Gefriertrocknung von Pharmazeutika - Pharmtech.uni-erlangen.de

Gefriertrocknung mit System - Das Christ Seminar -
Gefriertrocknung von Pharmazeutika
*
Grundlagen der
Formulierungs- und Prozessentwicklung
Apotheker Henning Gieseler
Lehrstuhl für pharmazeutische Technologie
Universität Erlangen-Nürnberg

Pharmazeutische Industrie
Marktsituation
Warum Lyophilisation ?
Formulierungsentwicklung
Proteine
Gerüstbildner
Amorphe Systeme
Tenside
Inhaltsübersicht
Prozessentwicklung
Einfrieren
Haupttrocknung
Temperaturfühler
Druckmessung
Wägesystem Firma
Christ
Nachtrocknung
Zusammenfassung

Pharmazeutische Industrie – Marktsituation I
Interferon alfa-2a/b Somatropin Follitropin
Penicilline
Vitamine
Liposomen
Enzyme
Proteine
Impfstoffe
Seren
Erythropoietin
Blutzubereitungen
Anteilige Zusammensetzung der pharmazeutisch relevanten Substanzklassen in Bezug auf den Einsatz
der Lyophillisation, unveröffentlichte Daten (2002).

Pharmazeutische Industrie – Marktsituation II
Pharmaceutical Research and Manufactures of America (2000).

Pharmazeutische Industrie – Warum Lyophilisation ?
Proteine werden aufgrund extrem schlechter Bioverfügbarkeit nach
oraler Gabe normalerweise subkutan injiziert.
Stabilität - Die Lyophilisation ist Methode der Wahl bei der Trocknung
thermolabiler bzw. hydrolyseempfindlicher Materialien:
es kommt zu keinen größeren Veränderungen der Wirkstoffe und
damit möglichen Verlusten an biologischer Aktivität.
lagerfähigen Produktes ⇒ in sekundenschnelle rekonstituierbar.
Nachteil ist der sehr teure und aufwendige Prozess.
(Verhältnis: Kosten des Arzneistoffes ⇔ Prozesskosten)
Stabilität

Formulierungsentwicklung
Proteine Polymere
Gerüstbildner Aminosäuren
Lyoprotectoren
Cryoprotectoren
Nicht-wässrige LM
Tenside
Puffer

Formulierungsentwicklung - Proteine I
Problematik dieser Substanzgruppe:
Sehr große und instabile Molekühle.
3D-Struktur 3D Struktur wird durch schwache,
nicht kovalente Kräfte stabilisiert.
Schnelle Hydrolyse, Deamidierung,
Deamidierung,
Isomerisierung.
Isomerisierung
Abbau auch bei schonender Lagerung.
Rascher Abbau / Elimination nach
Applikation.
Gewinnung großer Mengen schwierig.
Insulin-Derivat (Protein Data Bank, PDA)

pH-Shift
Ionenstärke
Formulierungsentwicklung - Proteine II
Konzentrationseffekte von
Hilfsstoffen, Proteinen
Hohe und niedrige Temperaturen
Nativer Zustand des Proteins
LYOPHILISATION
Scherkräfte, Sauerstoff, Oberflächeneffekte,
Hydrolyse
Denaturierter Zustand des Proteins
Aggregation
Rekonstitutionsprobleme
Verlust der Aktivität
ABFÜLLUNG in VIALS
LAGERUNGSBEDINGUNGEN
Restfeuchtigkeit, Licht,
Lagertemperatur, Oxidation

Formulierungsentwicklung – Gerüstbildner I
Cryoprotectoren – Lyoprotectoren
Konzentration der biologisch aktiven Substanz häufig extrem
gering ⇒ Schaffung eines „Körpers rpers“, , mechanische Stabilität Stabilit t und
attraktivem Aussehen. (1)
Stabilisierung des Proteins beim Einfrieren: (2)
„preferential
preferential interaction / exclusion“ exclusion [Timasheff Timasheff]
„preferential
preferential binding“ binding
Stabilisierung des Proteins beim Trocknen: (2, Trocknen: (2, 3, 4)
amorphes Glass
„water water replacement“
replacement
Aminosäuren
(Glycin, Alanin)
Zucker
(Saccharose, Trehalose)
Polymere
(Dextran, HPMC)

