbis
mittelgradig 14 Tage p.i., mittel- bis hochgradig am 28 Tage p.i. bis hochgradig am 42
Tage p.i. Bei beiden transgenen Mausgruppen waren 14 Tage p.i. mittelgradig, 28 mittel- bis
hochgradig und 42 Tage p.i. wieder mittelgradig positiv markierte Zellen vorhanden (Abb.
27). 28 Tage p.i. war zwischen den drei BDV-infizierten Mausgruppen eine statistisch
auffällige Differenz erkennbar (p=0,0600), wobei die ntg und tg+/- Tiere mehr positive Zellen
aufwiesen als die tg+/+ Tiere. Am 42. Tag p.i. waren statistisch signifikante Unterschiede
(p=0,0302) zwischen den drei Gruppen zu finden mit deutlich mehr positiven Zellen bei den
ntg Tieren als in den transgenen Mausgruppen.
+ssBDV-Intron I war 28 Tage p.i. in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten zu finden.
Der Nachweis der +ssBDV-Intron I in den verschiedenen Zelltypen wurde durch Doppelmarkierungen
von +ssBDV-Intron I spezifischer Sonde und immunhistologischem Nachweis
von GFAP bzw. CNPase verifiziert (4.2.2.3).
In Neuronen war +ssBDV-Intron I vor allem in Perikaryon und den neuronalen Fortsätzen zu
finden, nur ganz geringe Mengen RNA lagen, meist punktförmig, im Nukleus vor (Abb. 65).
In Astrozyten und Oligodendrozyten fand sich +ssBDV-Intron I vor allem im kernnahen
Zytoplasma. +ssBDV-Intron I war in allen untersuchten Gehirnarealen zu finden. In
Ammonshorn und Cortex cerebri zeigten vergleichbare Zellschichten, wie für das BDV-N
beschrieben, eine positive Reaktion (Abb. 63 und Abb. 64). Zwischen den drei BDVinfizierten
Mausgruppen gab es hinsichtlich der intrazellulären Verteilung und Topographie
des +ssBDV-Intron I Nachweises keine Unterschiede.
4.2.2.2 Korrelation der Ergebnisse der in situ Hybridisierungen
Zusammenfassend waren alle untersuchten -ssRNAs in Neuronen, Astrozyten und
Oligodendrozyten zu finden. Der Nachweis war zu allen untersuchten Zeitpunkten in allen
BDV-infizierten Tieren nur im Nukleus möglich. Die Anzahl der –ssBDV-N positiven Zellen
war vergleichbar mit der Anzahl -ssBDV-GP positiver Zellen (Abb. 24 und Abb. 25). Auch

100 Ergebnisse
die Anzahl der -ssBDV-Intron I positiver Zellen 28 Tage p.i. entsprach den -ssBDV-N und
-ssBDV-GP positiven Zellen zu diesem Zeitpunkt (Abb. 28).
Die drei untersuchten +ssRNAs waren ebenfalls in Neuronen, Astrozyten und
Oligodendrozyten zu finden. In der intrazellulären Verteilung waren ab 28 Tage p.i.
Unterschiede zwischen +ssBDV-N und +ssBDV-GP zu erkennen. Während die +ssBDV-N ab
28 Tage p.i. vor allem im Zytoplasma inklusive der Fortsätze zu finden war, und nur geringe
Mengen meist punktförmig im Zellkern lagen, konnte +ssBDV-GP ab 28 Tage p.i. im
Zytoplasma und diffus, teils punktförmig bis schollig im Zellkern angetroffen werden. Die
+ssBDV-Intron I zeigte 28 Tage p.i. eine dem +ssBDV-N vergleichbare intrazelluläre
Verteilung, mit deutlicher Reaktion im Zytoplasma und unregelmäßiger, schwacher,
punktförmiger, nukleärer Reaktion.
Zwischen den +ssRNAs waren keine wesentlichen Unterschiede hinsichtlich der Anzahl der
positiven Zellen pro Infektionszeitpunkt erkennbar (Abb. 26 bis Abb. 28), wobei im
Vergleich von +ssBDV-GP und +ssBDV-Intron I die etwas höheren Mediane der +ssBDV-
GP bei tg+/- Tiere auffielen (Abb. 28).
Bei den ntg Tieren zeigte die nachweisbare Anzahl von Zellen, die -ssBDV-N, -ssBDV-GP,
+ssBDV-N und +ssBDV-GP enthielten, im zeitlichen Verlauf einen signifikanten Anstieg im
Globaltest (p=0,0319, Abb. 29).

Ergebnisse 101
ISH-Reaktion
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
14 28 42
Tage p.i.
Abb. 24: Semiquantitative Auswertung der Expression genomischer viraler RNA (Genabschnitt
kodogen für das BDV-N, -ssBDV-N) mittels in situ Hybridisierung
ISH-Reaktion (0: keine, 1: gering-, 2: mittel-, 3: hochgradig BDV-spezifische RNA nachweisbar), p.i.: post
infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene
Mäuse, ISH: in situ Hybridisierung, BDV-N: BDV-Nukleoprotein, Median, Fehlerbalken: Minimaler/
Maximaler Wert, *: p< 0.05 (statistisch signifikanter Unterschied zwischen den drei BDV-infizierten
Mausgruppen)
ISH-Reaktion
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
14 28 42
Tage p.i.
Abb. 25: Semiquantitative Auswertung der Expression genomischer viraler RNA (Genabschnitt
kodogen für das BDV-GP, -ssBDV-GP) mittels in situ Hybridisierung
ISH-Reaktion (0: keine, 1: gering-, 2: mittel-, 3: hochgradig BDV-spezifische RNA nachweisbar), p.i.: post
infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene
Mäuse, ISH: in situ Hybridisierung, BDV-GP: BDV-Glykoprotein, Median, Fehlerbalken: Minimaler/
Maximaler Wert, *: p< 0.05 (statistisch signifikanter Unterschied zwischen den drei BDV-infizierten
Mausgruppen)
*
*
ntg
tg+/tg+/+
ntg
tg+/tg+/+

102 Ergebnisse
ISH-Reaktion
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
14 28 42
Tage p.i.
Abb. 26: Semiquantitative Auswertung der Expression viraler BDV-N spezifischer mRNA
(+ssBDV-N) mittels in situ Hybridisierung
ISH-Reaktion (0: keine, 1: gering-, 2: mittel-, 3: hochgradig BDV-spezifische RNA nachweisbar), p.i.: post
infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene
Mäuse, ISH: in situ Hybridisierung, BDV-N: BDV-Nukleoprotein, Median, Fehlerbalken: Minimaler/
Maximaler Wert
ISH-Reaktion
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
14 28 42
Tage p.i.
Abb. 27: Semiquantitative Auswertung der Expression viraler BDV-GP spezifischer mRNA
(+ssBDV-GP) mittels in situ Hybridisierung
ISH-Reaktion (0: keine, 1: gering-, 2: mittel-, 3: hochgradig BDV-spezifische RNA nachweisbar), p.i.: post
infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene
Mäuse, ISH: in situ Hybridisierung, BDV-GP: BDV-Glykoprotein, Median, Fehlerbalken: Minimaler/
Maximaler Wert, *: p< 0.05 (statistisch signifikanter Unterschied zwischen den drei BDV-infizierten
Mausgruppen)
*
ntg
tg+/tg+/+
ntg
tg+/tg+/+

Ergebnisse 103
ISH-Reaktion
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
ntg tg+/- tg+/+
+ssBDV-GP
+ssBDV-Intron I
Abb. 28: Semiquantitativen Auswertung der viraler BDV-GP mRNA- und BDV-Intron I
mRNA- Expression (+ssBDV-GP und +ssBDV-Intron I) am 28 Tag p.i.
ISH-Reaktion (0: keine, 1: gering-, 2: mittel-, 3: hochgradig BDV-spezifische RNA nachweisbar), p.i.: post
infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene
Mäuse, ISH: in situ Hybridisierung, BDV-GP: BDV-Glykoprotein, Median, Fehlerbalken: Minimaler/
Maximaler Wert
ISH-Reaktion
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
* * * *
ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+
-ssBDV-N -ssBDV-GP +ssBDV-N +ssBDV-GP
14 28 42 Tage p.i.
Abb. 29: Vergleich der mittels ISH nachgewiesenen RNA-Expressionen
ISH-Reaktion (0: keine, 1: gering-, 2: mittel-, 3: hochgradig BDV-spezifische RNA nachweisbar), p.i.: post
infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene
Mäuse, ISH: in situ Hybridisierung, BDV-N: BDV-Nukleoprotein, BDV-GP: BDV-Glykoprotein, -ss:
genomische Virus-RNA, +ss: positiv orientierte RNA, Median, *: p< 0.05 (statistisch signifikante Zunahme
RNA-haltiger Zellen im zeitlichen Verlauf)

104 Ergebnisse
4.2.2.3 Doppelmarkierungen zum Nachweis viraler RNA in spezifischen
Zellpopulationen
Um BDV-N-, BDV-GP- und BDV-Intron I-spezifische +ssRNA in Astrozyten und Oligodendrozyten
nachzuweisen, wurden ISH/Immunhistologie-Doppelmarkierungen mit den
entsprechenden BDV-spezifischen Sonden und GFAP zum Nachweis der Astrozyten bzw.
CNPase zum Nachweis der Oligodendrozyten an je drei Tieren pro Infektionsgruppe 28 Tage
p.i. angewandt. Des Weiteren wurde an den gleichen Tieren eine ISH/Immunhistologie-
Doppelmarkierung zum Nachweis viraler genomischer RNA, mit der den BDV-N
kodierenden Abschnitt des Genoms erkennenden Sonde (-ssBDV-N), und GFAP bzw.
CNPase durchgeführt. Die ISH-Sonden zeigten gleichartige Ergebnisse wie in der
entsprechenden ISH (4.2.2.1) beschrieben. GFAP-positive Signale waren im Zytoplasma der
Astrozyten zu finden. CNPase war im Myelin der Oligodendrozyten nachweisbar. Alle
Negativkontrollen zeigten keine spezifische Reaktion.
Es konnten Kolokalisationen aller virusspezifischen +ssRNAs sowie der -ssBDV-N mit
GFAP bzw. CNPase in allen Tieren nachgewiesen werden (Abb. 69 bis Abb. 76). –ssBDV-N
war sowohl in Astrozyten als auch in Oligodendrozyten ausschließlich im Zellkern zu finden.
+ssBDV-N, +ssBDV-GP und +ssBDV-Intron I waren wie schon für die Neuronen
beschrieben ebenfalls in Astrozyten und Oligodendrozyten sowohl im Zellkern als auch im
Zytoplasma nachweisbar, das Zytoplasma dieser BDV-infizierten Zellen zeigte eine braunblaue
Mischfarbe.
Astrozyten mit Nachweis von viraler +ssRNA und -ssRNA waren in allen untersuchten
Gehirnarealen zu finden. BDV-infizierte Oligodendrozyten waren vor allem im Corpus
callosum, der Capsula externa, Medulla oblongata, sowie im Kleinhirnmark lokalisiert,
einzelne Oligodendrozyten mit Nachweis von viraler +ssRNA und -ssRNA waren auch im
Thalamus zu finden.

Ergebnisse 105
4.2.2.4 qRT-PCR zum Nachweis viraler RNA im Gehirn
Die für jedes virale und zelluläre Gen mitgemessenen spezifischen Standardreihen konnten in
jedem PCR-Lauf in allen eingesetzten Verdünnungsstufen gemessen werden. Eine Übersicht
über die Details der qRT-PCR Messungen gibt Tab. 14. Über den gesamten Messzeitraum
wurden bei den NTCs keine Amplifikate detektiert.
Die qRT-PCR diente dem Nachweis der +ssBDV-N, +ssBDV-GP, +ssBDV-Intron I und des
+ssBDV-AG. Die qRT-PCR wurde mit Gehirnmaterial von je drei Tieren pro Gruppe 21 und
42 Tage p.i. durchgeführt.
Aus den drei eingesetzten Housekeeping Genen (SDAH, HPRT, GAPDH) wurde mittels
geNorm ein Faktor bestimmt, der der Normalisierung der viralen Gene diente. Alle
normalisierten Kopienzahlen der BDV-spezifischen cDNAs wurden in die Auswertung
einbezogen. Die Normalverteilung der Daten wurde mittels Kolmogorow-Smirnow-Test
bestätigt. Anschließend wurden der arithmetische Mittelwert und die Standardabweichung der
jeweiligen Gruppe bestimmt.
Die Menge der nachweisbaren Housekeeping Gene bei den fünf untersuchten Kontrolltieren
war mit den Mengen der Housekeeping Gene der infizierten Tiere vergleichbar, virale cDNA
konnte bei den Kontrolltieren nicht detektiert werden.
Tab. 14: Übersicht über Effizienz, RSq-Werte und Ct-Werte der jeweils höchsten und
niedrigsten Verdünnung in den Standardreihen
+ssBDV-AG #
Effizienz [%] RSq x Ct 10 8
x Ct 10 2
95,8 0,992 15,07 34,07
+ssBDV-N 98,0 0,998 12,03 32,74
+ssBDV-GP 101,2 0,999 11,99 31,75
+ssBDV-Intron I 102,1 0,991 13,40 32,43
+ssGAPDH 101,7 0,998 12,00 31,19
+ssHPRT 99,8 0,997 14,54 34,45
+ssSDHA 106,9 0,997 13,91 32,53
RSq: RSquared, Abweichung der Standardpunkte von der Standardkurve, x : arithmetischer Mittelwert, Ct:
threshold cycle, Schwellenwert, +ss: positiv strängige RNA, BDV-N: BDV- Nukleoprotein, BDV-GP: BDV-
Glykoprotein, BDV- AG: BDV-Antigenom, SDHA: Succinat Dehydrogenase Komplex, Untereinheit A; HPRT:
Hypoxanthin Phosphoribosly Transferase I, GAPDH: Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase, #: als
Mengenstandard wurde beim BDV-AG abweichend eine log10 107 bis 101 Standardverdünnungsreihe
eingesetzt

106 Ergebnisse
Das BDV-Antigenom wurde zum einen zur Normalisierung der anderen BDV spezifischen
RNAs gemessen, da durch den in der Reversen Transkription eingesetzten as-Primer neben
der mRNA auch das so genannte Antigenom in cDNA umgeschrieben wurde. Weiterhin
ermöglichte die Bestimmung der Menge des +ssBDV-AG eine Aussage über die aktive virale
Replikation. In allen drei infizierten Mausgruppen (ntg, tg+/-, tg+/+) waren zu beiden
Untersuchungszeitpunkten nur geringe Mengen Antigenom-spezifische cDNA in der Größenordnung
von 10 1 bis 10 2 Kopien nachweisbar (Tab. 15, Abb. 30). Bei den ntg Mäusen war
nur ein geringer Anstieg der nachweisbaren Kopienzahl vom 21. bis 42. Tag p.i. von
durchschnittlich 111 Kopien auf 149 Kopien zu finden. Die tg+/- Tiere zeigten in diesem
Zeitintervall eine deutliche Vermehrung der detektierbaren Kopien von 61 Kopien 21 Tage
p.i. auf 250 Kopien 42 Tage p.i. Auch bei den tg+/+ Mäusen war ein Anstieg von 56 Kopien
21 Tage p.i. auf 190 Kopien 42 Tage p.i. nachweisbar. In allen drei infizierten Mausgruppen
war der Anstieg der +ssBDV-AG Kopienzahl von 21 bis 42 Tage p.i. statistisch auffällig
(p=0,0821). Zwischen den BDV-infizierten Gruppen untereinander ließen sich keine
signifikanten Unterschiede feststellen.
Die nachweisbare Menge an +ssBDV-N lag in allen drei BDV-infizierten Mausgruppen im
Bereich von 10 7 Kopien. Bei tg+/- Tieren fand sich von 21 bis 42 Tage p.i. ein Anstieg der
Kopienzahlen, während in ntg und tg+/+ die nachweisbare Menge an +ssBDV-N nahezu
konstant blieb (Tab. 15, Abb. 31). Bei den ntg Tieren konnten 21 Tage p.i. 1,73 x 10 7 Kopien
nachgewiesen werden, 42 Tage p.i. konnten 1,60 x 10 7 Kopien gemessen werden. 21 Tage p.i.
waren in der Gruppe der tg+/- Mäuse 1,01 x 10 7 Kopien und 42 Tage p.i. 1,83 x 10 7 Kopien
nachweisbar. Bei den tg+/+ Tieren lagen die Messwerte bei 1,94 x 10 7 Kopien am 21. Tag p.i.
und bei 1,46 x 10 7 Kopien am 42. Tag p.i. Zwischen den BDV-infizierten Gruppen ließen sich
keine signifikanten Unterschiede feststellen.
+ssBDV-GP war in der Größenordnung von 10 5 Kopien detektierbar (Tab. 15, Abb. 32). Die
Kopienzahlen der +ssBDV-GP war 21 Tage p.i. in allen BDV-infizierten Mausgruppen
signifikant höher als 42 Tage p.i. (p=0,0300). Bei ntg Mäusen konnte eine Verminderung der
Kopienzahl von 4,86 x 10 5 Kopien 21 Tage p.i. auf 3,03 x 10 5 Kopien 42 Tage p.i. festgestellt
werden. Die tg+/- Tiere zeigten eine deutliche Verminderung der Kopienzahl von 6,11 x 10 5
Kopien 21 Tage p.i. auf 2,16 x 10 5 Kopien 42 Tage p.i. In der Gruppe der tg+/+ Mäuse war 21

Ergebnisse 107
Tage p.i. 3,76 x 10 5 Kopien nachweisbar, 42 Tage p.i. waren 2,41 x 10 5 Kopien zu finden.
Zwischen den BDV-infizierten Gruppen ließen sich keine signifikanten Unterschiede
feststellen.
+ssBDV-Intron I war ebenfalls in der Größenordnung von 10 5 Kopien detektierbar (Tab. 15,
Abb. 33). Die nachweisbaren Kopienzahlen waren in allen BDV-infizierten Gruppen am 21.
und 42. Tag p.i. vergleichbar. In der Gruppe der ntg Mäuse lagen die detektierbaren
Kopienzahlen 21 Tage p.i. bei 7,08 x 10 5 Kopien, 42 Tage p.i. bei 6,34 x 10 5 Kopien. Bei den
tg+/- Mäusen konnten 21 Tage p.i. 9,22 x 10 5 Kopien und 42 Tage p.i. 9,50 x 10 5 Kopien
gemessen werden. Die Kopienzahl der tg+/+ Tiere lag 21 Tage p.i. bei 5,97 x 10 5 Kopien und
42 Tage p.i. bei 5,62 x 10 5 Kopien. Zwischen den BDV-infizierten Gruppen ließen sich keine
signifikanten Unterschiede feststellen.
Tab. 15: Normalisierte Kopienzahlen der BDV-spezifischen cDNAs
Mausgruppe
ntg
tg+/-
tg+/+
+ssBDV-AG
x 10 2
+ssBDV-N
x 10 7
+ssBDV-GP
x 10 5
+ssBDV-Intron I
x 10 5
Tage
p.i.
x s x s x s x s
21 1,11 0,41 1,73 0,56 4,68 0,71 7,08 0,70
42 1,49 1,16 1,60 0,35 3,03 1,33 6,34 3,14
21 0,61 0,52 1,01 0,39 6,11 3,99 9,22 5,58
42 2,50 2,51 1,83 0,36 2,16 0,26 9,50 0,93
21 0,56 0,25 1,94 0,89 3,76 1,43 5,97 2,14
42 1,90 0,96 1,46 0,46 2,41 0,73 5,62 0,65
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot
transgene Mäuse, +ssBDV-AG: positiv strängiges BDV-Antigenom, +ssBDV-N: BDV- Nukleoprotein
spezifische positiv strängige RNA, +ssBDV-GP: BDV-Glykoprotein spezifische positiv strängige RNA;
+ssBDV-Intron I: BDV-Intron I spezifische positiv strängige RNA, Kopienzahl des BDV-spezifischen Gene
normalisiert anhand von drei Housekeeping Genen (GAPDH, HPRT, SDHA) mittels geNorm, x : arithmetischer
Mittelwert, s: Standardabweichung

108 Ergebnisse
Kopienzahlen (normalisiert)
600
500
400
300
200
100
0
21 42
Tage p.i.
Abb. 30: Normalisierte Kopienzahl des +ssBDV-Antigenom
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+ homozygot
transgene Mäuse, +ssBDV-Antigenom: komplette positiv orientierte BDV-RNA, Kopienzahl des BDV-AG
normalisiert anhand von drei Housekeeping Genen (GAPDH, HPRT, SDHA) mittels geNorm, arithmetischer
Mittelwert, Fehlerbalken: Standardabweichung
Kopienzahlen (normalisiert)
30.000.000
25.000.000
20.000.000
15.000.000
10.000.000
5.000.000
0
21 42
Tage p.i.
Abb. 31: Normalisierte Kopienzahlen der +ssBDV-N
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot
transgene Mäuse, +ssBDV: positiv orientierte RNA, Kopienzahl der +ssBDV-N normalisiert anhand von drei
Housekeeping Genen (GAPDH, HPRT, SDHA) mittels geNorm, arithmetischer Mittelwert, Fehlerbalken:
Standardabweichung
ntg
+/-
+/+
ntg
+/-
+/+

Ergebnisse 109
Kopienzahlen (normalisiert)
1.600.000
1.400.000
1.200.000
1.000.000
800.000
600.000
400.000
200.000
0
21 42
Tage p.i.
*
* *
Abb. 32: Normalisierte Kopienzahlen der +ssBDV-GP
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot
transgene Mäuse, +ssBDV: positiv orientierte RNA, Kopienzahl der +ssBDV-GP normalisiert anhand von drei
Housekeeping Genen (GAPDH, HPRT, SDHA) mittels geNorm, arithmetischer Mittelwert, Fehlerbalken:
Standardabweichung, *: p< 0,05 (statistisch signifikant geringere Kopienzahlen als 21 Tage p.i.)
Kopienzahlen (normalisiert)
1.600.000
1.400.000
1.200.000
1.000.000
800.000
600.000
400.000
200.000
0
21 42
Tage p.i.
Abb. 33: Normalisierte Kopienzahlen der +ssBDV-Intron I
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot
transgene Mäuse, +ssBDV: positiv orientierte RNA, Kopienzahl der +ssBDV-Intron I normalisiert anhand von
drei Housekeeping Genen (GAPDH, HPRT, SDHA) mittels geNorm, arithmetischer Mittelwert, Fehlerbalken:
Standardabweichung
ntg
+/-
+/+
ntg
+/-
+/+

110 Ergebnisse
4.2.2.5 Korrelation der Ergebnisse der qRT-PCR
Der Vergleich aller gemessenen Gene innerhalb einer Gruppe untereinander an einem
Zeitpunkt ergab bei allen BDV-infizierten Mausgruppen an allen untersuchten Zeitpunkten
statistisch signifikant höhere Kopienzahlen des +ssBDV-N im Vergleich zu den Kopien der
+ssBDV-GP, +ssBDV-Intron I und +ssBDV-AG (Abb. 34 bis Abb. 36). Das +ssBDV-AG
wies bei allen BDV-infizierten Mausgruppen an allen Zeitpunkten der Untersuchung
statistisch signifikant geringere Kopienzahlen als die anderen drei cDNA Spezies auf.
In allen Mäusen an beiden Untersuchungszeitpunkten waren mehr +ssBDV-Intron I als
+ssBDV-GP Kopien nachweisbar. Diese Differenz war 42 Tage p.i. in der tg+/- Mausgruppe
statistisch signifikant.
Kopienzahlen (normalisiert)
100.000.000
10.000.000
1.000.000
100.000
10.000
1.000
100
10
1
*
*
21 42
Tage p.i.
*
*
+ssBDV-N
+ssBDV-GP
+ssBDV-Intron I
+ssBDV-AG
Abb. 34: Normalisierte Kopienzahlen der +ssBDV-N, +ssBDV-GP, +ssBDV-Intron I und
+ssBDV-Antigenom bei nicht-transgen BDV-infizierten Mäusen
p.i.: post infectionem, +ss: positiv orientierte RNA, BDV-N: BDV-Nukleoprotein, BDV-GP: BDV-
Glykoprotein, BDV-AG: BDV-Antigenom, Kopienanzahl der viralen cDNAs normalisiert anhand von drei
Housekeeping Genen (GAPDH, HPRT, SDHA) mittels geNorm, arithmetischer Mittelwert, Fehlerbalken:
Standardabweichung, *: p< 0,05 (statistisch signifikant höhere/geringere Kopienzahlen im Vergleich zu den
anderen +ssRNAs)

Ergebnisse 111
Kopienzahlen (normalisiert)
100.000.000
10.000.000
1.000.000
100.000
10.000
1.000
100
10
1
*
*
21 42
Tage p.i.
*
*
*
+ssBDV-N
+ssBDV-GP
+ssBDV-Intron I
+ssBDV-AG
Abb. 35: Normalisierte Kopienzahlen der +ssBDV-N, +ssBDV-GP, +ssBDV-Intron I und
+ssBDV-Antigenom bei heterozygot transgenen BDV-infizierten Mäusen
p.i.: post infectionem, +ss: positiv orientierte RNA, BDV-N: BDV-Nukleoprotein, BDV-GP: BDV-Glykoprotein,
BDV-AG: BDV-Antigenom, Kopienanzahl der viralen cDNAs normalisiert anhand von drei Housekeeping
Genen (GAPDH, HPRT, SDHA) mittels geNorm, arithmetischer Mittelwert, Fehlerbalken: Standardabweichung,
*: p< 0,05 (statistisch signifikant höhere/geringere Kopienzahlen im Vergleich zu den anderen
+ssRNAs), |*: p< 0,05 (statistisch signifikanter Unterschied zwischen +ssBDV-GP und +ssBDV-Intron I)
Kopienzahlen (normalisiert)
100.000.000
10.000.000
1.000.000
100.000
10.000
1.000
100
10
1
* *
*
21 42
Tage p.i.
*
+ssBDV-N
+ssBDV-GP
+ssBDV-Intron I
+ssBDV-AG
Abb. 36: Normalisierte Kopienzahlen der +ssBDV-N, +ssBDV-GP, +ssBDV-Intron I und
+ssBDV-Antigenom bei homozygot transgenen BDV-infizierten Mäusen
p.i.: post infectionem, +ss: positiv orientierte RNA, BDV-N: BDV-Nukleoprotein, BDV-GP: BDV-
Glykoprotein, BDV-AG: BDV-Antigenom, Kopienanzahl der viralen cDNAs normalisiert anhand von drei
Housekeeping Genen (GAPDH, HPRT, SDHA) mittels geNorm, arithmetischer Mittelwert, Fehlerbalken:
Standardabweichung, *: p< 0,05 (statistisch signifikant höhere/geringere Kopienzahlen im Vergleich zu den
anderen +ssRNAs)

112 Ergebnisse
4.2.3 Nachweis von infektiösem Virus im Gehirn
Der Nachweis von infektiösem Virus im Mäusegehirn erfolgte exemplarisch an acht Tieren
28 und 49 Tage p.i. mittels indirektem Immunfluoreszenztest (IIFT). An beiden Tagen wurde
bei allen untersuchten Tieren infektiöses Virus mit einem Titer von 2 x 10 3 bis 6 x 10 3
ID50/ml nachgewiesen. Dabei ließen sich weder Unterschiede zwischen den BDV-infizierten
Mausgruppen, noch Titerveränderungen im zeitlichen Verlauf der Infektion feststellen. Eine
Übersicht über alle Ergebnisse findet sich in Abschnitt 9.1.2.3 des Anhangs.

Ergebnisse 113
4.3 Histopathologische Befunde
Die histologische Untersuchung diente dem Nachweis der Entzündungszellinfiltration, sowie
der Dokumentation der Aktivierung von Mikroglia und Astrozyten. Sie wurde bei allen BDVinfizierten,
mock-infizierten und Kontrollmäusen zu allen Untersuchungszeitpunkten
durchgeführt (Tab. 3). Die Auswertung erfolgte semiquantitativ. Zur Betrachtung der
Ergebnisse wurde der Median der jeweiligen Gruppe verwandt. Eine Übersicht über alle
Ergebnisse sowie über die Daten der statistischen Auswertung findet sich in Abschnitt 9.1.2.3
des Anhangs.
4.3.1 Enzephalitis
Die BDV-infizierten, transgenen Mäuse beider Gruppen (tg+/-, tg+/+) entwickelten ab 21
Tage p.i. eine nichteitrige Meningoenzephalitis. Einen Überblick über die histopathologischen
Veränderungen innerhalb der einzelnen Gruppen gibt Abb. 37 sowie Abb. 79 bis Abb. 86.
Anzahl und Stärke der Entzündungszellinfiltrate zeigte im Untersuchungszeitraum bis zum
49. Tag p.i. bei tg+/- Mäusen und tg+/+ Mäusen einen hochsignifikanten Anstieg (p=0,0004,
p=0,0024, Abb. 37). Die nicht-transgenen, BDV-infizierten Mäuse (ntg) entwickelten
ebenfalls eine nichteitrige Meningoenzephalitis. Die entzündlichen Veränderungen waren bei
diesen Tieren jedoch geringgradig ausgeprägt und zeigten keine Progression im Verlauf der
Studie (Abb. 79 und Abb. 82). Alle untersuchten ntg BDV-infizierten Tiere zeigten bis 42
Tage p.i. maximal eine geringgradige Entzündungsreaktion. Am 49. Tag p.i. war nur bei
einem Tier der ntg Mäusegruppe eine mittelgradige nichteitrige Meningoenzephalitis zu
erkennen, während die anderen drei Tiere lediglich eine dezente Meningoenzephalitis
aufwiesen. 42 und 49 Tage p.i. fielen bei zwei von vier bzw. drei von vier der ntg Tiere eine
deutliche Leukozytostase auf.
35 Tage p.i. konnten bei tg+/+ Mäusen eine signifikant stärkere Entzündungsreaktion im
Vergleich zu ntg Tieren festgestellt werden (p=0,0357), 42 und 49 Tage p.i. zeigten sowohl
die tg+/- (p=0,0256; p=0,0281) als auch die tg+/+ (p=0,0416; p=0,0416) Tiere signifikant
stärkere Entzündungsreaktionen als die ntg Mäuse dieser Infektionszeitpunkte. Der Vergleich
der beiden transgenen Mausgruppen ergab 21 und 49 Tage p.i. eine statistisch auffällig
(p=0,0626; p=0,0606) stärkere Entzündungsreaktion der tg+/+ Tiere als der tg+/- Tiere.

114 Ergebnisse
Bereits 7 und 14 Tage p.i. waren bei einzelnen transgenen und nicht-transgenen Tieren
diskrete mononukleäre perivaskuläre Infiltrate in Ammonshorn, Cortex cerebri oder Meninx
zu finden. Weiterhin waren bei vielen Tieren dieser beiden frühen Zeitpunkten p.i. zahlreiche
aktivierte Kapillarendothelien sichtbar, auch bei den Tieren ohne entzündliche Infiltrate. Im
weiteren Verlauf der Infektion nahm in beiden transgenen (tg+/-, tg+/+) Mausgruppen sowohl
die Anzahl der perivaskulären Infiltrate als auch die Anzahl der Entzündungszellen pro
Infiltrat zu. Mit zunehmender Entzündungsstärke waren Entzündungszellen auch großflächig
in dem die Infiltrate umgebenden Parenchym zu finden. Daneben konnte um die mittel- bis
hochgradigen Infiltrate eine deutliche Mikrogliaaktivierung (4.5.1) beobachtet werden. Auch
die Astrogliose (4.5.2) nahm korrespondierend zu (Abb. 85 und Abb. 86). Die Mikrogliaaktivierung
und die Astrogliose konnten mittels Immunhistologie bestätigt werden (4.5).
Ab 21. Tag p.i. waren die entzündlichen Infiltrate bei allen BDV-infizierten Tieren vor allem
in Cortex cerebri und Striatum zu finden. In beiden transgenen BDV-infizierten Mausgruppen
waren Infiltrate in allen untersuchten kortikalen Abschnitten zu finden. Bei den ntg Tieren
waren die Infiltrate im Cortex cerebri in der Ebene 1 (Abb. 7) auf die dorsalen Areale
beschränkt, in der Ebene 2 (Abb. 7) fanden sich die perivaskulären Infitrate in allen kortikalen
Anteilen mit Häufung in Nachbarschaft der rhinalen Fissur. Bei homozygoten Tieren zeigten
sich ab 28 Tagen p.i. neben entzündlichen Veränderungen in Cortex cerebri und Striatum
auch Infiltrate in Thalamus, sowie Kleinhirn und Medulla oblongata. Ab 35 Tagen p.i. war bei
nicht-transgenen und heterozygoten Tieren zusätzlich der Thalamus regelmäßig und das
Ammonshorn gelegentlich betroffen. Bei den heterozygoten Mäusen fanden sich ab 35 Tagen
p.i. weiterhin regelmäßig perivaskuläre Infiltrate im Kleinhirn und/oder in der Medulla
oblongata. Bei einigen Mäusen waren zudem perivaskuläre Infitrate im Ammonshorn zu
finden, diese bestanden bei den meisten Mäusen nur aus einzelnen migrierten, perivaskuläre
mononukleären Entzündungszellen (Abb. 79 bis Abb. 81). Drei Tiere (35 Tage p.i. tg +/+, 49
Tage p.i. tg +/+ und 49 Tage p.i. tg +/-) zeigten mehrere perivaskuläre Infitrate mit zwei und
mehr Zelllagen. Die Infitrate in Cortex cerebri, Striatum, Thalamus, Cerebellum und, sofern
betroffen, in der Medulla oblongata bestanden hingegen je nach Infektionszeitpunkt aus einbis
mehrlagigen Entzündungszellansammlungen (Abb. 82 bis Abb. 84). Eine Übersicht über
die topographische Verteilung der Infiltrate der jeweiligen Mausgruppen gibt Abb. 38.

Ergebnisse 115
Ab 28 Tagen p.i. wurden bei beiden transgenen Mausgruppen vereinzelt parenchymale
Entzündungszellherde, bestehend aus mononukleären Entzündungszellen, Mikroglia und
Astrozyten, beobachtet.
Bei einem ntg mock-infizierten Tier lag 7 Tage p.i. eine Malazie der Capsula externa vor, in
der zahlreiche mononukleären Entzündungszellen enthalten waren. Alle anderen mockinfizierten
Mäuse und alle nicht-infizierten Kontrolltiere zeigten weder eine Enzephalitis noch
Meningitis.
Grad der Entzünung
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
7 14 21 28
Tage p.i.
35 42 49
*
*
*
*
*
ntg
tg+/tg+/+
Abb. 37: Histopathologische Veränderungen der BDV-infizierten Mausgruppen
Score (0: keine, 1: gering-, 2: mittel-, 3: hochgradige Entzündungszellinfiltration), p.i.: post infectionem, ntg:
nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse,
Median, Fehlerbalken: Minimaler/Maximaler Wert, *: p< 0.05 (statistisch signifikanter Unterschied im Vergleich
zur Gruppe der ntg BDV-infizierten Mäuse)

116 Ergebnisse
ntg tg+/- tg+/+
Ebene 1 Ebene 1 Ebene 1
Ebene 2 Ebene 2 Ebene 2
Ebene 3 Ebene 3 Ebene 3
Abb. 38: Übersicht über die topographische Verteilung der perivaskulären Infiltrate
Projektion aller Infiltrate (weiße Punkte) der BDV-infizierten Mäuse einer Gruppe auf je einen Gehirnschnitt
Abbildungen aus http://www.mbl.org/atlas170/atlas170_frame.html

Ergebnisse 117
4.3.2 Degenerative Veränderungen
Bei drei BDV-infizierten Tieren war eine kortikale Malazie zu finden. Es handelte sich dabei
um eine tg+/+ Maus 21 Tage p.i., ein ntg Tier 28 Tage p.i. und ebenfalls 28 Tage p.i. eine
Maus der tg+/- Gruppe. Die tg+/+ Maus zeigte eine hochgradige Malazie des Corpus
callosum und der Capsula externa sowie einen Hydrozephalus internus. Das ntg Tier zeigte
eine hochgradige Ausdünnung des somatosensorischen Cortex cerebri mit korrespondierender
Astrogliose und Hydrozephalus internus. Weiterhin fand sich in dem betroffenen
Kortexbereich eine fokale Hämosiderose. Das tg+/- Tier zeigte eine hochgradige Dilatation
des lateralen Ventrikels und eine mittelgradige Malazie des Corpus callosum und der Capsula
externa mit Ausdünnung der angrenzenden kortikalen Areale.
In neun weiteren Tieren fiel ab 14 Tagen p.i. ebenfalls eine Erweiterung der Ventrikel auf.
Acht dieser Mäuse gehörten zur ntg BDV-infizierten Mausgruppe. Das neunte Tier gehörte
der tg+/- Mausgruppe 14 Tage p.i. an.

118 Ergebnisse
4.4 Nachweis infiltrierender Entzündungszellen
Die Darstellung der in das Gehirn einwandernden Entzündungszellen erfolgte
immunhistologisch unter Verwendung eines Pan-T-Zellmarker (Antikörper gegen CD3),
sowie der Marker CD4, CD8 und CD25, welche zur näheren Charakterisierung der Subpopulationen,
wie Th1-Helferzellen (CD4), zytotoxische T-Zellen (CD8) und regulatorische
T-Zellen (CD25), eingesetzt wurden. Als Marker für B-Zellen wurde der Antikörper gegen
CD45R angewandt. Mittels Mac-1 alpha-Antiserum waren neben den unter 4.5.1
beschriebenen stäbchenförmigen Zellen auch rund-ovoide Zellen der perivaskulären
Entzündungszellinfiltrate darstellbar, bei denen es sich am wahrscheinlichsten um
eingewanderte Makrophagen handelte. Die Untersuchungen wurden 42 Tage p.i. an je zwei
Tieren pro Gruppe an Gehirnschnitten der Ebenen 1 (Abb. 7) und 2 (Abb. 7) durchgeführt.
Die Negativkontrollen zeigten keine spezifische Reaktion, während in der Positivkontrolle
spezifische Reaktionen zu finden waren.
Typischerweise ergaben die CD-Marker als auch Mac-1 alpha eine zytoplasmatische Reaktion
entlang der Zellmembran von mononukleären Zellen. Es wurden die perivaskulären
Entzündungszellen ausgezählt und ihr jeweiliger Anteil am Gesamtinfiltrat errechnet. Zur
Darstellung der Ergebnisse wurde der arithmetische Mittelwert der jeweiligen Gruppe
berechnet. Eine Übersicht über alle Ergebnisse sowie über die Daten der statistischen
Auswertung findet sich in Abschnitt 9.1.4 des Anhangs.
Eine Übersicht über die prozentualen Anteile der Entzündungszellen der einzelnen
Mausgruppen an den perivaskulären Infiltraten nach BDV-Infektion gibt Abb. 39. Bei den ntg
Tieren waren 42 Tage p.i. nur geringgradige Entzündungszellinfiltrate zu finden, während bei
beiden tg Mausgruppen eine mittelgradige perivaskuläre Entzündungszellinfiltration
vorhanden war (4.3.1). Bei den ntg BDV-infizierten Mäusen waren 26,5% der perivaskulären
Entzündungszellen CD4 + T-Zellen, 4,4% CD8 + T-Zellen, 37,6% B-Zellen und 31,1% waren
mittels Mac-1 alpha positiv markiert (Abb. 40, Abb. 89 und Abb. 90). Die Anteile der
Entzündungszellpopulationen bei den BDV-infizierten tg+/- Tieren stellte sich
folgendermaßen dar: 35,1% der perivaskulären Entzündungszellen waren CD4 + T-Zellen,
6,8% CD8 + T-Zellen, 23,8% B-Zellen und 34,8% Mac-1 alpha positiv (Abb. 41). Die Gruppe
der BDV-infizierten tg+/+ Mäuse zeigte folgende Verteilung der perivaskulären

Ergebnisse 119
Entzündungszellpopulationen: 32,7% CD4 + T-Zellen, 4,4% CD8 + T-Zellen, 16,0% B-Zellen
und 37,8% Mac-1 alpha positive rund-ovoide Zellen (Abb. 42).
Da die Summe der CD4 + und CD8 + T-Zellen größer war, als die mit Hilfe des CD3 +
Antikörper nachweisbaren Zellen, wurde als Gesamtzahl der T-Zellen die Summe aus CD4 +
und CD8 + T-Zellen zugrunde gelegt. Die nähere Charakterisierung der T-Zellsubpopulationen
ergab bei allen drei BDV-infizierten Mausgruppen eine deutliche Dominanz der CD4 + T-
Zellen gegenüber CD8 + T-Zellen (Abb. 89). Bei ntg Tieren waren 85,73% der T-Zellen CD4 + ,
bei den tg+/- Mäusen war der Anteil der CD4 + Zellen an den T-Zellen 83,8% und in der
Gruppe der tg+/+ Tieren gehörten 88,2% der T-Zellen zu der CD4 + Subpopulation (Abb. 43).
Die regulatorischen CD25 + T-Zellen stellen eine Subpopulation der CD4 + T-Zellen dar. Der
Anteil der CD4 + CD25 + T-Zellen an der Gesamtzahl der CD4 + T-Zellen betrug bei ntg Mäusen
31,8%, in der tg+/- Gruppe 19,3% und bei den tg+/+ Tieren 30,2% (Abb. 44 und Abb. 89).
Aufgrund der relativ großen Streuung der Werte und der geringen Tierzahlen waren trotz
graphisch deutlich erkennbaren Unterschieden zwischen einzelnen Zellpopulationen keine
statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen ermittelbar.
Neben den perivaskulären Infitraten waren T-Zellen parenchymal in beiden untersuchten
Ebenen des Gehirns von BDV-infizierten Mäusen zu finden. Bei ntg Tieren waren 1-2 Zellen
pro Gesichtsfeld in der 400-fachen Gesamtvergrößerung (HPF) mittels CD3- und CD4-
Marker darstellbar. Bei einem ntg Tier konnten auch einzelne CD8 + T-Zellen, sowie eine
CD25 + T-Zelle im Neuropil nachgewiesen werden. Die tg+/- Tiere zeigten mehr parenchymal
gelegene T-Zellen, es ließen sich ≥4 Zellen/HPF mittels CD3 und CD4-Marker markieren. In
der Ebene 1 eines BDV-infizierten tg+/- Tieres waren parenchymal bis zu 20 CD3 + T-
Zellen/HPF und 16 CD4 + T-Zellen/HPF zu finden. Bei den tg+/+ Mäusen fanden sich im
Neuropil 4-8 CD4 + T-Zellen/HPF. Bei einem tg+/+ Tier konnten parenchymal 12 CD3 + T-
Zellen/HPF gefunden werden.
B-Zellen waren in allen BDV-infizierten Mausgruppen parenchymal nicht zu finden, sie
waren nur in den perivaskulären Entzündungszellinfitraten lokalisiert.

120 Ergebnisse
In Kontrolltieren und mock-infizierten Mäusen waren keine Entzündungszellinfiltrate zu
finden. Bei einem mock-infizierten tg+/- Tier waren parenchymal zwei CD3 + T-Zellen im
Schnitt der Ebene 1 zu finden. In einem nicht-infizierten tg+/+ Kontrolltier konnte eine B-
Zellen im Schnitt der Ebene 1, sowie drei mittels Mac-1 alpha markierte Zellen im Parenchym
der Ebene 1 gefunden werden. Bei einem weiteren nicht-infizierten tg+/- Kontrolltier fanden
sich einzelne Mac-1 alpha positive Zellen in der Meninx.
%
60
50
40
30
20
10
0
CD3 CD4 CD8 CD25 CD45R Mac-1
Abb. 39: Anteil der mononukleären Entzündungszellen an den perivaskulären Infitrate
bei BDV-infizierten Mäusen am 42. Tag p.i.
ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse,
CD: clusters of differentiation, Oberflächenantigen, arithmetischer Mittelwert, Fehlerbalken: Standardabweichung
ntg
tg+/-
tg+/+

Ergebnisse 121
31,1
37,6
26,5
4,4
CD4+ T-Zellen
CD8+ T-Zellen
B-Zellen
Makrophagen
Abb. 40: Anteil der einzelnen Entzündungszellpopulation an perivaskulären Infitraten bei nichttransgenen
BDV-infizierten Mäusen am 42. Tag p.i.
34,7
23,8
6,8
35,1
CD4+ T-Zellen
CD8+ T-Zellen
B-Zellen
Makrophagen
Abb. 41: Anteil der einzelnen Entzündungszellpopulation an perivaskulären Infitraten bei
heterozygot transgenen BDV-infizierten Mäusen am 42. Tag p.i.
37,8
16,0
4,4
32,7
CD4+ T-Zellen
CD8+ T-Zellen
B-Zellen
Makrophagen
Abb. 42: Anteil der einzelnen Entzündungszellpopulation an perivaskulären Infitraten bei
homozygot transgenen BDV-infizierten Mäusen am 42. Tag p.i.

122 Ergebnisse
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
ntg tg+/- tg+/+
CD4+ T-Zellen
CD8+ T-Zellen
Abb. 43: Anteil der CD4 + und CD8 + T-Zellen an der T-Zellpopulation perivaskulärer Infitrate
bei BDV-infizierten Mäusen am 42. Tag p.i.
ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
ntg tg+/- tg+/+
CD4+ CD25+ T-Zellen
CD4+ CD25- T-Zellen
Abb. 44: Anteil der CD25 + Zellen an der CD4 + T-Zellpopulation perivaskulärer Infitrate bei
BDV-infizierten Mäusen am 42. Tag p.i.
ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse,

Ergebnisse 123
4.5 Nachweis aktivierter Astrozyten und Mikroglia/
Makrophagen
Die Charakterisierung der aktivierten, residenten Zellen des Gehirns wurde mittels Histologie
und Immunhistologie durchgeführt. Aktivierte Mikroglia/ Makrophagen wurden mittels eines
Mac-1 alpha-spezifischen Antikörpers dargestellt. Aktivierte Astrozyten wurden ergänzend
zur histologischen Untersuchung mit dem astrozytenspezifischen Marker GFAP
nachgewiesen. Eine Übersicht über alle Ergebnisse sowie über die Daten der statistischen
Auswertung findet sich in Abschnitt 9.1.5 des Anhangs. Die Negativkontrollen zeigten keine
spezifische Reaktion.
4.5.1 Nachweis aktivierter Mikroglia
Aktivierte Mikroglia wurde anhand der typischen Morphologie und mittels Mac-1 alpha
Immunreaktion charakterisiert. Aktivierte Mikroglia (Stäbchen) stellen sich im HE-gefärbten
Schnitt als stäbchenförmige Zellen mit einem schlanken länglichen Zellkern dar.
Kapillarendothelien konnten durch ihre Nachbarschaft zu Erythrozyten oder Verzweigungen
abgegrenzt werden.
In der histologischen Auswertung der HE-gefärbten Schnitte fielen vor allem in der näheren
Umgebung der perivaskulären Infiltrate ab 21 Tagen p.i. stäbchenförmige Zellen mit heterochromatischen
schlanken Zellkernen auf.
Die Aktivierung der Mikroglia war großflächig um die perivaskulären Infiltrate zu
beobachten. Zur Auswertung wurde jeweils ein, das Zentrum eines Entzündungszellinfiltrat
beinhaltendes, Gesichtsfeld bei 400-facher Gesamtvergrößerung ausgezählt und aus den
einzelnen Werten eines Tieres ein arithmetischer Mittelwert gebildet. Aus diesen Werten der
Einzeltiere wurde wiederum für jede Infektionsgruppe der arithmetische Mittelwert gebildet.
Eine Übersicht über alle Ergebnisse sowie über die Daten der statistischen Auswertung findet
sich in Abschnitt 9.1.5 des Anhangs.
In allen drei BDV-infizierten Mausgruppen waren aktivierte Mikroglia ab 21. Tag p.i. zu
finden (Abb. 45).

124 Ergebnisse
Bei den ntg Mäusen waren in allen untersuchten Zeitpunkten bis 49 Tage p.i. durchschnittlich
weniger als 10 Stäbchen pro Infiltrat zu finden. Bei tg +/- Tieren stieg von 21 bis 42 Tage p.i.
die Anzahl der Stäbchen stetig an (Abb. 45). 21 Tage p.i. war durchschnittlich 1 Stäbchen pro
Infiltrat zu finden, 28 Tage p.i. lag die Anzahl der aktivierten Mikroglia durchschnittlich bei
14,9, am 35 Tage p.i. bei 28,9 und erreichte 42 Tage p.i. mit 57,7 das Maximum. 49 Tage p.i.
waren 42,3 Stäbchen pro Infiltrat zu finden.
Die tg+/+ Tiere zeigten vom 21. bis 35. Tag p.i. nur geringgradige Schwankungen, ebenfalls
42 Tage p.i. das Maximum und einen geringgradigen Abfall 49 Tage p.i. Die Anzahl der
Stäbchen lagen 21 bis 35 Tage p.i. zwischen 25 und 35 aktivierte Mikroglia pro Infiltrat (21
Tage p.i.: 33,1; 28 Tage p.i.: 24,2; 35 Tage p.i.: 30,6). Das Maximum war 42 Tage p.i. mit
48,1 aktivierten Mikroglia pro Infiltrat erreicht, 49 Tage p.i. waren durchschnittlich 35,0
Stäbchen pro Infiltrat zu finden.
Statistisch signifikante Unterschiede der beiden BDV-infizierten, transgenen Mausgruppen im
Vergleich mit den ntg BDV-infizierten Mäusen konnten 28, 42 und 49 Tage p.i. festgestellt
werden. 28 Tage p.i. waren bei den tg+/+ statistisch signifikant mehr Stäbchen zu finden als
bei ntg Tieren (p=0,0210). 42 und 49 Tage p.i. konnten bei tg+/- (42 Tage p.i.: p=0,0265; 49
Tage p.i.: p=0,0179) und tg+/+ Tieren (42 Tage p.i.: p=0,0436; 49 Tage p.i.: p=0,0436)
signifikant mehr aktivierte Mikroglia nachgewiesen werden. Die Anzahl der aktivierten
Mikroglia nahm bei tg+/- und tg+/+ Tieren im Untersuchungszeitraum statistisch
hochsignifikant zu (p=0,0007, p=0,0105).
In nicht-infizierten und mock-infizierten Tieren konnten an keinem Zeitpunkt Entzündungszellinfiltrate
mit umgebender aktivierter Mikroglia nachgewiesen werden. In den tg
Mausgruppen waren vereinzelte parenchymal gelegene Stäbchen zu finden.
Mittels Mac-1 alpha ließen sich vor allem rund-ovoide Zellen der perivaskulären
Entzündungszellinfiltrate darstellen, bei denen es sich am wahrscheinlichsten um
eingewanderte Makrophagen handelte (4.6). Im Neuroparenchym fanden sich ebenfalls
vereinzelt rund-ovoide positive Zellen (Abb. 87). Daneben waren in der Umgebung der
perivaskulären Infiltrate stäbchenförmige Zellen mit feinen Fortsätzen schwach positiv
markiert. Diese Zellen entsprachen denen in der HE-Färbung auffälligen stäbchenförmigen
Zellen. Diese Zellen konnten mittels Mac-1 alpha vereinzelt auch außerhalb der Umgebung
der Infiltrate im Neuropil gefunden werden.

Ergebnisse 125
Anzahl aktivierte Mirkoglia/Infiltrat
70
60
50
40
30
20
10
0
7 14 21 28 35 42 49
Tage p.i.
Abb. 45: Durchschnittliche Anzahl der aktivierten Mikroglia pro Infiltrat bei BDV-infizierten
Mäusen
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot
transgene Mäuse, arithmetischer Mittelwert, Fehlerbalken: Standardabweichung, *: p< 0,05 (statistisch
signifikant mehr aktivierte Mikroglia im Vergleich zu ntg Mäusen)
*
*
*
*
*
ntg
tg+/tg+/+

126 Ergebnisse
4.5.2 Nachweis aktivierter Astrozyten
Die Astrogliose wurde anhand der typischen Morphologie der aktivierten Astrozyten als auch
anhand der vermehrten Anzahl GFAP-positiver Astrozyten charakterisiert. Diese reaktiven
Astrozyten zeigten sich im HE-gefärbten Schnitt hypertroph mit homogen-eosinophilem
Zytoplasma und geschwollenen Zellkernen (GRAEBER et al., 2002). Bei der Auswertung der
GFAP-Reaktivität wurden die nicht-infizierten ntg Kontrolltiere des jeweiligen Infektionstages
als Nullwert definiert. Eine Übersicht über alle Ergebnisse sowie über die Daten der
statistischen Auswertung findet sich in Abschnitt 9.1.5 des Anhangs.
Ab dem 21. Tag p.i. fiel in den HE-gefärbten Schnitten bei den BDV-infizierten Tieren
generalisiert eine vermehrte Zellzahl auf. In der Umgebung der entzündlichen Infiltrate waren
vor allem in beiden Gruppen der tg Tiere vermehrt reaktive Astrozyten sichtbar. Bei den
transgenen Tieren waren ab 21. Tag p.i. vor allem in der Nachbarschaft der entzündlichen
Infiltrate zahlreiche aktivierte Astrozyten mit einem deutlich vergrößerten Zellkern zu finden.
Einige dieser reaktiven Astrozyten enthielten Zellkerne mit peripherer Chromatinkondensation
oder zeigten eine Fragmentierung des Kerns, was morphologisch als Apoptose
bewertet werden kann (Abb. 85). Diese untergehenden Zellen waren nur in den beiden
transgenen Mausgruppen nachweisbar und waren bis 49 Tage p.i. in zunehmender Anzahl zu
finden.
Die BDV-infizierte Tiere aller Mausgruppen entwickelten ab dem 14. Tag p.i. eine vermehrte
GFAP-Reaktivität (Abb. 46 und Abb. 88). Bei ntg BDV-infizierten Tieren stieg diese bis zum
21. Tag p.i. auf eine gering- bis mittelgradige Ausprägung an und schwankte in den folgenden
Zeitpunkten p.i. zwischen gering- und mittelgradig. Bei tg+/- BDV-infizierten Mäusen war
schon am 14. Tag p.i. eine mittelgradige Astrogliose zu finden, die bis zum 49. Tag p.i. mit
geringen Schwankungen innerhalb der Gruppen konstant blieb. Die tg+/+ Mausgruppe zeigte
einen kontinuierlichen Anstieg der reaktiven Astrozyten bis zu einer hochgradigen
Astrogliose am 42. Tag p.i., 49 Tage p.i. fiel die GFAP-Reaktivität der tg+/+ Mäuse auf
mittelgradig ab.
Die tg+/- BDV-infizierten Tiere zeigten 28 und 35 Tage p.i. eine statistisch signifikant höhere
GFAP-Expression als die ntg BDV-infizierten Tiere dieser Zeitpunkte (p=0,0471; p=0,0400).
Bei tg+/+ Tieren war 7, 28 und 35 Tage p.i. ebenfalls eine statistisch signifikant höhere

Ergebnisse 127
GFAP-Expression als bei ntg Tiere der entsprechenden Zeitpunkte zu finden (p=0,0247;
p=0,0177; p=0,0443). Bei transgenen Mäusen fanden sich, wie schon in der HE-Färbung zu
erkennen, zahlreiche aktivierte Astrozyten mit einem deutlich vergrößerten Zellkern, von
denen einige Hinweise auf einen apoptotischen Zelluntergang zeigten.
Die GFAP-positiven Astrozyten waren vor allem in Striatum und Ammonshorn zu finden, ab
21 Tagen p.i. zunehmend auch im Cortex cerebri. Im Thalamus konnten in allen BDVinfizierten
Mausgruppen an allen untersuchten Zeitpunkten weniger GFAP-positive Zellen
nachgewiesen werden. 7 und 14 Tage p.i. waren im Kleinhirn vor allem im Mark GFAPpositive
Astrozyten zu finden, ab 21. Tag p.i. waren in allen drei BDV-infizierten Gruppen
auch vermehrt positive Zellen in der Kleinhirnrinde zu erkennen.
7 Tage p.i. waren bei je einem ntg und tg+/- BDV-infizierten Tier, sowie einem mockinfizierten
tg+/- Tier im dorsalen Cortex cerebri eine fokale Astrogliose zu beobachten. Bei
den mock-infizierten Mäusen fiel ab 35 Tage p.i. in der Gruppe der tg+/+ Tieren eine dezent
vermehrte GFAP-Reaktivität auf, die 42 Tage p.i. gering- bis mittelgradig ausgeprägt war und
sich 49 Tage p.i. dezent bis geringgradig darstellte (Abb. 47). Bei den nicht-infizierten
Kontrolltieren konnte in beiden tg Mausgruppen ab dem 35 Tage p.i. eine dezente bis
geringgradige Vermehrung der GFAP-positiven Astrozyten gefunden werden.

128 Ergebnisse
GFAP-Reaktion
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
*
* * *
7 14 21 28 35 42 49
Tage p.i.
Abb. 46: Immunhistologischer Nachweis GFAP-positiver Astrozyten bei BDV-infizierten
Mäusen
Score (0: keine, 1: gering-, 2: mittel-, 3: hochgradig vermehrte GFAP-reaktive Astrozyten), p.i.: post
infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene
Mäuse, Median, Fehlerbalken: Minimaler/Maximaler Wert, *: p< 0,05 (statistisch signifikanter Unterschied zu
BDV-infizierten ntg Mäusen)
GFAP-Reaktion
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
7 14 21 28
Tage p.i.
35 42 49
Abb. 47: Immunhistologischer Nachweis GFAP-positiver Astrozyten in den mock-infizierten
Mausgruppen
Score (0: keine, 1: gering-, 2: mittel-, 3: hochgradig vermehrte GFAP-reaktive Astrozyten), p.i.: post
infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene
Mäuse, Median, Fehlerbalken: Minimaler/Maximaler Wert
*
ntg
tg+/tg+/+
ntg
tg+/tg+/+

Ergebnisse 129
4.6 Serologie
Die Untersuchung zum Vorliegen von BDV-spezifischen Serumantikörpern wurde, sofern
verwertbares Serum in ausreichender Menge gewonnen werden konnte, bei allen BDVinfizierten,
mock-infizierten und nicht-infizierten Mäusen zwischen 21 und 49 Tagen p.i.
durchgeführt. BDV spezifische Antikörper konnten in den meisten Seren die BDV-infizierten
Tiere nachgewiesen werden (Tab. 16). Aufgrund der geringen Serummengen mussten die
Proben zum Teil gepoolt werden.
Bei zwei von drei ntg BDV-infizierten Mäusen konnten 49 Tage p.i. Serumantikörper in einer
Titerhöhe von 1:1280 bzw. 1:640 nachgewiesen werden. Im Serum des dritten untersuchten
Tieres waren keine BDV-spezifischen Antikörper vorhanden. In dem gepoolten Serum aus
den drei Tieren lag der spezifische Antikörpertiter bei 1:1280. In der Gruppe der tg+/- BDVinfizierten
Tiere konnten in den Poolproben 35 und 42 Tage p.i., sowie in den beiden
individuellen Proben 49 Tage p.i. Antikörper nachgewiesen werden. 35 Tage p.i. war ein Titer
von 1:80 in der Poolprobe aus zwei Seren zu finden, 42 Tage p.i. waren in einer Probe aus
Seren dreier Tiere ein Titer von 1:160 feststellbar. 49 Tage p.i. waren zwei Tiere individuell
getestet worden und wiesen einen spezifischen Serumantikörpertiter von 1:5120 bzw. 1:320
auf. In der Gruppe der tg+/+ BDV-infizierten Mäuse waren bei dem einen zur Verfügung
stehenden Tier 21 Tage p.i. keine Antikörper nachweisbar. In der Poolprobe 28 Tage p.i. war
ein BDV-spezifischer Antikörpertiter von 1:10 nachweisbar, in der individuellen Testung der
beiden Seren konnten keine Antikörper nachgewiesen werden. Am 35. Tag p.i. wurde in der
Gruppe tg+/+ Mäuse in einer Sammelprobe aus drei Tieren ein Antikörpertiter von 1:10
nachgewiesen, in einer zweiten Sammelprobe aus zwei Tieren ein Titer von 1:160. Die
individuelle Untersuchung dieser beiden Tiere aus der zweiten Sammelprobe ergab bei einem
Tier ein Titer von 1:320, bei dem zweiten Tier waren keine Antikörper nachweisbar. Am 42.
Tag p.i. konnten in der Gruppe der BDV-infizierten tg+/+ Tiere zwei Seren untersucht werden
und wiesen BDV-spezifische Antikörpertiter von 1:160 bzw. 1:40 auf. Auch 49 Tage p.i.
konnten in der BDV-infizierten tg+/+ Gruppe von zwei Tieren Serum gewonnen werden, in
dem ersten war ein spezifischer Antikörpertiter von 1:2560, in dem zweiten waren keine
Antikörper nachweisbar.

130 Ergebnisse
Auffällig waren die individuellen Schwankungen innerhalb der Gruppen. Weiterhin fielen
relativ viele negative Ergebnisse in der Gruppe der tg+/+ Tiere auf, die sich, sofern Serum für
eine Wiederholungsuntersuchung zur Verfügung stand, bestätigen ließen.
In Kontrollmäusen und mock-infizierten Tieren waren keine BDV-spezifischen Antikörper
nachweisbar (9.1.6).
Tab. 16: Serumtiter einzelner BDV-infizierter Mäuse bzw. gepoolter Seren BDV-infizierter
Mäuse
Transgenstatus
ntg
tg +/-
tg +/+
Tage
p.i.
49
35
42
49
Maus
Tier 1
Tier 2
Tier 3
Tier 1
Tier 2
Tier 1
Titer
Untersuchung 1
1: 1280
1: 80
Titer
Untersuchung 2
1: 1280

Ergebnisse 131
4.7 Untersuchung der Augen
4.7.1 Immunhistologie
Mittels Immunhistologie wurden das virale Nukleoprotein (BDV-N), das Matrixprotein des
BDV (BDV-M), sowie das virale Glykoprotein (BDV-GP) nachgewiesen. Der Nachweis des
BDV-N wurde an allen BDV-infizierten, mock-infizierten und nicht-infizierten Kontrollmäusen
zu allen Untersuchungszeitpunkten durchgeführt (Tab. 3). Zusätzlich wurden 28 Tage
p.i. in allen BDV-infizierten Mausgruppen (ntg, tg+/-, tg+/+) die Virusproteine BDV-M und
BDV-GP bei je drei Tieren pro Gruppe nachgewiesen. Die Negativkontrollen zeigten keine
spezifische Reaktion. In den Positivkontrollen waren BDV-spezifische Reaktionen zu
beobachten.
Es konnte in der Retina aller BDV-infizierten Mausgruppen regelmäßig BDV-N
nachgewiesen werden. Das Nukleoprotein war im Zellkern und Zytoplasma retinaler Zellen
lokalisiert, in anderen Strukturen des Auges fand sich zu keinem Zeitpunkt virales Antigen.
7 Tage p.i. war bei keinem Tier in der Retina BDV-N nachweisbar. 14 Tage p.i. fanden sich
bei fast allen BDV-infizierten Mäusen gering- bis hochgradig positive Zellen. Bei je einem
ntg und tg+/- war 14 Tage p.i. kein BDV-N in den Augen zu finden. Zu frühen Zeitpunkten
p.i. war BDV-N in den Ganglienzellen, sowie der inneren plexiformen Schicht und der
inneren Körnerschicht zu finden. Im Verlauf der Infektion breitete sich das Virus-Antigen
über alle retinale Schichten aus (Abb. 91, Abb. 92). Ab 28 Tagen p.i. war in allen drei BDVinfizierten
Mausgruppen BDV-N in allen retinalen Schichten zu finden, wobei in der äußeren
Körnerschicht und der Photorezeptorenschicht in allen Gruppen nur wenige Zellen BDV-N
enthielten. Bis 49 Tage p.i. nahm die Anzahl der BDV-N enthaltenden Zellen auch in den
beiden äußeren Schichten zu. Die Mehrzahl der Zellen der äußeren Körnerschicht und der
Photorezeptorenschicht enthielten auch 49 Tage p.i. kein BDV-N.
BDV-M war 28 Tage p.i. in allen drei Mausgruppen in der Retina zu finden. Die BDV-M
positive Zellen befanden sich in der Ganglienzellschicht, der äußeren plexiformen Schicht
und der inneren Körnerschicht.
BDV-GP war 28 Tage p.i. in keiner BDV-infizierten Mausgruppe in retinalen Zellen
nachweisbar.