Formulierungsentwicklung – Gerüstbildner II
Amorphe Feststoffe:
Moleküle sind nicht regelmäßig angeordnet (niedriger Ordnungsgrad).
Thermodynamisch weniger stabil ⇒ größere Löslich-/ Zersetzlichkeit.
amorph
Glas mit sehr hoher
Viskosität
⇒ Einbettung der Moleküle Molek le
Hohe Wechselwirkungen
Zucker ⇔ Protein
⇒ „water water replacement“
replacement
Langsame Trocknung
⇒ tiefe Temperaturen
kristallin
sehr schnelle Trocknung
⇒ höhere here Temperaturen
möglich glich
Geringe Stabilisierung

Formulierungsentwicklung – Gerüstbildner III
SEM - Trehalose 7,5%
Einfriergeschwindigkeit 1,67°C/Min, 200x
amorph kristallin
SEM - Mannitol 7,5%
Einfriergeschwindigkeit 1,67°C/Min, 500x

Formulierungsentwicklung - Amorphe Systeme I
nach Unterkühlung friert Lösung
am Punkt TT ff ein.
freiwerdende Kristallisationsener-
gie führt zu Temperaturanstieg.
Eis und immer höher konzen-
triertere Lösung entstehen.
im Zuge der Konzentrierung
nimmt Viskosität der Restlösung
weiter zu, bis viskoelastischer
`rubber rubber´ ´ entsteht.
Diffussionsvorgänge (für Kristalli-
DSC: Einfrierverhalten einer wäßrigen Saccharoselösung
sation nötig) extrem verlangsamt!
am Punkt TT gg‘‘ ⇒ kein Eiswachstum mehr ⇒ Glasübergangstemperatur
der max. konzentrierten Lösung mit Wassergehalt wg‘ ‘ ⇒ festes System.
keine vollständige Phasentrennung ⇒ häufig hohe Gehalte an
„unfrozen unfrozen water“ water“
⇒ „gel gelöstes stes“ Wasser in der amorphen Matrix.
(5)
Wasser in der amorphen Matrix.

Formulierungsentwicklung - Amorphe Systeme II
Phasendiagramm eines Saccharose-Wasser Systems. Die Pfeile verdeutlichen den Verlaufsweg
der Gefriertrocknung mit einem anfänglichen Gehalt von 5% Feststoff. (1)

Formulierungsentwicklung - Tenside
Tenside (surfactants surfactants) ) – grenzflächenaktive Substanzen
Proteine sind meist grenzflächenaktiv und adhärieren an Grenzflächen
(Vials Vials, , Infusionsflaschen, …). Zugabe von Tensiden bewirkt:
Verhinderung der grenzflächenbedingten Denaturierung.
Reduzierung der Aggregation der Proteine.
Aber: höhere Tensidzugabe kann Produktmorphologie ändern,
z.B. bei Polysorbat 80 ⇒ Änderung nderung der Trocknungsrate.
Trocknungsrate.
(6)
SEM – Trehalose 7,5%
Keine Zusätze
Oberfläche des Kuchens, 400x
SEM – Trehalose 7,5%
Zusatz von 5% Polysorbat 80
Oberfläche des Kuchens, 250x

Prozessentwicklung
Relevante Fragen bei der Entwicklung:
Wie tief muß eingefroren werden?
Wie schnell kann eingefroren werden?
Wann ist mein Produkt vollständig durchgefroren?
o Unter welchem Druck und Temperatur sollte die Haupttrocknung
erfolgen?
Ermittlung von T c und T g‘, ‘, Trocknung unterhalb T g‘ .
o Wann ist kein Eis mehr vorhanden?
Ende der Haupttrocknung.
Wann habe ich meine gewünschte Restfeuchte (≤ ( 1%) erreicht?
Ende der Nachtrocknung.

Prozessentwicklung – Einfrieren I
Wie kann die richtige Einfriertemperatur und Geschwindigkeit
ermittelt werden?
Temperaturfühler
DSC, DTA
Cryomikroskop
Folgen einer zu hohen Einfriertemperatur bzw. zu kurzen Haltezeit: Haltezeit:
Kollaps der Kuchenstruktur
Zerstörung des Proteins
Folgen einer inhomogenen Nukleation, Nukleation,
einer zu tiefen Nukleations-
temperatur bzw. ungünstigen Einfriergeschwindigkeit:
Kleine Poren ⇒ große gro e Oberfläche Oberfl che ⇒ lange Primärtrocknungszeiten
+ Förderung der Proteinaggregation.
Proteinaggregation
Puffersalze
Kristallisation einer Komponete:
Komponete:
pH-shift pH shift von 7 auf 3,5!

Prozessentwicklung – Einfrieren II
Einfluß der Einfriergeschwindigkeit auf die Produktmorphologie
SEM - Trehalose 7,5%, Kuchenspitze
Einfriergeschwindigkeit 1,67°C/Min, 250x
SEM - Trehalose 7,5%, Kuchenspitze
Einfriergeschwindigkeit 108°C/Min (LN 2 ), 200x
Untergliederung in:
Langsam (0,5°C/Min)
(0,5 /Min)
Moderat (0,5°C/Min (0,5 C/Min bis 2,0°C/Min) 2,0 C/Min)
Schnell (100°C/Min):
(100 C/Min): flüssiger Stickstoff, Propan
Schnelles Einfrieren führt zu veränderter Trocknungsrate
(geringerer Porendiameter; rissfreie Oberflächenstruktur)
⇒ längere Primärtrocknung (7)

H2O
Prozessentwicklung - Einfrieren III
Nukleation
(durch Kristallisationskeime ausgelöst)
homogen
spontanes Ausbilden von
mikroskopischen H2O-Clustern
Abkühlen
Unterkühlung
Lösungen
heterogen
an der Oberfläche von
Verunreinigungen
kristallisierend zur Übersättigung
neigend
Das Einfrieren findet häufig h ufig in breiteren
Bereichen von Nukleationstemperaturen statt.
Die Eigenschaften der Eiskristalle hängen h ngen
maßgeblich ma geblich von der Nukleationstemperatur
ab!
Lösungen vor der Nukleation
Lösungen nach der Nukleation

Prozessentwicklung - Einfrieren IV
„Je Je höher die Nukleationstemperatur,
desto größer die Eiskristalle“
„Die Die dadurch gebildeten Poren führen
mehr Wasserdampf / Zeit ab,
der ständig von der sublimierenden
Eisfront nachgeliefert wird“
- Kürzere Primärtrocknungszeiten -

Prozessentwicklung – Einfrieren V
Probleme resultieren aus der Tatsache, daß Proben auf der gleichen gleichen
Stellfläche unterschiedliche Tn haben können
⇒ unterschiedliche Trocknungsraten der Produkte
In denjenigen Formulierungen, bei denen die Trocknungsrate höher
liegt, wird möglicherweise die Formulierung bzw. die Proteine durch
„Überhitzung“ zerstört.
Chargenheterogenität wird
verbessert durch z.B.:
Ice-fog technique (8)
Annealing (9)

Prozessentwicklung – Haupttrocknung I
Wie kann die richtige Stellflächentemperatur und Primärtrocknungs-
dauer ermittelt werden?
DSC, DTA (1, 4)
Temperaturfühler (5)
Druckanstiegstest
Komparative Druckmessung Barometrische Druckmessung
(6, 10)
Freeze Drying Microscopy
Massenspektrometer
Feuchtesensoren
Wägesystem Fa. Christ (11)
Folgen einer zu hohen Trocknungstemperatur bzw. einer zu kurzen
Trocknungsdauer:
Bei Trocknung oberhalb von T c bzw. T g‘ ‘ droht Kollaps der
Kuchenstruktur ⇒ Denaturierung des Proteins.
Bei Übertrocknung bertrocknung fehlt der kühlende k hlende Effekt der Eissublimation
⇒ Zerstörung Zerst rung des Proteins, unökonomisch.
un konomisch.
…

Prozessentwicklung – Haupttrocknung II
Temperaturfühler
Prinzip:
Messung des Temperaturanstiegs im Produkt ⇒ verursacht durch
ausbleibende Abführung der zugeführten Wärme durch Sublimation
und fehlende Selbstkühlung durch das Fehlen von Eis am Ende der
Primärtrocknung.
Messung durch direkte Temperaturmessung mit Thermometer oder
temperaturabhängige Widerstände
⇒ invasiv. invasiv
oder indirekt mit der manometrischen Temperaturmessung
⇒ nicht invasiv.
invasiv

Prozessentwicklung – Haupttrocknung III
Problematik der invasiven Methode:
Messung nur der unmittelbaren Umgebung ⇒ direkter Kontakt mit
Gut nötig ⇒ bei geringer Füllhöhe schwierig.
Beeinflussung des Kristallisationsverhaltens:
Wärmezufuhr an das Gut durch Stromfluss
Wirken des Fühlers als Kristallisationskeim
Extreme Reduktion des „supercooling
„ supercooling“
Nukleationsgegebenheiten verändert
⇒ heterogenen Nukleation
Messung nur eines Vials
Temperatur abhängig von Position des Fühlers im Vail. Vail.
Temperatur der Sublimationsfront ist nicht messbar.