132 Ergebnisse
Der N. opticus war nicht bei allen Tieren angeschnitten. Ab 14 Tagen p.i. war in allen BDVinfizierten
BDV-N im N. opticus zu finden. 28 Tage p.i. war ebenfalls BDV-M in N. opticus
zu finden.
Bei nicht-infizierten Kontrolltieren und mock-infizierten Mäusen aller drei Mausgruppen
konnte keine virus-spezifischen Proteine nachgewiesen werden.
4.7.2 In situ Hybridisierung
Mit der ISH wurden genomische virale RNA (-ssRNA) und mRNA (+ssRNA) spezifisch für
das BDV-N (-ssBDV-N, +ssBDV-N) und BDV-GP (-ssBDV-GP, +ssBDV-GP) 14, 28 und 42
Tage p.i. von je drei Tieren jeder BDV-infizierten Mausgruppe nachgewiesen. Die ISH zum
Nachweis BDV-Intron I (-ssBDV-Intron I, +ssBDV-Intron I) spezifischer RNA wurde 28
Tage p.i. an ebenfalls drei Tieren pro BDV-infizierter Gruppe durchgeführt. Der Nachweis
+ssBDV-Intron I erlaubt einen Rückschluss auf BDV-M kodierende mRNAs. Die
Negativkontrollen zeigten keine spezifische Reaktion.
Mit Hilfe der in situ Hybridisierung konnten BDV-spezifische +ssRNA und -ssRNA
ebenfalls zu allen untersuchten Zeitpunkten in der Retina BDV-infizierter Mäuse aller drei
Gruppen nachgewiesen werden. 14 Tage p.i. waren sowohl die genomische virale RNA als
auch +ssBDV-N und +ssBDV-GP in allen BDV-infizierten Mausgruppen nur bei einzelnen
Tieren zu finden. 28 und 42 Tage p.i. konnten alle untersuchten RNA-Spezies bei allen BDVinfizierten
Mausgruppen in der Retina nachgewiesen werden. In allen drei Gruppen war der
RNA-Nachweis zu diesen beiden Zeitpunkten vor allem in der Ganglienzellschicht und der
inneren Körnerschicht möglich (Abb. 92). Bei einzelnen Tieren war 42 Tage p.i. auch
+ssBDV-N in allen retinalen Schichten zu finden.
Zusammenfassend konnten zwischen den Sonden (-ssBDV-N, +ssBDV-N, -ssBDV-GP,
+ssBDV-GP, -ssBDV-Intron I, +ssBDV-Intron I) keine Unterschiede in der Anzahl der
positiven Zellen und der Verteilung innerhalb der Retina festgestellt werden.
Bei nicht-infizierte Kontrolltiere und mock-infizierte Mäuse aller drei Mausgruppen konnte
keine Virus-spezifische RNA nachgewiesen werden.

Ergebnisse 133
4.7.3 Korrelation der immunhistologischen Ergebnissen mit den
Ergebnissen der in situ Hybridisierung
Zwischen den drei BDV-infizierten Mausgruppen ließen sich weder in der histologischen
Untersuchung noch in der Immunhistologie und in situ Hybridisierung Unterschiede in Bezug
auf die Verteilung und Anzahl der positiven Zellen feststellen.
4.7.4 Histopathologische Befunde
Die histologische Untersuchung diente dem Nachweis der Entzündungszellinfiltration. Sie
wurde bei allen BDV-infizierten, mock-infizierten und nicht-infizierten Kontrollmäusen zu
allen Untersuchungszeitpunkten durchgeführt (Tab. 3). Die Auswertung erfolgte semiquantitativ.
In der histologischen Untersuchung konnten bei keiner Maus der drei BDV-infizierten
Gruppen (ntg, tg+/-, tg+/+) entzündliche Veränderungen festgestellt werden (Abb. 93).
Nicht-infizierte Kontrolltiere und mock-infizierte Mäuse aller drei Mausgruppen zeigten keine
entzündlichen Veränderungen.

134 Ergebnisse
4.8 Fotografische Dokumentation der Ergebnisse
Abb. 48: Nachweis von BDV-N
Antigen
Disseminiertes Vorkommen in Ammonshorn,
Cortex cerebri (CC) und Thalamus
(Th), charakteristisches Expressionsmuster
im Ammonshorn mit zahlreichen
positiven Neuronen in der CA3 Region
(CA3) und dem Gyrus dentatus (Gd)
sowie nur vereinzelt positiven Neuronen
in der CA1 Region (CA1),
BDV-infizierte, tg+/- Maus, 21 Tage p.i.
Balken 250 µm
Abb. 49: Nachweis von BDV-N
Antigen
Charakteristisches Expressionsmuster im
Cortex cerebri mit deutlicher Reaktion in
der äußeren Körnerschicht (II) sowie
äußeren (III) und inneren Pyramidenschicht
(V).
Molekular (I), innere Körner (IV) und
Multiforme Schicht (VI) enthalten
deutlich weniger positive Zellen.
BDV-infizierte, tg+/- Maus, 21 Tage p.i.
Balken 250 µm
Abb. 50: Nachweis von BDV-N
Antigen
Intrazelluläre Lokalisation des BDV-N
in Zellkernen, Zytoplasma und Fortsätzen,
ausgeprägte Neuropilreaktion,
Kapillarendothelien () enthalten kein
Antigen,
BDV-infizierte, tg+/- Maus, 49 Tage p.i.
Balken 25 µm

Ergebnisse 135
Abb. 51: Nachweis von BDV-M
Antigen
Disseminiertes Vorkommen in Ammonshorn,
Cortex cerebri (CC) und Thalamus
(Th), charakteristisches Expressionsmuster
im Ammonshorn mit zahlreichen
positiven Neuronen in der CA3 Region
(CA3) und dem Gyrus dentatus (Gd)
sowie nur vereinzelt positiven Neuronen
in der CA1 Region (CA1),
BDV-infizierte, tg+/- Maus, 28 Tage p.i.
Balken 250 µm
Abb. 52: Nachweis von BDV-M
Antigen
Charakteristisches Expressionsmuster im
Cortex cerebri mit deutlicher Reaktion in
der äußeren Körnerschicht (II) sowie
äußeren (III) und inneren Pyramidenschicht
(V).
Molekular (I), innere Körner (IV) und
Multiforme Schicht (VI) enthalten
deutlich weniger positive Zellen.
BDV-infizierte, tg+/- Maus, 28 Tage p.i.
Balken 250 µm
Abb. 53: Nachweis von BDV-M
Antigen
Intrazelluläre Lokalisation des BDV-M
in Zytoplasma und Fortsätzen,
ausgeprägte Neuropilreaktion, Kapilarendothelien
() enthalten kein Antigen,
BDV-infizierte, tg+/+ Maus, 28 Tage p.i.
Balken 25 µm

136 Ergebnisse
Abb. 54: Nachweis von BDV-GP
Antigen
Vereinzelt positive Zellen in Thalamus
() (Th); kein positiven Zellen in
Ammonshorn (CA1, CA3, Gd) und
Cortex cerebri (CC)
BDV-infizierte, tg+/+ Maus, 28 Tage p.i.
Balken 250 µm
Abb. 55: Nachweis von BDV-GP
Antigen
Vereinzelt positive Zellen () im Cortex
cerebri,
BDV-infizierte, tg+/+ Maus, 28 Tage p.i.
Balken 250 µm
Abb. 56: Nachweis von BDV-GP
Antigen
Intrazelluläre Lokalisation des BDV-GP
in Zytoplasma und Fortsätzen, vereinzelt
positive Zelle () bei starker
Hintergrundreaktion, Kapilarendothelien
() enthalten kein Antigen,
BDV-infizierte, ntg Maus, 28 Tage p.i.
Balken 25 µm

Ergebnisse 137
Abb. 57: Nachweis viraler
genomischer RNA (-ssBDV-N)
Disseminiertes Vorkommen in Ammonshorn,
Cortex cerebri (CC) und Thalamus
(Th), charakteristisches Expressionsmuster
im Ammonshorn mit zahlreichen
positiven Neuronen in der CA3 Region
(CA3) und dem Gyrus dentatus (Gd)
sowie nur vereinzelt positiven Neuronen
in der CA1 Region (CA1),
BDV-infizierte, ntg Maus, 42 Tage p.i.
Balken 250 µm
Abb. 58: Nachweis viraler
genomischer RNA (-ssBDV-N)
Charakteristisches Expressionsmuster im
Cortex cerebri mit deutlicher Reaktion in
der äußeren Körnerschicht (II) sowie
äußeren (III) und inneren Pyramidenschicht
(V).
Molekular (I), innere Körner (IV) und
Multiforme Schicht (VI) enthalten
deutlich weniger positive Zellen.
BDV-infizierte, ntg Maus, 42 Tage p.i.
Balken 250 µm
Abb. 59: Nachweis viraler
genomischer RNA (-ssBDV-N)
Intrazelluläre Lokalisation des -ssBDV-
N ausschließlich in Zellkernen teils
punktförmige (), teils diffuse Reaktion
(),
BDV-infizierte, ntg Maus, 42 Tage p.i.
Balken 25 µm

138 Ergebnisse
Abb. 60: Nachweis von positiv
orientierter BDV-N RNA (+ssBDV-N)
Disseminiertes Vorkommen in Ammonshorn,
Cortex cerebri (CC) und Thalamus
(Th), charakteristisches Expressionsmuster
im Ammonshorns mit
zahlreichen positiven Neuronen in der
CA3 Region (CA3) und dem Gyrus
dentatus (Gd) sowie nur vereinzelt
positiven Neuronen in der CA1 Region
(CA1),
BDV-infizierte, ntg Maus, 42 Tage p.i.
Balken 250 µm
Abb. 61: Nachweis von positiv
orientierter BDV-N RNA
(+ssBDV-N) Charakteristisches
Expressionsmuster im Cortex cerebri mit
deutlicher Reaktion in der äußeren
Körnerschicht (II) sowie äußeren (III)
und inneren Pyramidenschicht (V).
Molekular (I), innere Körner (IV) und
Multiforme Schicht (VI) enthalten
deutlich weniger positive Zellen.
dilatierter lateral Ventrikel (LV),
BDV-infizierte, ntg Maus, 42 Tage p.i.
Balken 250 µm
Abb. 62: Nachweis von positiv
orientierter BDV-N RNA (+ssBDV-N)
Intrazelluläre Lokalisation des
+ssBDV-N vor allem in Zytoplasma und
Fortsätzen, meist nur punktförmig im
Zellkern,
BDV-infizierte, tg+/+ Maus, 28 Tage p.i.
Balken 25 µm

Ergebnisse 139
Abb. 63: Nachweis von positiv
orientierter BDV-Intron I RNA
(+ssBDV-Intron I)
Disseminiertes Vorkommen in Ammonshorn,
Cortex cerebri (CC) und Thalamus
(Th), charakteristisches Expressionsmuster
im Ammonshorns mit
zahlreichen positiven Neuronen in der
CA3 Region (CA3) und dem Gyrus
dentatus (Gd) sowie nur vereinzelt
positiven Neuronen in der CA1 Region
(CA1),
BDV-infizierte, tg+/+ Maus, 28 Tage p.i.
Balken 250 µm
Abb. 64: Nachweis von positiv
orientierter BDV-Intron I RNA
(+ssBDV-Intron I)
Charakteristisches Expressionsmuster im
Cortex cerebri mit deutlicher Reaktion in
der äußeren Körnerschicht (II) sowie
äußeren (III) und inneren Pyramidenschicht
(V).
Molekular (I), innere Körner (IV) und
Multiforme Schicht (VI) enthalten
deutlich weniger positive Zellen.
BDV-infizierte, tg+/+ Maus, 28 Tage p.i.
Balken 250 µm
Abb. 65: Nachweis von positiv
orientierter BDV-Intron I RNA
(+ssBDV-Intron I)
Intrazelluläre Lokalisation des +ssBDV-
Intron I in vor allem in Zytoplasma und
Fortsätzen, nur punktförmig im Zellkern,
BDV-infizierte, tg+/+ Maus, 28 Tage p.i.
Balken 25 µm

140 Ergebnisse
Abb. 66: Nachweis von positiv orientierter
BDV-GP RNA (+ssBDV-GP)
Disseminiertes Vorkommen in Ammonshorn,
Cortex cerebri (CC) und Thalamus
(Th), charakteristisches Expressionsmuster
im Ammonshorn mit zahlreichen positiven
Neuronen in der CA3 Region (CA3) und
dem Gyrus dentatus (Gd) sowie nur
vereinzelt positiven Neuronen in der CA1
Region (CA1),
BDV-infizierte, ntg Maus, 42 Tage p.i.
Balken 250 µm
Abb. 67: Nachweis von positiv orientierter
BDV-GP RNA (+ssBDV-GP)
Charakteristisches Expressionsmuster im
Cortex cerebri mit deutlicher Reaktion in
der äußeren Körnerschicht (II) sowie
äußeren (III) und inneren Pyramidenschicht
(V).
Molekular (I), innere Körner (IV) und
Multiforme Schicht (VI) enthalten
deutlich weniger positive Zellen.
dilatierter lateral Ventrikel (LV),
BDV-infizierte, ntg Maus, 42 Tage p.i.
Balken 250 µm
Abb. 68: Nachweis von positiv orientierter
BDV-GP RNA (+ssBDV-GP)
Intrazelluläre Lokalisation des +ssBDV-
GP in Zellkernen, Zytoplasma und
Fortsätzen,
BDV-infizierte, tg+/+ Maus, 28 Tage p.i.
Balken 25 µm

Ergebnisse 141
Abb. 69: Nachweis des BDV-N Abschnitts des
BDV-Genoms (-ssBDV-N) in Oligodendrozyten
Doppelmarkierung () von -ssBDV-N (in situ
Hybridisierung, blau) und immunhistologischer
Nachweis von CNPase (braun),
BDV-infizierte, tg+/+ Maus, 28 Tage p.i.
Balken 25 µm
Abb. 70: Nachweis von positiv orientierter
BDV-N RNA (+ssBDV-N) in Oligodendrozyten
Doppelmarkierung von +ssBDV-N (in situ
Hybridisierung, blau) und immunhistologischer
Nachweis von CNPase (braun), Nachweis von
+ssBDV-N in Zellkern () oder Zellkern und
Zytoplasma (),
BDV-infizierte, tg+/+ Maus, 14 Tage p.i.
o.li.: BDV-infizierte, tg+/+ Maus, 28 Tage p.i.
Balken 25 µm
Abb. 71: Nachweis von positiv orientierter
BDV-GP RNA (+ssBDV-GP) in Oligodendrozyten
Doppelmarkierung () von +ssBDV-GP (in situ
Hybridisierung, blau) und immunhistologischer
Nachweis von CNPase (braun), Nachweis im
Zellkern
BDV-infizierte, tg+/+ Maus, 14 Tage p.i.
Balken 25 µm
Abb. 72: Nachweis von positiv orientierter
BDV-Intron I RNA (+ssBDV-Intron I) in
Oligodendrozyten
Doppelmarkierung () von +ssBDV-Intron I
(in situ Hybridisierung, blau) und immunhistologischer
Nachweis von CNPase (braun),
Nachweis im Zellkern
BDV-infizierte, ntg Maus, 28 Tage p.i.
Balken 25 µm

142 Ergebnisse
Abb. 73: Nachweis des BDV-N Abschnitts des
BDV-Genoms (-ssBDV-N) in Astrozyten
Doppelmarkierung () von -ssBDV-N (in situ
Hybridisierung, blau) und immunhistologischer
Nachweis von GFAP (braun), Nachweis von
-ssBDV-N in Zellkernen,
BDV-infizierte, tg+/+ Maus, 28 Tage p.i.
Balken 25 µm
Abb. 74: Nachweis von positiv orientierter
BDV-N RNA (+ssBDV-N) in Astrozyten
Doppelmarkierung () von +ssBDV-N (in situ
Hybridisierung, blau) und immunhistologischer
Nachweis von GFAP (braun), Nachweis von
+ssBDV-N in Zellkernen und Zytoplasma
BDV-infizierte, tg+/+ Maus, 28 Tage p.i.
Balken 25 µm
Abb. 75: Nachweis von positiv orientierter
BDV-GP RNA (+ssBDV-GP) in Astrozyten
Doppelmarkierung () von +ssBDV-GP (in situ
Hybridisierung, blau) und immunhistologischer
Nachweis von GFAP (braun), Nachweis von
+ssBDV-GP in Zellkernen und Zytoplasma
BDV-infizierte, tg+/+ Maus, 28 Tage p.i.
Balken 25 µm
Abb. 76: Nachweis von positiv orientierter
BDV-Intron I RNA (+ssBDV-Intron I) in
Astrozyten
Doppelmarkierung () von +ssBDV-Intron I
(in situ Hybridisierung, blau) und immunhistologischem
Nachweis von GFAP (braun),
Nachweis von +ssBDV-Intron I in Zellkernen
BDV-infizierte, tg+/+ Maus, 28 Tage p.i.
Balken 25 µm

Ergebnisse 143
Abb. 77: Elektrophoretische Auftrennung von PCR-Amplifikaten nach qPCR, Comparative
Quantitation zur Differenzierung der drei Mausgruppen
L: 100 bp-Leiter, 1 und 2: Kalibrator (homogygotes Tier), 3-5 Kontrolltiere mit bekannten transgen
Status (3: tg+/+, 4: tg+/-, 5: ntg), 6-8: zu testende Mäuse mit unbekanntem transgen Status, 9: NTC (no
templat contol, Negativ Kontrolle)
links: TNF-transgen Konstrukt, rechts: GAPDH, das als Normalizer eingesetzte Housekeeping Gen
Abb. 78: Elektrophoretische Auftrennung von qRT-PCR Amplifikaten
L: 20 bp-Leiter, 1: +ssBDV-Nukleprotein (96 bp), 2: NTC, 3: +ssBDV-Glykoprotein (124 bp), 4: NTC,
5: +ssBDV-Intron I (100 bp), 6: NTC, 7: BDV-Antigenom (110 bp), 8: NTC, 9: SDHA (Succinat
Dehydrogenase Komplex, Untereinheit A, 95 bp), 10: NTC, 11: HPRT (Hypoxanthin Phosphoribosly
Transferase I, 86 bp), 12: NTC, 13: GAPDH (Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase, 82 bp), 14:
NTC (no templat control, Negativ Kontrolle)

144 Ergebnisse
Abb. 79: Ammonshorn, ntg
keine entzündlichen oder degenerativen
Veränderungen,
HE-Färbung, BDV-infiziert, 49 Tage p.i.
Balken 250 µm
Abb. 80: Ammonshorn, tg+/-
keine entzündlichen oder degenerativen
Veränderungen
HE-Färbung BDV-infiziert, 49 Tage p.i.
Balken 250 µm
Abb. 81: Ammonshorn, tg+/+
meningeale Entzündungszellinfiltration
(),keine degenerativen Veränderungen,
HE-Färbung, BDV-infiziert, 49 Tage p.i.
Balken 250 µm

Ergebnisse 145
Abb. 82: Perivaskuläre Infiltrate, ntg
vereinzelte perivaskuläre Entzündungszellen
im Cortex cerebri (CC) und
Striatum (Str)
HE-Färbung, BDV-infiziert, 42 Tage p.i.
Balken 250 µm
Abb. 83: Perivaskuläre Infiltrate, tg+/-
hochgradige perivaskuläre und geringgradige
parenchymale Infiltrate () im
Cortex cerebri (CC) und Striatum (Str)
HE-Färbung, BDV-infiziert, 42 Tage p.i.
Balken 250 µm
Abb. 84: Perivaskuläre Infiltrate, tg+/+
hochgradige perivaskuläre und mittelgradige
parenchymale Infiltrate () im
Cortex cerebri (CC) und Striatum (Str)
HE-Färbung, BDV-infiziert, 42 Tage p.i.
Balken 250 µm

146 Ergebnisse
Abb. 85: Perivaskuläres Infiltrat
Striatum, Infiltrat mit zahlreichen
aktivierten Mikroglia und Astrozyten,
z.T. mit degenerierten Zellkernen ()
HE-Färbung, BDV-infizierte, tg+/+ Maus,
21 Tage p.i.
Balken 50 µm
Abb. 86: Perivaskuläres Infiltrat
Cortex cerebri, perivaskuläres Infiltrat mit
zahlreichen aktivierten Mikroglia und
Astrozyten ()
HE-Färbung, BDV-infizierte,
tg+/+ Maus, 21 Tage p.i.
Balken 50 µm
Abb. 87: Nachweis von
Makrophagen/Mikroglia,
Thalamus, stäbchenförmige positive
Zellen (aktivierte Mikroglia, ) im
Neuroparenchym,
Mac-1 alpha-Immunhistologie
BDV-infizierte, tg+/+ Maus, 42 Tage p.i.
Balken 50 µm

Ergebnisse 147
Abb. 88: Nachweis von GFAP-reaktiven Astrozyten
Ebene 1: Cortex cerebri (CC) und Striatum (Str)
A: nicht-infiziertes, ntg Kontrolltier, 42 Tage p.i.
B: Mittelgradig vermehrt GFAP-positive Astrozyten bei BDV-infizierter, ntg Maus, 42 Tage p.i.
C: Mittelgradig vermehrt GFAP-positive Astrozyten bei BDV-infizierter, tg+/- Maus, 42 Tage p.i.
D: Mittel- bis hochgradig vermehrt GFAP-positive Astrozyten bei BDV-infizierter, tg+/+
Maus, 42 Tage p.i.
GFAP Immunhistologie
Balken 250 µm

148 Ergebnisse
Abb. 89: Charakterisierung der mononukleären Entzündungszellen der perivaskulären Infiltrate
oben : perivaskuläres Infiltrat im Thalamus mit zahlreichen CD4 + T-Zellen (A)
und einzelnen CD8 + T-Zellen (B), tg+/- Maus, 42 Tage p.i.
unten: perivaskuläres Infiltrat im Thalamus mit zahlreichen CD4 + T-Zellen (C)
und einigen CD25 + T-Zellen (D), tg +/+ Maus, 42 Tage p.i.
Balken 25 µm

Ergebnisse 149
Abb. 90: Charakterisierung der mononukleären Entzündungszellen der perivaskulären Infiltrate
oben : perivaskuläres Infiltrat im Thalamus mit zahlreichen CD3 + T-Zellen (A)
und B-Zellen (B), BDV-infizierte, tg+/+ Maus, 42 Tage p.i.
Balken 50 µm
unten: perivaskuläres Infiltrat im Thalamus mit zahlreichen ovoiden Mac-1 alpha positiven
mononuklären Entzündungszellen (Makrophagen), BDV-infizierte, tg +/- Maus, 42 Tage p.i.
Balken 25 µm

150 Ergebnisse
BDV-N +ssBDV-N
Abb. 91: Disseminierter Nachweis von
BDV-N im Auge
Zentrifugale Ausbreitung des BDV über
den N. opticus in die Retina,
BDV-infizierte, ntg Maus, 42 Tage p.i.
Balken 500 µm
Abb. 92: Nachweis von BDV-N und
+ssBDV-N in der Retina
Nachweis von Protein (BDV-N) in allen
Retinaschichten, Nachweis von +ssRNA
war vor allem in der Ganglienzell- (VII)
und der innern Körnerschicht (V),
BDV-infizierte, ntg Maus, 42 Tage p.i.
Balken 50 µm
Abb. 93: HE-Färbung, Retina
keine entzündlichen oder degenerativen
Veränderungen,
I: Pigmentepithel, II: Schicht der
Stäbchen und Zapfen, III: äußere
Körnerschicht, IV: äußere plexiforme
Schicht, V: innere Körnerschicht, VI:
innere Plexiforme Schicht, VII:
Ganglienzell- und Nervenfaserschicht,
BDV-infizierte, ntg Maus, 42 Tage p.i.
Balken 50 µm

Diskussion 151
5 Diskussion
Die experimentelle BDV-Infektion transgener Mäuse ermöglicht die gezielte Untersuchung
einzelner Komponenten der zugrunde liegenden immunpathogenen Mechanismen. Ziel der
vorliegenden Studie war es, den Einfluss verschieden hoher TNF-Spiegel im Gehirn auf
die klinische Symptomatik, Entzündungsreaktion und Virusausbreitung nach
experimenteller BDV-Infektion von neonatalen Mäusen zu untersuchen. Bei adulten BDVinfizierten
Lewis Ratten wird eine Aufregulierung proinflammatorischer Zytokine wie
TNF und IFNγ parallel zum Auftreten der entzündlichen Veränderungen im ZNS und den
neurologischen Symptomen beobachtet (SHANKAR et al., 1995; STITZ et al., 1995;
HATALSKI et al., 1998). Auch bei Mäusen ist eine starke Aufregulierung von TNF in den
Gehirnen nach BDV-Infektion beschrieben (SAUDER et al., 2000). Im Gegensatz zu den
bestehenden TNF-Mausmodellen weisen die in diesem Projekt verwendeten Mäuse eine
moderate, selektive Überexpression von TNF in Neuronen, vor allem in Cortex cerebri,
Ammonshorn, Thalamus und Striatum auf, ohne spontane pathologische Veränderungen zu
entwickeln. (MARCHETTI et al., 2004). Durch den Einsatz homozygoter (tg+/+) und
heterozygoter (tg+/-) Tiere können verschieden hohe TNF-Spiegel im Gehirn erzeugt und
ihr Einfluss auf die Entzündungsreaktion und Virusausbreitung, -replikation und
-persistenz im Verlauf der BDV-Infektion untersucht werden.
Klinik
In einer Studie zur experimentellen BDV-Infektion verschiedener Mausstämme wurde
bereits festgestellt, dass die Schwere der Erkrankung bei Mäusen in Abhängigkeit des
MHC I-Allels variiert (HALLENSLEBEN et al., 1998). Die Empfänglichkeit für die
klinische BD scheint ebenfalls genetisch determiniert zu sein, wobei die zugrunde
liegenden genetischen Faktoren bisher noch nicht geklärt werden konnten. Die in der
vorliegenden Studie eingesetzten C57Bl/6 Mäuse gehören dem Haplotyp an, der laut der
Studie von HALLENSLEBEN et al. (1998) nur geringe Symptome entwickelt und wenig
empfänglich für die klinisch apparente BD ist. Daher eignen sich Mäuse mit derartigem
genetischen Hintergrund zur Untersuchung potentieller Einflüsse des TNF auf die
Induktion und den Verlauf der Erkrankung.
Die in der vorliegenden Studie untersuchten Tiere zeigten nicht die typische Symptomatik,
wie sie von HALLENSLEBEN et al. (1998) beobachtet wurde. Bei zahlreichen klinisch

152 Diskussion
untersuchten Parametern konnten nur dezente Unterschiede zwischen BDV-infizierten und
mock-infizierten Tieren gefunden werden, die meist erst an den späteren Infektionszeitpunkten
auffällig waren. Zwischen nicht-transgen und transgen BDV-infizierten Mausgruppen
ließen sich in der Regel nur geringe Unterschiede feststellen.
Deutlich auffällig waren die ausschließlich in den BDV-infizierten transgenen Tieren
aufgetretenen spontanen, epileptiformen Krämpfe. Die Krämpfe wurden im Rahmen der
Untersuchungen beobachtet, was möglicherweise darauf zurückgeführt werden kann, dass
die Tiere durch die klinischen Untersuchungen einer Stresssituation ausgesetzt waren.
Ähnliche Krämpfe wurden ebenfalls bei adult BDV-infizierten Lewis Ratten ab 42 Tagen
p.i. (SOLBRIG et al., 1996a) und bei p35-knockout Mäusen (WENZEL et al., 2001)
beobachtet. p35 spielt eine Schlüsselrolle in der kortikalen Entwicklung für die neuronale
Migration und hat Einfluss auf die Ausbildung der Dendriten. Die p35-knockout Mäuse
zeigten, wie auch in der vorliegenden Studie beobachtet, krampfassoziierte Todesfälle. Die
Krampfaktivität der p35-knockout Mäuse wird auf eine Desorganisation der Schichten des
Ammonshorns und Cortex cerebri zurückgeführt, die bei den BDV-infizierten transgenen
Mäusen jedoch nicht vorhanden war. Studien an BDV-infizierten Lewis Ratten konnten
zeigen, dass eine BDV-Infektion Opioid-Veränderungen im Gehirn bewirkt und die Tiere
damit in einen prokonvulsiven Status versetzt wurden (SOLBRIG et al., 1996a,b, 2005,
2006). Die in der vorliegenden Studie untersuchten Mäuse wurden nicht auf
Veränderungen des Opoidstatus speziell untersucht, Aussagen über funktionelle
Imbalancen können daher nicht gemacht werden. Hinweise auf mögliche Interaktionen mit
Opioiden geben die erhöhten brain-derived neurotropic factor (BDNF)-spezifischen
mRNA Level, die in beiden transgenen Mausgruppen im Ammonshorn gefunden wurden,
während die BDNF-Werte der ntg BDV-infizierten Mäuse den Werten der Kontrolltiere
entsprachen (SCHAUDIEN, persönliche Mitteilung). Erhöhte BDNF-Level im Gehirn
werden für verminderte Level des Opioids Dynorphin im Ammonshorn verantwortlich
gemacht (CROLL et al., 1994). Inwieweit veränderte Dynorphin-Level mit der
Krampfaktivität der BDV-infizierten transgenen Tiere im Zusammenhang steht, muss in
weiteren Untersuchungen geklärt werden.
In der vorliegenden Studie traten die Krämpfe nur bei transgenen Tieren auf, wobei 42%
der tg+/+ Tiere und 25% der tg+/- Mäuse betroffen waren. Dies kann auf einen
Zusammenhang der Transgen-Expression und der BDV-Infektion hindeuten. Eine
zerebrale TNF-Überexpression als solche induziert keine Krämpfe (PROBERT et al.,

Diskussion 153
1997; TAUPIN et al., 1997; AKASSOGLOU et al., 1998; MARCHETTI et al., 2004), dies
haben auch die klinischen Untersuchungen der transgenen Kontrolltiere und mockinfizierten
Mäuse bestätigt. Möglicherweise sind auch die prominenten entzündlichen
Infiltrate bei den transgenen Tieren verantwortlich für neuronale Dysfunktionen, welche
zur Induktion der Krämpfe führten.
Alle untersuchten Gruppen zeigten bis 42 Tage p.i. eine Gewichtszunahme. Die BDVinfizierten
Tiere zeigten deutliche, z.T. signifikant geringere Zunahmen als mock-infizierte
Kontrolltiere. Dieses steht in Einklang mit den Beobachtungen von HALLENSLEBEN et
al. (1998), die ebenfalls verminderte Gewichtszunahmen bei Mäusen nach BDV-Infektion
beobachteten. Auch BDV-infizierte Lewis Ratten zeigen nach Infektion mit der
Viruspräparation, die die biphasische Form der BD induziert, eine Reduktion des
Körpergewichts (HERDEN et al., 2000). Bei neonatal infizierten Ratten konnte ebenfalls
eine Reduktion des Körpergewichts festgestellt werden (BAUTISTA et al., 1994;
PLETNIKOV et al., 1999). Die Gewichtsreduktion bei den adult infizierten Lewis Ratten
wird auf Infiltrate im motorischen Cortex cerebri und die verminderte Futteraufnahme
durch die sich entwickelnde Blindheit zurückgeführt (HERDEN, persönliche Mitteilung).
In der vorliegenden Studie lässt die Gewichtsentwicklung neben dem Effekt der BDV-
Infektion einen Zusammenhang mit dem TNF-transgen Statuts der Tiere erkennen. Die
Rolle der TNF-Überexpression kann möglicherweise auf die Induktion der entzündlichen
Infiltrate, die regelmäßig auch im motorischen Cortex der BDV-infizierten Mäuse zu
finden waren, zurückgeführt werden. Auch bei experimentell mit Vesikulären Stomatitis
Virus (VSV) infizierten C57Bl/6 Mäusen konnte ein Zusammenhang von TNF-Expression
und VSV-Infektion mit Gewichtsverlust gezeigt werden. VSV-infizierte TNF-knockout
Mäuse zeigten einen geringeren Gewichtsverlust nach Infektion als wt Mäuse
(PUBLICOVER et al., 2006). Dieses weist, wie die Ergebnisse der vorliegenden Studie,
auf einen negativen Koeffekt bei der Gewichtsentwicklung von viraler Infektion und TNF
Expression hin.
Die Beurteilung der Aktivität ermöglicht Rückschlüsse über die Funktion des limbischen
Systems, kortikaler und subkortikaler Zentren sowie der Formatio reticularis
(VANDEVELDE et al., 2001). Es konnten keine prägnanten Unterschiede zwischen den
drei BDV-infizierten Mausgruppen oder im Vergleich zu den mock-infizierten Tieren
festgestellt werden. Beim Laufen auf dem Gitter und Plexiglas wurde neben dem Gang
auch die Haltung der Tiere beobachtet. Beim Gang wurde besonderes Augenmerk auf