Prozessentwicklung – Haupttrocknung IV
Messungen an verschiedenen Positionen eines Lyophilisates mit einem Temperaturfühler (5)

Druckmessung
Prozessentwicklung – Haupttrocknung V
Prinzip:
Messungen des Drucks als Endpunkt-
kriterium der Primärtrocknung.
Abnahme des Druckes führt zum Ab-
sinken der Wärmeleitfähigkeit durch
verminderten Materietransport.
Ende der Primärtrocknung
⇒ Wassderdampfgehalt fällt
⇒ Druck sinkt
Messung des Kammerdrucks mit:
1. Piraniröhre (gasartabhängig)
2. Kapazitivem Manometer
(gasartunabhängig)
Wärmeleitungsmanometer nach Pirani (6)
Kapazitives Manometer (6)

Prozessentwicklung – Haupttrocknung VI
Komparative Druckmessung
gleichzeitige Verwendung von Pirani und Kapazitiven Manometer.
Pirani zeigt am Anfang höhere Werte durch hohen Wasserdampf-
gehalt an.
zum Ende nähern sich beide Manometer in ihren Werten an und
zeigen schließlich deckungsgleiche Werte an.
Somit kann über das Ausmaß der Abweichung (am Anfang stark ⇒
am Ende wenig) der momentane Trocknungsfortschritt gemessen und
so das Primärtrocknungsende festgesetzt werden.

Prozessentwicklung – Haupttrocknung VII
Wägesystem Fa. Christ
Prinzip:
Durch kontinuierliche Messung wird die Möglichkeit geschaffen,
Verlauf und Charakteristik der Trocknung während des Prozesses
durch Differenzwägung in vorgegebenen Intervallen zu ermitteln
⇒ Bestimmung des Trocknungsendes über ber die Gewichtsab-
nahme eines einzelnen Vials. Vials
an beliebiger Position auf den Stellplatten positionierbar.
Meßbereich zwischen 0,001g und 50,0g bei einer Meßgenauigkeit
von 0,005g. (12)
Nutzbarer Temperaturbereich von - 40 oC C bis + 40o 40 C.
Problematik:
Messung nur eines Vials, Vials,
Übertragbarkeit auf die Charge?
Veränderte Wärmestrahlung?

Prozessentwicklung – Haupttrocknung VIII
Positionierung der Mikrowaage
auf der Stellfläche des GT
Mikrowägesystem der Firma Christ mit Hubarm und 10R Vial
Gesamtaufbau der Anlage inklusive
EDV

Trocknungsrate
[mg/ 10min]
Stellflächentemperatur
[ o C]
Prozessentwicklung – Haupttrocknung IX
40
30
20
10
0
40
20
0
-20
-40
Beispiel für den Verlauf der Trocknung einer 7,5% (m/m) Saccharose-Lösung
(PD: 0,260) in Gegenüberstellung zum verwendeten Gefriertrocknungszyklus
Einfrieren
Primärtrocknung
Sekundärtrocknung
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600
Trocknungszeit [Min]
? ?
3
2
1
0
10 3
10 2
10 1
10 0
10 -1
10 -2
10 -3
Menge an sublimiertem Wasser
[g]
Vakuum
[mbar]

Prozessentwicklung – Nachtrocknung
Wie kann die richtige Stellflächentemperatur und Sekundär-
trocknungsdauer ermittelt werden?
Druckanstiegstest
Barometrische Druckmessung
Folgen bei zu hoher Restfeuchte:
Massenspektrometer
Schleuse
Unterhalb T g – teilweise kollabieren der Kuchenstruktur
Probleme bei der Rekonstituerbarkeit
Ausmaß und Geschwindigkeit der Zersetzung des Proteins
Lager- Lager / Stabilitätsprobleme

Zusammenfassung
Die Formulierung von Biopharmaka erfordert möglichst genaue
Kenntnisse von potentiellen Einflußfaktoren und ist insgesamt sehr sehr
zeitintensiv.
Einheitliche, kurze und ausgereifte Entwicklungsstrategien für den den
Durchschnittsanwender existieren derzeit noch nicht.
Ansatzpunkte: Design of a „Smart Freeze Dryer“ Dryer“
(13)
Viele Untersuchungen können nur nach dem „trial „ trial and error“ error“
Prinzip
ausgeführt werden.
Weitere systematische Arbeiten sind für das Verständnis vieler
einzelner, weniger bekannter Einflußparameter notwendig.

Gefriertrocknung mit System - Das Christ Seminar -
Henning Gieseler
Lehrstuhl für pharmazeutische Technologie
Universität Erlangen-Nürnberg
Professor Geoffrey Lee
Tel: 09131-8529547
Fax: 09131-8529545
gieseler@pharmtech.uni-erlangen.de
www.pharmtech.uni-erlangen.de

Literatur
(1) Franks, Felix, „Freeze „ Freeze-drying drying of bioproducts:
bioproducts:
putting principles into practice“. practice“.
European Journal of
Pharmaceutics and Biopharmaceutics 45, 221-229 221 229 (1998).
(2) Mi, J., „Protection Mechanisms of Excipients on Lactat Dehydrogenase during Freeze-Thawing and
Lyohilisation“. Doctoral Dissertation (2002).
(3) Allison, S.D., Chang, Chang,
B., Randolph, T., Carpenter, Carpenter,
J., „Hydrogen „ Hydrogen bonding between sugar and proteins is
responsible for inhibition of dehydration-induced
dehydration induced protein unfolding“, unfolding“,
Arch.. Biochem. Biochem.
Biophys., Biophys.,
365, 289- 289
298 (1999).
(4) Cleland & Langer, „Formulation and Delivery of Proteins and Peptides“, Chapter 8, „Freeze Drying of
Proteins“ by Pikal, M., American Chemical Society, 120-133 (1994).
(5) Oetjen, Oetjen,
G.W., „Lyophilisation“. Wiley-VCH Wiley VCH, , ISBN 3-527 3 527-29571 29571-2 2 (1999).
(6) Kramer, M., „Innovatives Einfrierverfahren zur Minimierung der Prozeßzeit von Gefriertrocknungszyklen“,
Dissertation Universität Erlangen (1999).
(7) Gieseler, H. and Lee G., „Influence of Different Cooling Rate on Cake Structure of Freeze Dried Samples
Measured by Microbalance Technique“. Poster presentation, Controlled Release Society German Chapter
Annual Meeting, München (2003).
(8) Ramott R., Rambhatla, Rambhatla,
S., Pikal, M., „The „ The Effect of Nukleation Temperature on the Process of
Lyophilisation“. Oral Presentation at the University of Connecticut School of Pharmacy (2002).
(9) Searls, J., Carpenter, J., Randolph, T., „Annealing to Optimize the Primary Drying Rate, Reduce Freeze-
Induced Drying Rate Heterogeneity, and Determine Tg‘ in Pharmaceutical Lyophilisation“, J. Pharm. Sci.,
Vol. 90, Nr. 7, 872-887 (2001).
(10) Milton, N., „Evaluation of Manometric Temperature Measurement as a Method of Monitoring Produkt
Temperature During Lyophilization, Lyophilization,
J. Pharm. Sci. Sci.
and Techn., Techn.,
57, 7-16 7 16 (1997).
(11) Roth, C., Winter, G., Lee, G., „Continuous Measurement of Drying Rate of Crystalline and Amorphous
Systems during Freeze-Drying Using an In Situ Microbalance Technique“. J. Pharm. Sci., Vol. 90, No. 9,
1345-1355 (2001).
(12) Bedienungsanleitung Wägesystem CWS 40, Fa. Christ Gefriertrocknungsanlagen, 10/1997, 03/2000.
(13) Pikal, M., Nail, S. and Tang, Xiaolin, „Automated Process Design Through Manometric Temperature
Measurement – Design of a „Smart Freeze Dryer“. Conference Presentaton, Freeze Drying of
Pharmaceuticals and Biologicals, Breckenridge, CO (2001).