154 Diskussion
Ataxien gelegt, welche für Läsionen im Hirnstamm, Kleinhirn, Vestibularapparat,
Rückenmark und sensiblen Nerven sprechen können (VANDEVELDE et al., 2001).
Ataxien, abnorme Haltungen und Verhaltensänderungen werden bei BD-erkrankten
Pferden sowie nach experimenteller BDV-Infektion von Ratten und empfänglichen
Mausstämmen (MRL) regelmäßig beobachtet (Übersichten bei ZWICK, 1939; HEINIG,
1969; NARAYAN et al., 1983 a, b; KOMPTER et al., 1988; DESCHL et al., 1990;
HALLENSLEBEN et al., 1998; ROTT und BECHT 1995; HERDEN et al., 2000). Beim
Laufen auf dem Gitter fanden sich Hinweise auf eine Beeinträchtigung der BDVinfizierten
Tiere aller drei Mausgruppen, so zeigte 35 bis 49 Tage p.i. je ein Tier geringgradig
ataktischen Gang. Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit den
Untersuchungsergebnissen des Balancierens auf einem Stab. Hier zeigten ab 35 Tagen
p.i. alle BDV-infizierten Mausgruppen geringgradige Unsicherheiten, während die mockinfizierten
Tiere ohne Probleme auf dem Stab balancieren konnten. Das Balancieren diente
dem Erkennen dezenter Gangstörungen, die durch Großhirnläsionen verursacht werden.
Diese Tests ließen somit auch dezente klinische Symptome erkennen und korrelierten mit
dem Auftreten der entzündlichen Läsionen in den BDV-infizierten Gruppen. Ab 35 Tagen
p.i. waren bei der Mehrzahl der Tiere aller drei BDV-infizierten Mausgruppen histopathologische
Veränderungen vor allem in Cortex cerebri, Striatum und Thalamus zu
finden, Kleinhirn und Hirnstamm waren unregelmäßig betroffen. Zwischen den drei BDVinfizierten
Mausgruppen waren nur z.T. signifikante Unterschiede in den klinischen Tests
zu erkennen, so dass zwar eine Korrelation mit dem Auftreten der Enzephalitis, nicht
jedoch mit der Stärke der Entzündung feststellbar war.
Im Hängtest fielen 42 und 49 Tage p.i. die tg+/+ BDV-infizierten Tiere durch
durchschnittlich deutlich längere Zeiten auf, die sie benötigten, um ins Rad zu klettern.
Dieser Test ermöglichte die Untersuchung von Koordinationsfähigkeit und
neuromuskulärer Kraft. Bei den untersuchten BDV-infizierten tg+/+ Tieren dauerte, wie
bei den beiden anderen Gruppen (ntg und tg+/-), das Hereinklettern nur wenige Sekunden,
die längere Dauer war auf eine lange Phase bis zum Start der Aktion zurückzuführen. Auch
der Radlauf ermöglichte ebenfalls die Untersuchunng der neuromuskulären Kraft und
Koordination. Beim Radlauf konnten keine Unterschiede zwischen infizierten und nichtinfizierten
Tieren beobachtet werden, so dass ein Einfluss der BDV-Infektion oder der
TNF-Überexpression auf die neuromuskuläre Kraft und Koordination nicht festgestellt
werden konnte. Die längere Dauer bis zum erfolgreichen Hereinklettern ins Hamsterrad

Diskussion 155
beim Hängtest ist vielmehr auf eine Unentschlossenheit der tg+/+ Tiere als auf
körperliches Unvermögen zurückzuführen. Weitere Untersuchungen überprüften den
Greifreflex und den kaudalen Flexorreflex, mit denen die Funktionalität des unteren
motorischen Neurons und die spezifischen Reflexzentren in der Cervical- bzw.
Lumbalschwellung des Rückenmarks überprüft wurden, an denen keine Beeinträchtigung
festgestellt werden konnte. Anhand der Provokationsproben des N. trigenimus und des N.
fascialis wurde die Kopfsensibilität überprüft. Mit diesen Tests konnten ebenfalls keine
abweichenden Befunde erhoben werden. Dieses stimmt mit den histologischen
Ergebnissen überein. Im Bereich der Kerngebiete dieser beiden Nerven waren keine
Infiltrate zu finden. Von den Haltungs- und Stellreaktionen konnten aufgrund der Größe
der untersuchten Spezies die Aufrichtereaktion und die Tischkantenprobe durchgeführt
werden. Auch bei diesen Untersuchungen, die es ermöglichen, alle Ebenen des
Nervensystems sowie Motorik und Sensibilität zu untersuchen, konnten keine
abweichenden Befunde bei den BDV-infizierten Tieren aller drei Gruppen untereinander
und zu den mock-infizierten Mäusen festgestellt werden. Dies deutet auf eine
Kompensation der durch die entzündlichen Veränderungen induzierten neurologischen
Defizite bei BDV-infizierten Tieren hin. Aufrichtereaktion und Tischkantenprobe
überprüfen zusätzlich das visuelle System der Tiere. Bei den in der vorliegenden Studie
untersuchten Mäusen konnten keine Hinweise auf eine Störung der Sehfunktion beobachtet
werden. Dieses steht im Einklang mit der histologisch unveränderten Retina. Allerdings
waren im Thalamus ab 21 Tagen p.i. regelmäßig Infiltrate zu finden, es konnte jedoch kein
Einfluss auf das visuelle System festgestellt werden.
5.1 Charakterisierung der Virusreplikation
5.1.1 Immunhistologischer Nachweis viraler Proteine im Gehirn
Das Nukleoprotein (BDV-N) war in der vorliegenden Studie in Neuronen, Astrozyten und
Oligodendrozyten nachweisbar. Diese stimmt mit den in der Literatur für Lewis Ratten
beschriebenen infizierten Zellen überein (NARAYAN et al., 1983b; CARBONE et al.,
1989; DESCHL et al., 1990; CARBONE et al., 1991; CARBONE et al., 1993; HERDEN
et al., 2000). Zusätzlich kann BDV-N bei der Ratte regelmäßig auch in Ependymzellen
gefunden werden. Bei den Mäusen der vorliegenden Studie war nur in vereinzelten

156 Diskussion
Ependymzellen BDV-N ab 21 Tage p.i. nachweisbar. Der Nachweis von BDV-N in
Nukleus und Zytoplasma der infizierten Zellen und im Neuropil, entspricht dem für die
Ratte beschriebenen Verteilungsmuster (HAAS et al., 1986; DESCHL et al., 1990;
THIEDEMANN et al., 1992; RICHT et al., 1998; HERDEN et al., 2000). Diese
disseminierte intrazelluläre Verteilung lässt sich durch spezielle Regionen des BDV-N,
welche als nuclear loclization signal (NLS) und nuclear export signal (NES) den
nukleozytoplasmatischen Transport des Proteins ermöglichen, erklären (KOBAYASHI et
al., 1998). Als Hauptbestandteil des aktiven Polymerase-Komplex (RNP) hat das BDV-N
eine wichtige Funktion in der viralen Replikation (SCHNEIDER et al., 2004b) und wird
für eine aktive Virusreplikation auch intranukleär benötigt. Die Ausbreitung des BDV-N,
das bei allen BDV-infizierten Mausgruppen ab 21 Tage p.i. in allen untersuchten
Gehirnregionen nachweisbar war, stimmt ebenfalls mit dem disseminierten Vorkommen
des BDV-N bei experimentell infizierten Ratten überein (NARAYAN et al., 1983a;
DESCHL et al., 1990; CARBONNE et al., 1991; RICHT et al., 1994; GOSZTONYI und
LUDWIG, 1995, 2001; HERDEN et al., 2000; STITZ et al., 2002). Das charakteristische
Expressionsmuster des BDV-N im Ammonshorn aller infizierter Mausgruppen dieser
Studie wird ebenfalls in BDV-infizierten Ratten beobachtet (MORALES et al., 1988;
GOSZTONYI und LUDWIG, 1995; WERNER-KEIŠS, persönliche Mitteilung). Bis 49
Tage p.i. konnten nur einzelne BDV-N enthaltende Neurone in der CA1 Region
nachgewiesen werden, jedoch war zu diesem Zeitpunkt eine starke positive Reaktion in
Stratum oriens und radiatum der CA1 Region zu erkennen. Alle den Schaffer Kollateralen
vorgeschalteten Neurone des Gyrus dentatus und der CA3 Region enthielten bei den
Mäusen der vorliegenden Studie BDV-N, in den Pyramidenzellen der CA1 Region
dagegen war nur vereinzelt BDV-N nachweisbar. Ob dies auf eine spezifische Ausstattung
der CA1-Pyramidenzellen zurückzuführen ist, welche sie für BDV-Infektion
unempfindlich macht oder im Zusammenhang mit der Verschaltung der Neurone
zusammenhängt, muss in weiteren Untersuchungen geklärt werden. Die CA1 Region
besitzt z.B. kein der CA3 Region vergleichbares schichtinternes Netzwerk (AMARAL und
WITTER, 2001). Ein Zusammenhang mit der TNF-Expression war nicht vorhanden, da ntg
Tiere das gleiche Expressionsmuster wie die beiden transgenen Mausgruppen zeigten.
GOSZTONYI und LUDWIG (1995) haben einen Zusammenhang der regionenspezifischen
BDV-N Verteilung im Ammonshorn mit dem Vorkommen von Aspartat- und Glutamatneurotransmittern
postuliert, der bisher weder belegt noch widerlegt werden konnte. Im

Diskussion 157
Gegensatz zu den Beschreibungen bei der Ratte, konnte in den Zellen der Subgranularschicht
des Gyrus dentatus kein BDV-N nachgewiesen werden. In dieser Schicht sind
basket cells und eine heterogene Population multipolarer oder fusiformer Neurone
lokalisiert, bei denen es sich vorwiegend um GABA-erge Interneurone handelt (AMARAL
und WITTER, 2001). Daneben war im Gyrus dentatus eine intensive feingranuläre
Neuropilreaktion der inneren Molekularschicht zu erkennen. Dieses innere Drittel des
Stratum moleculare empfängt Projektionen ausschließlich von der Polymorphschicht des
Gyrus dentatus (BLACKSTAD, 1956; LAURBERG, 1979; LAURBERG und
SORENSEN, 1981; SWANSON, 1978, 1981; ZIMMER, 1971). Der transgene Status der
Tiere zeigte keinen Einfluss auf diese topographische Verteilung des BDV-N im
Ammonshorn, weder in den CA Regionen noch im Gyrus dentatus, obwohl das transgene
TNF über den NR2B-Glutamatrezeptor exprimiert wird, der in diesen Lokalisationen
vermehrt nachweisbar ist.
Weiterhin fiel im Cortex cerebri eine schichtspezifisch unterschiedliche Verteilung des
BDV-N auf, wie sie auch bei der Lewis Ratte beobachtet wurde (WERNER-KEIŠS,
persönliche Mitteilung) Zahlreiche positive Zellen waren in der äußeren Körnerschicht und
den beiden Pyramidenschichten zu finden. Dieses Muster kann mit keiner spezifischen
Neurotransmitterverteilung in Übereinstimmung gebracht werden (ZILLE und WREE,
2001). Gegebenenfalls hängt dies mit einer anderen zellspezifischen Ausstattung
zusammen wie z.B. schicht- bzw. regionenspezifischen Enzymausstattungen oder Stoffwechselzustände
der Zellen sowie unterschiedliche zelluläre Spleißmechanismen.
Zwischen den drei Mausgruppen fanden sich keine Unterschiede, so dass ein Einfluss der
TNF-Überexpression ebenfalls unwahrscheinlich ist.
Das Maximum der Virusausbreitung war in den drei Mausgruppen zwischen 35 und 42
Tage p.i. erreicht, wobei die Schwankungen innerhalb der Gruppen und im Vergleich der
Mausgruppen ähnlich waren und als biologische Schwankungsbreite interpretiert werden
können. HAUSMANN et al. (2004) konnten für zahlreiche andere Entzündungsmediatoren
wie IFNγ, FAS/FAS-L, CXCR3, CXCL10 und iNOs zeigen, dass sie keinen Einfluss auf
die Verteilung des Virusantigens im Gehirn der infizierten Mäuse hatten. Die vorliegende
Studie konnte einen Effekt der TNF-Überexpression auf die virale Ausbreitung auf
Proteinebene ebenfalls nicht zeigen. Bis zum Ende der Studie 49 Tage p.i. war disseminiert
BDV-N nachweisbar. Dieses zeigt die Fähigkeit des BDV auch bei Mäusen mit TNF-
Überexpression eine persistierende Infektion zu etablieren.

158 Diskussion
Das Matrixprotein (BDV-M) konnte in der vorliegenden Studie am 28. Tag p.i. ebenfalls
in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten nachgewiesen werden. Im Unterschied
zum BDV-N war das BDV-M nicht in Ependymzellen zu finden. Intrazellulär war das
Matrixprotein vor allem zytoplasmatisch lokalisiert. Dieses stimmt mit der subzellulären
Lokalisation im Gehirn experimentell BDV-infizierter Lewis Ratten überein (WERNER-
KEIŠS, persönliche Mitteilung). Virale Matrixproteine interagieren mit RNPs,
transportieren diese zur Zellmembran und sind für die Bildung maturer Viruspartikel
verantwortlich (GAROFF et al., 1998; MARTIN und HELENIUS, 1991). Das
Matrixprotein des BDV ist ein nicht-glykolisiertes Membran-assoziiertes Protein (KRAUS
et al., 2001), für das ähnliche Funktionen bei der Reifung von Viruspartikeln beschrieben
wurden (KRAUS et al., 2005); daher war die zytoplasmatische Lokalisation zu erwarten.
Das BDV-M war in den gleichen Gehirnarealen zu finden wie BDV-N. Das
Verteilungsmuster in Ammonshorn und Cortex cerebri entsprach dem, wie für BDV-N
beschrieben wurde. Der Vergleich der drei BDV-infizierten Mausgruppen ergab keine
Unterschiede hinsichtlich der Topographie, des Zelltropismus oder der intrazellulären
Verteilung des BDV-M, so dass ebenfalls kein Einfluss der TNF-Überexpression auf die
Expression dieses viralen Strukturproteins zu erkennen war.
Im Gegensatz zu Nukleo- und Matrixprotein war das Glykoprotein (BDV-GP)
ausschließlich in Neuronen nachweisbar, obwohl die entsprechende mRNA auch in
Astrozyten und Oligodendrozyten gefunden wurde. BDV-GP war lediglich in einzelnen
wenigen Zellen im Zytoplasma zu finden und lag damit in signifikant geringeren Mengen
als BDV-N und BDV-M vor. Auch in der Ratte wurde eine sehr begrenzte BDV-GP
Expression beobachtet, die ebenfalls auf Neuronen beschränkt war und sich ausschließlich
im Zytoplasma einzelner Gehrinregionen der Zellen befand (WERNER-KEIŠS,
persönliche Mitteilung). Ergebnisse aus in vitro Studien können dieses intrazelluläre
Verteilungsmuster bestätigen (BAJRAMOVIC et al., 2003). Die in der vorliegenden Studie
beobachtete restriktive Expression stimmt ebenfalls mit Literaturangaben überein. So
wurde BDV-GP in nur 1-10 % persistent BDV-infizierter Zellen nachgewiesen (RICHT et
al., 1998; DE LA TORRE, 2002). In der vorliegenden Studie fand sich das BDV-GP vor
allem in Neuronen des Cortex cerebri, Thalamus, Cerebellum und der Medulla oblongata.
Es waren keine Unterschiede zwischen den drei BDV-infizierten Mausgruppen zu

Diskussion 159
beobachten, so dass kein Einfluss der TNF-Überexpression auf Anzahl und Verteilung der
Glykoprotein-haltigen Neurone zu beobachten war. Insgesamt war jedoch BDV-GP in
noch weniger Zellen nachweisbar als bei der Ratte. Das BDV-GP fand sich bei den Ratten
ebenfalls vor allem in Cortex cerebri und Thalamus, aber auch in Ammonshorn und
Amygdala (WERNER-KEIŠS, persönliche Mitteilung). Dies lässt auf einen
unterschiedlichen regionalen Tropismus sowie eine stärkere Regulation der Translation des
BDV-GP bei den Mäusen schließen.
Zusammenfassend zeigten die experimentell BDV-infizierten C57Bl/6 Mäuse eine virale
Proteinexpression, die dem Expressionsmuster der Lewis Ratte sehr ähnlich war. Lediglich
in Ependymzellen konnte bei den Mäusen nur ausnahmsweise BDV-N gefunden werden.
Weiterhin fielen bei der Maus im Unterschied zu den BDV-infizierten Lewis Ratten die
Virusprotein-freie Subgranularschicht im Gyrus dentatus und die insgesamt deutlich
geringere Anzahl von Neuronen, in denen BDV-GP nachgewiesen wurde, auf.
Insgesamt scheinen bei den Mäusen somit ähnliche Mechanismen der Virusausbreitung,
Translation und Expression viraler Proteine wie in anderen Nagermodellen vorzuliegen.
Interessanterweise wurden diese Strategien nicht durch verschieden hohe TNF-Spiegel im
Gehirn beeinflusst, obwohl für TNF eine Interaktion mit der Ausbreitung und Eliminierung
zahlreicher Viren beschrieben wurde (Übersichten bei LIEBERT 2001; HERBEIN und
O’BRIEN, 2000). Auch in anderen transgenen BDV-infizierten Mäusen wurde die
Virusausbreitung durch die Ausschaltung verschiedener Chemo- und Zytokine nicht
verändert (HAUSMANN et al., 2004).
5.1.2 Morphologischer und qualitativer Nachweis viraler RNA im
Gehirn
In der in situ Hybridisierung (ISH) dienten die -ssBDV-N, -ssBDV-GP und -ssBDV-
Intron I spezifischen Sonden dem Nachweis verschiedener viraler Genomabschnitte und
stellten damit eine interne Kontrolle des Genomnachweises dar. Darüber hinaus gab die
Detektion des Virusgenoms Aufschluss über die virale Replikation. Die -ssRNAs waren in
Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten zu finden, dies konnte mit
Doppelmarkierungen belegt werden. Der Nachweis der -ssRNAs war zu allen untersuchten
Zeitpunkten in allen BDV-infizierten Tieren nur im Nukleus möglich. Auch bei der Ratte

160 Diskussion
wurden genomische RNAs hauptsächlich im Zellkern gefunden. Interessanterweise wurde
bei den Ratten jedoch zu späteren Untersuchungszeitpunkten zusätzlich vor allem im
Ammonshorn eine Faserreaktion beobachtet (POROMBKA und WERNER-KEIŠS,
persönliche Mitteilungen), dies kann möglicherweise auf den intraaxonalen Transport
genomischer RNA hindeuten, der so bei den BDV-infizierten Mäusen nicht stattzufinden
scheint. Bei den Mäusen waren -ssBDV-N, -ssBDV-GP, -ssBDV-Intron I 28 Tage p.i. in
einer vergleichbaren Anzahl von Zellen und in allen untersuchten Gehirnarealen zu finden,
dies bestätigte sich auch für den Vergleich von -ssBDV-N und -ssBDV-GP 14 und 42 Tage
p.i. Die zunehmende Anzahl der positiven Zellen bei ntg Tieren im Verlauf der
Untersuchung kann auf eine aktive virale Replikation hin deuten. Dagegen zeigten die
tg+/- Tiere einen flachen Anstieg mit Maximum am 28. Tag p.i. und die tg+/+ Tieren einen
über den Untersuchungszeitraum konstanten Nachweis positiver Zellen. Dieses deutet auf
eine regulierte, konstante virale Replikation in transgenen Tieren hin.
Die zum Nachweis der +ssRNAs verwendeten antisense-Sonden markierten neben der
jeweiligen spezifischen mRNA auch das BDV-Antigenom, welches die Matrize zur
Replikation des gesamten viralen Genoms darstellt. Mit der qRT-PCR konnte jedoch
gezeigt werden, dass das Antigenom in deutlich geringeren Mengen als die jeweiligen
subgenomischen mRNAs exprimiert wurde, so dass der Nachweis mittels antisense-
Sonden in der ISH vornehmlich mRNA detektierte.
Die drei untersuchten +ssRNAs waren ebenfalls im Zellkern und im Zytoplasma von
Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten zu finden. Wie Astrozyten mit -ssBDV-N
waren Astrozyten mit mRNA für BDV-N, BDV-M und BDV-GP, wie die BDV-infizierten
Neurone, in allen untersuchten Gehirnarealen zu finden. BDV-infizierte Oligodendrozyten
waren vor allem in Corpus callosum, der Capsula externa, Medulla oblongata, sowie im
Kleinhirnmark lokalisiert, einzelne Oligodendrozyten mit -ssBDV-N und mRNA für BDV-
N, BDV-M und BDV-GP waren auch im Thalamus zu finden.
Die Nachweisbarkeit der viralen RNAs in Astrozyten und Oligodendrozyten zeigte keinen
Unterschied zwischen den verschiedenen transgenen und nicht-transgenen Mausgruppen
und steht in Übereinstimmung mit den Literaturangaben. In verschiedenen Studien konnte
BDV in Neuronen, Ependymzellen, Astrozyten und Oligodendrozyten nachgewiesen
werden (NARAYAN et al., 1983b; CARBONE et al., 1989; DESCHL et al., 1990;
CARBONE et al., 1991). Interessanterweise war in aktivierten, geschwollenen Astrozyten

Diskussion 161
in der Regel keine BDV-RNA nachweisbar, dies steht in Kontrast zu den Beobachtungen
bei der Lewis Ratte (WERNER-KEIŠS, persönliche Mitteilung).
14 Tage p.i. waren +ssBDV-N und +ssBDV-GP vor allem im Nukleus der infizierten
Zellen zu finden. Ab 28. Tag p.i. fielen Unterschiede in der intrazellulären Verteilung
zwischen +ssBDV-N und +ssBDV-GP auf. Während +ssBDV-N ab diesem Zeitpunkt vor
allem im Zytoplasma inklusive der Fortsätze zu finden war, und nur geringe Mengen meist
punktförmig im Zellkern lagen, konnte +ssBDV-GP gleichermaßen im Zytoplasma und im
Zellkern angetroffen werden. Die +ssBDV-Intron I zeigte 28 Tage p.i. eine dem +ssBDV-
N vergleichbare deutliche Reaktion im Zytoplasma und unregelmäßige, schwache,
punktförmige, nukleäre Reaktionen. Zwischen den +ssRNA Spezies waren keine
wesentlichen Unterschiede hinsichtlich der Anzahl der positiven Zellen pro
Infektionszeitpunkt erkennbar. Dieses deutet auf eine aktive mRNA-Synthese am 14. Tag
p.i. im Zellkern hin, ab 28 Tagen p.i. war +ssBDV-N vor allem im Zytoplasma zu finden,
was auf eine verstärkte Translation und verminderte Transkription hinweist. Dagegen war
ab 28 Tagen p.i. +ssBDV-GP sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern vorhanden,
obwohl nur wenig Protein gebildet wurde. Möglicherweise wird die Expression des BDV-
GP bei der Maus erst über eine Regulation der Translation vermindert. Andererseits kann
nicht ausgeschlossen werden, dass von der mRNA, an die die BDV-GP detektierende
Sonde bindet, nur das BDV-M translatiert wird. Bei der Ratte konnte +ssBDV-GP
vorwiegend im Zellkern gefunden werden (WERNER-KEIŠS, persönliche Mitteilung), so
dass von Unterschieden bei der Translation und dem intrazellulären Transport bei Ratte
und Maus auszugehen ist.
Ein besonderes Augenmerk wurde auf den Vergleich der Expression der +ssBDV-GP und
+ssBDV-Intron I gelegt, da diese beiden Abschnitte auf derselben primären mRNA
lokalisiert sind und posttranskriptionelle Modulationen über die Translation des BDV-GP
oder BDV-M entscheiden. Bei den in der vorliegenden Studie untersuchten Mäusen waren
28 Tage p.i. in vergleichbarer Anzahl von Zellen +ssBDV-GP und +ssBDV-Intron I zu
finden. Dabei wurde interessanterweise die +ssBDV-GP in Zytoplasma und Zellkern
nachgewiesen, +ssBDV-Intron I jedoch hauptsächlich im Zytoplasma. Dieses zeigt, dass
BDV am 28. dpi gespleißte und ungespleißte RNA aus dem Zellkern exportieren kann,
gespleißte dagegen auch zurückgehalten werden kann.

162 Diskussion
Nur wenig mehr Zellen enthielten +ssBDV-N im Vergleich zu der Anzahl der Zellen, in
denen immunhistologisch BDV-N nachgewiesen werden konnte. Ebenso enthielten ähnlich
viele Zellen +ssBDV-Intron I und BDV-M, welches von Intron I-haltiger mRNA
translatiert wird. Interessanterweise war eine deutliche Diskrepanz zwischen +ssBDV-GP
Nachweis und immunhistologisch nachweisbarem BDV-GP feststellbar. Dieses kann zum
einen auf eine strikte Regulierung der BDV-GP-Expression zurückzuführen sein, die
möglicherweise mit der viralen Persistenz im Zusammenhang steht. Ein ähnliches
Phänomen wird für das Tollwutvirus (Rabies Virus, RV) vermutet, da eine optimale
Expression des RV-Glykoproteins Apoptose und andere Abwehrreaktionen verzögert und
so das Überleben des Virus im ZNS ermöglicht (MORIMOTO et al., 1999; FABER et al.,
2002). Andererseits kann nicht vollkommen ausgeschlossen werden, dass die +ssBDV-GP
spezifische Sonde auch an die 2,8 kb bzw. 7,2 kb große, ungespleißte, Intron I enthaltende
mRNA bindet, von der BDV-M synthetisiert wird und aufgrund dessen viele Zellen ein
positives zytoplasmatisches BDV-GP mRNA-Signal aufwiesen. Es ist bekannt, dass nur
geringe Mengen des C-terminalen Anteils des BDV-GP an die Zelloberfläche transportiert
werden, dort akkumulieren und eine wichtige Rolle in der Fusion der Virushülle mit der
Zellmembran des Wirtes spielen (GONZALES-DUNIA et al., 1997; KOHNO et al., 1999;
KIERMAYER et al., 2002; EICKMANN et al., 2005). Die anderen BDV-GP-Anteile und
komplettes BDV-GP scheinen im endoplasmatischen Retikulum zurückgehalten zu werden
(EICKMANN et al., 2005). Von anderen Viren, wie dem RV, dem Vesikulären Stomatitis
Virus (VSV) und dem Masern Virus (MV) ist bekannt, dass die Glykoproteine für die
Ausbreitung eine wichtige Rolle spielen (COX et al., 1977; WILD et al., 1991;
MEBATSION et al., 1996; NESSELER et al., 1999; ETESSAMI et al., 2000). Bisher
konnte der Ausbreitungsmechanismus des BDV in vivo noch nicht vollkommen geklärt
werden. Es liegen zum einen Hinweise auf eine Ausbreitung als RNPs vor (GOSZTONYI
et al., 1993; CUBITT und DE LA TORRE, 1994) andererseits zeigten in vitro
Untersuchungen eine Rolle des BDV-GP für die interneuronale Ausbreitung
(BAJARAMOVIC et al., 2003). Diese stützt die Beobachtung, dass bei persistierend
infizierten Ratten die Applikation von Seren, in denen neutralisierende Antikörper gegen
BDV-M und BDV-GP nachgewiesen wurden, die Ausbreitung in die Peripherie verhindern
konnte (STITZ et al., 1998). In der vorliegenden Studie war trotz der wenigen Zellen, die
BDV-GP enthielten, die Ausbreitung und Replikation des BDV im Gehirn und die

Diskussion 163
zentrifugale Ausbreitung in die Retina möglich, so dass wahrscheinlich auch BDV-GP
unabhängige Ausbreitungsmechanismen bei der Maus vorliegen.
Eine weitere mögliche Erklärung für den restriktiven BDV-GP Nachweis kann die starke
Glykolisierung des BDV-GP liefern. Es konnte gezeigt werden, dass dadurch
antigenetische Strukturen abgeschirmt werden (KIERMAYER et al., 2002). Daher kann
nicht ausgeschlossen werden, dass diese Glykolisierung auch die Bindung der in der
Immunhistologie eingesetzten Antikörper verhindert und damit nicht alles BDV-GP
detektiert werden konnte.
Die Ergebnisse der ISH zeigen eine aktive virale Replikation und Transkription bei allen
drei BDV-infizierten Mausgruppen. Die stetige signifikante Zunahme der Anzahl RNAhaltiger
Zellen bei den ntg Tieren im Vergleich zu der nahezu konstanten Anzahl RNAhaltiger
Zellen bei beiden transgenen Mausgruppen lässt einen regulierenden TNF-Effekt
auf die virale Transkription vermuten. Interessanterweise fand sich kein Einfluss der
regulierten Transkription auf die BDV-N Translation. Ein antiviraler Effekt des TNF
konnte ebenfalls nach experimenteller RV-Infektion gezeigt werden (FABER et al., 2005).
Die TNF-Überexpression war in der vorliegenden Studie nicht in der Lage, das BDV zu
eliminieren. Möglicherweise wird die Proteinsynthese durch Reduktion der Zellen, in
denen mRNA nachweisbar war, quantitativ nicht beeinflusst und andere Zellen
translatieren entsprechend mehr BDV-N. Über den Verlauf der BDV-GP und BDV-M
Expression sind keine Aussagen möglich, da nur ein Zeitpunkt (28 Tage p.i.) untersucht
wurde.
5.1.3 qRT-PCR zum Nachweis viraler RNA im Gehirn
Bemerkenswerterweise waren bei allen drei BDV-infizierten Mausgruppen signifikant
weniger Kopien des BDV-Antigenoms (+ssBDV-AG) nachweisbar als von den anderen
Transkripten. Das Antigenom kann als Indikator aktiver viraler Replikation gewertet
werden. Diese sehr geringen gemessenen Werte können als Hinweise auf eine strenge
Regulierung der Replikation angesehen werden. Eine kontrollierte Replikation gilt als einer
der Persistenzmechanismen des BDV und soll unter anderem durch Verkürzung der
jeweiligen 5’-Enden, sowohl der genomischen RNA als auch des Antigenomstranges,
erreicht werden, was die Effizienz der Replikation reduzieren soll (ROSARIO et al., 2005;
SCHNEIDER, 2005; SCHNEIDER et al., 2005). Die Ergebnisse der Immunhistologie und

164 Diskussion
in situ Hybridisierung der vorliegenden Studie zeugen von einer disseminierten
Virusausbreitung bis 49 Tage p.i., daher scheinen diese geringen Mengen Antigenom für
eine effiziente Virusreplikation und Ausbreitung auszureichen, sowie die virale Persistenz
zu ermöglichen. In allen drei Mausgruppen war zwischen 21 und 42 Tagen p.i. ein Anstieg
der Kopienzahlen des Antigenoms zu erkennen, was auf eine ansteigende virale
Replikation schließen lässt, dieses korrelierte bei ntg Tieren mit signifikanten Zunahmen
genomischer RNAs in der ISH. Interessanterweise lag in den beiden transgenen Gruppen
eine stärkere Zunahme der Kopienzahlen vor als in den ntg Mäusen, obwohl genomische
RNA in weniger Zellen als bei ntg Tieren in der ISH vorlag. Dies zeigt zwar eine
ansteigende Antigenomsynthese, die aber nicht in einer vermehrten Anzahl Zellen
resultierte, die genomische RNA enthielten. Möglicherweise ist dies auf einen bisher noch
nicht beschriebenen TNF-Effekt zurückzuführen, der die weitere Ausbreitung des Virus
limitierte.
Bei Betrachtung der mRNAs fiel eine deutliche Differenz zwischen den Kopienzahlen für
+ssBDV-N und +ssBDV-GP bzw. +BDV-Intron I auf. cDNA des +ssBDV-N war bei allen
drei BDV-infizierten Mausgruppen in signifikant höherer Anzahl zu finden. Dieses steht in
Einklang mit den aus der Literatur bekannten Transkriptionsgradienten vom 3’- zum 5’-
Ende des BDV-Genoms (RICHT et al., 1998; DE LA TORRE et al., 2002), sowie der
disseminierten Ausbreitung des BDV-N. Die Anzahl der +ssBDV-N Kopien zeigte im
Verlauf der Untersuchung bei ntg und tg+/+ Tieren einen geringen Abfall vom 21. bis 42.
Tag p.i., bei tg+/- Mäusen zeigte sich ein deutlicher Anstieg in diesem Zeitraum.
Interessanterweise war bei allen Mausgruppen an beiden untersuchten Zeitpunkten mehr
+ssBDV-Intron I als +ssBDV-GP Kopienzahlen nachweisbar, dieses steht im Gegensatz zu
den Ergebnissen der ISH, in der in einer vergleichbaren Anzahl von Zellen +ssBDV-Intron
I und +ssBDV-GP nachweisbar war. Dabei muss beachtet werden, dass die ISH nur
Aussagen über die Anzahl positiver Zellen und nicht über die Gesamtkopienzahl im Gehirn
erlaubt. Mit Hilfe der qRT-PCR wurde hingegen eine absolute Quantifizierung
vorgenommen, ohne Möglichkeiten zur Aussage über die Menge RNA pro Zelle. So kann
eine nahezu konstante Anzahl positiver Zellen (ISH) bei steigenden Kopienzahlen (qRT-
PCR) auf eine steigende Menge von RNA pro Zelle hinweisen. Für den Nachweis eines
positiven Signals bei der ISH sollen 10-20 RNA Kopien genügen (WALBOOMERS et al.,
1988; NUOVO und RICHART, 1989; CRUM et al., 1989). Somit lässt sich schlussfolgern,

Diskussion 165
dass +ssBDV-Intron I in höheren Konzentrationen pro Zelle vorlag als +ssBDV-GP, was
auch mit dem signifikant höherem BDV-M im Gehirn korrelierte.
Weiterhin reduzierten sich die nachweisbaren Kopienzahlen +ssBDV-GP in allen drei
Gruppen signifikant vom 21. bis 42. Tag p.i., ohne dass es zu einer Reduktion der Anzahl
positiver Zellen kam, in denen +ssBDV-GP mittels ISH nachweisbar war. Diese Abnahme
der +ssBDV-GP Kopienzahlen ist vermutlich auf eine negative Regulation der
Transkription zurückzuführen.
Zusammenfassend geben die Untersuchungen der morphologischen und quantitativen
viralen RNA-Nachweise Hinweise auf eine regulierte Transkription, wobei Unterschiede
zwischen den ntg und den beiden transgenen Mausgruppen zu finden waren. In der ISH
zeigen die ntg Tiere eine Zunahme RNA-exprimierender Zellen, während die
Kopienzahlen viraler RNAs zwischen 21 und 42 Tagen p.i. geringere Veränderungen
zeigten als bei den transgenen Mausgruppen. Dagegen zeigten beide transgenen
Mausgruppen eine relativ konstante Anzahl RNA-haltiger Zellen mittels ISH, in der qRT-
PCR aber stärker variierende Transkriptmengen als die ntg Tiere. Alle drei verwendeten
Sonden, die an die verschiedenen Abschnitte des viralen Genoms binden, waren
ausschließlich im Nukleus zu finden. Dagegen zeigten die mRNAs ein individuelles
Verteilungsmuster. +ssBDV-N und +ssBDV-Intron I waren vor allem im Zytoplasma
lokalisiert, dagegen konnten +ssBDV-GP sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern der
BDV-infizierten Zellen gefunden werden. Dieses zeigt, dass bei Mäusen die virale RNA
vor allem ungespleißt und nur z.T. gespleißt aus dem Nukleus exportiert wird. Die qRT-
PCR konnte den für BDV beschriebenen Transkriptionsgradienten vom 3’- zum 5’- Ende
(RICHT et al., 1998, DE LA TORRE et al., 2002) bestätigen. Die in allen Mausgruppen
höheren Kopienzahlen des +ssBDV-Intron I als +ssBDV-GP stehen in Einklang mit den
Beobachtungen von JEHLE et al. (2000), die in BDV-infizierten Zellkulturen vor allem
ungespleißte virale RNA finden konnten, die für das BDV-M kodieren. Dagegen war
Intron I-gespleißte RNA, welche für das BDV-GP kodiert, nur in geringeren Mengen
nachweisbar. Diese Ergebnisse zeigen, dass das BDV in der Maus unterschiedliche
Mechanismen zur Regulation der Transkription und Translation seiner verschiedenen
Proteine, sowie zur viralen Replikation verwendet.

166 Diskussion
5.2 Nachweis von infektiösem Virus im Gehirn
Infektiöses Virus konnte 28 und 49 Tage p.i. aus den Gehirnen aller untersuchten BDVinfizierten
Mäuse isoliert werden. Es konnten keine Unterschiede zwischen den BDVinfizierten
Mausgruppen, noch Titerveränderungen im zeitlichen Verlauf der Infektion
festgestellt werden. Dieses entspricht den Beobachtungen zahlreicher Studien, dass sich in
Mäusen nach i.c. Infektion mit dem BDV eine persistierende Infektion entwickelt (KAO et
al., 1984; HALLERSLEBEN et al., 1998; HAUSMANN et al., 1999, 2001, 2004, 2005a,b;
FREUDE et al., 2002). Die zuvor beschriebenen Replikationsstrategien ermöglichen so
scheinbar erfolgreich den Erhalt des viralen Lebenszyklus.
5.3 Histopathologische Befunde
Alle BDV-infizierten Mäuse entwickelten eine nichteitrige Enzephalitis mit mononukleärer
Entzündungszellinfiltration. Die Stärke der Enzephalitis zeigte eine deutliche Korrelation
mit dem transgenen Status der Tiere. Bei ntg Mäusen fand sich lediglich eine geringgradige
Enzephalitis ohne Progression der Entzündung im Verlauf der Studie. Dagegen
konnte in beiden transgenen Mausgruppen ein hoch signifikanter Anstieg der
Entzündungsreaktion bis zum Ende der Studie 49 Tage p.i. festgestellt werden. Diese
Beobachtungen stehen im Gegensatz zu dem bei der biphasischen BD der adulten Lewis
Ratten beobachteten Rückgang der entzündlichen Infiltrate in der späten Phase der
Erkrankung (NARAYAN et al., 1983a,b; HIRANO et al., 1983; DESCHL et al., 1990;
GOSZTONYI und LUDWIG, 1995; HERDEN et al., 2000).
Die geringe Ausprägung der Enzephalitis bei ntg Tieren steht in Übereinstimmung mit
Literaturangaben, da C57Bl/6 Mäuse als relativ resistent gegenüber einer BD gelten. Sie
entwickeln nur dezente Enzephalitiden und kaum klinische Symptome (HALLENSLEBEN
et al., 1998). In der vorliegenden Studie konnte ab 21 Tagen p.i. bei BDV-infizierten ntg
Tieren nur eine geringgradige Enzephalitis nachgewiesen werden, obwohl bei allen Tieren
eine disseminierte Virusausbreitung ab 21 Tage p.i. nachweisbar war. Interessanterweise
fiel am 42. und 49. Tag p.i. bei über der Hälfte der ntg Tiere eine deutliche Leukozytostase
auf. Inwieweit die relative Resistenz von C57Bl/6 Mäusen auf eine verminderte Invasion
mononukleärer Immunzellen zurückzuführen ist, muss durch weitere Untersuchungen
geklärt werden.

Diskussion 167
Die starke entzündliche Reaktion der beiden transgenen Mausgruppen kann als Effekt der
TNF-Überexpression gewertet werden. Bei beiden transgenen Gruppen waren deutlich
erhöhte TNF mRNA-Level im Vergleich zu den ntg Tieren zu finden, dabei fiel weiterhin
auf, dass die Werte der tg+/+ deutlich höher als die der tg+/- waren (SCHAUDIEN,
persönliche Mitteilung). Ab 35. Tag p.i. lagen bei tg+/- und tg+/+ Mäusen starke
entzündliche Veränderungen vor. Es ist beschrieben, dass TNF auch an den Endothelzellen
des Gehirns die Expression des vascular adhesion molecule (VCAM)-1 erhöht, an das
aktivierte T-Zellen binden, bevor sie in das ZNS einwandern können (LIEBERT, 2001;
NOTTET, 2005). In der vorliegenden Studie scheint die TNF-Überexpression die
Einwanderung der Immunzellen ins Gehirn zu triggern, ohne dass die starke entzündliche
Reaktion einen Einfluss auf die Virusausbreitung hatte. Bei transgenen und nichttransgenen
Tieren war eine vergleichbare disseminierte Virusausbreitung im Gehirn auch
in Regionen mit entzündlichen Veränderungen zu finden. Dieses steht im Gegensatz zu den
Ergebnissen von HALLENSLEBEN et al. (1998), die bei den meisten Mäusen dieser
Studie eine negative Korrelation zwischen Arealen mit Entzündungsreaktion und
Virusnachweis feststellten. Weiterhin war in der vorliegenden Studie, im Gegensatz zu den
Untersuchungen von HALLENSLEBEN et al. (1998), keine deutliche Korrelation der
Klinik mit der Entzündungsreaktion feststellbar. Die höheren TNF-Level induzieren
vermutlich wiederum erhöhte Level anderer Zytokine welche an die Aufrechterhaltung der
signifikant stärkeren Entzündungsreaktion in den transgenen Tieren beteiligt waren.
Interessanterweise fanden sich erst ab 35. Tag p.i. bei allen BDV-infizierten Mausgruppen
gelegentlich dezente, entzündliche Reaktionen im Ammonshorn, obwohl dort vergleichbar
hohe TNF-Spiegel wie im Cortex cerebri, Striatum und Thalamus vorlagen
(SCHAUDIEN, persönliche Mitteilung). Auch bei den transgenen Mausgruppen, in denen
49 Tage p.i. im Cortex cerebri, Striatum und Thalamus zahlreiche mehrlagige Infiltrate zu
finden waren, waren im Ammonshorn meist nur einzelne migrierte perivaskuläre
Entzündungszellen vorhanden. Dieser Befund steht im Gegensatz zu der bei Ratte und
Pferd beobachteten starken entzündlichen Reaktion im Ammonshorn (GOSZTONYI et al.,
1993; GOSZTONYI und LUDWIG, 1984; HERDEN et al., 2000; RICHT et al., 2006).
Worauf diese Unterschiede zwischen Ratten, Pferden und den in der Studie eingesetzten
transgenen Mäusen beruhen, kann mit den vorliegenden Ergebnissen nicht geklärt werden.
Möglicherweise sind im Ammonshorn der Mäuse spezielle protektive Faktoren aktiv, die
in den anderen Gehirngebieten mit hoher TNF-Expression fehlen. Auch bei ntg Mäusen

168 Diskussion
fielen nur dezente entzündliche Veränderungen im Ammonshorn auf, allerdings war die
Enzephalitis in allen Gehirnarealen während des gesamten Untersuchungszeitraums nur
dezent ausgeprägt, so dass eine Aussage über einen Unterschied zu den anderen
Gehirngebieten nicht möglich ist.
Die fokale Entzündungszellinfiltration in der erweiterten Capsula externa eines mockinfizierten
Tieres 7 Tage p.i. ist wahrscheinlich als Reaktion auf die Injektion einzustufen.
Auch die bei drei BDV-infizierten Tieren beobachteten kortikalen Malazien stellen
möglicherweise ebenfalls Reaktionen auf die Injektion dar.
Zusammenfassend zeigten tg+/- Tiere ab 42. Tag p.i. und tg+/+ Mäuse ab 35. Tag p.i.
signifikant stärkere Enzephalitiden als ntg Mäuse. Beide transgenen Mausgruppen zeigten
einen kontinuierlichen, hoch signifikanten Anstieg der Entzündungsreaktion bis 49 Tage
p.i. mit auffällig geringer Beteiligung des Ammonshorns. Dagegen zeigten die ntg Tiere
eine geringgradige Enzephalitis ohne Progression bis 49 Tage p.i. Damit konnte eine
Korrelation der Stärke der Entzündung mit der TNF-Überexpression der Tiere gezeigt
werden, wobei die TNF-Wirkung im Einzelnen durch weitere Untersuchungen aufgeklärt
werden muss.
5.4 Nachweis infiltrierender Entzündungszellen
Der Immunpathogenese der BD wird eine Hypersensibilitätsreaktion vom verzögerten Typ
zu Grunde gelegt (RICHT et al., 1989; RICHT und ROTT, 2001; STITZ et al., 2002). Die
vorliegende Studie konnte eine Korrelation der Stärke der Enzephalitis mit der TNF-
Überexpression zeigen. Die immunhistologische Charakterisierung der perivaskulären
Entzündungszellen ergab bei allen drei BDV-infizierten Mausgruppen eine ähnliche
Verteilung der einzelnen Entzündungszellpopulationen. Dabei stellten T-Zellen und
Makrophagen jeweils ca. ein Drittel der Entzündungszellen. Ein geringer Unterschied stellt
sich bei dem Anteil der B-Zellen dar. Bei ntg Tieren stellten B-Zellen mit rund 38% die
größte Fraktion der Entzündungszellen, dagegen war in den beiden transgenen
Mausgruppen der Anteil der B-Zellen mit ca. 24% in tg+/- bzw. etwa 16% in tg+/+
geringer als der Anteil der T-Zellen und Makrophagen. Der geringere prozentuale Anteil
der B-Zellen bei den tg Mausgruppen im Vergleich zu den ntg Mäusen könnte ein Hinweis
auf einen Zusammenhang mit der TNF-Überexpression und eine verminderte Th2-Antwort
sein, andererseits können aufgrund der geringen Gesamtzahl der perivaskulären

Diskussion 169
Entzündungszellen bei ntg Mäusen nur wenige Zellen eine große prozentuale
Verschiebung verursachen. Bei der Ratte konnten DESCHL et al. (1990) eine ähnliche
Verteilung der perivaskulären Entzündungszellen feststellen. Auch hier stellten T-Zellen
und Makrophagen 38 Tage p.i. mit jeweils ca. 25% die größten Anteile der Entzündungszellinfiltrate.
Die nähere Charakterisierung der T-Zellsubpopulationen ergab bei allen drei BDVinfizierten
Mausgruppen eine deutliche Dominanz der CD4 + gegenüber CD8 + T-Zellen.
Diese Verteilung wurde ebenfalls bei der Lewis Ratte beschrieben (DESCHL et al., 1990;
HATALSKI et al., 1998). Auch bei Mäusen wurden sowohl CD4 + als auch CD8 + T-Zellen
im Gehirn nachgewiesen (HALLENSLEBEN et al., 1998; HAUSMANN et al., 1998,
1999, 2001; FREUDE et al., 2002). FREUDE et al. (2002) fanden bei IL-12 defizienten
Mäusen (C57Bl/6 x SJL) 1,4-fach mehr CD4 + als CD8 + T-Zellen, diese Differenz war bei
den Mäusen der vorliegenden Studie mit Faktoren von 5 bis 7,5 wesentlich deutlicher
ausgeprägt. Auch HAUSMANN et al. (2001) fanden in MRL und Perforin-defizienten
Mäusen signifikant mehr CD4 + als CD8 + T-Zellen in den perivaskulären Infiltraten,
allerdings waren zahlreiche CD8 + T-Zellen im Parenchym lokalisiert. Dieses steht im
Kontrast zu den Ergebnissen der vorliegenden Studie, in der parenchymal, wenn auch nur
einzelne, vor allem CD4 + T-Zellen fanden. Ein konträres Verhältnis der T-
Zellpopulationen fanden HAUSMANN et al. (1999) in MRL Mäusen nach BDV-Infektion,
in dieser Studie waren 2,3-fach mehr CD8 + als CD4 + T-Zellen im Gehirn der Mäuse zu
finden. Die CD8 + T-Zellen gelten derzeit als Haupteffektorzellen der murinen BD. So
konnten HALLENSLEBEN et al. (1998) bei Mäusen (C57Bl/6 und MRL) mit einem
defekten β2-Mikroglobulin nach BDV-Infektion keine klinischen Symptome sowie 42
Tage p.i. und 52 Tage p.i. keine entzündlichen Veränderungen im ZNS feststellen. Da
diese Mäuse aufgrund des β2-Mikroglobulin-Defektes keine MHC I-Rezeptoren
exprimieren, sind die CD8 + T-Zellen funktionslos. Dieses Ausbleiben der Entzündung bei
fehlender CD8 + T-Zellaktivität, unterstreicht die Bedeutung dieser T-Zellen in der Immunpathogenese.
Weiterhin fanden ENGELHARDT et al. (2005) in persisierend BDVinfizierten
MRL Mäusen eine reduzierte Avidität der CD8 + T-Zellen. Allerdings konnten
HAUSMANN et al. (1999) schon zeigen, dass Mäuse mit Depletion der CD4 + T-Zellen
ebenso wie Tiere nach CD8 + T-Zelldepletion keine BD entwickelten. Diese Beobachtung
deutet auf eine zentrale Rolle auch der CD4 + T-Zellen hin. Möglicherweise liegt ein
ähnlicher immunpathogenetischer Mechanismus bei der BD zugrunde, wie es kürzlich für

170 Diskussion
die Masern Virus (MV)-Infektion gezeigt werden konnte. Nach experimenteller MV-
Infektion des ZNS konnte bei transgenen Mäusen mit C57Bl/6-Hintergrund gezeigt
werden, dass CD4 + T-Zellen als Haupteffektorzellen anzusehen sind. Sie können jedoch
nur im Zusammenspiel mit CD8 + T-Zellen oder B-Zellen ihre Wirkung entfalten (TISHON
et al., 2006). Eine BDV-induzierte Enzephalitis mit Dominanz der CD4 + T-Zellen, wie sie
in der vorliegenden Studie gefunden wurde, entspricht zum einen den Beobachtungen bei
der Ratte (DESCHL et al., 1990), zum anderen erklärt diese möglicherweise den nichtzytolytischen
Verlauf der BD auch bei der Maus. Bisher ist bei Mäusen nur für CD8 + T-
Zellen die Antigenspezifität für BDV-N gezeigt worden (HAUSMANN et al., 1998), für
CD4 + T-Zellen liegen derzeit keine Untersuchungen vor.
Der IL-2 Rezeptor α (CD25) wird von einer Subpopulation der CD4 + T-Zellen exprimiert,
welche über Zell-Zell-Kontakt immunmodulierend wirken (GROUX, 2003; FOUSSAT et
al., 2003). Sie haben sowohl auf CD4 + , als auch auf CD8 + T-Zellen eine starke immunsupprimierende
Wirkung und können in verschiedenen Infektionsmodellen die immunmodulierte
Entstehung von Erkrankungen wie autoimmume gastrits oder inflammatory
bowel disease verhindern (Übersicht bei SHEVACH, 2002). Im peripheren Blut
exprimieren 5-10% der T-Zellen CD25 (FOUSSAT et al., 2003). In den perivaskulären
Infiltraten der in der vorliegenden Studie untersuchten Mäuse aller drei Gruppen waren 16
- 27% der T-Zellen CD25 + , was einer dreifach erhöhten Menge im Vergleich zu den
physiologisch im Blut vorkommenden T-Zellen entspricht. In dem prozentualen Anteil der
CD4 + CD25 + T-Zellen an den CD4 + T-Zellen waren zwischen den ntg Tieren mit geringgradiger
Enzephalitis und den transgenen Mausgruppen mit progressiver und starker
Entzündungsreaktion 42 Tage p.i. keine Unterschiede festzustellen. Inwieweit ihr Anteil
dennoch von Bedeutung für die Pathogenese der murinen BD ist, muss durch gezielte
kinetische Untersuchungen der Entzündungszellpopulationen geklärt werden.
Im Parenchym konnten, insgesamt weniger, aber vor allem CD3 + und CD4 + T-Zellen
nachgewiesen werden. Bei den transgenen Mausgruppen fielen jedoch mehr parenchymal
gelegene Zellen auf als bei ntg Tieren. CD8 + und CD25 + T-Zellen waren nur vereinzelt bei
einem einzigen ntg Tier im Parenchym nachweisbar, B-Zellen waren ausschließlich in den
perivaskulären Infiltraten zu finden. Von der Ratte ist bekannt, dass vor allem die CD8 +
T-Zellen im Parenchym vorkommen, CD4 + T-Zellen waren nur vereinzelt bei der Ratte
außerhalb der Infiltrate zu finden, während B-Zellen in steigender Anzahl disseminiert im
Neuropil vorkamen (DESCHL et al., 1990). Dieser Unterschied im Vergleich zu Ratten

Diskussion 171
deutet möglicherweise auf einen TNF-Effekt hin, der die Auswanderung von CD4 + T-
Zellen ins Parenchym ermöglicht.
Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Studie gezeigt werden, dass 42 Tage p.i.
T-Zellen, und Makrophagen in vergleichbaren Anteilen an den perivaskulären Infiltraten
beteiligt waren. B-Zellen stellen bei ntg Tieren die größte Fraktion der perivaskulären
Zellen dar, bei den transgenen Mausgruppen ist dieser Anteil kleiner als der der T-Zellen
und Makrophagen. Weiterhin wurde deutlich, dass CD4 + T-Zellen den Hauptanteil der T-
Zellen darstellen. Zwischen den drei Mausgruppen ergaben sich, abgesehen von der B-
Zellmenge, keine deutlichen prozentualen Unterschiede, damit zeigt die TNF-
Überexpression einen signifikanten Einfluss auf die Anzahl der Entzündungszellen, nicht
aber auf die qualitative Zusammensetzung der perivaskulären Infiltrate. Möglicherweise
hat die TNF-Überexpression weiterhin einen Effekt auf die CD4 + T-Zellen, der eine
Auswanderung ins Parenchym bewirken kann.
5.5 Nachweis aktivierter Astrozyten und Mikroglia/
Makrophagen
5.5.1 Aktivierte Mikroglia/ Makrophagen
Bei den tg +/+ Mäusen konnte nach BDV-Infektion ab 21. Tag p.i. und bei tg+/- Tieren ab
28. Tag p.i. eine progressive Mikrogliaaktivierung mit Maximum am 42. Tag p.i.
festgestellt werden, die anschließend bis 49 Tage p.i. geringgradig abnahm. Auch adulte
Lewis Ratten zeigen nach BDV-Infektion eine deutliche Mikrogliaaktivierung (DESCHL
et al., 1990; HERDEN et al., 2005). Die ntg BDV-infizierten Tiere der vorliegenden Studie
zeigten über den gesamten Untersuchungszeitraum nur eine geringe Mikrogliaaktivierung.
Dieser deutliche Unterschied zwischen ntg und transgenen Mäusen spricht für einen Effekt
der TNF-Überexpression auf die Mikrogliaaktivierung nach BDV-Infektion. Ob es sich
dabei um eine direkte TNF-Wirkung auf die Mikroglia oder einen indirekten Effekt durch
die stärkere Entzündungsreaktion in beiden transgenen Mausgruppen handelt, kann
abschließend nicht geklärt werden. Es ist bekannt, dass der Phänotyp der in der
vorliegenden Studie eingesetzten TNF-transgenen Mäuse eine geringgradige Mikrogliaaktivierung
in den Gehirngebieten mit der höchsten TNF-Expression aufweist
(MARCHETTI et al., 2004). Eine der Mikrogliaaktivierung nach BDV-Infektion

172 Diskussion
vergleichbare Reaktion war in den transgenen mock-infizierten und transgenen nichtinfizierten
Kontrolltieren nicht nachweisbar, so dass ein sich potenzierender Effekt der
TNF-Expression und der BDV-Infektion nahe liegt. Dieser kann vermutlich auf die
Wirkung weiterer aufregulierter Zytokine im Rahmen der BDV-Infektion zurückgeführt
werden (SAUDER et al., 2000; HATALSKI et al., 1998). Ein Zusammenhang von
Mikrogliaaktivierung mit dem TNF-Level konnte ebenfalls in einer Studie an TNFRknockout
Mäusen festgestellt werden, dabei war durch das fehlende TNF-Signal eine
reduzierte Mikrogliaaktivierung zu beobachten (BRUCE et al., 1996). Auch bei vielen
neurologischen Erkrankungen, bei denen erhöhte TNF-Level beobachtet wurden
beispielsweise Multiple Sklerose, Alzheimer Erkrankung, AIDS-Dementia und anderen
Retrovirus-induzierten Erkrankungen, wie die Retrovirus-Infektion von Mäusen, ist
ebenfalls eine Mikrogliaaktivierung beschrieben (MINAGAR et al., 2002; NELSON et al.,
2002; WILLIAMS und HICKEY, 2002; PETERSON et al., 2004).
Zusammenfassend zeigten beide transgenen Mausgruppen nach BDV-Infektion in der
Umgebung der Entzündungszellinfiltrate eine deutliche, 42 und 49 Tage p.i. signifikant
stärkere Mikrogliaaktivierung als ntg Tiere. Diese Ergebnisse weisen auf eine Korrelation
der Mikrogliaaktivierung mit TNF-Überexpression und BDV-Infektion hin.
5.5.2 Aktivierte Astrozyten
In beiden BDV-infizierten transgenen Mausgruppen wurde ein progressiver Verlauf der
Astrozytenaktivierung beobachtet. Bei BDV-infizierten ntg Tieren war ein wellenförmiger
Verlauf des Nachweises von GFAP-positiven Astrozyten mit zwei Maxima am 21. und 42.
Tag p.i. zu erkennen. Die Astrogliose bei BDV-infizierten ntg Tieren zeigte sich vor allem
in Form einer Hyperplasie der Astrozyten und war geringgradig schwächer ausgeprägt als
in den transgenen Mausgruppen. Dagegen zeigten die transgenen Mausgruppen neben der
Hyperplasie ab 21 Tage p.i. eine deutliche, z.T. ungewöhnliche Hypertrophie mit sehr
großen, geschwollenen Kernen und Anzeichen von Degeneration. Bei tg+/- BDVinfizierten
Mäusen waren ab 14 Tagen p.i. relativ konstant bis 49 Tage p.i. mittelgradig
GFAP-markierte Astrozyten zu finden. Bei tg+/+ BDV-infizierten Tieren konnte ein
Anstieg bis zum Maximum der Astrozytenaktivierung 42 Tage p.i. festgestellt werden. Die
Astrogliose stellt eine unspezifische Reaktion auf einen Insult des ZNS dar (GRAEBER et
al., 2002), welche auch bei Virusinfektionen des ZNS beobachtet wird. Auch bei der BDV-

Diskussion 173
Infektion von adulten Lewis Ratten ist regelmäßig eine Astrogliose zu beobachten
(DESCHL et al., 1990; HERDEN et al., 2000, 2005). Bei BDV-infizierten erkrankten
MRL Mäusen konnten HALLENSLEBEN et al. (1998) keine vermehrte GFAP
Immunreaktion feststellen, obwohl eine Schwellung der Astrozyten beobachtet wurde.
Eine experimentelle Infektion von TNF-knockout Mäusen mit dem EC-Retrovirus konnte
zeigen, dass TNF-knockout Mäuse eine vergleichbare Astrozytenaktivierung wie infizierte
wt-Kontrolltiere aufwiesen. Entweder hatte der TNF-Level keinen Einfluss auf die
Astrozytenaktivierung oder andere Chemokine, wie IL-1, IL-6, SDF-α und RANTES, die
ebenfalls Astrozyten aktivieren können, haben die fehlende TNF-Wirkung kompensiert
(PETERSON et al., 2004). In einer weiteren Studie konnten BALASINGAM et al. (1996)
zeigen, dass nach chronischer Irritation des ZNS durch Implantation einer Nitrozellulose
Membran eine Korrelation zwischen der Mikrogliaaktivierung und der Astrozytose vorlag.
Eine gegenseitige Beeinflussung der Mikrogliaaktivierung und Astrogliose erscheint auch
bei den transgenen BDV-infizierten Mäusen der vorliegenden Studie möglich.
Die fokale kortikale Astrogliose eines mock-infizierten Tieres 7 Tage p.i., sowie je eines
BDV-infizierten ntg und tg+/- Tieres ebenfalls 7 Tage p.i., ist wahrscheinlich als Reaktion
auf die Injektion einzustufen.
Zusammenfassend fand sich in allen drei Mausgruppen eine Astrogliose, wobei die
transgenen Mäuse eine deutlich z.T. signifikant stärkere Reaktion zeigten als ntg Tiere.
Daneben fielen in beiden transgenen Mausgruppen ab 21 Tagen p.i. ungewöhnlich
hypertrophe Astrozyten auf. Damit zeigt sich ein deutlicher Einfluss der TNF-
Überexpression auf die Anzahl als auch die Morphologie der Astrozyten, welcher
möglicherweise über gesteigerte Zytokinlevel, die Entzündungsreaktion oder die verstärke
Mikrogliaaktivierung induziert ist.
5.6 Serologie
Die Bestimmung BDV-spezifischer Serumantikörper zeigte deutliche individuelle
Schwankungen innerhalb der Gruppen und untersuchten Zeitpunkte p.i. Erste Nachweise
von spezifischen Antikörpern waren 35 Tage p.i. möglich. Die Ergebnisse deuten auch auf
einen Titeranstieg im Verlauf der BDV-Infektion hin. 49 Tage p.i. waren Titer bis zu
1:5120 nachweisbar. Bei den tg+/+ Tieren fielen relativ viele negative Ergebnisse auf. Bei

174 Diskussion
Lewis Ratten werden regelmäßig hohe Serumantikörpertiter gefunden, je nach verwendeter
Viruspräparation konnten die Antikörper ab 8 Tagen p.i. (DESCHL et al., 1990; HERDEN
et al., 2000) bzw. 15 bis 20 Tagen p.i. (NARAYAN et al., 1983b; HERDEN et al., 2000)
detektiert werden. Bei Mäusen konnte gezeigt werden, dass das Auftreten der spezifischen
Antikörper auch von der applizierten Viruspräparation abhängig ist und die Antikörper bei
der Verwendung einer mausadaptierten Viruspräparation ab 21 Tagen p.i. auftraten
(ENGBERGS et al., 2001). In wieweit die negativen Ergebnisse der Serologie bei tg+/+
Tieren eventuell mit einer geringeren peripheren B-Zell-Anzahl entsprechend der
immunhistologischen Ergebnisse im Gehirn zusammenhängen, muss durch weitere
Untersuchungen geklärt werden.
5.7 Histologische Untersuchung und Nachweis von BDV-
spezifischen Protein und RNA in den Augen
Ab 7 Tagen p.i. war in allen BDV-infizierten Mausgruppen BDV-N in Ganglienzellen,
sowie der inneren plexiformen Schicht und der inneren Körnerschicht zu finden. Ab 28
Tagen p.i. war in allen drei BDV-infizierten Mausgruppen BDV-N in allen retinalen
Schichten zu finden. BDV-M konnte 28 Tage p.i. in Ganglienzellen, der inneren
plexiformen Schicht und inneren Körnerschicht gefunden werden. Dagegen war BDV-GP
in allen drei Mausgruppen in der Retina nicht nachweisbar. Auch in Ratten kann BDV-N in
der Retina etwa ab 14 Tagen p.i. nachgewiesen werden (HERZOG et al., 1984;
NARAYAN et al., 1983a,b). In einer anderen Studie war der erste Nachweis von BDV-N
in der Retina von Lewis Ratten 20 Tage p.i. möglich (MORLAES et al., 1988).
Untersuchungen zu der Verteilung anderer viraler Proteine in der Retina liegen derzeit
nicht vor.
Alle untersuchten viralen RNAs waren ab 14 Tagen p.i. vor allem in der
Ganglienzellschicht und der inneren Körnerzellschicht zu finden. 42 Tage p.i. waren bei
einzelnen Tieren alle viralen RNAs in allen retinalen Schichten zu finden. Dieses lässt auf
eine aktive virale Replikation und Transkription auch in der Retina schließen. Die
Virusausbreitung in die Retina fand in allen drei Mausgruppen gleichartig statt und
verdeutlicht, dass auch bei Mäusen eine zentrifugale BDV-Ausbreitung entlang des N.
opticus stattfindet. Die TNF-Überexpression zeigte keinen Einfluss auf die Virus-

Diskussion 175
ausbreitung ins Auge. Die Translation der viralen Proteine scheint wie im Gehirn geregelt
zu sein.
Histologisch konnten keine entzündlichen Veränderungen festgestellt werden. Dies steht
im Gegensatz zu den Beobachtungen an BDV-infizierten Ratten, bei denen ab 20. Tag p.i.
mononukleäre Entzündungszellinfiltrate um retinale Gefäße nachgewiesen werden, die im
weiteren Verlauf zu einer progressiven Degeneration der Retina und konsekutiver
Blindheit führen (NARAYAN et al., 1983a,b; GOSZTONYI und LUDWIG, 1995; STAHL
et al., 2003). Bei Pferden wird in der akuten BD auch regelmäßig Blindheit beobachtet,
wobei jedoch keinerlei entzündliche Reaktion in der Retina gefunden werden kann, obwohl
Virus nachweisbar ist (BILZER et al., 1996; HERDEN et al., 1999). Die Erblindung der
Pferde wird dabei auf entzündliche Infiltrate in zentralen Sehbahnen zurückgeführt. Die
Mäuse der vorliegenden Studie zeigten trotz Virusproteinexpression und Nachweis viraler
RNA in der Retina klinisch keine Hinweise auf eine Erblindung.

Zusammenfassung 177
6 Zusammenfassung
Experimentelle Infektion von TNFα-transgenen Mäusen mit dem Virus der
Bornaschen Krankheit – Charakterisierung der Entzündungsreaktion und der
Virusreplikation
Katharina Kramer
Es war Ziel dieser Arbeit, den Einfluss des proinflammatorischen Zytokines Tumor
Nekrose Faktor-α (TNF) auf die Klinik, Entzündungsreaktion und Virusausbreitung nach
experimenteller Infektion von Mäusen mit dem neurotropen Virus der Bornaschen
Krankheit (BDV) zu untersuchen. Dazu wurden TNF-transgene Mäuse mit einer
moderaten neuronalen TNF-Überexpression und nicht-transgene Tiere gleichen
genetischen Hintergrunds neonatal mit einer mausadaptierten BDV-Präparation
intrazerebral infiziert. Durch den Einsatz homo- und heterozygot transgener Tiere konnten
unterschiedlich hohe TNF-Level im Gehirn erzeugt und verglichen werden.
Zur Durchführung dieser Studie wurde zunächst die Comparative Quantitation real time-
Polymerase Kettenreaktion etabliert, um die Nachzucht der Mauspopulation in drei
Mausgruppen, nicht-transgen, hetero- und homozygot transgen, einordnen zu können. Die
Tiere wurden wöchentlich klinisch-neurologisch untersucht. Nach der Sektion wurden die
pathohistologischen Veränderungen der Mäusegehirne ausgewertet und immunhistologisch
das virale Nukleoprotein (BDV-N) und Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)-reaktive
Astrozyten dargestellt. An ausgewählten Zeitpunkten wurde die Expression des viralen
Matrix- (BDV-M) und Glykoprotein (BDV-GP) ebenfalls mit Hilfe von Immunhistologie
untersucht. Mittels in situ Hybridisierung und quantitativer Reverser Transkriptase-
Polymerase Kettenreaktion (qRT-PCR) wurde die Verteilung und Anzahl verschiedener
virale RNAs (ssBDV-N, ssBDV-Intron I, ssBDV-GP) analysiert. Weiterhin wurden die
Entzündungszellen in den Gehirnen der BDV-infizierten Mäuse immunhistologisch näher
charakterisiert. Aus nativem Gehirnmaterial wurde infektiöses Virus isoliert und der
Nachweis von virusspezifischen Antikörpern erfolgte serologisch. Abschließend wurde das
Vorhandensein entzündlicher Läsionen und die zentrifugale Ausbreitung des Virus in die
Augen histologisch, immunhistologisch und mittels in situ Hybridisierung untersucht.

178 Zusammenfassung
Zwischen den drei BDV-infizierten Mausgruppen ergaben sich bei den klinischneurologischen
Tests lediglich dezente Unterschiede. Auffällig waren die deutlichen, teils
signifikant geringeren Gewichtszunahmen der BDV-infizierten Tiere im Vergleich zu den
mock-infizierten Mäusen und die geringere Zunahme der transgenen Tiere im Vergleich zu
den nicht-transgenen Tieren. In den Gruppen der transgenen BDV-infizierten Tiere traten
spontane, epileptiforme Krämpfe auf, die bei ntg Mäusen nicht beobachtet wurden. Die
homozygoten transgenen Tiere zeigten diese häufiger und schon ab 21 Tagen post
infectionem (p.i.), während bei den heterozygoten transgenen Mäusen die Krämpfe erst ab
42 Tagen p.i. beobachtet wurden. In allen drei BDV-infizierten Mausgruppen konnte eine
disseminierte Ausbreitung der viralen Proteine BDV-N und BDV-M im Gehirn festgestellt
werden, eine BDV-GP Expression dagegen war nur in einzelnen Neuronen in einigen
Gehirngebieten nachweisbar. Auf Proteinebene konnte hinsichtlich der Ausbreitung,
Zelltropismus und intrazellulärer Lokalisation der Virusantigene zwischen den drei
Mausgruppen kein Unterschied festgestellt werden. Die in situ Hybridisierung (ISH) und
qRT-PCR ergaben hingegen Hinweise auf eine unterschiedliche Regulierung der
Replikation und Ausbreitung des BDV bei nicht-transgenen und transgenen Mäusen. Die
genomische RNA war bei nicht-transgenen Tieren in einer signifikant ansteigenden Anzahl
von Zellen über den Untersuchungszeitraum nachweisbar, wogegen in beiden transgenen
Mausgruppen die Anzahl RNA-haltiger Zellen in diesem Zeitraum nahezu konstant blieb.
Die positiv orientierten RNAs, im wesentlichen die jeweilige virale mRNA, zeigten bei
nicht-transgenen Tieren ebenfalls eine stete Zunahme RNA-haltiger Neurone in der ISH,
während mittels qRT-PCR relativ konstante Kopienzahlen am 21. und 42. Tag p.i.
quantifiziert wurden. Bei beiden transgenen Mausgruppen war hingegen eine nahezu
konstante Anzahl BDV-RNA positiver Zellen zu beobachten, jedoch waren quantitativ
differierende Werte zwischen 21 und 42 Tagen p.i. messbar. Die intrazelluläre Verteilung
der mRNAs gab Aufschluss über potentielle Regulationsmechanismen der Transkription
und zeigte, dass bei Mäusen sowohl ungespleißte als auch gespleißte Virus-RNA aus dem
Zellkern exportiert werden kann. Die Diskrepanz zwischen hoher Trankriptexpression und
restriktiver Expression des Proteins BDV-GP, weißt auf eine Restriktion der Translation
und möglicherweise anteilige Retention der ungespleißten RNA im Zellkern hin. Die
geringen Mengen von Antigenom in allen drei Mausgruppen weisen ebenfalls auf eine
strikte regulierte Virusreplikation hin, was möglicherweise eine der Strategien darstellt

Zusammenfassung 179
über die das BDV eine persistierende Infektion des ZNS etablieren kann. Infektiöses Virus
konnte jedoch aus Gehirnen aller drei Mausgruppen 28 und 49 Tage p.i. isoliert werden.
In Bezug auf die Entzündungsreaktion konnte eine deutliche Korrelation mit dem
transgenen Status der Tiere festgestellt werden. Die nicht-transgenen Tiere zeigten eine
geringgradige Entzündungszellinfiltration ohne Progression im Verlauf der Studie,
dagegen war in beiden transgenen Mausgruppen ein signifikanter Anstieg der
Meningoenzephalitis mit Läsionen vorwiegend in den TNF-exprimierenden Arealen und
korrespondierender Astrogliose und Mikrogliaaktivierung festzustellen. Auffällig waren im
Ammonshorn trotz hoher Transgen-Expression meistens nur dezente
Entzündungszellinfiltrate. Interessanterweise war auch bei den nicht-transgenen BDVinfizierten
Tieren trotz geringer Entzündungszellinfiltration eine deutliche Astrogliose zu
beobachten. Die TNF-Überexpression zeigte zwar einen Einfluss auf die Ausprägung der
Entzündung, nicht aber auf die qualitative Beteiligung der einzelnen
Immunzellpopulationen. Unter den eingewanderten, perivaskulären Entzündungszellen
waren in allen drei Mausgruppen vor allem T-Zellen und Makrophagen sowie B-Zellen zu
finden. Die Klassifizierung der T-Zellen ergab eine 5- bis 7,5-fache Dominanz der CD4 +
gegenüber den CD8 + T-Zellen, unabhängig vom transgenen Status der Tiere. Parenchymal
waren vor allem bei den transgenen Mausgruppen insbesondere einzelne CD3 + und CD4 +
T-Zellen zu finden.
Bei Untersuchung des Auges konnte in allen drei Mausgruppen eine anterograde
Ausbreitung des BDV über den N. opticus in die Retina festgestellt werden, entzündliche
oder degenerative Veränderungen fehlten.
Die vorliegende Studie weist daraufhin, dass eine TNF-Überexpression bei BDVinfizierten
Mäusen epileptiforme Krämpfe induziert. Diese stehen vermutlich mit der
signifikant stärkeren Entzündungsreaktion und korrespondierender Mikrogliaaktivierung
im Zusammenhang. Die TNF-Überexpression hatte jedoch keinen Einfluss auf die
qualitative Zusammensetzung der Entzündungszellinfiltrate. In diesem Mausmodell
ergaben sich Hinweise auf regulierte virale Strategien zur Ausbreitung, Replikation und
Persistenz, die in vergleichbarer Weise bei transgenen und nicht-transgenen Tiere zu
beobachten waren, sich jedoch anhand der generell geringen Anzahl RNA-haltiger Zellen
bei transgenen Tieren unterschieden.

Summary 181
7 Summary
Experimental Infection of TNFα-transgenic Mice with the Borna Disease Virus –
Characterization of the Inflammatory Reaction and Viral Replication
Katharina Kramer
The aim of the study was to analyze the influence of the proinflammatory cytokine tumor
necrosis factor-α (TNF) on the clinical outcome, the inflammatory reaction and the viral
spread of mice experimentally infected with the neurotropic Borna Disease Virus (BDV).
TNF-transgenic mice with a moderate neuronal TNF-overexpression and non-transgenic
neonatal animals with the same genetic background were infected intracerebrally with a
mouse adapted BDV-strain. The influence of different TNF expression levels in mice brain
on the course of BDV-infection was investigated using homo- and heterozygous transgenic
animals.
The comparative quantification real time-polymerase chain reaction was established to
differentiate the mice into the three groups (non-transgenic, hetero- and homozygous
transgenic). Clinical and neurological examinations were carried out weekly. After
necropsy, the mice brains were analyzed for the presence of pathohistological lesions. The
viral nucleoprotein (BDV-N) expression and glial fibrillary acidic protein (GFAP)-reactive
astrocytes were visualized using immunohistochemistry. At selected time points p.i., the
viral matrix- (BDV-M) and glycoprotein (BDV-GP) expression was examined additionally
immunohistochemically. Furthermore, in situ hybridization (ISH) and quantitative reverse
transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis were carried out to study the
distribution and amount of different viral RNAs (ssBDV-N, ssBDV-G, ssBDV-Intron I) in
BDV-infected mice brains of all mice groups. In addition, invading immune cells were
characterized by immunohistochemistry. Infectious virus was isolated from brain tissue
and presence of virus specific antibodies was analyzed serologically. Finally, the
occurrence of inflammatory lesions and centripetal spread of BDV into the eyes was
analyzed using histology, immunohistochemistry and in situ hybridization.
The clinical-neurological examinations revealed only mild differences between the three
mice groups. Notably, significantly lower weight gain was found in BDV-infected nontransgenic
mice compared to mock-infected animals. Furthermore, transgenic mice

182 Summary
displayed a lower weight gain compared to their non-transgenic counterparts. Spontaneous
epileptic seizures were observed exclusively in BDV-infected transgenic animals. These
seizures appeared more frequently in homozygous transgenic mice starting at 21 days post
infection (dpi). In contrast, seizures started at 42 dpi in heterozygous transgenic animals.
The viral proteins BDV-N and BDV-M showed a disseminated distribution within the
brain in all three BDV-infected mice groups, whereas BDV-GP expression was restricted
to few neurons in selected brain areas. On the protein level, no differences between the
mice groups were found with regard to viral spread, cell tropism and subcellular location.
However, in situ hybridization (ISH) and qRT-PCR indicated a regulated replication and
spread of BDV on RNA-level in non-transgenic and transgenic mice. In non-transgenic
animals, the genomic RNA was detected in increasing amounts of cells up to 42 dpi,
whereas both transgenic mice groups showed a constant number of RNA containing cells
over the investigation period. The positive orientated RNAs, mainly the mRNAs encoding
for the different viral proteins, displayed likewise an increase of cells containing RNA in
non-transgenic mice, while the qRT-PCR revealed nearly constant copy numbers 21 and 42
dpi. In contrast, both transgenic mice groups showed nearly constant numbers of cells
containing RNA up to 42 dpi, whereas the qRT-PCR revealed varying quantities at 21 and
42 dpi in both transgenic mice groups. The intracellular mRNA distribution suggested
mechanisms for regulated +ssRNA expression, demonstrating the ability to export
unspliced as well as spliced viral RNA into the cytoplasm in mice brain. The high load of
viral GP mRNA in contrast to low GP-Level indicated a strict regulation of BDV-GP
translation. The low amounts of antigenomic RNA in all three groups displayed a tightly
regulated viral replication. This might be a strategy of BDV to establish persistent infection
in the CNS. However, infectious virus was isolated from mice brains of all three groups.
The inflammatory reaction correlated strongly with the transgene status of the animals.
Non-transgenic mice showed a mild immune cell infiltration without progression during
the investigation period. In contrast, the inflammatory reaction in both TNFoverexpressing
transgenic mice groups caused a progressive severe nonpurulent
meningoencephalitis with astrogliosis and activation of microglia. Despite a high
transgene-expression, only a minimal inflammatory reaction was present in the
hippocampus. Interestingly, an astrogliosis was observed also in non-transgenic mice
despite only mild inflammatory lesions. TNF-overexpression correlated with the degree of
the meningoencephalitis, but not with the qualitative composition of the immune cell

Summary 183
infiltrates. The invading cells consisted mainly of T-cells, macrophages and B-cells. The
characterization of the T-cells revealed a 5- to 7,5-fold higher amount of CD4 + compared
to CD8 + T-cells in perivascular infiltrates regardless of the transgene status. In the
parenchyma, few CD3 + and CD4 + T-cells were found predominantly in transgenic mice. In
all three BDV-infected mice groups, a retrograde viral spread via the N. opticus into the
retina was observed. The virus spread was not associated with inflammatory or
degenerative alterations.
The presented study demonstrated that TNF-overexpression led to epileptic seizures in
BDV-infected transgenic mice, which were associated with a severe inflammatory reaction
and microglial activation. The TNF-overexpression itself did not modify the qualitative
composition of inflammatory infiltrates but only the total number of invading immune
cells. Furthermore, the data indicated tightly regulated viral strategies concerning the viral
spread, replication and persistence which were present comparably in transgenic and nontransgenic
animals, but differed regarding the limited numbers of cells containing viral
RNAs in transgenic mice.

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Anhang 213
9 Anhang
9.1 Tabellen
9.1.1 Klinik
Tab. 17: Vergleich der Krämpfe zwischen den BDV-infizierten Mausgruppen untereinander
p-Werte
Kruskal-
Wallis-Test
Wilcoxon Zwei Stichproben-Test
Krämpfe Tage p.i. global ntg, tg+/- ntg, tg+/+ tg+/-, tg+/+
21 0,2738 — — —
28 1,0000 — — —
35 0,0253 1,0000 0,0468 0,0748
Komplex
42 0,2121 — — —
fokaler Anfall 49 0,3902 — — —
21 1,0000 — — —
28 1,0000 — — —
35 1,0000 — — —
Generalisierter 42 0,0397 1,0000 0,1215 0,0554
Krampfanfall 49 0,3644 — — —
21 0,2738 — — —
28 1,0000 — — —
35 0,0253 1,0000 0,0468 0,0748
Summe der 42 0,0385 0,0887 0,0171 0,1787
Krampfanfälle 49 0,1294 — — —
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse,
tg+/+: homozygot transgene Mäuse, signifikante Unterschiede (p < 0,05), —: nicht durchgeführt
Tab. 18: Vergleich der Krämpfe der BDV-infizierten Mausgruppen im zeitlichen Verlauf
p-Werte
Kruskal-
Wallis-
Test
Wilcoxon Zwei Stichproben-Test
zeitlicher Verlauf
Komplex ntg
global 21–28 Tpi 28–35 Tpi 35–42 Tpi 42–49 Tpi 21–42 Tpi 21–49 Tpi
1,0000 — — — — — —
fokaler tg+/- < 0,0001 1,0000 1,0000 0,0145 0,8867 0,0027 0,0017
Anfall
Gen.
Krampftg+/+
ntg
tg+/-
0,1242
1,0000
0,0518
0,3929
—
—
0,0999
—
—
0,6322
—
—
0,8952
—
—
0,1144
—
—
0,1095
—
—
anfall tg+/+ 0,0042 1,0000 1,0000 0,0753 0,8952 0,0197 0,0097
Summe ntg 1,0000 — — — — — —
Krampf- tg+/- < 0,0001 1,0000 1,0000 0,0145 0,4339 0,0027 0,0002
anfälle tg+/+ 0,0004 0,3929 0,0999 0,0750 0,7431 0,0034 0,0024
Tpi: Tage post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+:
homozygot transgene Mäuse, Gen. Krampfanfall: Generalisierter Krampfanfall, signifikante Unterschiede (p
< 0,05), —: nicht durchgeführt

214 Anhang
Tab. 19: Gewichtsverlauf BDV-infizierter und mock-infizierter Mäuse
Gewicht [g] BDV-infizierte Mäuse mock-infizierte Mäuse
Tage p.i. ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+
n 10 15 8 4 5 4
21 arithm MW 8,68 9,77 8,91 8,10 9,92 10,23
Stdabw 1,22 0,99 0,61 0,42 1,22 0,71
n 10 15 8 4 5 4
28 arithm MW 11,26 12,77 12,09 14,18 15,48 13,75
Stdabw 3,05 1,90 1,45 1,02 1,22 1,13
n 10 15 8 4 5 4
35 arithm MW 15,95 15,93 15,40 19,20 20,16 16,50
Stdabw 3,04 1,89 1,72 1,06 1,10 1,51
n 10 15 6 4 5 4
42 arithm MW 18,50 17,72 16,70 22,03 21,74 17,08
Stdabw 2,40 1,85 1,48 0,52 1,18 1,00
n 5 10 3 2 2 2
49 arithm MW 20,84 18,11 16,03 24,00 24,60 19,10
Stdabw 2,08 2,31 2,11 1,13 0,00 1,27
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot
transgene Mäuse, n: Stichprobenumfang, arithm MW: arithmetischer Mittelwert, Stdabw: Standardabweichnung
Tab. 20: Vergleich des Gewichtsverlauf der BDV- und mock-infizierten Mäuse
p-Werte Varianzanalysen
Tage p.i. < 0,0001
gruppe 0,0031
Infektion < 0,0001
tag*gruppe < 0,0001
tag*Infektion < 0,0001
gruppe*Infektion 0,3511
tag*gruppe*Infektion 0,0217
tag: Tage post infectionem, gruppe: transgen Status
signifikante Unterschiede (p < 0,05)
Tab. 21: Vergleich des Einflusses der Faktoren Zeitpunkt, Infektion und transgen Status auf
den Gewichtsverlauf bei BDV- und mock-infizierten Mäusen
p-Werte
Zwei Faktorielle Varianzanalysen
tag*infektion tag*gruppe
BDV ntg ntg tg+/-
Tage p.i. mock tg+/- tg+/+ tg+/+
21 0,5819 0,0429 0,1118 0,7377
28 < 0,0001 0,0297 0,7849 0,0634
35 < 0,0001 0,4588 0,0291 0,0030
42 < 0,0001 0,5194 < 0,0001 < 0,0001
49 < 0,0001 0,1551 < 0,0001 < 0,0001
tag: Tage post infectionem, gruppe: transgen Status, signifikante Unterschiede (p < 0,05)

Anhang 215
Tab. 22: Vergleich des Einflusses der Faktoren Infektion und transgen Status auf den
Gewichtsverlauf bei BDV- und mock-infizierten Mäusen
p-Werte
mock
Zwei Faktorielle Varianzanalysen
transgen*infektion
BDV ntg tg+/- tg+/+
ntg 0,0043 0,9609 0,0924
tg+/- 0,4800 0,0935 0,0783
tg+/+ 0,0329 0,0043 0,0002
ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse,
tg+/+: homozygot transgene Mäuse, signifikante Unterschiede (p < 0,05)
Tabelle 23: Vergleich der Gewichtsentwicklung bei BDV- und mock-infizierten Mäusen
p-Werte Paarweise Einzelvergleiche, T-Test
BDV- mit mock-infizierten Mäusen
Tage p.i. ntg tg+/- tg+/+
21 0,5716 0,8063 0,2173
28 0,0051 0,0089 0,1188
35 0,0019 < 0,0001 0,3007
42 0,0008 < 0,0001 0,6747
49 0,0025 < 0,0001 0,0227
BDV-infizierte Mäuse untereinander
ntg tg+/-
Tage p.i. tg+/- tg+/+ tg+/+
21 0,1832 0,7772 0,3343
28 0,0229 0,3148 0,2581
35 0,9282 0,5036 0,4429
42 0,4215 0,0283 0,1288
49 0,0232 < 0,0001 0,0166
mock-infizierte Mäuse untereinander
ntg tg+/-
Tage p.i. tg+/- tg+/+ tg+/+
21 0,1191 0,0846 0,7929
28 0,2626 0,7286 0,1383
35 0,4093 0,0290 0,0020
42 0,8062 < 0,0001 0,4203
49 0,8001 0,0005 0,0009
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-:
heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene
Mäuse, signifikante Unterschiede (p < 0,05)

Tab. 24: Ergebnisse der klinischen Untersuchungen der BDV-infizierten Mäuse
BDV- Tage p.i. 21 28 35 42 49
infiziert Gruppe ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+
n 5 6 4 5 5 5 5 6 5 5 5 5 5 10 3
Aktivität Median 0 0 0 0 0 0,25 0 0 0 0 -0,25 0 0 0 -0,5
Max/ Min 0/0 0,5/0 1/0 0,5/0 1/0 1/-0,5 0,5/0 0/-0,5 1/0 0/0 0/-0,5 0/0 0,5/0 0,5/-1 1,5/-2
Gitter Median 0 0 0 0 1,5 1,5 0 0 0 1 1 1,75 2 2 2
Max/ Min 1/0 1/0 0/0 2/0 2/0 2,5/0 1/0,5 1,5/0 3/0 2/1 2/0 2,5/0 3/0 2,5/1 3/1,5
Plexiglas Median 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ▲ 0 0 1,5 ▲ 0 0 1 ▲
Max/ Min 0/0 0/0 0/0 1/0 1/0 1/0 1/0 0/0 2/0 1/0 0/0 3/0 3/0 1/0 3/0
Stab Median 0 n.d. 0,25 0 0 0,5 1 1,5 1,25 1 0,5 1 1 0,66 n.d.
Max/ Min 0/0 0/0 0,5/0 0,5/0 0,5/0 2/0 2/0 2/0,5 2/0,5 1/0 2/0 1/0,5 4/0 2/0 0/0
Hängtest arith. MW 14,8 6 15 14,4 8,8 17,4 15,6 20,5 24 12,6 17,7 68,5 12,8 22 46
Gesamtzeit
[s] Stdabw 7,8 — — 7,7 5,0 20,8 5,4 24,6 19,5 7,5 6,8 41,7 13,1 30,8 36,8
Radlauf deskriptiv 4b 4b 4b 2-4b 4b 4b 4b 2-4b 4b 4b 2-4b 4b 2-4b 4b 4b
a a a-wa wa a a a wa a-wa a-wa, a-wa a a a a
Provokations Median 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
proben Max/ Min 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Reflexe Median 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Max/ Min 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Aufrichtungs- Median 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
reaktion Max/ Min 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Tischkantenp Median 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
robe Max/ Min 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Fell/ Median 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Haltung Max/ Min 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, n: Stichprobenumfang, Max/ Min:
maximaler/ minimaler Wert, arithm. MW: arithmetischer Mittelwert, Stdabw: Standardabweichung, Score: Aktivität: -3 bis +3, Lauf auf dem Gitter/ Plexiglas: 0 bis 3,
▲: ein Tier geringgradige Ataxie (Hausmann Score=1), Balancieren auf einem Stab: 0 bis 4, Hängtest: arithmetischer Mittelwert der Gesamtzeit, Beurteilung Radlauf:
4b: vierbeinig, 2-4b: vierbeinig, teilweise Hochziehen mit den Vordergliedmaßen, a: aktiv, wa: wenig aktiv, : einzelne Tiere der Gruppe geringgradig unsicher, Score
Provokationsproben und Reflexe: -2 bis 2, Aufrichtereaktion und Tischkantenprobe: 0-2
216 Anhang

Tab. 25: Ergebnisse der klinischen Untersuchungen der mock-infizierten Mäuse
mock- Tage p.i. 21 28 35 42 49
infiziert Gruppe ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+
n 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 2 2 2 2 2
Aktivität Median 0 -0,25 0,5 0,25 0,5 0 -0,25 1 0,5 0 0 0,5 0 0 -0,25
Max/ Min 0/0 0/-0,5 0,5/0,5 0,5/0 1/0 0/0 0/0 1/0 1/0 1/0 0/0 1/0 0/0 0/0 0/-0,5
Gitter Median 1,25 1 1 1 0,5 0 0 0 1 1 0 0,5 0 0,5 0
Max/ Min 1,5/1 1/1 1/1 1/1 1/0 0/0 1/0 1/0 1,5/1 1/0 0/0 1/0 0/0 1/0 0/0
Plexiglas Median 0 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Max/ Min 0/0 1/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Stab Median 0 0,25 0 0 0,5 0,25 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Max/ Min 0/0 0,5/0 0/0 0/0 0,5/0,5 0,5/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Hängtest arith. MW 9 16,5 5 21,5 16 18 32 13 41,7 12 5,3 24,5 10 13,5 21,5
Gesamtzeit
[s] Stdabw 8,5 19,1 — 23,3 14,1 21,2 33,9 10,1 40,1 1,4 2,1 4,9 4,2 9,2 26,2
Radlauf deskriptiv 4b 4b 4b 4b 2-4b 4b 4b 4b 4b 4b 4b 4b 4b 4b 4b
a wa a a a a a a wa a a a a a wa
Provokations Median 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
proben Max/ Min 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Reflexe Median 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Max/ Min 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Aufrichtungs- Median 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
reaktion Max/ Min 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Tischkantenp Median 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
robe Max/ Min 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Fell/ Median 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Haltung Max/ Min 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, n: Stichprobenumfang, Max/ Min:
maximaler/ minimaler Wert, arithm. MW: arithmetischer Mittelwert, Stdabw: Standardabweichung, Score: Aktivität: -3 bis +3, Lauf auf dem Gitter/ Plexiglas: 0 bis 3,
▲: ein Tier geringgradige Ataxie (Hausmann Score=1), Balancieren auf einem Stab: 0 bis 4, Hängtest: arithmetischer Mittelwert der Gesamtzeit, Beurteilung Radlauf:
4b: vierbeinig, 2-4b: vierbeinig, teilweise Hochziehen mit den Vordergliedmaßen, a: aktiv, wa: wenig aktiv, : einzelne Tiere der Gruppe geringgradig unsicher, Score
Provokationsproben und Reflexe: -2 bis 2, Aufrichtereaktion und Tischkantenprobe: 0-2
Anhang 217

218 Anhang
Tab. 26: Vergleich der klinischen Untersuchungsergebnisse der BDV-infizierten Mausgruppen
untereinander
p-Werte Aktivität Gitter Plexiglas Stab
Wilcoxon Zwei Stichproben-Test
Kruskal- Kruskal- Kruskal- ntg ntg
Kruskal-
Tage p.i. Wallis-Test Wallis-Test Wallis-Test tg+/- tg+/+ tg+/- tg+/+ Wallis-Test
21 0,5790 0,6086 1,0000 — — — 0,1573
28 0,9703 0,7071 0,7558 — — — 0,3184
35 0,1816 0,7297 0,5238 — — — 0,9555
42 0,1108 0,4391 0,0389 0,4237 0,1056 0,0416 0,9281
49 0,7280 0,7877 0,4326 — — — 0,3501
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot
transgene Mäuse, signifikante Unterschiede (p < 0,05), —: nicht durchgeführt
Tab. 27: Vergleich der klinischen Untersuchungsergebnisse der BDV-infizierten nichttransgenen
mit mock-infizierten nicht-transgenen Mäusen
p-Werte Wilcoxon Zwei Stichproben-Test
Tage p.i. Aktivität Gitter Plexiglas Stab
21 1,0000 0,1336 1,0000 1,0000
28 1,0000 0,8308 0,7518 0,7237
35 0,1949 0,3340 0,7518 0,1514
42 0,3017 0,1719 0,6056 0,1175
49 0,7518 0,1595 0,4687 0,1595
p.i.: post infectionem
Tab. 28: Vergleich der klinischen Untersuchungsergebnisse der BDV-infizierten heterozygot
transgenen mit mock-infizierten heterozygot transgenen Mäusen
p-Werte Wilcoxon Zwei Stichproben-Test
Tage p.i. Aktivität Gitter Plexiglas Stab
21 0,1904 0,0759 0,1489 —
28 0,8257 0,1555 0,4624 0,1876
35 0,0641 1,0000 1,0000 0,0416
42 0,4017 0,2801 1,0000 0,4113
49 0,8611 0,0715 0,5445 0,2108
p.i.: post infectionem, signifikante Unterschiede (p < 0,05),
—: nicht durchgeführt

Anhang 219
Tab. 29: Vergleich der klinischen Untersuchungsergebnisse der BDV-infizierten homozygot
transgenen mit mock-infizierten homozygot transgenen Mäusen
p-Werte Wilcoxon Zwei Stichproben-Test
Tage p.i. Aktivität Gitter Plexiglas Stab
21 0,6926 0,1336 1,0000 1,0000
28 0,8057 0,0732 0,4624 0,5338
35 0,3894 0,5224 0,6056 0,2207
42 0,4142 0,4677 0,2188 0,1281
49 1,0000 0,2128 0,3329 0,6386
p.i.: post infectionem
Tab. 30: Vergleich der Ergebnisse des Hängtests von BDV-infizierten Mausgruppen
untereinander und mit den mock-infizierten Mäusen
Kruskal-Wallis- Wilcoxon Zwei Stichprobenp-Werte
Test Test
BDV BDV — mock
Tage p.i. global ntg tg+/- tg+/+
21 0,4514 0,6386 1,0000 —
28 0,5638 0,8451 1,0000 0,5582
35 0,6247 1,0000 0,7937 0,5959
42 0,0856 0,8465 0,0809 0,2453
49 0,3186 0,6959 1,0000 0,6985
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse,
tg+/+: homozygot transgene Mäuse, —: nicht durchgeführt

220 Anhang
9.1.2 Charakterisierung der Virusreplikation
9.1.2.1 Nachweis viraler Proteine
Tab. 31: Ergebnisse der BDV-N Immunhistologie
BDV-N (Bo18) BDV-infizierte Mäuse mock-infizierte Mäuse nicht-infizierte Kontrolltiere
Tage p.i. ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+
n 3 4 4 2 2 2 3 3 0
7
Median
Max
0,5
0,5
0,5
1,0
0,5
0,5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
—
—
Min 0,5 0,5 0,5 0 0 0 0 0 —
n 4 4 4 2 2 2 2, (1) 0, (2) 2, (1)
14
Median
Max
1,8
2,5
1,5
2,0
1,5
2,0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Min 1,0 1,0 0,5 0 0 0 0 0 0
n 3 5 5 2 2 2 3 3 4
21
Median
Max
2,3
2,5
2,5
3,0
2,0
2,5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Min 2,0 1,5 2,0 0 0 0 0 0 0
n 4 5 4 2 2 2 2, (1) 1, (2) 3
28
Median
Max
2,0
2,0
2,0
3,0
2,0
2,0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Min 2,0 2,0 1,5 0 0 0 0 0 0
n 5 4 3 2 2 2 2 4 4
35
Median
Max
2,5
3,0
3,0
3,0
2,0
2,0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Min 2,5 2,5 1,5 0 0 0 0 0 0
n 3 4 3 2 2 2 1, (3) 1, (3) 1, (3)
42
Median
Max
2,5
3,0
2,0
2,5
3,0
3,0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Min 2,5 1,5 2,0 0 0 0 0 0 0
n 4 7 3 2 2 2 4 3 5
49
Median
Max
2,5
3,0
2,5
3,0
2,0
2,0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Min 2,0 2,0 2,0 0 0 0 0 0 0
Semiquantitative Auswertung (0: kein, 1: ggr, 2 mgr, 3: hgr Antigen nachweisbar), p.i.: post infectionem, ntg:
nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, n:
Stichprobenumfang, Max: maximaler Wert, Min: minimaler Wert, (n): Anzahl der Tiere, bei denen in der in situ
Hybridisierung kein Virus nachweisbar war, daher wurde die BDV-N Immunhistologie nicht durchgeführt,
—: keine Daten

Anhang 221
Tab. 32: Ergebnisse der BDV-M- und BDV-GP-Immunhistologie
BDV-infizierte Mäuse BDV-M BDV-GP
Tage p.i. ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+
n 3 3 3 3 3 3
28
Median
Max
2,0
2,5
2,5
2,5
2,0
2,0
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
Min 2,0 2,0 2,0 0,5 0,5 0,5
Semiquantitative Auswertung (0: kein, 1: ggr, 2 mgr, 3: hgr Antigen nachweisbar), p.i.: post infectionem,
ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, n: Stichprobenumfang,
Max: maximaler Wert, Min: minimaler Wert
Tab. 33: Vergleich der Ergebnisse der BDV-Immunhistologie der BDV-infizierten Mausgruppen
untereinander
p-Werte
Kruskal-
Wallis-Test
Wilcoxon Zwei Stichproben-Test
Tage p.i. ntg, tg+/- ntg, tg+/+ tg+/-, tg+/+
7 0,4169 — — —
14 0,8540 — — —
BDV-N
(Bo18)
21
28
35
0,5307
0,2592
0,0399
—
—
0,1573
—
—
0,0877
—
—
0,0640
42 0,1373 — — —
49 0,0722 — — —
BDV-M 28 0,2636 — — —
BDV-GP 28 1,0000 — — —
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot
transgene Mäuse, BDV-N: BDV-Nukleoprotein, BDV-M: BDV-Matrixprotein, BDV-GP: BDV-Glykoprotein,
statisch signifikante Unterschiede (p < 0,05), —: nicht durchgeführt
Tab. 34: Vergleich der Ergebnisse der BDV-Immunhistologie zum Nachweis der verschiedenen
viralen Antigenen bei den einzelnen BDV-infizierten Mausgruppen
p-Werte
Kruskal-
Wallis-Test
BDV-N,
Wilcoxon Zwei Stichproben-Test
BDV-M, BDV-N, BDV-N, BDV-M,
Gruppen BDV-GP BDV-M BDV-GP BDV-GP
global — 0,2662 < 0,0001 0,0001
ntg 0,0302 0,5050 0,0469 0,0593
tg+/- 0,0533 1,0000 0,0593 0,0593
tg+/+ 0,0302 0,5050 0,0593 0,0469
ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse,
BDV-N: BDV-Nukleoprotein, BDV-M: BDV-Matrixprotein, BDV-GP: BDV-Glykoprotein,
signifikante Unterschiede (p < 0,05), —: nicht durchgeführt

222 Anhang
9.1.2.2 Nachweis viraler RNA im Gehirn
Tab. 35: Ergebnisse der in situ Hybridisierung zum Nachweis von ssBDV-N und ssBDV-GP
-ssBDV-N BDV-infizierte Mäuse nicht-infizierte Kontrolltiere
Tage p.i. ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+
n 3 3 3 2 2 1
Median 2 2 2 0 0 0
Max 2 2 2,5 0 0 0
14 Min 1 1 2 0 0 0
n 3 3 3 2 2 0
Median 2,5 2,5 2 0 0 —
Max 3 2,5 2 0 0 —
28 Min 2,5 2 2 0 0 —
n 3 3 3 3 3 3
Median 3 2 2 0 0 0
Max 3 2 2,5 0 0 0
42 Min 3 2 2 0 0 0
-ssBDV-GP
n 3 3 3 2 2 1
Median 2 2 2 0 0 0
Max 2 2 2,5 0 0 0
14 Min 1 1 2 0 0 0
n 3 3 3 2 2 0
Median 2,5 2,5 2 0 0 —
Max 2,5 2,5 2 0 0 —
28 Min 2,5 2 2 0 0 —
n 3 3 3 3 3 3
Median 3 2 2 0 0 0
Max 3 2,5 2 0 0 0
42 Min 3 2 2 0 0 0
+ssBDV-N
n 3 3 3 2 2 1
Median 2 2 2 0 0 0
Max 2 2 2,5 0 0 0
14 Min 1 1,5 2 0 0 0
n 3 3 3 2 2 0
Median 2,5 2,5 2 0 0 —
Max 3 2,5 2 0 0 —
28 Min 2,5 2 2 0 0 —
n 3 3 3 3 3 3
Median 3 2,5 2 0 0 0
Max 3 2,5 3 0 0 0
42 Min 3 2 2 0 0 0

Anhang 223
Fortsetzung Tab. 35: Ergebnisse der in situ Hybridisierung zum Nachweis von ssBDV-N und
ssBDV-GP
+ssBDV-GP
n 3 3 3 2 2 1
Median 2 2 2 0 0 0
Max 2 2 2 0 0 0
14 Min 1 1,5 2 0 0 0
n 3 3 3 2 2 0
Median 2,5 2,5 2 0 0 —
Max 3 2,5 2 0 0 —
28 Min 2,5 2 2 0 0 —
n 3 3 3 3 3 3
Median 3 2 2 0 0 0
Max 3 2 2,5 0 0 0
42 Min 3 2 2 0 0 0
Semiquantitative Auswertung (0: keine Reaktion, 1: ggr, 2 mgr, 3: hgr RNA nachweisbar), p.i.: post infectionem,
ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, -ssBDV-N:
negativ orientierte RNA kodogen für das BDV-Nukleoprotein, +ssBDV-N: positiv orientierte RNA kodogen für
das BDV-Nukleoprotein, -ssBDV-GP: negativ orientierte RNA kodogen für das BDV-Glykoprotein, +ssBDV-
GP: positiv orientierte RNA kodogen für das BDV-Glykoprotein, n: Stichprobenumfang, Max: maximaler Wert,
Min: minimaler Wert, —: keine Daten
Tab. 36: Ergebnisse der in situ Hybridisierung zum Nachweis von ssBDV-Intron I
28 Tage p.i.
BDV-infizierte Mäuse
ntg tg+/- tg+/+
n 3 3 3
-ssBDV-Intron I
Median
Max
2,5
3
2
2
2
2
Min 2 2 2
n 3 3 3
+ssBDV-Intron I
Median
Max
2,5
2,5
2
2
2
2
Min 2 2 2
Semiquantitative Auswertung (0: keine Reaktion, 1: ggr, 2 mgr, 3: hgr RNA nachweisbar), p.i.: post infectionem,
ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, -ssBDV-
Intron I: negativ orientierte RNA kodogen für das BDV- Intron I, +ssBDV- Intron I: positiv orientierte RNA
kodogen für das BDV- Intron I, n: Stichprobenumfang, Max: maximaler Wert, Min: minimaler Wert

224 Anhang
Tab. 37: Vergleich der in situ Hybridisierung der BDV-infizierten Mausgruppen untereinander
p-Werte
Sonde zum
Kruskal-
Wallis Test
Wilcoxon Zwei Stichproben-Test
Tage p.i. Nachweis von global ntg, tg+/- ntg, tg+/+ tg+/-, tg+/+
-ssBDV-N 0,5647 1,0000 0,5050 0,5050
14
+ssBDV-N
-ssBDV-GP
0,3036
0,3041
1,0000
1,0000
0,3017
0,3017
0,3017
0,3017
+ssBDV-GP 0,5580 1,0000 0,5050 0,5050
-ssBDV-N 0,0600 0,3017 0,0593 0,1876
+ssBDV-N 0,0600 0,3490 0,0593 0,1876
28
-ssBDV-GP
+ssBDV-GP
0,0600
0,0600
0,3017
0,3017
0,0593
0,0593
0,1876
0,1876
-ssBDV-Intron I 0,1489 0,3329 0,1967 1,0000
+ssBDV-Intron I 0,1017 0,1876 0,1876 1,0000
-ssBDV-N 0,0302 0,0469 0,0593 0,5050
42
+ssBDV-N
-ssBDV-GP
0,1169
0,0457
0,0593
0,1180
0,1876
0,0593
1,0000
1,0000
+ssBDV-GP 0,0302 0,0469 0,0593 0,5050
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot
transgene Mäuse, -ssBDV-N: negativ orientierte RNA kodogen für das BDV-Nukleoprotein, +ssBDV-N: positiv
orientierte RNA kodogen für das BDV-Nukleoprotein, -ssBDV-GP: negativ orientierte RNA kodogen für das
BDV-Glykoprotein, +ssBDV-GP: positiv orientierte RNA kodogen für das BDV-Glykoprotein, ssBDV-Intron I:
negativ orientierte RNA kodogen für das BDV- Intron I, +ssBDV- Intron I: positiv orientierte RNA kodogen für
das BDV- Intron I, signifikante Unterschiede (p < 0,05)

Anhang 225
Tab. 38: Vergleich der in situ Hybridisierung der BDV-infizierten Mausgruppen im zeitlichen
Verlauf
p-Werte, zeitlicher Verlauf ntg tg+/- tg+/+
Kruskal-
Wallis Test
Wilcoxon
Zwei
Stichproben-
Test
global
14 Tage p.i.
28 Tage p.i.
14 Tage p.i.
42 Tage p.i.
28 Tage p.i.
42 Tage p.i.
+ssBDV-N 0,0319 0,1409 0,5580
-ssBDV-N 0,0319 0,1101 0,3679
+ssBDV-GP 0,0319 0,1101 0,3679
-ssBDV-GP 0,0319 0,1787 0,5647
+ssBDV-N 0,0722 0,1573 0,5050
-ssBDV-N 0,0722 0,1573 1,0000
+ssBDV-GP 0,0722 0,1573 1,0000
-ssBDV-GP 0,0722 0,1573 0,5050
+ssBDV-N 0,0593 1,0000 0,1573
-ssBDV-N 0,0593 0,5050 0,5050
+ssBDV-GP 0,0593 0,5050 0,5050
-ssBDV-GP 0,0593 1,0000 0,1876
+ssBDV-N 0,1876 0,5050 1,0000
-ssBDV-N 0,1876 0,5050 0,1876
+ssBDV-GP 0,1876 0,5050 0,1876
-ssBDV-GP 0,1876 0,5050 0,6193
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot
transgene Mäuse, -ssBDV-N: negativ orientierte RNA kodogen für das BDV-Nukleoprotein, +ssBDV-N: positiv
orientierte RNA kodogen für das BDV-Nukleoprotein, -ssBDV-GP: negativ orientierte RNA kodogen für das
BDV-Glykoprotein, +ssBDV-GP: positiv orientierte RNA kodogen für das BDV-Glykoprotein, ssBDV-Intron I:
negativ orientierte RNA kodogen für das BDV- Intron I, +ssBDV- Intron I: positiv orientierte RNA kodogen für
das BDV- Intron I, signifikante Unterschiede (p < 0,05)
Tab. 39: Vergleich der Kopienzahlen in der qRT-PCR auf Unterschiede zwischen den Gruppen
und den Infektionszeitpunkten (tag)
p-Werte General Lineal Model (GLM)
cDNA Gruppe tag Gruppe*tag
+ssBDV-N 0,5800 0,7755 0,1189
+ssBDV-GP 0,6645 0,0300 0,4712
+ssBDV-Intron I 0,1424 0,8511 0,9526
+ssBDV-AG 0,9058 0,0821 0,6053
tag: Tage post infectionem, +ssBDV-N: positiv orientierte RNA kodogen für das BDV-Nukleoprotein, +ssBDV-
GP: positiv orientierte RNA kodogen für das BDV-Glykoprotein, +ssBDV- Intron I: positiv orientierte RNA
kodogen für das BDV- Intron I, +ssBDV-AG: positiv orientiertes BDV-Antigenom, signifikante Unterschiede
(p < 0,05)

226 Anhang
Tab. 40: Vergleich der Kopienzahlen in der qRT-PCR
Tukey’s post-hoc der logarithmisch transformierten Daten
p-Werte
+ssBDV-N +ssBDV-GP
+ssBDV-
Intron I
Tage +ssBDV- +ssBDV- +ssBDV- +ssBDV- +ssBDV- +ssBDV-
Gruppe p.i. GP Intron I AG Intron I AG AG
ntg
21
42
< 0,0001
0,0004
< 0,0001
0,0017
< 0,0001
< 0,0001
0,3768
0,5992
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
tg+/-
21
42
0,0061
< 0,0001
0,0148
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
0,8973
0,0005
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
tg+/+
21
42
0,0027
< 0,0001
0,0044
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
0,7142
0,0906
0,0001
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
p.i.: post infectionem, +ss: positiv strängige RNA, BDV-N: BDV- Nukleoprotein, BDV-GP: BDV-Glykoprotein,
BDV- AG: BDV-Antigenom, signifikante Unterschiede (p < 0,05)
9.1.2.3 Nachweis von Infektiösem Virus im Gehirn
Tab. 41: Exemplarischer Nachweis von infektiösem Virus aus dem Gehirn BDV-infizierter
Mäuse
Indirekter
Immunfluoreszenztest
ntg tg+/- tg+/+
Tier 1 6 x 10 3 6 x 10 3 6 x 10 3
28 Tage p.i.
Tier 2
Tier 1
3
2 x 10
6 x 10
3
2 x 10 —
3 6 x 10 3 49 Tage p.i.
Tier 2 —
3
2 x 10
—
—
Einheit: REB-ID50 ml, p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse,
tg+/+: homozygot transgene Mäuse, —: nicht durchgeführt

Anhang 227
9.1.3 Histopathologische Befunde
Tab. 42: Ergebnisse der histologischen Bewertung der Enzephalitis
HE-Färbung BDV-infizierte Mäuse mock-infizierte Mäuse nicht-infizierte Kontrolltiere
Tage p.i. ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+
n 6 4 4 2 2 2 3 3 0
7
Median
Max
0,3
0,5
0
0,5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
—
—
Min 0 0 0 0 0 0 0 0 —
n 4 4 3 2 2 2 3 2 3
14
Median
Max
0
0,5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Min 0 0 0 0 0 0 0 0 0
n 4 5 5 2 2 2 3 4 4
21
Median
Max
0,8
1
0,5
1
1
3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Min 0 0 0,5 0 0 0 0 0 0
n 4 6 4 2 2 2 3 3 3
28
Median
Max
0,5
1
0,8
1,5
1,5
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Min 0 0 1 0 0 0 0 0 0
n 4 5 3 2 2 2 3 4 4
35
Median
Max
0,5
1
1
3
2
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Min 0,5 0,5 2 0 0 0 0 0 0
n 4 4 3 2 2 2 4 4 3
42
Median
Max
0,5
0,5
2
2,5
2,5
3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Min 0 1 2,5 0 0 0 0 0 0
n 4 6 3 2 2 2 3 3 5
49
Median
Max
0,5
2
2
3
3
3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Min 0,5 2 2,5 0 0 0 0 0 0
Semiquantitative Auswertung (0: obB, 1: ggr, 2 mgr, 3: hgr Enzephalitis) p.i.: post infectionem, ntg: nichttransgene
Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, n:
Stichprobenumfang, Max: maximaler Wert, Min: minimaler Wert, —: keine Daten

228 Anhang
Tab. 43: Vergleich der Enzephalitiden der BDV-infizierten Mausgruppen untereinander
p-Werte
Kruskal-
Wallis Test Wilcoxon Zwei Stichproben-Test
ntg ntg tg+/-
Tage p.i. global tg+/- tg+/+ tg+/+
7 0,2513 0,5320 0,1416 0,4533
14 0,4169 0,4533 0,5637 1,0000
21 0,1216 0,5186 0,2807 0,0626
28 0,1047 0,7330 0,0864 0,0968
35 0,0563 0,1179 0,0357 0,4240
42 0,0130 0,0256 0,0416 0,0955
49 0,0124 0,0281 0,0416 0,0606
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse,
tg+/+: homozygot transgene Mäuse, signifikante Unterschiede (p < 0,05)
Tab. 44: Vergleich der Enzephalitisstärke der BDV-infizierten Mausgruppen im zeitlichen
Verlauf
zeitlicher Anstieg ntg tg+/- tg+/+
Kruskal-Wallis Test 0,2333 0,0004 0,0024
ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse,
tg+/+: homozygot transgene Mäuse, signifikante Unterschiede (p < 0,05)
Tab. 45: Korrelation der Enzephalitisstärke mit dem Zeitpunkt nach Infektion
Korrelation nach Spearmann
Korrelations Koeffizient 0,36907 0,89040 0,84103
zu % auf Zeitpunkt
zurückzuführen 60,75 94,36 91,71

Anhang 229
9.1.4 Nachweis infiltrierender Entzündungszellen
Tab. 46: Immunhistologische Charakterisierung der perivaskulären Immunzellen
Antigen ntg tg+/- tg+/+
n 2 2 2
CD3 pos Z/ GesamtZ (%), Tier 1 76/ 272 (27,9) 141/ 323 (43,7) 125/ 591 (21,2)
CD3 CD3 pos Z/ GesamtZ (%),Tier 2 25/ 104 (24,0) 56/ 237 (23,6) 109/ 379 (28,8)
arithmetischer Mittelwert [%] 25,99 33,64 24,96
Standardabweichung 2,76 14,16 5,38
n 2 2 2
CD4 pos Z/ GesamtZ (%),Tier 1 38/ 166 (22,9) 197/ 499 (39,5) 64/ 231 (27,7)
CD4 CD4 pos Z/ GesamtZ (%), Tier 2 50/ 166 (30,1) 52/ 169 (30,8) 156/ 414 (37,7)
arithmetischer Mittelwert [%] 26,51 35,12 32,69
Standardabweichung 5,11 6,16 7,05
n 2 2 2
CD8 pos Z/ GesamtZ (%),Tier 1 8/ 141(5,7) 8/ 234 (3,4) 33/ 485 (6,8)
CD8 CD8 pos Z/ GesamtZ (%), Tier 2 4/ 127 (3,2) 50/ 492 (10,2) 5/ 257 (2,0)
arithmetischer Mittelwert [%] 4,41 6,79 4,37
Standardabweichung 1,78 4,77 3,44
n 2 2 2
CD25 pos Z/ GesamtZ (%),Tier 1 21/ 139 (15,1) 5/ 140 (3,6) 15/ 359 (4,2)
CD25 CD25 pos Z/ GesamtZ (%), Tier 2 2/ 116 (1,7) 19/ 190 (10,0) 35/ 550 (15,6)
arithmetischer Mittelwert [%] 8,42 6,79 9,87
Standardabweichung 9,49 4,55 8,04
n 2 2 2
CD45R pos Z/ GesamtZ (%),Tier 1 31/ 63 (49,2) 29/ 199 (14,6) 74/ 428 (5,9)
CD45R CD45R pos Z/ GesamtZ (%), Tier 2 44/ 169 (26,0) 72/ 443 (16,5) 112/ 763 (14,7)
arithmetischer Mittelwert [%] 37,62 23,76 15,98
Mac-1
alpha
Standardabweichung 16,38 13,00 1,85
n 2 2 2
Mac-1 pos Z/ GesamtZ (%),Tier 1 32/ 110 (29,1) 108/ 312 (34,6) 76/ 197 (38,6)
Mac-1 pos Z/ GesamtZ (%), Tier 2 35/ 106 (33,0) 128/ 367 (34,9) 46/ 124 (37,1)
arithmetischer Mittelwert [%] 31,05 34,75 37,84
Standardabweichung 2,78 0,19 1,05
ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, n: Stichprobenumfang,
CD: clusters of differentiation, Oberflächenantigen
Tab. 47: Vergleich der einzelnen Entzündungszellpopulationen an den perivaskulären
Infiltraten
p-Werte gepaarter T-Test
Antigen ntg tg+/- tg+/+
CD4-CD8 0,1383 0,1695 0,1631
CD4-BZ 0,5980 0,1684 0,2293
CD4-M 0,2216 0,9465 0,5342
BZ-M 0,7127 0,0272 0,0164
ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse,
tg+/+: homozygot transgene Mäuse, signifikante Unterschiede (p < 0,05)

230 Anhang
9.1.5 Nachweis aktivierter Astrozyten und Mikroglia/ Makrophagen
9.1.5.1 Nachweis aktivierter Mikroglia
Tab. 48: Mikrogliaaktivierung
Tage p.i. BDV-infizierte Mäuse ntg tg+/- tg+/+
n 6 4 4
7 arithmetischer Mittelwert 0,0 0,0 0,0
Standardabweichung 0,0 0,0 0,0
n 4 4 3
14 arithmetischer Mittelwert 0,0 0,0 0,0
Standardabweichung 0,0 0,0 0,0
n 4 5 5
21 arithmetischer Mittelwert 7,5 1,0 33,1
Standardabweichung 7,6 2,2 33,0
n 4 6 4
28 arithmetischer Mittelwert 0,0 14,9 24,2
Standardabweichung 0,0 23,8 7,9
n 4 5 3
35 arithmetischer Mittelwert 3,6 28,9 30,6
Standardabweichung 5,2 19,6 1,8
n 4 4 3
42 arithmetischer Mittelwert 1,4 57,7 48,1
Standardabweichung 2,8 10,0 7,7
n 4 5 3
49 arithmetischer Mittelwert 1,3 42,3 35,0
Standardabweichung 2,5 10,4 2,6
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse,
tg+/+: homozygot transgene Mäuse, n: Stichprobenumfang

Anhang 231
Tab. 49: Vergleich der Mikrogliaaktivierung der BDV-infizierten Mausgruppen untereinander
p-Werte
Wilcoxon Zwei Stichproben-Test
Kruskal-
Wallis Test ntg ntg tg+/-
Tage p.i. global tg+/- tg+/+ tg+/+
7 1,0000 — — —
14 1,0000 — — —
21 0,0560 — — —
28 0,0297 0,0716 0,0210 0,2395
35 0,0799 — — —
42 0,0184 0,0265 0,0436 0,2159
49 0,0155 0,0179 0,0436 0,2330
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse,
tg+/+: homozygot transgene Mäuse, signifikante Unterschiede (p < 0,05)
Tab. 50: Vergleich der Mikrogliaaktivierung der BDV-infizierten Mausgruppen im zeitlichen
Verlauf und einzelner Zeitpunkte untereinander
p-Werte, zeitlicher Anstieg ntg tg+/- tg+/+
Kruskal-Wallis
Test global 0,0680 0,0007 0,0105
7 — 14 Tpi — 1,0000 1,0000
14 — 21 Tpi — 0,5023 0,0806
21 — 28 Tpi — 0,1956 1,0000
Wilcoxon Zwei
Stichproben-
Test
28 — 35 Tpi — 0,4070 0,3768
35 — 42 Tpi — 0,0373 0,0809
42 — 49 Tpi — 0,1113 0,0809
7 — 49 Tpi — 0,0151 0,0319
21 — 42 Tpi — 0,0151 0,7656
21 — 49 Tpi — 0,0097 0,7656
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse,
tg+/+: homozygot transgene Mäuse, signifikante Unterschiede (p < 0,05), —: nicht durchgeführt

232 Anhang
9.1.5.2 Nachweis aktivierter Astrozyten
Tab. 51: Astrogliose
GFAP BDV-infizierte Mäuse mock-infizierte Mäuse nicht-infizierte Kontrolltiere
Tage p.i. ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+
n 3 4 4 2 2 2 3 3 0
7
Median
Max
0,5
0,5
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
—
—
Min 0,5 0 0 0 0 0 0 0 —
n 4 4 4 2 2 2 3 3 3
14
Median
Max
1
1,5
2
2
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Min 0 1 0,5 0 0 0 0 0 0
n 3 4 5 2 1 2 3 4 3
21
Median
Max
1,5
2
1,5
2
2
2,5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Min 1,5 0,5 2 0 0 0 0 0 0
n 4 4 4 2 2 2 3 3 3
28
Median
Max
0,5
1,5
1,75
2
2
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Min 0,5 1,5 2 0 0 0 0 0 0
n 5 4 3 2 2 2 2 3 3
35
Median
Max
1
2
2
2
2,5
2,5
0
0
0,25
0,5
0,5
0,5
0
0
1
0,5
0,5
0,5
Min 1 2 2 0 0 0,5 0 1 0
n 3 3 3 2 1 2 4 4 3
42
Median
Max
2
2
2
2,5
3
3
0,25
0,5
0
0
1,5
1,5
0
0
0,5
0,5
0,5
1
Min 2 2 2 0 0 1,5 0 0 0,5
n 3 5 3 2 2 2 3 3 4
49
Median
Max
1,5
2
2
3
2
2,5
0,25
0,5
0,25
0,5
0,75
1
0
0
1
1
0,5
0,5
Min 1,5 2 2 0 0 0,5 0 1 1
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot
transgene Mäuse, n: Stichprobenumfang, Max: maximaler Wert, Min: minimaler Wert, —: keine Daten

Anhang 233
Tab. 52: Vergleich der GFAP-Reaktivität BDV-infizierter Tiere untereinander
p-Werte Kruskal-
Wallis-Test Wilcoxon Zwei Stichproben-Test
Tage p.i. global ntg, tg+/- ntg, tg+/+ tg+/-, tg+/+
7 0,0421 1,0000 0,0247 0,0668
14 0,0711 — — —
21 0,1127 — — —
28 0,0139 0,0471 0,0177 0,1814
35 0,0184 0,0400 0,0443 0,1175
42 0,1950 — — —
49 0,1009 — — —
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot
transgene Mäuse, signifikante Unterschiede (p < 0,05), —: nicht durchgeführt
Tab. 53: Vergleich der GFAP-Reaktivität zwischen BDV-infizierten und mock-infizierten
Mäusen eines transgenen Status
p-Werte Wilcoxon Zwei Stichproben-Test
Tage p.i. ntg tg+/- tg+/+
7 0,0956 0,2113 1,0000
14 0,2113 0,0801 0,0801
21 0,1281 0,2765 0,0519
28 0,0801 0,0902 0,0504
35 0,0678 0,0552 0,1281
42 0,1066 0,3458 0,1281
49 0,1386 0,0705 0,1386
p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse,
tg+/+: homozygot transgene Mäuse

234 Anhang
9.1.6 Serologie
Tab. 54: Ergebnisse der serologischen Untersuchungen der mock-infizierten und nichtinfizierten
Kontrolltiere
mock-infizierte Mäuse nicht-infizierte Kontrolltiere
Tage p.i. ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+
21
n
Titer
1 2 2

Anhang 235
9.2 Mäusehaltung
Temperatur (20-24°C)
Luftfeuchte (50-60%)
Zuchtstall (Überdruckbelüftung):
Zuluft (oben) ca. 74 m³/h – 1,0 m³ x Luftwechsel (70-80 m³)
Abluft (unten) ca. 53 m³/h – ca. 30 % weniger als Zuluft
H-Temp (Polysulfonkäfig) Eurostandard : Typ II L 1284L00SUV, 267x207x140 mm,
Nutzfläche 370 cm 2
Infektionsstall (Unterdruckbelüftung):
Zuluft (oben) ca. 60 m³/h – 40% weniger als Abluft
Abluft (unten) ca. 100 m³/h – 1,4 m³ x Luftwechsel (70-80 m³)
H-Temp (Polysulfonkäfig) Eurostandard : Typ III H 1291H00SUV, 425x266x155 mm,
Nutzfläche 800 cm2 Ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest
ssniff R/M-Haltung, V1534-727
ssniff M-Z, Ereich, V1185-000
ssniff bedding ¾ Faser, H1505-05

236 Anhang
9.3 Lösungen und Puffer
9.3.1 Immunhistologie
Citratpuffer (pH 6,0)
2,1 g Citronensäuremonohydrat ad 1000 ml Aqua dest., pH-Wert mit 1 N NaOH auf
6,0 einstellen.
3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochloridlösung (DAB)
0,1 g DAB in 200 ml PBS (pH 7,1) lösen und mischen (Magnetrührer), anschließend
300 µl 30%iges H2O2 hinzugeben, frisch ansetzen.
0,5 %iges H2O2 in Methanol für Paraffinschnitte
3 ml 30 %iges H2O2 in 200 ml Methanol, reinst geben und mischen (Magnetrührer).
Herstellung von Ziegen-Normalserum
Frisches Vollblut einige Stunden im Kühlschrank lagern. Danach Serum abpipettieren
und 30 Minuten bei 190 x g zentrifugieren. Überstehendes Serum erneut abpipettieren
und in einem geeigneten Gefäß für 30 Minuten ins 56°C heiße Wasserbad geben.
Danach portionieren und bis zum Gebrauch bei -20°C einfrieren.
1 normale Natriumhydroxid-Lösung (1 N NaOH)
40 g Natriumhydroxid-Plätzchen in 1 l Aqua dest. lösen.
Phosphat-Puffer ("Phospate buffered saline", PBS), pH 7,1
40,0 g NaCl2
7,8 g Na2HPO4
ad 5000 ml Aqua dest.
9.3.2 In situ Hybridisierung
Alle verwendeten Lösungen und Puffer werden, sofern nicht anders angegeben, autoklaviert
(20 Minuten bei 121°C und 210 kPA) und in ausgebackenen Glaswaren angesetzt.
Prähybridisierungspuffer, Hybridisierungspuffer und deren einzelne Bestandteile werden
nicht autoklaviert.

Anhang 237
Diethylpyrokarbonat (DEPC)-Aqua bidest.
1 ml Diethylpyrokarbonat Reinsubstanz
1000 ml Aqua bidest.
unter einem Abzug über Nacht auf Magnetrührer lösen, anschließend autoklavieren
A. bidest., steril
A. bidest. in sterile, ausgebackene Glasflaschen füllen, autoklavieren
5-Brom-4-Chlor-3-Indol-Phosphat (X-Phosphat, BCIP) 50 mg/ml (Stammlösung)
500 mg X-Phosphat
10 ml 100%iges Dimethylformamid
In Originalpackung ansetzen, Aufbewahrung bei -20°C
0,1 M CaCl2
1 47 CaCl2 (MW 147,02)
100 ml A. bidest., autoklavieren
0,5 M EDTA-Na2, pH 8,0
18,6 g Di-Natrium-EDTA-di-Hydrat (MW 372,31)
ad 60 ml mit DEPC-Aqua bidest auffüllen
mit 5 N NaOH auf pH 8,0 einstellen
auf 100 ml mit DEPC-Aqua bidest. einstellen, autoklavieren
50 x Denhardts
5 g Ficoll
5 g Polyvinylpyrolidone
5 g bovines Serumalbumin
500 ml DEPC-Aqua bidest.
zu je 50 ml aliquotieren und bei -20°C aufbewahren
0,2%iges Glycin in 1 x PBS
1 g Glycin
500 ml 1 x PBS, pH 7,4
Lagerung bei 4°C
0,2 N HCl
50 ml 2 N HCl
450 ml A. bidest.

238 Anhang
Heringssperma-DNA (ssDNA)-Lösung, 10 mg/ml
in Originalpackung ansetzen:
250 mg ssDNA-Lyophilisat + 25 ml Puffer 4, pH 8,0
Aufbewahrung bei 4°C
Hybridisierungspuffer (HB-Mix, steril hergestellt)
16 ml 100%iges Formamid, deionisiert
8 ml 20 x Hybridisierungssalze
3,2 ml 50 x Denhartds
320 µl Heparin
320 µl 10%iges Triton X-100
40 Aliquots zu je 696µl herstellen, Lagerung bei -20°C
im Versuch je Aliquot hinzufügen:
18 µl RNA-Lösung
20 µl Herings-ssDNA-Lösung
80 µl Dextransulfat
RNA-Sonde (2-5 µl/ 100 µl gemäß Protokoll)
20 x Hybridisierungssalze
10 ml 0,5 M EDTA-Na2, pH 8,0
10 ml 0,5 M PIPES, pH 7,0
30 ml 5 M NaCl
1 M MgCl2
20,33 g MgCl2 (Hexahydrat, MW 202,3)
100 ml DEPC-Aqua bidest
steril filtrieren, nicht autoklavieren (MgCl2 fällt sonst aus)
NaCl
5 M: 29,22 g NaCl (MW 58,44)
100 ml DEPC-Aqua bidest.
3 M: 87,66 g NaCl (MW 58,44)
500 ml DEPC-Aqua bidest.
5 N NaOH
20 g NaOH-Plätzchen (MW 40,0)
100 ml A. bidest.

Anhang 239
Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT) 75 mg/ml (Stammlösung)
in Originalpackung ansetzen:
1 g NBT
13,3 ml 70%iges Dimethylformamid (DMF)
Aufbewahrung bei 4°C
4%iges Paraformaldehyd (PFA), pH 7,35-7,4
40 g Paraformaldehyd
1000 ml 1 x PBS, pH 7,4
Mit Atemmaske unter Abzug arbeiten, unter Rühren auflösen bei ca. 60°C, auf pH
7,35-7,4 einstellen, nicht autoklavieren, kann bis zu 4 Wochen aufbewahrt werden
10 x PBS (Phospate buffered saline)-Puffer (Stammlösung)
80,0 g NaCl2
2,0 g KCl
14,4 g Na2HPO4
2,4 g KH2PO4
1 x PBS, pH 7,4 (Gebrauchslösung)
100 ml 10 x PBS
900 ml DEPC-Aqua bidest.
auf pH 7,4 einstellen
1 x PBS + 5 mM MgCl2
100 ml 10 x PBS
5 ml 1 M MgCl2
1000 ml mit DEPC-Aqua bidest.
steril filtrieren
oder im Versuch frisch ansetzen:
6 ml 10 x PBS
300µl 1 M MgCl2
60 ml DEPC-Aqua bidest.
0,5 M Piperazin-N,N’bis[2-ethansulfatsäure] (PIPES), pH 7,0 (steril hergestellt)
8,6575 g PIPES (MW 346,3)
50 ml DEPC-Aqua bidest.
Nicht autoklavieren

240 Anhang
Prähybridiserungspuffer (steril hergestellt)
450 ml 20 x SSC
675 ml 100%iges Formamid, deionisiert
150 ml 50 x Denhardts
210 ml DEPC-Aqua bidest.
Herstellen von 30 Aliquots zu je 49,5 ml, Lagerung bei -20°C
im Versuch je Aliquot hinzufügen:
0,5 ml ssDNA-Lösung (zuvor 5 Minuten bei 95°C inkubieren, anschließend auf Eis
abkühlen)
1,25 ml RNA-Lösung
Puffer 1, pH 7,5
12,11 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan (MW 121,14)
8,77 g NaCl (MW 58,44)
1000 ml A. bidest.
pH unter Abzug mit konzentrierter HCl einstellen
Puffer 3, pH 9,5 (Stammlösung)
12,11 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan (MW 121,14)
5,84 g NaCl (MW 58,44)
1000 ml DEPC-Aqua bidest., auf pH 9,5 einstellen, autoklavieren
im Versuch frisch ansetzen
2,03 g MgCl2 · 6 H2O
200 ml Stammlösung 3
Puffer 4, pH 8,0
1,21 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan (MW 121,14)
0,37 g EDTA-Na2 (MW 372,3)
1000 ml DEPC-Aqua bidest.
Ribonukleinsäure (RNA)-Lösung, 10 mg/ml
in Originalverpackung ansetzen:
250 mg Lyophilisat
25 ml DEPC-Aqua bidest.
Lagerung bei -20°C, nicht autoklavieren
20 x SSC (standard saline citrat), pH 7,0 (Stammlösung)
175,3 g NaCl (MW 58,44)
88,2 Na-Citrat (Tri-Natrium-Di-Hydrat)

Anhang 241
ad 800 ml A. bidest.
mit 1 N HCl auf pH 7,0 einstellen, ad 1000 ml mit A. bidest. auffüllen
2 x SSC + 5 mM EDTA-Na2
50 ml 20 x SSC
5 ml 0,5 M EDTA-Na2
500 ml DEPC-Aqua bidest.
1 M Tris-HCl, pH 8,0
12,11 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan (MW 121,14)
100 ml A. bidest.
pH mit konzentrierter HCl einstellen
Nachfolgende Lösungen werden im Versuch frisch angesetzt
(die Angaben beziehen sich auf eine Standküvette, 60 ml).
Antikörper-Lösung (1:200)
3 ml Puffer 1
31µl normales steriles Schafserum
94µl 10%iges Triton X-100
zusammen vorinkubieren bei 37°C
unmittelbar vor Gebrauch hinzufügen:
15µl Anti-DIG-Antikörper, AP konjugiert
0,25%iges Azetanhydrid in 0,1 M Triethanolamin, pH 7,5
894 mg Triethanolamin
60 ml DEPC-Aqua bidest.
pH auf 7,5 einstellen
150µl Azetanhydrid unmittelbar vor der Inkubation hinzufügen und 60 Sekunden
rühren
Dextransulfatlösung
250 mg Dextransulfat
400µl DEPC-Aqua bidest.
in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß geben und bei 70°C im Wasserbad lösen
Färbelösung (50 ml)
225µl NBT-Stammlösung
175µl X-Phosphat-Stammlösung
12 mg Levamisol

242 Anhang
50 ml Puffer 3
bis zum unmittelbaren Gebrauch abdunkeln
Proteinase K-Lösung (4 µg Prot. K/ml)
1 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0
1 ml 0,1 M CaCl2
60 ml DEPC-Aqua bidest.
zusammen bei 37°C vorinkubieren
unmittelbar vor Gebrauch hinzufügen:
4 µl Proteinase K (15 µg/µl)
(Endkonzentration 4 µg Prot. K/ml Verdaulösung)
Puffer 2 (Blockierungsreagenz)
1,2 ml normales steriles Schafserum
1,8 ml 10%iges Triton X-100
60 ml Puffer 1
RNase-Lösung
10 ml 3 M NaCl
600µl 1 M Tris-HCl, pH 8,0
120µl 0,5 M EDTA-Na2, pH 8,0
49 ml A. bidest.
zusammen bei 37°C vorinkubieren
unmittelbar vor Gebrauch hinzufügen:
15µl Rnase, Dnase frei (Rnase A)
10µl RNase T1
6 x SSC + 45% Formamid, 120 ml
36 ml 20 x SSC
54 ml 100%iges Formamid, nicht deionisiert
30 ml A. bidest.
9.3.3 RNA-Isolierung, RT-PCR, qRT-PCR und Gelelektrophorese
Diethylpyrokarbonat (DEPC)-Aqua bidest.
1 ml Diethylpyrokarbonat Reinsubstanz
1000 ml Aqua bidest.
unter einem Abzug über Nacht auf Magnetrührer lösen, anschließend autoklavieren

Anhang 243
2%iges (w/v) Agarosegel (104,3 cm 3 )
1,82 g Agarose
91 ml 1 x TBE-Puffer
Agarose in TBE-Puffer in der Mikrowelle aufkochen, bis Agarose gelöst ist
(verdampftes Wasser mit Aqua dest. wieder auffüllen), erkalten lassen auf ca. 65°C,
Zugabe von 1,8 µl Ethidiumbromid-Lösung (10 mg/ml), blasenfrei ausgießen und
erstarren lassen
0,2 M EDTA-Na2, pH 8,0
0,4 ml 0,5 M EDTA-Na2-Lösung, pH 8,0
0,6 ml DEPC-Aqua bidest.
Lösungen mischen, autoklavieren
0,5 M EDTA-Na2, pH 8,0
18,6 g Di-Natrium-EDTA-di-Hydrat (MW 372,31)
ad 60 ml mit DEPC-Aqua bidest auffüllen
mit 5 N NaOH auf pH 8,0 einstellen
auf 100 ml mit DEPC-Aqua bidest. Einstellen, autoklavieren
4 M Lithiumchlorid-Lösung
0,5 ml 8 M Lithiumchloridlösung
0,5 ml DEPC-Aqua bidest
10 x TBE-Elektrophoresepuffer (Stammlösung)
108,8 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan (MW 121,14)
55,0 g Borsäure (MW 61,83)
40,0 ml 0,5 M EDTA-Na2, pH 8,0
ad 1000 ml A. bidest., autoklavieren
1 x TBE-Elektrophoresepuffer (Gebrauchslösung)
100 ml 10 x TBE-Puffer
900 ml A. bidest.

244 Anhang
9.4 Bezugsquellen für Chemikalien und Antikörper
ABgene ® Advanced Biotechnologies, Hamburg
Superladder-Low (100bp ladder); SLL-100
Superladder-Low (20bp ladder); SLL-020
6x Type II DNA electrophoresis loading buffer, AB-0594
BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg
CD4-Antikörper, monoklonal Ratte-anti-Maus (L3T4), 550280
CD8b.2-Antikörper, monoklonal Ratte-anti-Maus (Ly-3.2), 553038
CD25-Antikörper, monoklonal Ratte-anti-Maus biotiniliert
(IL-2 Receptor α Chain, p55), 550529
CD45R/B220-Antikörper, monoklonal Ratte-anti-Maus biotiniliert, 553085
Biochrom AG, Berlin
Fetales Bovines Serum (FKS), S0115
Biologo, Dr. Hartmut Schultheiß e.K., Immunbiologische Produkte, Kronshagen
Aszitesflüssigkeit von nicht-immunisierten Balb/cJ Mäusen, CL8100
Biozym Diagnostik GmbH, Hess. Oldendorf
SeaKem ® LE Agarose
CHEMICON ® International, Ltd, Hampshire, United Kingdom
CNPase-Antikörper, monoklonal Maus-anti-CNPase, MAB326
CHV Chemie-Vertrieb, Hannover
Formaldehyd, 37%, 101064
DakoCytomation GmbH (ehemals Dako ® Diagnostik GmbH), Hamburg
ARK TM (Animal Research Kit) Peroxidase, K3954
CD3-Antikörper, polyklonal Kaninchen, A0452
Gliafaserprotein (GFAP)-Antikörper, polyklonal Kaninchen-anti-Rind, Z0334
Target Retrieval Solution (Ready-to-use), S1700
eBioscience, San Diego, CA, USA
Mac-1 alpha- Antikörper, monoclonal anti-Maus, 14-0112
Eurogentec SA, Seraing, Belgien
Synthese der 5’-FAM-3’-TAMRA-markierte Oligonukleotid-Sonden für die PCR
(TaqMan ® -Sonden)

Anhang 245
Hoffmann La Roche, Grenzach-Whylen
Liquemin ® N 25.000 (Heparin-Natrium), G-067741
I. Hecht, Kiel-Hassee
Eukitt ® (Corbit-Balsam)
Invitrogen TM GmbH (ehem. Gibco), Karlsruhe
BHK-21, Glasgow MEM (G-MEM), 21710-025
dNTP Set 100 mM, PCR Grade, 10297-018
RNaseOUT TM Recombinat Ribonuclease Inhibitor, 10777-019
Taq DNA Polymerase, recombinant, 10342-020
TRIzol ® Reagent, 15596-026
Klinik für kleine Klauentiere, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Ziegennormalserum
Machery-Nagel GmbH & Co. KG, Düren
NucleoSpin ® Extract II, 740609.50
Menno Chemie Vertriebsgesellschaft mbH, Norderstedt
Venno TM Vet 1 super
MWG Biotech AG, Ebersberg
Synthese der Primer
PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen
E.N.Z.A. Tissue DNA Mini Kit, 12-3496-02
Qbiogene GmbH, Heidelberg
Formamid, deionisiert 1l, FORMD003
Qiagen GmbH, Hilden
Omniskript RT Kit (50), 205111
RNeasy Mini Kit (50), 74101
RNase-free DNase Set, 79254
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments, vom Schaf, 1093274
DNase I, RNase-free, 776785
Proteinase K 5 ml, 1373196
RNase, DNase-frei 1119915
Rnase T1, 109207

246 Anhang
Roth Carl, GmbH &Co. KG, Karlsruhe
Citronensäure-Monohydrat, 3958,1
Essigsäure-n-butylester (EBE), 4600.7
Ethanol, vergällt, K928.2
Hämalaunlösung sauer nach Mayer, T865.2
Histokit ® , 6638.2
Isopropanol ® , 6640
Methanol, Rotipuran ® , 99,9%, p.a., 4627.6
Tri-Natriumcitrat-Dihydrat p.a. (C6H5Na3O7 · 2 H2O)
Natriumdihyrogenphosphat-Monohydrat (Na2HPO4 · H2O), K300.2
2-Propanol (Isopropanol) 9866.4
Roticlear ® , A538.3
Rotihistol ® , 6640
Roti ® -Histokit II, T160.2
Roti ® -Plast, Gewebeeinbettungsmedium, 6642.6
Rotiprotect ® -Nitrilhandschuhe, P777.1
Trichlormethan/ Chloroform Rotipuran ® , 3313.1
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, TRIS Ultra Qualität, 5429.3
Sakura Finetek Europe B.V., Zoeterwoude, Niederlande
Tissue-Tek ® O.C.T. TM Compound, 4583
SeqLab, Göttingen
Sequenzieren von PCR-Produkten
SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg
Natriumcarbonat p.a., 30181
Ethylendiamin-tetraessigsäure (EDTA) · Na2-Salz · 2 H2O p.a., 11280
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen (ehemals Sigma, Fluka, Riedel de Haën)
Aceton, reinst, 24201
Acetanhydrid, 45830
Bovines Serumalbumin (BSA), A-3059
5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphat (X-Phosphat) 500 mg, B6777
Deoxyribonucleic acid type XIV from Herring testes (ssDNA) 250 mg, D6898
Dextransulfat, Na-salz aus Leuconostoc 10 g, 31403

Anhang 247
3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid Dihydrat purum (DAB) p.a., 32750
Diethylpyrocarbonat (DEPC) 100 ml, 32490
N,N-Dimethylformamid, D4551
Ethidiumbromid-Lösung 10 mg/ml, 10 ml E1510
Ficoll ® 400, F2637
Isopentan (2-Methylbutan), 59075
Kaninchenserum, R4505
Levamisol, L-9756
Lithiumchloroid Lösung 8 M, 50 ml, 62479
β-Mercaptoethanol, 102K0025
Nitro Blue Tetrazolium (NBT) 1 g, N6639
Normales Schafserum, steril, S2263
Paraformaldehyd (PFA), 76240
Piperazin-N,N-bis[2-ethansulfatsäure] di-Natrium Salz (PIPES) 25 g, P3768
Polyvinylpyrrolidone (PVP), P5288
Ribonucleic acid type IV from calf liver, 250 mg, R7250
Stratagene ® Europe, Amsterdam
Brilliant ® SYBR ® Green QPCR Core Reagent Kit, 600546
Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA, über Biologo, Kronshagen
Biotiniliertes Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulin, GAR-b IgG (H+L) BA 1000
Biotiniliertes Maus adsorbiertes Kaninchen-anti-Ratte-Immunglobulin,
RARat-b IgG (H+L) BA 4001
Biotiniliertes Ziege-anti-Maus-Immunglobulin, GAM-b IgG (H+L) BA 9200
Vectastain Elite ABC-Kit, PK-6100
VWR TM International GmbH, Darmstadt (ehemals Merck KGaA, Darmstadt)
Borsäure krist. Reinst, 1.00160
Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2 · 2 H2O), 1.0282.0500
Eosin (gelblich), 1.15935.2500
Formamid p.a., 1.09684.2500
Glycin, p.a., 1.04201.1000
Kaliumchlorid (KCl), p.a., 1.04936.0500
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) p.a., 1.04873.0250

248 Anhang
Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl2 . 6 H2O), 1.05833.1000
di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na2HPO4 . 2 H2O), p.a., 1.06580.1000
Natriumchlorid (NaCl), reinst, 1.06400.1000
Natriumhydroxid-Plätzchen (NaOH) p.a., 1.06498.1000
Natriumhypochlorit-Lösung, 1.05614
Salzsäure (HCl) 1N, 1.09057.1000
Salzsäure (HCl) 2N, 1.09063.1000
Salzsäure 25%, reinst, 1.00312.2500
Trietholamin (TEA), p.a., 1.08379.0250
Triton ® X-100, p.a., 1.08643
Wasserstoffperoxid 30% H2O2 (Perhydrol ® ) p.a., 1.07209.0250
Xylol, reinst, 1.08685
9.5 Bezugsquellen für Geräte und Einmalartikel
Aesulap AG & Co, Tuttlingen
Skalpell, BB084-R
Klinge, BB522
Baby-Metzbaumschere gebogen, BC603-R
Irisschere gerade, BC110
Irisschere gebogen, BC111
Pinzette anatomisch, BD320-R
Pinzette anatomisch, BD215
Pinzette anatomisch gebogen, BD035-R
Pinzette nach Adson, BD222-R
Pinzette nach Graeffe, OC100-R
Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg (ehemals Pharmacia Biotech)
Spektralphotometer GeneQuant TM II
Biometra biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen
Transilluminator, TI 5
Software BioDoc Analyze Version 1.0

Anhang 249
Biozym Diagnostik GmbH, Hess. Oldendorf
Gelbond ® Film, 863748
PCR-Tubes, 0,5 ml, 710910
Safeseal-Tips Premium 10 µl, 693010
Safeseal-Tips Premium 20 µl, 692151
Safeseal-Tips Premium 100 µl, 690066
Safeseal-Tips Premium 200 µl, 692069
Safeseal-Tips Premium 1000 µl, 690079
Brand GmbH & Co KG, Wertheim
Reaktionsgefäße für PCR 0,5 ml, 7805 07
DakoCytomation GmbH (ehemals Dako ® Diagnostika GmbH), Hamburg
DakoCytomation Pen, S 200230-2
Glycergel, Aqueous Mounting Medium, C 056330-2
Eppendorf AG, Hamburg
Eppendorf Zentrifuge, 5415 C
Eppendorf Zentrifuge, 5417 R
Pipette Reference 10 µl, 4910 000.506
Pipette Reference 100 µl, 4910 000.506
Pipette Reference 1000 µl, 4910 000.506
Pipette Research 20 µl, 3111 000.130
Pipette Research 200 µl, 3111 000.157
SafeLock Reaktionsgefäße 1,5 ml, 0030 120.086
SafeLock Reaktionsgefäße 2 ml, 0030 120.094
Gerhard Menzel Glasbearbeitungswerk GmbH & Co. KG, Braunschweig
SuperFrost ® Plus Objektträger, 041300
Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel
Paraffinsteckbad, 1052
Hamilton, Bonaduz, Schweiz
Hamilton-Spritze Modell, 705
Hettich A., Tuttlingen
Kühlzentrifuge Rotina, 48 RC

250 Anhang
Kendro Laboratory Products GmbH, Hanau (ehemals Heraeus Sepatech GmbH,
Osterode)
Heraeus Zentrifuge Labofuge ® A, 2500
Heraeus HeraSafe Sicherheitswerkbank, HS18
Heraeus Minifuge RF
Kreuz Laborgeräte, Reiskirchen
Flachgel-Elektrophoresekammer „Midi“, horizontal, 0030191-00
Gießvorrichtung, 00301911-03
Leica Microsystems Nussloch GmbH, Nussloch
Färbegerät Leica, ST 4040
Marabu Werke GmbH & Co KG, Tamm
Fix-o-gum ® , 2901 17000 VbF A1
Medite Medizintechnik, Burgdorf
Objektträger-Eindeckautomat Promounter, RCM 2000
Memmert GmbH & Co.KG, Schwalbach
Wasserbad, WB22
Wasserbad, WB45
Mettler-Toledo GmbH, Giessen
Laborwaage, PC180
Präzisionswaage LabStyle, 204
MJ Research, Waltham, USA
Peltier Thermal Cycler PTC-200
OMNILAB-Laborzentrum GmbH & Co. KG, Gehrden
Eppendorf Thermomixer comfort
Olympus Deutschland GmbH, Hamburg
Mikroskop IX 70
Premier Biosoft International, vertrieben durch PE Biosystems, Weiterstadt
Beacon Designer 2 TM -Software
Pharmacia Biotech, Freiburg
Spektralphotometer GenQuant 2
Polaroid, Massachusetts, USA
Kamera MP 4

Anhang 251
Sartorius AG, Göttingen
Elektronische Präzisionswaage L310, WL-6006-m88091
Papierfaltenfilter 270 mm Durchmesser, FT-4-303-270
Sarstedt AG & Co, Nümbrecht
Mikrovette CB 300 Z, 16440
Reaktionsgefäße 1,5 ml, 72690
Reaktionsgefäße 2,0, 72695
Stratagene ® Europe, Amsterdam
Mx4000 qPCR Platform
Mx3005 qPCR Platform
Strip tube 8x 0,2 ml Format, 410022
Opitcal cap 8x Strip, 410024
Systec GmbH, Wettenberg
Autoklave, 3850 ELC
Tecniplast Deutschland GmbH, Hohenspeißenberg
SlimLine-Gebläseeinheit, BOXUNCP04
SealSafe-IVC-Systemgestell, 2L96MAC20CA
H-Temp (Polysulfon) Käfig Eurostandard: Typ II L, 1284L00SUV
H-Temp (Polysulfonkäfig) Eurostandard : Typ III H 1291H00SUV
Edelstahl Gitterdeckel, 1284L189
Edelstahl Gitterdeckel, 1290D189
H-Temp SealSafe haube, 1284L452SU
H-Temp SealSafe haube; 1290D452SU
Tränkeflasche 260 ml, ACBT0262
Tränkekappe, ACCP6521
Edelstahl-Kartenhalter, ACPC10575VS
Terumo Europe N.V., Leuven, Belgium
Neolus Einwegkanülen 22-G x 1¼’’ (0,7 x 30 mm) Luer, NN-2232 R
Neolus Einwegkanülen 23-G x 1’’ (0,6 x 25 mm) Luer, NN-2325 R
Neolus Einwegkanülen 24-G x 1’’ (0,55 x 25 mm) Luer, NN-2425 R
Neolus Einwegkanülen 26-G x 1’’ (0,45 x 12 mm) Luer, NN-2623 R

252 Anhang
Thermo Electron GmbH, Dreieich
Shandon Coverplates TM , 72110013
Shandon Sequenza ® Slide Racks (Einsätze für Coverplates), 7331017
Pathcentre (Gewebeeinbettungsapparat)
Paraplast Plus ®
TRIXIE Heimtierbedarf, Jarplund-Weding
Hamsterrad Metall, Durchmesser 11 cm, 6083
Vogel GmbH & Co. Kg, Gießen
Tissue-Tec ® TEC TM 5, Einbettsystem
W. Knittel Glasbearbeitungs GmbH, Braunschweig
Deckgläser (24 x 50 mm)
WDT Wirtschaftsgenossenschaft deutscher Tierärzte eG, Garbsen
Trapanal ® (Thiopental-Natrium)
Ziegra-Eismaschinen GmbH, Isernhagen
Eismaschine, ZBE 70-35
Zeiss, Oberkochen
Zeiss Mikroskop

Anhang 253
9.6 Abkürzungen
Abb. Abbildung
ABC Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex
Acc.-No. GeneBank ® -Accession-Nummer
Aqua dest. Aqua destillata
Aqua bidest. Aqua bidestillata
arith. MW arithmetsicher Mittelwert
as antisense
BD Borna Disease
BDV Borna Disease Virus
BDV-AG BDV-Antigenom
BDV-GP BDV-Glykoprotein
BDV-L RNA abhängige RNA-Polymerase, Large Protein
BDV-M BDV-Matrixprotein
BDV-N BDV-Nukleoprotein
BDV-P BDV-Phophoprotein
BDV-X BDV-X-Protein
bp Basenpaare
Bo18 Antikörper zum Nachweis des BDV-Nukleoprotein
BSA Bovines Serumalbumin
bzw. beziehungsweise
ca.
Calcium
circa
CA1 - CA3 Region CA1-CA3 des Ammonshorns
CC Cortex cerebri
CD cluster of differentiation, Oberflächenantigene
cDNA komplementäre DNA
CNPase 2’,3’-cyclic nucleotide 3’-Phoshodiesterase
Ct threshold cycle
Ca 2+

254 Anhang
DAB 3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid
DEPC Diethylpyrokarbonat
DIG Digoxigenin
DMF Dimethylformamid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxynukleotid
dRN relative Quantität
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
FKS fetales Kälberserum
g Gramm
x g Gravitation
GAPDH Glyzeraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
Gd Gyrus dentatus
GFAP glial fibrillary acidic protein, Saures Gliafaserprotein
ggr geringgradig
GMEM Modifikation von Eagle’s Medium
GOI gene of interest
h Stunden
HB-Mix Hybridisierungsmix
HCl Salzsäure
HE Hämatoxylin-Eosin
hgr hochgradig
HPF high power field, Gesichtsfeld bei 400-facher Gesamtvergrößerung
i.c. intra cerebral
IFNγ Interferon γ
IIFT indirekter Immunfluoreszenztest
IL Interleukin
ISH in situ Hybridisierung

Anhang 255
kb Kilo Basen
kDa Kilo Dalton
Konz. Konzentration
kPa Kilopascal
l Liter
L Leiter
Lsg. Lösung
LV Lateral Ventrikel
M Molarität
Max Maximum
mA MilliAmpere
MBP myelin basic protein
mgr mittelgradig
MHC major histocompatibility complex, Haupthistokompatibilitätskomplex
Min Minimum
ml Milliliter
mm Millimeter
mM Millimol
MM Mastermix
mRNA messengerRNA, Boten-Ribonukleinsäure
MW Molekulargewicht
MV Masernvirus
m 3
Quadratmeter
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
n Anzahl, Stichprobenumfang
nd nicht durchgeführt
N Normalität
NaCl Natriumchlorid

256 Anhang
NaOH Natronlauge
NBT Nitrobluetetratzolium
NES nuclear export signal
NF Neurofilament
NF-κB nukleärer Faktor κB
NGF nerve growth factor
NK natural killer cell, natürliche Killerzelle
NLS nuclear loclization signal
Nr. Nummer
NTC no template control, PCR Negativkontrolle
ntg nicht transgen (wildtyp)
OCT Tissue-Tek ® O.C.T. TM -Compound
ORF open reading frame, offener Leserahmen
OT Objektträger
p Primer
PBS phosphat bufferd saline, Phosphat gepufferte Kochsalzlösung
PCR Polymerase Kettenreaktion
PFA Paraformaldehyd
PHB-Mix Prähybridisierungsmix
p.i. post infectionem, nach Infektion
PIPES Piperazin-N,N’bis[2-ethansulfatsäure]
pmol piko mol
qPCR quantivative Polymerase Kettenreaktion
qRT-PCR quantivative Reverse Transkriptase-Polymerase Kettenreaktion
RNA Ribonukleinsäure
rpm rounds per minute, Umdrehungen pro Minute
RPN ribonucleoprotein complex, aktiver Polymerase-Komplex
RSq RSquared, Abweichung der Standardpunkte von der Standardkurve
RT Reverse Transkriptase

Anhang 257
RV rabies virus, Tollwut Virus
s sense
S1-3 Transkriptions-Initiationsstellen
SNS Schweine-Normalserum
SSC standard saline citrate
ssDNA single strand DNA, Heringssperma-DNA
-ssBDV-N Abschnitt des BDV-Genoms der für das Nukleoprotein kodiert
-ssBDV-GP Abschnitt des BDV-Genoms der für das Glykoprotein kodiert
-ssBDV-Intron I Abschnitt des BDV-Genoms der für das Intron I (Matrixprotein)
kodiert
+ssBDV-AG Antigenom, positive orientierte RNA
+ssBDV-N positive orientierte die für das Nukleoprotein kodiert
+ssBDV-GP positive orientierte die für das Glykoprotein kodiert
+ssBDV-Intron I positive orientierte die für das Intron I (Matrixprotein) kodiert
-ssRNA negativ orientierten RNA (genomische virale RNA)
+ssRNA positive orientierten RNA (Antigenom und mRNA)
Stdabw Standardabweichung
T1-4, t6 Transkriptions-Terminationsstellen,
Tab. Tabelle
Taq Thermus aquaticus
TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer
TBS Tris-buffered saline, Tris-gepufferte Kochsalzlösung
tg +/+ homozygot TNFα- transgen
tg +/- heterozygot TNFα- transgen
Th Thalamus
TNF Tumor Nekrose Faktorα
TNFR Tumor Nekrose Faktor Rezeptor
Tpi Tage post infectionem
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
u.a. unter anderem

258 Anhang
UV Ultraviolett
U Units
V Volt
VCAM-1 vascular adhesion molecule-1
wt Wildtyp
X-Phosphat 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat (BCIP)
z.B. zum Beispiel
ZNS Zentrales Nervensystem
ZS Ziegennormalserum

Danksagung
Zu guter letzt bleibt mir nur noch, mich bei allen herzlich zu bedanken, die zu dem Gelingen
dieser Arbeit beigetragen haben:
Zu allererst möchte ich Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D. für die Überlassung des
interessanten, vielseitigen Themas und die Chance, diese Arbeit in dem Zentrum für
Systemische Neurowissenschaften durchzuführen, danken. Vielen Dank für die Möglichkeit
der Ausbildung in der Pathologie.
Ganz herzlichen danke ich Dr. Christiane Herden für die hervorragende Betreuung und ihre
zügige und äußerst konstruktive Durchsicht des Manuskriptes, ohne die die vorverlegte
deadline nie erreichbar gewesen wäre, die motivierende und sehr freundschaftliche
Arbeitsatmosphäre in unsere Unterarbeitsgruppe Borna.
Bedanken möchte ich mich auch bei Prof. Dr. Andrea Tipold und Prof. Dr. Claudia Grothe,
die als meine Kobetreuerinnnen meine Arbeit begleitet haben, für ihre wohlwollende Kritik.
Prof. Dr. Felix Ehrensperger danke ich für das Interesse an meiner Arbeit und die Übernahme
des externen Gutachtens.
Das Zentrum für Systemische Neurowissenschaften versorgte mich neben der fachlichen
Ausbildung mit der nötigen finanziellen Sicherheit, mein besonderer Dank gilt dem
Sekretariat und Koordinationsreferat des ZSN Kerstin Stark, Dr. Steffi Schwab, Nadja
Bornum und Dr. Dagmar Esser für die gute Betreuung.
Für die initialen Zuchtpaare unsere Mäuse und für zahlreiche konstruktive Gespräche möchte
mich ganz herzlich bei Prof. Dr. Ulrich Eisel bedanken. Lara Marchetti danke ich für die
freundliche Aufnahme in Stuttgart und ihre Geduld mit uns PCR-Anfängern.
Dr. Sibylle Herzog danke ich herzlich für die Virusisolierungen und die Antikörpertiterbestimmug.
Bei Prof. Dr. Wolfgang Garten und Dr. Markus Eickmann möchte ich mich für die hilfreichen
Gespräche bedanken.
Mein Dank gilt dem gesamten Team aus der Pathologie für die freundliche Aufnahme in dem
Institut, insbesondere meinen Kollegen aus dem Großraumbüro.
Meinen Mitbewohnern der „Arbeits- und Wohngemeinschaft Borna“ Dirk Schaudien und
Doris Porombka gilt mein ganz herzlicher Dank für die schönen und die Unterstützung
während der weniger schönen Stunden in unserem gemeinsamen Zimmer, das Korrekturlesen
und dafür, dass immer etwas zu Essen da war. Dirk danke ich im Besonderen für die
freundschaftliche Zusammenarbeit während zahlreicher Stunden bei den Mäusen, in Stuttgart,
im Labor und schließlich für die spontane Hilfe mit der Statistik in letzter Minute, Doris für
die ausdauernde Diskussionsbereitschaft, die Sonden und die Hilfe mit dem
Literaturverzeichnis.
Bei Nicole Werner-Keišs möchte ich mich für die Sonden und Dorothee Algermissen für die
Unterstützung bei der Durchführung der ISH bedanken.
Bedanken möchte ich mich besonders bei Heinz Theobald für die gewissenhafte Versorgung
unsere Mäuse.

Danksagung
Danuta Waschke bin ich sehr dankbar für ihre ausgezeichnete Hilfe im ISH-Labor, Petra
Grünig für die wertvolle Hilfe bei der Immunhistologie und Julia Schirmer, Claudia
Herrmann und Bettina Buck für die vielen Paraffinschnitte.
All meinen Freunden möchte ich ganz besonders für ihr Verständnis und alle die aufbauenden
Worte danken.
Ganz herzlicher Dank gebührt Christiane Krudewig für ihre Unterstützung in allen Phasen der
Arbeit und nicht zu letzt für Saumur, der mir so oft den Kopf frei töltete.
Katrin Schulze und Heike Duisberg danke ganz besonders ich für die stets offenen Ohren,
guten Ratschläge und die gewissenhaften Korrekturen der Diss.
Ein herzliches Dankeschön gebührt Yann Igel für die vielen, leckeren Mahlzeiten an den
langen, arbeitsreichen Wochenenden.
Vielen Dank auch an Axel Hacke für die kleine sprechende Zahnbürste, die Doris, Björn und
mich so oft zum WEITERMACHEN motiviert hat.
Und nicht zu letzt Danke an das Heimatmuseum in Borna für die interessanten Anregungen in
Sachen Pathogenese der Bornaschen Krankheit:
Letzte Abbildung: Originalfoto einer Texttafel im Heimatmuseum Borna, Juli 2005
Meiner Oma Bill danke ich ganz herzlich für ihre liebevolle Unterstützung und ihr
anhaltendes Interesse an meiner Arbeit, deren Abgabe sie leider nicht mehr erlebt hat.
Und schließlich möchte ich mich ganz besonders bei meinen Eltern Klaus und Marianne und
meinen Geschwistern Paul und Annemarie für ALLES bedanken: das Vertrauen in mich, die
aufbauenden Telefonate, bei meinen Eltern für die finanzielle Unterstützung, speziell meiner
Mutter für die zahlreichen aufmunterten Worte und meinem Vater für den Computer, die
allzeit erreichbare Computerhotline und für die Hilfe bei der so sinnvollen Ausmerzung des
dpi.

ISBN 3-939902-19-5
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